一、微孔同种异体表面脱钙骨基质明胶诱导成骨能力的实验研究（论文文献综述）
刘鹏[1]（2021）在《含稀土碳酸化羟基磷灰石材料的制备及其应用于骨修复的实验研究》文中进行了进一步梳理由口腔颌面部肿瘤、创伤、先天性疾病以及炎症导致的骨组织缺损是口腔诊疗中的常见问题,同时也是口腔医生修复骨缺损时所面临的难题之一。颌骨缺损严重影响咀嚼、吞咽、语言等重要生理功能,骨缺损治疗效果不佳或骨缺损修复失败都会直接影响患者的生活质量。口腔种植修复是目前牙列缺失和牙列缺损的主要治疗方式。充足的骨量是保证种植成功的关键之一,但在复杂的咬合关系及不同的口腔环境影响下,牙齿缺失患者往往伴有不同程度的缺牙区牙槽骨萎缩,易引发种植失败的问题。自体骨虽被临床认为是骨移植的“金标准”,但第二术区的开辟造成的创伤较为严重,来源限制,无法随意塑形,且自体骨移植后会发生一定的并发症。异体骨也受限于原料需求和排异反应等造成价格昂贵,并且存在修复风险。“骨组织工程”概念的提出即是针对以上问题,提出的以种子细胞、细胞因子、支架为媒介代替传统的骨移植的治疗方法。利用骨修复材料与种子细胞及细胞因子的相互配合,实现骨缺损的高水平修复是针对较大骨缺损量的骨缺损治疗的必由之路。近年来随着细胞工程和基因编辑技术的发展,组织工程中种子细胞和细胞因子的研究取得了很大进展,骨组织工程里可选用的支架体系种类繁多,但其各自存在的无法避免的问题使得其应用仍然非常受限。例如,金属支架的生物惰性、力学不匹配、高分子材料降解速率可控性差、引发排异反应、传统陶瓷支架的脆性、较差的骨传导性等问题。寻找合适的材料体系,设计并制备出符合不同成骨需求的个性化支架,是骨组织工程在口腔颌骨修复从理念走向临床应用的关键。羟基磷灰石（hydroxyapatite,HA）是骨骼和牙齿组织中天然存在的无机矿物成份,由HA制备成的支架一直被骨组织工程修复领域所推崇。然而,实验室中常用的HA主要是Ca10（PO4）6（OH）2及其它形式的磷酸钙材料,这与骨组织中的HA结晶性差、存在多种离子的梯度取代、在不同骨位置的成份差异等的实际需求相差较大。在文献里已报道的应用中,未掺杂的纯HA存在脆性大、降解效果差、与新生骨组织存在界面等问题,仍然是限制其作为骨组织工程支架的瓶颈之一。如何设计并制备出具有与人体骨组织中的矿物相类似的仿生HA骨粉材料,并且根据不同部位的骨缺损需求,个性化订制骨修复材料,是推动骨组织工程在临床应用的关键。在骨骼和牙齿中的HA主要为存在金属离子梯度掺杂的碳酸根取代的HA,碳酸根的质量分数为3-8wt%,其中碳酸根主要取代磷酸根的晶体学位置,称为B-型羟基磷灰石。碳酸根取代可以使HA结晶度变差,结构更松散,从而有利于破骨和骨重建,其松散的结构更利于与胶原及其它蛋白的结合从而降低材料的脆性,使之具有更强的塑性。因此,开发出碳酸根取代的HA材料,实现碳酸根的浓度可控取代,对于从支架方面推动骨组织工程应用于口腔临床骨缺损治疗具有重要意义。稀土元素由于其特征的光谱性质,可作为生物材料的荧光标记物,尤其是其离子半径与Ca2+离子接近,有很多文献已将其应用于骨植入材料在体内演化情况的荧光标记。另外,也有文献报道低剂量的稀土离子掺杂不但可以调节HA的结晶度,而且还能通过缓释的稀土离子激活钙通道,从而促进间充质细胞向成骨细胞的分化。基于以上关于HA应用于骨组织工程支架的研究现状,我们提出以碳酸根的可控取代和稀土的可控掺杂为源头,制备出系列具有不通碳酸根和稀土离子含量的B-型羟基磷灰石仿生骨粉材料,采用3D打印的方式,将其制备成支架,在细胞和动物水平上评价其促成骨效果,为骨组织工程研究提供更接近于骨组织的可个性化订制的支架体系,从而推动解决口腔颌骨修复所面临的的复杂的成骨环境和特异性成骨需求的问题。本论文主要分为（1）材料设计与可控制备,（2）细胞水平评价小鼠胚胎成骨细胞前体细胞（MC3T3-E1）的增殖、分化与关键蛋白表达,（3）动物水平评价新生骨组织形成、钙化及新骨在支架中的生长等三个部分,分别简述如下:（1）碳酸化及稀土掺杂的HA仿生骨粉的制备根据在生理环境下的钙离子、磷酸根离子、碳酸根离子的热力学平衡条件,利用Pourbaix计算并得到了B-型羟基磷灰石的矿化条件及调节参数,制备出了系列碳酸根取代的羟基磷灰石（carbonated hydroxyapatite,CHA）纳米材料,通过控制反应条件和初始碳酸根浓度,可调节产物HA中碳酸根的比例。在此基础上,将与Ca2+离子具有相近离子半径但是不同电荷的稀土离子掺杂进入HA及CHA晶格中,从而制备出系列稀土离子掺杂的HA及CHA材料。结构分析表明具有三角形构象的碳酸根阴离子在取代具有四面体构象的磷酸根离子时,以相对于c-轴呈30 o角的方式扭曲叠加在磷酸根四面体的一个较长P-O键参与的面上。随着碳酸化程度的增加,纳米棒的长径比从3.6降为2.9。稀土离子的种类可以影响B-型羟基磷灰石纳米棒的形貌,并且碳酸化并不会影响稀土在HA中的配位环境及发光性质。采用该方法得到的B-型羟基磷灰石材料与人体骨组织中的矿化成份接近,并且稀土元素可以均匀地掺杂在材料的晶格中,既可以利用其特征荧光光谱标记其在体内的变化过程,又可以作为潜在的成骨细胞分化促进剂来激活成骨过程,以实现更好的促成骨效果。（2）细胞实验检测稀土掺杂及碳酸根取代的HA材料的生物学性能选取HA、1mol%铕（europium,Eu）掺杂的HA（Eu-HA）、1mol%铽（terbium,Tb）掺杂的HA（Tb-HA）、碳酸根取代度为3.3wt%的羟基磷灰石（CHA）、1mol%Eu-掺杂的CHA（Eu-CHA）、1mol%Tb-掺杂的CHA（Tb-CHA）六组材料为代表,研究了它们对于MC3T3-E1细胞的形态、增殖及成骨分化的影响。采用三维打印机将以上材料打印成支架,通过系统的细胞增殖、分化及蛋白表达测试,评价其作为骨修复材料应用于骨组织工程的潜力。六组材料都是潜在的骨修复材料,其中Tb的掺入可促进MC3T3-E1细胞的黏附增殖,尤其是Tb-CHA,在ALP染色和定量、茜素红染色、成骨相关蛋白表达实验结果中,表现出了最佳的促成骨效果,明显优于Tb-HA、HA和CHA;Eu的掺入减缓了MC3T3-E1细胞的增殖、黏附及成骨分化。（3）稀土掺杂及碳酸根取代的HA支架促大鼠颅骨缺损修复的实验研究通过以上研究,我们发现在体外促进成骨细胞增殖、黏附和成骨分化方面,掺杂Tb的材料优于掺杂Eu的材料,CHA优于HA,故我们采用大鼠颅骨缺损模型,分别植入HA支架、Tb-HA支架、CHA支架和Tb-CHA支架材料,评价骨缺损的修复。经影像学及HE染色分析结果可知,术后4周,各组对骨缺损的修复均不明显。术后8周,空白对照组缺损处仅表现为少量的新骨形成,HA组未见明显愈合,Tb-HA可见缺损部位实现了一部分修复,HE染色切片可见新生骨;与HA组相比,CHA组对骨缺损进行了一定程度的修复;Tb-CHA组显示出最强的成骨效果,且可降低局部炎症反应。综上所述,本论文从应用于骨组织工程修复骨缺损支架的源头出发,通过对HA材料矿化机制的深入分析,设计并制备出了系列与人体骨组织成份最为接近的CHA材料,并且将稀土离子选择性地标记在HA结构的Ca1晶体学位置;采用3D打印技术,将模型材料打印成支架,分别在细胞水平上和动物水平上,通过系列实验手段检测了材料对MC3T3-E1细胞的增殖、分化能力、蛋白表达水平和新骨生长情况的影响,发现了碳酸根取代和稀土Tb3+离子掺杂都可促进HA材料的骨缺损修复效果。本论文的研究将从源头上把以HA为主的骨组织工程支架材料引导为碳酸根取代的HA和异价金属离子掺杂HA,利用这种碳酸根和稀土离子调控的成骨性能差异,借助3D打印设备,根据不同位置的成骨需要个性化的设计支架,订制具有不同成骨需求的支架材料,从而为像口腔颌面部骨组织这种复杂的骨缺损疾病提供个性化的修复植入材料。
笪虎,张建中,宋建宽,徐长明,熊卓[2]（2021）在《不同浓度多聚赖氨酸溶液对同种异体骨进行表面改性的实验研究》文中认为目的探讨多聚赖氨酸溶液对兔同种异体骨进行表面改性使其具有良好的细胞亲和力与最低细胞毒性的最佳浓度。方法使用浓度为100 mg/mL、30 mg/mL、1 mg/mL、0.1 mg/mL、0.025 mg/mL和0.01 mg/mL的多聚赖氨酸溶液,采取冻干法,分别对兔同种异体骨的微孔进行表面改性。根据多聚赖氨酸浓度,将兔同种异体骨分为100 mg/mL组、30 mg/mL组、1 mg/mL组、0.1 mg/mL组、0.025 mg/mL组和0.01 mg/mL组,同时,将未行表面改性的同种异体骨设为空白对照组。将兔骨髓间充质干细胞（BMSCs）分别种植在各组同种异体骨内,并向成骨方向进行诱导和增殖。采用噻唑蓝（MTT）比色试验检测BMSCs在各组同种异体骨微孔表面的黏附、增殖情况,同时检测各组经诱导培养后的细胞表达碱性磷酸酶（ALP）的活性。结果在经不同浓度多聚赖氨酸溶液表面改性的同种异体骨中,空白对照组和0.01 mg/mL组BMSCs增殖及其表达ALP的活性明显小于其他各组（P <0.05）,而其他各组之间差异无统计学意义（P> 0.05）。结论从经济、有效方面考虑,多聚赖氨酸溶液对同种异体骨进行表面改性的最佳浓度为0.025 mg/mL,该浓度可使同种异体骨具有良好的细胞亲和力与最低的细胞毒性。
王钊,闫石[3]（2020）在《应用Masquelet技术治疗大段骨缺损减少自体骨用量的可能性》文中指出背景:Masquelet技术是目前治疗大段骨缺损的有效方法之一,该技术在手术治疗的第二阶段中需要使用较多的自体骨,而自体骨来源有限且存在供区并发症的风险,如何减少自体骨的使用量是一个亟待解决的问题。目的:结合国内外诱导膜技术的发展现状,介绍在诱导膜技术中如何减少自体骨用量的一些有效方法,包括填充骨移植替代材料及一些特殊的手术方式。方法:由第一作者应用计算机检索PubMed、知网、万方数据库中1996年1月至2019年9月出版的文献,英文检索词为"masquelet technique;induced membrane;bone transport technique;autologous bone;bone defect;bone graft;3D printing;tissue engineering";中文检索词为"Masquelet技术;诱导膜;骨运输技术;自体骨;骨缺损;骨移植物;3D打印;组织工程"。结果与结论:自诱导膜技术出现之后不断有学者对该术式进行改进与创新,但针对如何减少诱导膜第二阶段自体骨使用量的问题,目前还没有一种国际统一的观点。目前应用的改进方式各有其优缺点,临床医师还需根据客观条件进行选择。Jong-Keon Oh提出的将明胶海绵作为植骨中心、外周环形植骨的方法简单且实用。组织工程技术具有发展潜力,随着种子细胞与支架材料的深入研究,将逐步取代现有的治疗方案。根据现有研究可大致将未来诱导膜技术研究方向归纳为4种方向:膜技术的改进,手术方式的改进,应用联合材料,3D打印及组织工程技术的应用,这些方向需要进一步探索和发展。
李淑君[4]（2020）在《不同骨移植材料在拔牙位点保存中的应用研究》文中认为目的:拔牙位点保存术即利用引导骨再生术（guided bone regeneratio n,GBR）在拔牙后新鲜的牙槽窝中植入骨移植物并覆盖生物膜,可以有效减缓拔牙后牙槽骨吸收,为种植牙提供良好的软硬组织基础。在众多骨移植材料中如何选择,是众多专家学者争论的问题之一。本实验通过比较联结同种异体冻干脱钙骨（DFDBA）、倍骼生生物玻璃、Bio-Oss骨粉进行位点保存和自然愈合拔牙窝的牙槽嵴变化,研究不同骨移植材料对位点保存的作用。方法:1.在我院种植科就诊拟行牙种植术的病例中,选择满足本研究病例筛选标准的40名患者,行拔牙位点保存术,根据拔牙窝内填入物不同,将它们随机分成4组:A组:脱蛋白牛骨矿物基质Bio-Oss骨粉+Bio-Gid e胶原膜、B组:联结同种异体冻干脱钙骨（DFDBA）+Bio-Gide胶原膜、C组:倍骼生生物玻璃+Bio-Gide胶原膜和D组:空白对照组。利用锥体束计算机断层扫描（Cone Beam Computed Technology,CBCT）测量拔牙位点保存术后当天和6个月牙槽骨高度和宽度的变化进行统计分析。2.分别使用三种骨粉浸提液培养人骨髓间充质干细胞（hMSCs）,BioOss组、同种异体冻干脱钙骨（DFDBA）组、生物玻璃组并设置空白对照组,于1天、3天、5天利用CCK-8法对比细胞体外增殖情况。与21天后利用碱性磷酸酶（ALP）检测试剂盒,测定ALP活性。结果:1.A、B、C三组牙槽骨垂直向、水平向骨吸收量均显着低于空白对照组,差异有统计学意义（P<0.05）,而A,B,C三组差异无统计学意义,P>0.05;2.CCK-8法检人骨髓间充质干细胞（hMSCs）增殖结果显示:实验组A在1天、3天、5天的吸光度值（Optical density,OD）分别为0.067±0.04,0.107±0.08,0.155±0.06。实验组B为在1天、3天、5天的吸光度值（Optical density,OD）分别为0.216±0.12,0.487±0.19,1.027±0.22,实验组C在1天、3天、5天的吸光度值（Optical density,OD）分别为0.259±0.17,0.421±0.11,0.945±0.18,对照组在1天、3天、5天的OD值分别为0.052±0.01,0.041±0.02,0.105±0.05。实验组B和实验组C均高于实验组A和对照组D,且具有统计学差异（P<0.05）。3.ALP活性检测实验:在21天的实验组A吸光度值（optical density,OD）为0.6±0.45,实验组B为3.31±2.13,实验组C为0.55±0.37,对照组D的OD值分别为0.54±0.45。实验组B均高于ACD三组,且具有统计学差异（P<0.05）。结论:1.同种异体冻干脱钙骨（DFDBA）具有促进人骨髓间充质干细胞增殖、诱导其分化成骨的能力。2.生物玻璃对细胞无毒性,有促进骨髓间充质干细胞增殖的作用。3.应用同种异体冻干脱钙骨（DFDBA）、生物玻璃行拔牙位点保存术,对牙槽骨宽度、高度的保存效果同Bio-Oss骨粉,都具有良好的临床效果。
梁磊[5]（2019）在《体外冲击波对兔同种异体骨异位再血管化与骨活性的影响》文中研究表明背景由于交通事故、感染或骨肿瘤切除导致的骨缺损变得越来越多。同种异体骨正在更多的应用于该领域,但这种去抗原处理的同种异体骨大多为“死骨”。本实验团队前期研究已经证实,将兔的同种异体大段骨置于大腿隐动脉处的股直肌与股内侧肌的间隙内,能够完成其再血管化和骨活化进程;另外通过外源性局部泵入VEGF、BMP,还可以加快整个进程。但是由于操作相对复杂、花费相对高昂、增加感染的风险。所以本次实验就是来探讨体外冲击波是否可以加速同种异体骨移植后再血管化和骨活化进程。目的对同种异体骨异位再血管化和骨活化的兔子模型进行体外冲击波干预,研究其对同种异体骨异位的再血管化及骨活化进程影响。研究结果将为临床中找到一种经济、安全、可靠的促进同种异体骨异位再血管化和骨活化进程的方案。方法用健康中国白兔（6个月龄）140只,随机选20只,手术取出其双侧胫骨,制成同种异体骨段（长度1.2cm）;余120只随机分为对照组（同种异体骨组）、实验组（同种异体骨+ESWT组）,每组各60只。模型制备:将骨段包埋于右大腿隐动脉旁股直肌与股内侧肌间隙内,并用2根0.8mm的克氏针固定在股骨上。术后处理:实验组,从术后从第2周开始,每隔一周（2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12周）局部使用体外冲击波治疗一次;对照组,术后没有特殊处理。两组分别于术后2、4、6、8、10、12周随机选取10只处死,取出植入物,分别行大体标本观察、HE染色组织学检查、免疫荧光染色（CD34、I型胶原蛋白）、ELSA染色（碱性磷酸酶）检测,进而分析所取得的结果意义。采用SPSS 17.0统计软件对结果进行统计分析。计数资料、计量资料分别以构成比（%）、均数±标准差（x±s）表示;采用独立样本t检验进行实验组和对照组组间比较;P<0.05认为有统计学差异。结果1.大体标本观察:术后2周末时,按时拆线。取出植入骨段,观察到两组骨段表面均比较光滑,有少量的纤维组织膜包裹,极易被剥离。术后第4周,观察到实验组骨段表面上的结缔组织增多,骨段表面出现了一些较为表浅的骨吸收陷窝;对照组骨段表面见少量纤维组织覆盖,结构疏松,剥离后见骨段光滑、未出现明显陷窝。术后第6周,实验组的骨段表面的纤维组织进一步增多,包裹的更加紧密,骨段表面都出现较多凹陷;对照组骨段表面的纤维软组织也有所增多,与周围组织粘连相较前紧密一些,但是骨段表面凹陷有所增加。术后第8周,观察实验组骨段表面的纤维结缔组织继续增厚,剥开骨段发现骨段表面陷窝进一步增多、变深;对照组骨段表面纤维结缔组织也继续增厚,与周围组织粘连较为紧密,骨段表面可看见较多的骨凹陷。术后第10周,实验组骨段表面的纤维结缔组织已不再明显增加,形成较疏松、支架结构的结缔组织,骨段表面的陷窝继续加深,且骨皮质已变薄;对照组骨段表面的纤维结缔组织还在增加,也与周围组织粘连紧密,分离困难,骨凹陷进一步加深增多。术后12周,两组骨段表面的纤维结缔组织也几乎一样厚度,均被严密包裹、剥离困难,取出骨段观察到骨段表面陷窝程度差别已较小,对照组的骨凹陷较实验组略少,骨皮质均变薄。2.HE染色结果:第2周时,实验组和对照组可见小面积骨细胞坏死,可见小血管增生。第4周时,实验组可见大量小血管新生;对照组的小血管数量较实验组少。第6周时,实验组可见大量新生血管,骨密度增加;对照组的可见较多的新生血管,骨密度有所增强。第8周时,实验组血管较前无明显变化,但是骨密度仍在增加,有更多的新生骨组织,可见成熟骨小梁。对照组血管数较前增多,新生骨细胞进一步增多。第10周时,实验组较前变化不明显;对照组血管数无明显变化,但是新生骨细胞数增加。第12周时,两组和第10周相比较基本变化不大,两组对比也不明显。3.CD34结果（免疫荧光染色）:实验组和对照组CD34阳性血管数总体均呈先升高后降低趋势,分别于术后第6周和第8周达到峰值,峰值对比无统计学差异（P>0.05）。4.Ⅰ型胶原蛋白结果（免疫荧光染色）:变化趋势与CD34显示结果类似。实验组和对照组结果分别于术后第8周和第10周达到峰值,峰值对比无统计学意义（P>0.05）。5.骨源性碱性磷酸酶结果（ELSA染色）:变化趋势和I型胶原蛋白结果一致,两组结果总体呈先升高后降低趋势。实验组在第8周时达到峰值,对照组在第10周时达到峰值,两组峰值对比无统计学差异（P>0.05）。结论体外冲击波可加速兔同种异体骨异位再血管化和骨活化进程。
陈红庆[6]（2019）在《多元个性化3D打印自体颅骨的实现及其修复兔颅骨极限缺损的骨再生研究》文中认为3D打印技术已逐渐被应用于钛合金,聚甲基丙烯酸甲酯和聚醚醚酮等颅骨修复植入物的制造,以便能更加方便、高效、准确的加工此类具有特定形状需求的植入物。然而随着颅骨成形术的目标开始从外形重建向骨再生进展,现阶段的3D打印形式仍主要集中在颅骨植入物的形状与骨缺损的匹配上,缺乏实现骨再生的理想材料和活细胞。这显然不能满足颅骨缺损修复的骨再生需求。迄今为止,已被证实具有促进骨再生作用的生物材料中,其中多数仍然存在成本高、异源性、骨再生能力有限等缺点。而且长期的异源性材料植入和异源性细胞的使用不可避免会引起异物反应或免疫排斥。自体颅骨瓣因其在生物来源上具有真正的患者特异性而常被作为颅骨修复材料的首选,却因创伤性颅脑损伤、缺损面积过大、骨瓣碎裂、颅骨修复时间晚等不利因素而出现无菌性骨坏死并最终演变为骨瓣吸收。此外,处于颅骨关键生长期的儿童因活跃的骨质重构而更易出现骨瓣吸收。本研究从个性化颅骨修复再生的角度出发,提出包括外形特异、材料来源特异（自体骨基质）和细胞来源特异（自体细胞）的多元个性化3D打印植入物解决方案,拟以自体颅骨瓣为原料制造具有材料特异性的3D打印自体颅骨植入物,通过结合自体骨髓间充质干细胞（BMSCs）进一步构建多元个性化颅骨修复植入物。并在不使用外源性成骨活性因子的情况下,对此植入物的体内和体外成骨能力进行评估,以期提供一种真正兼具患者特异性和骨再生能力的颅骨缺损修复解决方案。第一部分3D打印自体骨个性化外形与结构的实现及特性研究【目的】探索建立以自体骨瓣为原料的3D打印体系的可行性;测试该3D打印体系在特异外形和结构方面的稳定性、实用性和多样性;评价该体系下3D打印自体骨的理化特性。【方法】低温研磨冻干的兔自体骨瓣获得骨粉并在电镜下进行微观形貌观察,使用激光粒度分析仪测量粒度分布;将自体骨粉与多种溶剂制备的聚（ε-己内酯）（PCL）墨水混合获得骨浆料,评价不同溶剂下自体骨浆料的可打印性;在优化的3D打印参数下,以不同填充率及层间角度进行简易模型及基于人体影像数据的成人尺寸模型打印;电镜下观察3D打印自体骨的微观形貌,以万能测试机进行力学强度测试;以样品浸提液孵育L929小鼠成纤维细胞系,评价样本细胞毒性。【结果】兔自体骨瓣的骨粉得率约47%,骨粉粒径达微米级;以冰乙酸为溶剂的自体骨浆料打印流畅且易于成型,浆料可顺利通过的打印喷头最小规格为22G;打印模型可只经过水处理达到固化作用。通过基于冰乙酸的自体骨浆料可以实现多种结构、多种规格的样品打印;电镜下的微观结构呈海绵样,其杨氏模量为3.50±0.73MPa,水处理72h后细胞毒性达到0级。【结论】（1）以自体骨瓣为原料建立3D打印体系是可行的;（2）基于冰乙酸PCL打印墨水的自体骨浆料体系具有良好的打印稳定性、实用性和多样性;（3）3D打印自体骨具有一定的力学强度和良好的生物安全性。第二部分自体BMSCs的分离、培养及多细胞分化潜能鉴定【目的】使用骨髓血进行自体BMSCs的分离和体外培养,并通过诱导其向多种细胞分化证实其多向分化潜能。【方法】取兔股骨上端骨髓血,密度梯度离心获得单核细胞后贴壁筛选培养,并通过Alamar Blue实验检测P3自体BMSCs的增殖能力;诱导对数生长期的P3 BMSCs分别向成骨细胞、脂肪细胞及软骨细胞定向分化,以检测细胞的多向分化潜能。标记细胞以确保其与对应的自体骨瓣来自同一个体。【结果】自体BMSCs呈梭形,束状排列,当细胞传代培养至P3时细胞形态更加均一;P3自体BMSCs在第3天进入对数生长期,到达第13天时进入平台期。成骨诱导后碱性磷酸酶（ALP）四唑氮蓝/5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐（NBT/BCIP）染色及细胞外钙盐茜素红S染色、成脂诱导后细胞内脂滴油红O染色及成软骨诱导后细胞外硫酸糖胺聚糖阿利辛蓝（pH1.0）染色均呈阳性。【结论】（1）密度梯度离心联合贴壁筛选获得的自体BMSCs具有良好的生长活性和多向分化潜能;（2）自体BMSCs有望用于3D打印自体骨以构建多元个性化颅骨修复植入物。第三部分3D打印自体骨对自体BMSCs的细胞亲和性研究【目的】明确自体BMSCs在3D打印自体骨上的初始粘附率,增殖情况以及细胞活力。【方法】将对数生长期P3自体BMSCs种植于3D打印自体骨24h后行CCK-8实验,以2D培养同样数量的BMSCs为参照,计算BMSCs的相对有效粘附率;隔天行Alamar Blue实验,检测自体BMSCs在3D打印自体骨中的增殖情况;分别于不同时间点行细胞活/死染色,计算自体BMSCs的细胞存活率;电镜下观察3D打印自体骨中自体BMSCs的细胞形态。分别以纳米羟基磷灰石（nHA）和异体骨粉为原料的3D打印nHA骨及3D打印异体骨设为对照组。【结果】3D打印自体骨对自体BMSCs的细胞粘附率最高;细胞数量在三种3D打印骨中于第15天达到峰值并保持4天;整个培养过程中,3D打印自体骨和3D打印nHA骨中BMSCs的细胞活力明显强于3D打印异体骨;培养第14天时,扫描电子显微镜（SEM）下发现3D打印自体骨中的细胞在形态上与成骨细胞类似,3D打印nHA骨中的细胞仍保持BMSCs的细胞形态,3D打印异体骨中的细胞则出现老化迹象。【结论】（1）3D打印自体骨对自体BMSCs具有良好的细胞亲和性;（2）自体BMSCs在3D打印自体骨中有自发向成骨细胞分化的可能;（3）自体BMSCs与3D打印自体骨结合有望构建出具有骨再生能力的多元个性化自体骨植入物。第四部分3D打印自体骨中自体BMSCs的体外成骨能力研究【目的】明确3D打印自体骨中自体BMSCs自发向成骨细胞分化的能力,为具有骨再生能力的多元个性化3D打印自体骨构建提供分子生物学支持。【方法】于不同时间点对3D打印自体骨中的BMSCs进行ALP活性检测;分别于培养7d、14d及21d应用实时定量聚合酶链式反应进行runt相关转录因子2（RUNX2）、ALP、I型胶原α1片段（COL1A1）、骨桥蛋白（OPN）和骨钙蛋白（OCN）等成骨分化相关基因表达检测;3D打印nHA骨及3D打印异体骨设为对照组。【结果】在没有外源性成骨因子的情况下,3D打印自体骨中细胞的ALP活性更早、更显着的升高;RUNX2、ALP、COL1A1、OPN和OCN等成骨分化相关基因表达的变化趋势均提示3D打印自体骨中的自体BMSCs更易自发向成骨细胞分化。【结论】（1）3D打印自体骨中的自体BMSCs能更好地自发向成骨细胞分化;（2）3D打印自体骨和自体BMSCs为构建多元个性化自体骨提供了良好的分子生物学基础。第五部分多元个性化3D打印自体骨修复兔颅骨极限缺损的骨再生研究【目的】结合3D打印自体骨及自体BMSCs,构建多元个性化3D打印自体骨;通过兔颅骨极限缺损模型验证这种多元个性化植入物在体内的骨再生能力。【方法】建立兔颅骨极限缺损模型;按上述方法制备3D打印自体骨并提取自体BMSCs;将自体BMSCs种植于3D打印自体骨构建多元个性化骨植入物;建模1月后将多元个性化自体骨回植,3个月后收获标本;通过微型计算机断层扫描（MicroCT）分析新骨矿化,通过HE染色、Masson三色染色、I型胶原和OCN免疫组化分析进一步评估新骨生成情况,通过血管性血友病因子（vWF）免疫荧光分析评估新骨血管生成情况;同样方法应用于无细胞的3D打印自体骨、携带细胞及无细胞的3D打印nHA骨以对比评估其体内成骨能力。【结果】Micro-CT分析结果提示多元个性化自体骨能更有效的促进矿物形成和沉积进而形成矿化新骨;HE染色显示植入物内部的新生骨围绕打印纤维丝生成,并在新骨边缘可观察到明显的活跃成骨细胞;新骨大部分被Masson三色染色染成红色,提示新骨为成熟骨;新生骨的I型胶原免疫组化染色呈阳性;OCN免疫组化染色在新生骨内部及边缘均呈阳性,提示新骨仍处于成骨的活跃状态;vWF免疫荧光染色显示部分成熟骨生成了内生性血管;无细胞3D打印自体骨的打印纤维丝周围也有新骨生成,但骨成熟度和成骨活性均弱于多元个性化自体骨;在3DP打印nHA骨中只观察到一点初始形成的类骨组织,并且当结合BMSCs时只形成了极少量的新骨。【结论】（1）多元个性化自体骨具有良好的天然骨再生能力,具备了患者特异性骨再生植入物的基本特性;（2）这种多元个性化颅骨植入物的制造为实现真正患者特异性的颅骨缺损修复再生提供了可行性;（3）无细胞3D打印自体骨的骨再生能力较弱,可作为多元个性化自体骨的次选方案。
李林峰,李月,李瑞玉,郝跃玲,李蒙,张俊会,党莹,李兵,王文杰[7]（2017）在《骨移植和组织工程支架材料在上颌窦提升口腔种植修复中的应用》文中研究指明背景:骨萎缩和上颌窦的持续气化可以引起上颌骨后牙的高度不足,在此部位进行牙种植体植入非常困难,增加上颌骨的骨量将有利于种植体植入物,采用骨移植材料进行上颌窦提升以弥补骨量不足是目前公认的方法。目的:分析骨移植材料、人工作骨材料以及组织工程支架材料在上颌窦提升中的应用效果。方法:以"上颌窦提升,种植体,自体骨,异体骨,人工骨,组织工程支持材料"为中文关键词,以"maxillary sinus elevation,dental implants,autologous bone,allograft,artificial Bone,scaffold"为英文关键词检索PubMed和万方数据库有关上颌窦提升移植材料应用的相关文献,分析各移植材料对上颌窦提升后新骨形成、种植体稳定性和骨-种植体结合率的影响。结果与结论:自体骨是上颌窦提升中骨移植材料的金标准,可保证种植体周围骨量及种植的长期稳定性,但自体取骨造成供区二次损伤,容易产生感染。同种异体骨可作为自体骨的替代材料,可生成新生骨并保证种植体植入,达到足够的稳定性。人工骨材料如羟基磷灰石、β-磷酸三钙、双相复合磷酸钙等具有良好的骨传导性,可达到高骨-种植体接触率。组织工程骨移植物将干细胞、细胞因子与生物支架材料相结合用于上颌窦提升,可促进新骨形成,提高骨量,使种植体成功植入且稳定性良好。
张军[8]（2008）在《再血管化坏死骨修复胫骨骨髓炎骨缺损的实验研究》文中研究指明一实验目的临床高能量损伤造成的开放性骨折常发生骨髓炎并骨质外露坏死,手术清创后常造成节段性骨缺损。感染性骨缺损的修复重建非常困难。我们试图通过模拟临床创伤后骨髓炎的发病机制建立动物模型,在此模型基础上以骨髓炎坏死皮质骨为研究对象,制备出部分脱钙骨基质并设法恢复其血运,同时结合显微外科技术来修复胫骨感染性骨缺损。二实验方法:（一）第一部分伴软组织缺损的创伤后骨髓炎皮质骨坏死动物模型的创建。以雄性Wistar大鼠为研究对象,随机分为两组,实验组和对照组各10只,共20只。在大鼠胫骨干制造4mm×8mm皮质骨缺损,将3×106cfu金黄色葡萄球菌和异物（纱布）接种到胫骨骨缺损处髓腔内,并将游离骨块回植到缺损区,外翻缝合软组织使骨质外露,对照组不接种金葡菌。术后2W、4W观察记录一般情况,行放射学、病理组织学检查。定量数据采用SPSS 12.0统计软件处理。术后通过病理组织学和放射学方法评价骨髓炎及骨坏死的情况。（二）第二部分大鼠骨髓炎坏死皮质骨脱钙骨基质制备及理化性质和生物力学测定。以大鼠骨髓炎坏死皮质骨和正常新鲜皮质骨作为研究对象,按改良Urist法将骨髓炎坏死皮质骨经脱钙脱脂处理得到部分脱钙骨基质,扫描电镜观察测量其孔隙度,全自动生化分析仪测量其钙含量并计算脱钙率,生物力学仪测量其形变—负荷曲线。（三）第三部分自体骨髓炎坏死皮质骨脱钙骨基质再血管化并修复骨缺损的实验研究。以骨髓炎骨坏死模型造模后的雄性Wistar大鼠为研究对象,随机分成两大组,腹部包埋组:其中实验组和对照组各9只,共18只;骨缺损修复组22只,共40只。所有大鼠取腹部切口显露腹壁浅动脉,将骨髓炎坏死皮质骨部分脱钙骨基质灭菌后,无菌条件下包埋于双侧腹壁浅动脉肌瓣中,对照组将未脱钙坏死皮质骨包埋于相同肌瓣中。腹部包埋组术后1W、2W、4W实验组和对照组各处死3只动物,取材行病理组织学检查观察血管化情况。骨缺损修复组22只大鼠于腹壁浅动脉肌瓣包埋后2W,将部分血管化的坏死皮质骨脱钙骨基质连同腹壁浅动脉带蒂肌瓣转移填充于胫骨骨髓炎骨缺损处,术后4W、8W、12W行经放射学和病理组织学检查骨髓炎及缺损修复情况。三结果（一）第一部分实验组大鼠术后体重下降,体温和WBC升高,放射学检查见髓腔内骨质破坏,骨皮质变薄,骨膜反应和软组织肿胀阴影,部分出现病理性骨折。病理组织学见髓腔内大量炎细胞浸润,骨小梁部分溶解、吸收、稀疏、坏死,骨细胞坏死,骨陷窝空虚。对照侧仅表现为轻微的炎症反应,无明显骨髓炎征象。（二）第二部分骨髓炎坏死皮质骨经脱钙脱脂后形成部分脱钙骨基质,平均钙含量为92.17±0.54 mg/g,脱钙率为38.1%。扫描电镜显示:坏死皮质骨脱钙骨基质表面凹凸不平,包含两种微孔结构,直径在7～15μm和0.1～0.4μm之间,微孔之间相互沟通共同形成筛孔样结构,与正常新鲜皮质骨DBM比较,无明显差异。生物力学测定:形变与负荷呈函数关系,随着负荷增加,形变逐渐增加,形变一负荷表现为一条平缓的上升曲线,与新鲜皮质骨形变-负荷曲线比较接近。（三）第三部分腹部包埋实验组1W时,部分脱钙骨基质内大量骨细胞坏死,骨陷窝空虚,周围肌肉组织中炎细胞浸润。2W时,哈弗氏管内偶见血管长入,主要集中在表层组织内,骨陷窝内仍空虚,无细胞或血管。4W时少许血管长入,仍以集中在表层为主,血管直径不等,分布不均,骨陷窝内可见成骨细胞,分布密度不均,无特征性骨结构。对照组2W,4W坏死皮质骨组织内均未见血管长入。骨缺损修复组术后4W,脱钙骨基质内出现了软骨化生,周围被纤维细胞包绕,靠近骨髓腔一侧可见炎细胞浸润。术后8W:部分脱钙骨基质大量软骨化,外层包被纤维组织和肌肉。术后12W:部分脱钙骨基质出现不同程度的软骨化和骨化,靠近干骺端一侧骨化明显,出现部分类似骨小梁的结构。放射学显示胫骨缺损修复区4W时,胫骨缺损清晰可见,移植组织密度低,无钙化征象。8W时,胫骨缺损仍清晰可见,移植组织密度低,无明显钙化征象,周围组织硬化,骨膜增生。12W时,胫骨缺损稍模糊,移植组织密度稍增高,与周围骨质有部分连接。四结论（一）第一部分大鼠胫骨造成皮质骨缺损并接种金葡菌和异物,骨块回植并骨外露,可以成功建立伴软组织缺损的创伤后骨髓炎皮质骨坏死动物模型。细菌、异物、创伤是建立此模型的必要条件,软组织外翻缝合骨外露更接近临床伴有软组织缺损的创伤后骨髓炎的实际情况。（二）第二部分创伤后骨髓炎坏死皮质骨经脱钙脱脂处理后可得到部分脱钙骨基质,既有三维的网状孔隙结构,又保持了一定的生物力学强度,既脱去部分钙质,暴露出骨基质中的细胞因子,又因源于自体组织不存在免疫排斥反应,具备了DBM的基本特性,并有独特的优点,具备再血管化可能和修复骨缺损的潜能。（三）第三部分自体骨髓炎坏死皮质骨部分脱钙骨基质包埋于自体腹壁浅动脉肌瓣中可以再血管化。部分血管化的坏死皮质骨脱钙骨基质连同腹壁浅动脉带蒂肌瓣转移填充于胫骨骨髓炎骨缺损,可以改善局部血运并修复骨髓炎骨缺损。
任民[9]（2008）在《DBM/rhBMP-2/CPC复合材料修复大段长骨缺损的实验研究》文中认为目的骨缺损修复是当前骨科临床上常见的难题,长期以来,人们寻求一种良好的人工替代材料用来修复骨缺损,但结果不理想。本实验制备脱钙骨基质颗粒（DBM）/磷酸钙骨水泥（CPC）/重组人骨形成蛋白-2（rhBMP-2）的复合材料,探讨其力学性能、结构特征和生物相容性,找出该复合材料的最佳配方。进一步观察复合材料植入骨缺损内的超微结构、X线及组织学特征,评价该材料修复大段长骨缺损的能力和降解性能,为临床应用和批量化生产提供依据。方法:（1）预制兔DBM,用吸附法将rhBMP-2与DBM复合后,按DBM :复合材料的质量比为分别是0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6,0.7的配方与CPC复合,制备的复合材料含rhBMP-2的量约1.2×106 mg/ m3。（2）将DBM质量比为分别是0.1,0.2,0.3,0.4复合材料行体外抗压强度测定和扫描电镜（SEM）观察,探讨其力学性能、结构特征,找出该复合材料的最佳配方。（3）通过毒性实验、凝血实验、溶血实验、热原实验和肌肉植入实验评价材料的生物相容性。（4）将DBM质量比为0.2的柱状复合材料植入兔股骨髁部0.5cm缺损,术后6、12、24周处死取材进行组织学和扫描电镜观察,评价其成骨性能。（5）将质量比为0.2和0.3的柱状复合材料植入兔1.5cm长桡骨缺损和股骨髁部缺损,术后6、12、24、36周观察X线征象、组织学形态及超微结构,评价其修复大段长骨缺损的能力和降解性能。结果:（1）DBM的质量比在0.2～0.4的范围内,复合材料中存在较多100μm以上的不规则裂隙。DBM的质量比≤0.1时,材料内部的大部分间隙<100μm。DBM的质量比≥0.5时,DBM和CPC丧失结合及塑型能力。随DBM质量比的增加,材料抗压极限强度递减,质量比为0.1,0.2,0.3,0.4的抗压极限强度分别为（8.12±0.79）MPa,（5.46±1.13）MPa,（5.13±1.18）MPa,（1.49±0.61）MPa。各组数据经方差分析,有统计学差异（P<0.05）,其中质量比为0.2,0.3两组比较无统计学差异（P>0.05）,而（1.49±0.61）MPa小于人体松质骨的平均抗压强度。（2）复合材料具有良好的生物相容性。（3）组织学和扫描电镜观察见:复合材料植入股骨髁部缺损后第6周复合材料-骨界面模糊,宿骨发出纤维连续通过界面,编织骨样结构开始向材料内部长入。第12周血管和成骨细胞在复合材料内部形成。第24周骨缺损已修复,形成骨性连接,材料大部分被新骨替代。（4）将复合材料植入兔1.5cm长桡骨缺损,X线示:第6周复合材料-骨界面模糊,周围有骨痂再生。第12周骨痂生长丰富,材料-骨界面消失,材料被降解失去原有外形。第24周材料被降解更明显,髓腔开始再通。第36周材料被新骨替代,髓腔再通。组织学检查也支持此结果。复合材料植入兔股骨髁部缺损,X线示:第6周～24周,材料逐渐被降解,密度逐渐降低。扫描电镜观察结果也得出同样的结论。结论:随着DBM质量比的增加,孔隙越丰富而材料力学强度逐渐降低。DBM质量比为0.2～0.3的复合材料可用于修复低承重部位松质骨的骨缺损。复合材料具有良好的生物相容性,植入骨缺损内可以促进细胞、血管、新骨的长入、易降解和被自体骨替代,能够用于修复大段骨缺损。
梁文杰[10]（2007）在《猪骨髓间充质干细胞成骨诱导分化后免疫原性的实验研究》文中指出研究背景及意义:严重创伤、感染、肿瘤等原因所致的骨缺损在临床治疗中非常常见。目前常用的治疗方法是植骨术,而严重的骨缺损用现有的方法难以获得满意的疗效,骨组织工程的兴起为解决大段骨缺损的难题提供了新的途径。骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cell,MSCs）被认为是骨组织工程最佳的种子细胞。因为这种细胞取材方便,可通过穿刺获得,创伤小,取材后并发症少,细胞培养增殖快,在体内外成骨诱导环境下可分化为骨组织,而且具有多向分化潜能;此外,MSCs也容易分离和培养。尽管自体MSCs或成骨细胞用于动物及临床个体化治疗已经取得了良好的结果,但MSCs在骨髓中含量很少,并随着年龄的增长减少;现有方法体外迅速扩增困难。而且一些自身免疫性疾病患者,其MSCs增殖能力明显减弱。随着培养代数增加可能出现“反分化”现象和致瘤性,从而失去了细胞应有的功能和安全性。因此,自体骨髓间充质干细胞的应用会受来源和数量限制,难以满足临床“随取随用”的要求。建立同种异体MSCs种子细胞库是解决这些问题的捷径,也是组织工程从实验室走向产业化的重要前提。近年来,国内外研究发现MSCs具有免疫调节作用,已往低等级动物模型也证明同种异体种子细胞及其构建的组织工程肌腱、软骨、骨组织植入体内免疫反应轻微,不足以影响工程化组织植入体内后的修复功能。因此,同种异体骨组织工程研究前景充满潜力和希望。目的:（1）猪骨髓分离培养MSCs并在体外诱导成骨细胞,并对其细胞生物学特性进行观察,探讨MSCs最佳的培养方法和条件;（2）研究MSCs成骨诱导分化后在不同条件下对外周血单个核细胞增殖的影响及细胞因子分泌情况;研究MSCs免疫原性及IFN-γ对其免疫原性的影响,探讨MSCs免疫调节机制,为体内实验提供依据;（3）成骨诱导分化后MSCs与脱钙骨基质材料复合构建组织工程骨,植入猪皮下并和单纯脱钙骨基质材料植入进行比较,以了解同种异体组织工程骨在体内的免疫排斥反应程度及异位成骨能力。从而了解以MSCs为种子细胞的同种异体组织工程骨移植的可行性。方法: 1.猪骨髓间充质干细胞生物学特性（1）无菌条件下在小香猪髂嵴处穿刺抽取2-5m1骨髓,经密度梯度离心分离提纯MSCs,分别培养在含5%胎牛血清的A-DMEM培养液和10%胎牛血清F12-DMEM培养液里。观察第3d、第5d的CFU-F数量、最大传代次数、细胞长满时间、FACS检测第3代细胞的CD14、CD29、CD44、CD45、SLA-I、SLA-II表达。（2）比较MSCs及DOC细胞贴壁率、生长曲线、生长周期。（3）用碱性磷酸酶染色、Von-Kossa染色、茜素红法、骨钙素免疫组化染色鉴定成骨诱导分化后的MSCs。2.猪骨髓间充质干细胞成骨诱导分化后免疫原性实验研究（1）以未分化的骨髓间充质干细胞为对照,采用流式细胞技术分别检测未诱导、成骨诱导的MSCs、MSCs+IFN-γ、DOC+IFN-γSLA分子的表达;（2）采用RT-PCR技术分别检测DOC、未分化的MSCs、MSCs+IFN-γ组、DOC+IFN-γ的SLA基因表达情况;（3）采用混合淋巴反应观察①不同数量级的DOC对PBMC增殖的影响;②DOC对经丝分裂原刺激的PBMC增殖的影响;③DOC经IFN-γ预处理后体外对单向混合淋巴反应体系影响;④DOC经IFN-γ预处理后体外对双向混合淋巴反应体系的影响。（4）检测MSCs和DOC未经过和经过IFN-γ处理后其培养上清TGF-β1和IL-10的分泌情况3.同种异体组织工程骨猪皮下植入免疫排斥及异位成骨实验研究（1）对新鲜猪胫骨采用脱脂、脱钙、脱蛋白方法制备猪DBM材料并在光镜下和电镜下观察形态学和组织学结构;（2）体外组织工程骨构建并在光镜下和电镜下细胞附着,生长,基质分泌情况。（3）以DBM材料为对照,将同种异体组织工程骨植入15头免疫功能健全的异体小香猪背侧脊柱旁左侧皮下作为实验组,对侧植入单纯的脱钙骨基质猪皮下,采用HE和Masson染色观测1w、2w、4w、8w、12w异位成骨情况,并用ELISA法检测术后局部组织和外周血1w、2w、4w、8w、12w的IL-2及其TNF-α表达水平。结果:1.猪骨髓间充质干细胞及成骨诱导分化后生物学特性（1）在A-DMEM与F12-DMEM培养液培养的MSCs具有相同特征:细胞呈纺锤形或三角形,类似纤维细胞,旋涡样排列;第3代细胞FACS检测结果显示:分离培养的细胞CD29、CD44、SLA-I表达强阳性,而CD14、CD34、SLA-II阴性。与F12-DMEM培养液培养的MSCs相比,A-DMEM培养的MSCs、原代培养3d、5d贴壁生长的细胞克隆数较多、原代细胞生长至80-100%所需时间较短,最大传代次数多。（2） MSCs及DOC细胞贴壁率无明显差别,生长曲线MSCs倍增时间为36.8h,DOC为38.9h。MSCs和DOC细胞周期比较,MSCs细胞周期中S+G2比例较多,G1比例较少。表明:MSCs生长增殖速度较DOC快。（3）成骨诱导14d,Von-Kossa染色见细胞间质有大量的钙盐沉积;ALP染色显示细胞呈85%阳性;茜素红法见到团块状细胞中有钙盐沉积;免疫细胞化学检测见到骨钙素阳性表达细胞。2.猪骨髓间充质干细胞成骨诱导分化后免疫原性实验研究（1） FACS检测结果显示:MSCs+IFN-γ组、DOC+IFN-γ组SLA-I表达上调（P<0.05）,SLA-II表达明显上调（P<0.01）。（2） RT-PCR结果显示:DOC组、MSCs+IFN-γ组、DOC+IFN-γ组SLA-I（P1,P14）表达上调（P<0.05）,SLA-II（DRA,DRB,DQA,DQB）表达明显上调（P<0.01）。（3）①大于1×104数量级以上DOC不能刺激PBMC增殖,低于1×104数量级对PBMC有增殖作用。抑制作用与细胞数量成正相关。②DOC能抑制经PHA刺激的PBMC增殖。③DOC经IFN-γ预处理后仍然能抑制PHA和Con-A刺激的PBMC增殖。④DOC经IFN-γ预处理后体外对双向混合淋巴反应体系（hPBMC+pPBMC）PBMC增殖有抑制作用。（4） MSCs和DOC均能分泌TGF-β1和IL-10,DOC分泌的IL-10水平高于MSCs（P<0.01）,但经IFN-γ刺激后,MSCs分泌的TGF-β1水平明显高于未经IFN-γ刺激的MSCs,而经IFN-γ刺激后DOC分泌的TGF-β1明显低于未经IFN-γ刺激的DOC。3.同种异体组织工程骨猪皮下植入免疫排斥及异位成骨实验研究（1）制备猪DBM材料保持天然的网状结构;（2）成骨诱导分化后MSCs与脱钙骨基质材料复合7天显示细胞附着于材料表面和孔隙内壁,并分裂增殖数目倍增。SEM观察,细胞排列规则,周围有细胞外基质分泌。（3）所有小香猪术后无发热、畏寒等全身反应。取材所见术后1、2、4周双侧植入物周围均见轻微组织反应,但于8、12周逐渐消失。组织学观察,异位成骨以软骨内化骨为主。结论:（1）猪MSCs成骨能力强,在成骨诱导条件下可向成骨细胞分化,表达碱性磷酸酶和骨钙素,具有作为种子细胞的潜力。（2）体外实验表明猪MSCs的诱导成骨后仍保持低免疫原性,在炎前细胞因子刺激下其免疫原性可能增强,但其可能通过分泌一些具有免疫调节作用的细胞因子来调控免疫反应。（3）体内实验表明同种异体组织工程骨植入具有较好的异位成骨效果。但早期可引发宿主轻微的免疫反应,但随时间延长,免疫反应逐渐消失。总之,同种异体MSCs作为种子细胞与DBM材料复合培养可能是体外组织工程骨构建的一种较好选择。
二、微孔同种异体表面脱钙骨基质明胶诱导成骨能力的实验研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、微孔同种异体表面脱钙骨基质明胶诱导成骨能力的实验研究（论文提纲范文）
（1）含稀土碳酸化羟基磷灰石材料的制备及其应用于骨修复的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 口腔颌面部骨的形成和缺损修复 |
| 1.1.1 口腔颌面部骨的形成与自修复过程 |
| 1.1.2 口腔颌面部骨缺损疾病的治疗方法 |
| 1.2 口腔颌面部骨组织工程概述 |
| 1.2.1 骨组织工程中的种子细胞 |
| 1.2.2 骨组织工程中常用的生长因子及其功能简介 |
| 1.2.3 骨组织工程中常用的支架体系 |
| 1.3 骨缺损修复材料简介 |
| 1.3.1 骨修复材料的研究现状及性能要求 |
| 1.3.2 天然及人工合成的骨修复材料 |
| 1.3.3 骨组织中的羟基磷灰石 |
| 1.3.4 用于骨再生的支架材料 |
| 1.3.5 稀土在生物医学材料中的作用 |
| 1.4 本论文的设计思路和技术路线 |
| 1.4.1 设计思路 |
| 1.4.2 技术路线 |
| 第二章 碳酸化及稀土掺杂的羟基磷灰石仿生骨粉的制备 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验仪器与试剂 |
| 2.2.1 仪器 |
| 2.2.2 试剂 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 钙-磷-碳酸体系的热力学平衡相图计算 |
| 2.3.2 碳酸化羟基磷灰石纳米骨粉的制备 |
| 2.3.3 碳酸化羟基磷灰石纳米骨粉的结构表征 |
| 2.3.4 碳酸根取代度的确定 |
| 2.3.5 形貌与化学组成分析 |
| 2.3.6 碳酸化羟基磷灰石纳米骨粉的稀土荧光标记检测 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 模拟生物矿化环境下的钙-磷-碳酸根热力学平衡相图与矿化因素 |
| 2.4.2 碳酸化羟基磷灰石材料的结构 |
| 2.4.3 碳酸化及矿化环境调控对羟基磷灰石形貌的影响 |
| 2.4.4 碳酸根取代度的确定 |
| 2.4.5 稀土离子标记的碳酸化羟基磷灰石可控制备及光谱性质 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 小鼠胚胎成骨细胞前体细胞实验检测稀土掺杂及碳酸根取代的羟基磷灰石材料的生物学性能 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.1 实验试剂 |
| 3.2.2 实验仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 MC3T3-E1 细胞培养 |
| 3.3.2 使用荧光染色观察细胞形态 |
| 3.3.3 使用CCK-8 法检测细胞增殖 |
| 3.3.4 使用活细胞/死细胞染色检测细胞的生长活性 |
| 3.3.5 使用碱性磷酸酶染色检测ALP活性 |
| 3.3.6 使用ALP定量检测试剂盒检测ALP活性 |
| 3.3.7 茜素红染色检测细胞形成的钙结节 |
| 3.3.8 Western blot检测各组材料对细胞成骨分化的影响 |
| 3.3.9 使用三维打印机打印支架 |
| 3.3.10 支架的形貌及成份表征 |
| 3.3.11 扫描电镜检测细胞在支架上的黏附 |
| 3.3.12 使用CCK-8 检测细胞在支架上的增殖 |
| 3.3.13 使用活细胞/死细胞染色检测细胞在支架上的生长活性 |
| 3.3.14 使用ALP染色检测支架上细胞的ALP活性 |
| 3.3.15 统计学分析 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 MC3T3-E1 细胞的培养 |
| 3.4.2 各组材料浸提液对细胞形态的影响 |
| 3.4.3 各组材料浸提液对细胞增殖的影响 |
| 3.4.4 各组材料浸提液对细胞生长活性的影响 |
| 3.4.5 各组材料浸提液对细胞ALP染色的影响 |
| 3.4.6 各组材料浸提液对细胞ALP活性影响的定量分析 |
| 3.4.7 各组材料浸提液对细胞体外矿化的影响 |
| 3.4.8 各组材料浸提液对细胞分泌成骨特异性蛋白的影响 |
| 3.4.9 三维打印支架的宏观外形 |
| 3.4.10 三维打印支架的微观形貌、组分表征 |
| 3.4.11 细胞在各组三维打印支架上的黏附 |
| 3.4.12 细胞在各组三维打印支架上的增殖 |
| 3.4.13 细胞在各组三维打印支架上的生长活性 |
| 3.4.14 细胞在各组三维打印支架上的ALP活性 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 稀土掺杂及碳酸根取代的羟基磷灰石支架促大鼠颅骨缺损修复的实验研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 试剂 |
| 4.2.2 仪器 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 大鼠颅骨缺损模型建立及分组 |
| 4.3.2 术后大体观察 |
| 4.3.3 术后影像学观察 |
| 4.3.4 组织学观察染色 |
| 4.3.5 Masson染色 |
| 4.3.6 体内生物安全性评价 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 大鼠临界骨缺损模型的建立 |
| 4.4.2 动物处死后标本的获取 |
| 4.4.3 动态Micro-CT观察缺损颅骨的修复 |
| 4.4.4 术后组织学检测 |
| 4.4.5 Masson染色表征 |
| 4.4.6 支架促血管再生 |
| 4.4.7 支架的体内安全性结果分析 |
| 4.4.8 支架促成骨性能讨论 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 结论与展望 |
| 5.1 本论文的主要创新点 |
| 5.2 全文结论 |
| 5.3 展望 |
| 参考文献 |
| 作者简介及科研成果 |
| 致谢 |
（2）不同浓度多聚赖氨酸溶液对同种异体骨进行表面改性的实验研究（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 兔同种异体骨的表面改性和分组 |
| 1.2.2 兔骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchy-mal stem cells,BMSCs)的分离与扩增 |
| 1.2.3 BMSCs的种植、诱导和培养 |
| 1.2.4 MTT比色试验检测BMSCs黏附、增殖的情况 |
| 1.2.5 检测各组同种异体骨内黏附细胞表达ALP的活性 |
| 1.3 统计学处理 |
| 2 结果 |
| 2.1 BMSCs在同种异体骨内的增殖情况 |
| 2.2 细胞表达ALP的活性比较 |
| 3 讨论 |
（3）应用Masquelet技术治疗大段骨缺损减少自体骨用量的可能性（论文提纲范文）
| 文章快速阅读： |
| 文题释义： |
| 0引言Introduction |
| 1 资料和方法Data and methods |
| 1.1 资料来源 |
| 1.2 入选标准 |
| 1.3 排除标准 |
| 1.4 质量评估 |
| 2 结果Results |
| 2.1在保证避免过大副损伤的情况下增加取骨部位 |
| 2.2 自体骨与同种异体骨混合移植 |
| 2.3 人工骨与自体骨混合移植 |
| 2.3.1 磷酸钙骨水泥 |
| 2.3.2 硫酸钙骨水泥 |
| 2.4 明胶海绵等物的巧妙使用 |
| 2.5使用内固定物减少骨缺损处自体骨使用量 |
| 2.6 骨运输技术的使用 |
| 2.7 3D打印微孔钛合金支架的应用 |
| 2.8 诱导膜技术联合自体腓骨移植 |
| 2.9 一些生长因子等添加剂及辅助设备的使用 |
| 2.1 0 组织工程技术与诱导膜 |
| 3 讨论与展望Discussion and prospects |
（4）不同骨移植材料在拔牙位点保存中的应用研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩写 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 拔牙后位点保存术中骨移植材料的选择 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（5）体外冲击波对兔同种异体骨异位再血管化与骨活性的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 1 实验材料 |
| 2 手术过程 |
| 3 术后处置 |
| 4 观察指标及方法 |
| 5 统计学分析 |
| 结果 |
| 1 大体标本观察结果 |
| 2 HE染色检测结果 |
| 3 CD34的荧光免疫染色检测结果 |
| 4 Ⅰ型胶原蛋白荧光免疫染色检测结果 |
| 5 骨源性碱性磷酸酶检测 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 综述:体外冲击波在骨肌病治疗的进展 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间发表文章情况 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（6）多元个性化3D打印自体颅骨的实现及其修复兔颅骨极限缺损的骨再生研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 文献回顾 |
| 1 颅骨修复材料的临床应用现状 |
| 1.1 自体骨瓣 |
| 1.2 钛网 |
| 1.3 聚甲基丙烯酸甲酯 |
| 1.4 聚醚醚酮 |
| 2 颅骨再生研究进展 |
| 2.1 磷酸钙 |
| 2.1.1 羟基磷灰石 |
| 2.1.2 磷酸三钙 |
| 2.1.3 双相磷酸钙 |
| 2.2 硫酸钙 |
| 2.3 生物活性玻璃 |
| 2.4 同种异体/异种骨基质 |
| 2.4.1 脱细胞骨基质 |
| 2.4.2 脱钙骨基质 |
| 2.5 植入物的微观结构对骨再生的影响 |
| 2.6 间充质干细胞 |
| 3 颅骨修复材料制造工艺进展 |
| 3.1 颅骨修复材料的传统制造方式 |
| 3.2 3D打印在颅骨修复材料中的应用 |
| 3.2.1 3D打印在生物医学中的应用 |
| 3.2.2 3D打印颅骨修复材料现状 |
| 3.3.3 3D打印在颅骨再生中的研究进展 |
| 3.3.4 3D打印可再生自体颅骨展望 |
| 第一部分 3D打印自体骨个性化外形与结构实现及特性研究 |
| 引言 |
| 1 材料和仪器 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 材料 |
| 1.3 配置试剂 |
| 1.4 实验仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 兔自体颅骨骨瓣获取 |
| 2.2 自体骨粉及骨浆料制备 |
| 2.3 3D打印骨模型的个性化结构、外形实现 |
| 2.4 3D打印自体骨特性研究 |
| 2.5 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 自体骨粉得率 |
| 3.2 自体骨粉微观形貌及粒度分布 |
| 3.3 自体骨浆料的打印可行性 |
| 3.4 3D打印自体骨结构个性化实现及冰乙酸PCL墨水多样性应用 |
| 3.5 3D打印骨模型的外形个性化实现 |
| 3.6 3D打印自体骨的外观和微观结构 |
| 3.7 3D打印自体骨的力学强度 |
| 3.8 3D打印自体骨的生物安全性 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分 自体BMSCS的分离、培养及多细胞分化潜能鉴定 |
| 引言 |
| 1 材料和仪器 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 材料 |
| 1.3 配置试剂 |
| 1.4 实验仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 单核细胞分离、BMSCs纯化培养 |
| 2.2 体外诱导BMSCs向多种细胞分化 |
| 3 结果 |
| 3.1 BMSCs的生长特性 |
| 3.2 BMSCs的多细胞分化潜能鉴定 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第三部分 3D打印自体骨对自体BMSCS的细胞亲和性研究 |
| 引言 |
| 1.材料和仪器 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 配置试剂 |
| 1.3 实验仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 3D打印自体骨上自体BMSCs的种植 |
| 2.2 3D打印自体骨自体BMSCs细胞粘附实验 |
| 2.3 3D打印自体骨中自体BMSCs增殖实验 |
| 2.4 3D打印自体骨中自体BMSCs细胞活力实验 |
| 2.5 3D打印自体骨种植自体BMSCs后的SEM形态学观察 |
| 2.6 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 自体BMSCs在3D打印自体骨中的粘附率 |
| 3.2 自体BMSCs在3D打印自体骨中的增殖特性 |
| 3.3 自体BMSCs在3D打印自体骨中的细胞活力 |
| 3.4 自体BMSCs在3D打印自体骨中的细胞形态 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第四部分 3D打印自体骨中自体BMSCS的体外成骨能力研究 |
| 引言 |
| 1 材料和仪器 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 配置试剂 |
| 1.3 实验仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 ALP活性检测 |
| 2.2 成骨相关基因表达检测 |
| 2.3 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 ALP活性分析 |
| 3.2 成骨相关基因表达分析 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第五部分 多元个性化3D打印自体骨修复兔颅骨极限缺损的骨再生研究 |
| 引言 |
| 1 材料和仪器 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 材料 |
| 1.3 配置试剂 |
| 1.4 实验仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 兔颅骨极限缺损造模及自体BMSCs提取 |
| 2.2 多元个性化3D打印自体骨制备 |
| 2.3 多元个性化3D打印自体骨回植及取样 |
| 2.4 Micro-CT检测新骨矿化 |
| 2.5 组织病理学检测 |
| 2.6 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 取材标本大体观察 |
| 3.2 新生骨矿化分析 |
| 3.3 新生骨组织形态(HE染色分析) |
| 3.4 新生骨成熟度评价(Masson染色分析) |
| 3.5 新生骨特异性标志物表达(I型胶原、OCN免疫组化分析) |
| 3.6 新生骨血管化评价(v WF免疫荧光分析) |
| 3.7 新生骨特点总结 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 个人简历和研究成果 |
| 致谢 |
（7）骨移植和组织工程支架材料在上颌窦提升口腔种植修复中的应用（论文提纲范文）
| 0引言Introduction |
| 1 资料和方法Data and methods |
| 1.1 资料来源 |
| 1.2 纳入与排除标准 |
| 1.3 数据提取 |
| 1.4 质量评价 |
| 2 结果Results |
| 2.1 自体骨和异体骨在上颌窦提升种植体植入中的作用 |
| 2.1.1自体骨 |
| 2.1.2异体骨 |
| 2.2 人工骨在上颌窦提升种植体植入中的作用 |
| 2.3 组织工程生物支架材料在上颌窦提升种植体植入中的作用 |
| 3 讨论Discussion |
（8）再血管化坏死骨修复胫骨骨髓炎骨缺损的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 伴软组织缺损的创伤后骨髓炎皮质骨坏死动物模型的创建 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附图及说明 |
| 第二部分 大鼠骨髓炎坏死皮质骨脱钙骨基质物理学及生物力学测定 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附图及说明 |
| 第三部分 自体骨髓炎坏死皮质骨脱钙骨基质再血管化并修复骨缺损的实验研究 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附图及说明 |
| 综述一 骨髓炎动物模型的研究 |
| 综述二 脱钙骨基质的研究进展 |
| 综述三、创伤后骨髓炎的病因分析和治疗对策 |
| 在读期间发表论文和参加科研工作的情况 |
| 致谢 |
（9）DBM/rhBMP-2/CPC复合材料修复大段长骨缺损的实验研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 文献回顾 |
| 一、骨缺损修复的历史及现状 |
| 二、脱钙骨基质的研究进展 |
| 三、生物活性因子的研究进展 |
| 四、磷酸钙骨水泥的研究进展 |
| 五、组织工程骨修复材料的研究进展 |
| 正文 |
| 实验一 异体脱钙骨基质/rhBMP-2/CPC 复合材料的制备 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验二 不同配方DBM/rhBMP-2/CPC 复合材料的物理结构特征和抗压强度 测定 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验三 自制DBM 和DBM/rhBMP-2/CPC 复合材料生物相容性实验 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验四 优化配方的DBM/rhBMP-2/CPC 复合材料植入兔股骨髁上缺损动物模型的成骨性能评价 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验五 优化配方的DBM/RHBMP-2/CPC复合材料对兔大段长骨缺损修复能力的长期观察及其降解性能的评价 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 实验结果图示 |
| 个人简历和研究成果 |
| 致谢 |
（10）猪骨髓间充质干细胞成骨诱导分化后免疫原性的实验研究（论文提纲范文）
| 英文缩写一览表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 论文正文 猪骨髓间充质干细胞成骨诱导分化后免疫原性的实验研究 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 猪骨髓间充质干细胞生物学特性 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第一部分照片 |
| 参考文献 |
| 第二部分 猪骨髓间充质干细胞成骨诱导分化后免疫原性实验研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 同种异体组织工程骨猪皮下植入免疫排斥及异位成骨实验研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第三部分照片 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 致谢 |
| 文献综述 骨组织工程移植免疫研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读博士期间发表情况 |
四、微孔同种异体表面脱钙骨基质明胶诱导成骨能力的实验研究（论文参考文献）
- [1]含稀土碳酸化羟基磷灰石材料的制备及其应用于骨修复的实验研究[D]. 刘鹏. 吉林大学, 2021(01)
- [2]不同浓度多聚赖氨酸溶液对同种异体骨进行表面改性的实验研究[J]. 笪虎,张建中,宋建宽,徐长明,熊卓. 局解手术学杂志, 2021(04)
- [3]应用Masquelet技术治疗大段骨缺损减少自体骨用量的可能性[J]. 王钊,闫石. 中国组织工程研究, 2020(24)
- [4]不同骨移植材料在拔牙位点保存中的应用研究[D]. 李淑君. 河北医科大学, 2020(02)
- [5]体外冲击波对兔同种异体骨异位再血管化与骨活性的影响[D]. 梁磊. 新乡医学院, 2019(06)
- [6]多元个性化3D打印自体颅骨的实现及其修复兔颅骨极限缺损的骨再生研究[D]. 陈红庆. 中国人民解放军空军军医大学, 2019(06)
- [7]骨移植和组织工程支架材料在上颌窦提升口腔种植修复中的应用[J]. 李林峰,李月,李瑞玉,郝跃玲,李蒙,张俊会,党莹,李兵,王文杰. 中国组织工程研究, 2017(34)
- [8]再血管化坏死骨修复胫骨骨髓炎骨缺损的实验研究[D]. 张军. 第二军医大学, 2008(01)
- [9]DBM/rhBMP-2/CPC复合材料修复大段长骨缺损的实验研究[D]. 任民. 第四军医大学, 2008(04)
- [10]猪骨髓间充质干细胞成骨诱导分化后免疫原性的实验研究[D]. 梁文杰. 第三军医大学, 2007(03)