一、NANOPARTICLE AS A NEW GENE TRANSFERRING VECTOR IN SPECIFIC EXPRESSION GENE（论文文献综述）
韩帅波[1]（2021）在《盐环境来源微生物多相分类及嗜盐古菌基因组适应性与演化研究》文中研究表明盐环境中的微生物因其独特的生理代谢类型和特殊的生命演化地位,受到人们的广泛关注。新疆阿尔金山无人区由于高山阻隔,气候恶劣,人迹罕至,其中古老而原始的微生物资源一直以来鲜有报道。本文以新疆阿尔金山高海拔盐湖为重点,以包括其在内的8个盐湖（阿牙克库木湖、卡尔敦湖、龙尾错、销库尔咸湖、玛纳斯湖、巴里坤湖、运城盐湖和吉林碱湖）为研究对象,研究盐湖中的微生物群落结构并挖掘其中嗜盐微生物资源,对分离到的6株嗜盐微生物进行了多相分类学研究。此外,对38株嗜盐古菌模式菌株进行了全基因组测序,并对其中一株的基因组环境适应性和基因演化进行了深入探讨。本论文运用非培养的宏基因组方法,对阿牙克库木湖和玛纳斯湖的微生物群落结构进行分析,发现在阿牙克库木湖中,细菌是优势类群,红杆菌目在目水平丰度最高,而在玛纳斯湖中,嗜盐古菌是优势类群,盐红菌属在属水平丰度最高。运用可培养的方法,共分离纯化得到403株嗜盐微生物,包括191株嗜盐古菌和212株嗜盐细菌,其中嗜盐古菌疑似新分类单元8个,嗜盐细菌疑似新分类单元17个。在群落分析中,发现玛纳斯湖和运城盐湖,销库尔咸湖与运城盐湖的嗜盐古菌群落结构较为类似;卡尔敦湖、阿牙克库木湖和龙尾错这三个高海拔盐湖的细菌群落结构相似,优势类群均为海杆菌属菌株,而海杆菌属的物种大部分直接或间接来自海洋,在远离海洋、人迹罕至的高原盐湖中发现如此之多的海杆菌属菌株,可能是继喜马拉雅山脉发现海洋鱼类化石后,青藏高原海洋起源假说的又一力证,在地球物种演化研究上具有一定的科学意义。对分离自不同盐环境的6株嗜盐微生物进行了多相分类学研究,建立了2个新属（Salilacivita gen.nov.和Ayaqqumibacter gen.nov.）和6个新种（Salilacivita planktonica、Ayaqqumibacter halotolerans、Wenzhouxiangella salilacus、Rhodohalobacter barkolensis、Marinobacterium zhoushanense和Terasakiella brassicae）。在属和种的水平增加了新的分类单元,丰富了嗜盐微生物资源,为后续的研究提供物种材料和参考信息。对38株嗜盐古菌模式菌株进行了全基因组测序,共获得9个高质量基因组完成图和29个草图,极大地丰富了嗜盐古菌模式菌株的基因组数据资源,并对其中Salinigranum rubrum GX10T基因组的环境适应性与基因演化进行了深入分析。菌株GX10T的基因组由一个环状染色体和5个环状质粒组成。在其基因组中存在大量K+和Na+转运蛋白编码基因以及相容性溶质的吸收和合成相关的基因,使其能够保持细胞内外的渗透压平衡。偏酸性的蛋白质等电点使得其细胞内的生物大分子在高盐环境下依旧能够保持稳定的结构。该菌株拥有光修复、切除修复、错配修复和重组修复等完善的DNA修复系统,可以对紫外辐射导致的受损DNA进行修复。该菌株基因组中含有大量重金属抗性和代谢相关的基因,可能有助于降低重金属对菌体的毒害作用。其基因组中含有多个CRISPR位点和多种类型的Cas蛋白编码基因,共同组成CRISPR-Cas系统,来降解侵入细胞内的噬菌体和外源DNA,维持基因组的稳定。运用基于系统发育树的方法,对该菌株中的新基因进行注释和分析,发现大部分新基因形成于热原菌纲和嗜盐菌纲的物种分化过程中。此外,该菌株基因组也还存在有编码丝氨酸蛋白酶、α-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、脂肪酶、酯酶、内切葡聚糖酶等工业用酶和PHA合成途径的全部基因,表明菌株GX10T还具有较大的生物技术应用潜力。新疆高海拔盐湖嗜盐微生物资源的研究鲜有报道,本研究通过非培养和可培养方法揭示了其微生物群落组成以及特有的群落类型,加深了对特殊环境下微生物分布的认识。对6株疑似新分类单元进行了多相分类学研究,丰富了嗜盐微生物物种资源。对38株嗜盐古菌模式菌株进行全基因组测序,为后续分类学、比较基因组学和生物技术利用奠定数据基础。对菌株S.rubrum GX10T的环境适应性和基因演化分析,则进一步加深了对生命在极端环境下生存机制和演化历史的理解。
潘香羽[2]（2020）在《反刍动物瘤胃功能进化的遗传基础及与微生物互作的研究》文中指出研究动物复杂器官功能形成的遗传进化基础是认识复杂生命的重要途径。反刍动物因其独特的前胃发酵系统和反刍行为而得名,其瘤胃是前胃发酵系统的主要器官,它与微生物的紧密协作,使得反刍动物具有了高效消化植物纤维的能力并因此获得了独特的进化优势,促进了反刍动物类群的繁盛和多样性。有关瘤胃功能的基因表达特征已经取得一定进展。然而,关于瘤胃的功能创新的遗传进化机制仍有待研究。因此,本研究利用反刍动物比较基因组、比较转录组和功能验证对反刍动物瘤胃的功能创新进行了探究,并利用瘤胃壁多个发育时间点的转录组和瘤胃内容物的宏基因组数据对早期瘤胃发育重编程的功能建立过程与微生物功能互作的关系进行了深入的研究,包括瘤胃结构和功能相关基因的筛选、进化关键候选基因的识别和功能验证及瘤胃基因表达动态、微生物演替及两者的功能相关性三个部分。1.本研究收集了反刍动物类群所在的鲸偶蹄目的50种组织的897个转录组数据,包括255个本研究首次获得的样本和642个下载自公共数据库的样本,覆盖鲸偶蹄目中的三个拥有多胃室结构的亚目,包括反刍亚目的绵羊和狍子、胼足亚目的双峰驼及鲸河马亚目的布氏鲸和江豚,用于识别瘤胃功能创新的候选基因。首先,利用本研究开发的一个组织特异表达基因筛选指标E50,鉴定到655个瘤胃相对其他组织高表达的基因。其中14.7%的基因来自食道组织,其余的大部分是从表皮、免疫和消化代谢等相关组织中募集的,这些基因参与的功能通路都与瘤胃已知的功能高度相关。其次,通过比较骆驼、鲸豚和反刍动物的第一胃室的表达谱,发现它们与各自食道组织的表达最相似,三个类群第一胃室共享的基因参与表皮发育分化等功能。瘤胃相比其它物种的第一胃室表达上调427个基因,主要参与酮体代谢和调控微生物等功能相关通路。最后,胚胎期瘤胃与食道相比表达上调了285个差异基因,这些基因显着富集在表皮分化等功能。成熟期瘤胃相对其他组织高表达基因与胚胎期瘤胃相比食道表达上调的基因构成了846个瘤胃核心基因,这些基因反映了瘤胃从胚胎到成熟的功能并与塑造瘤胃的发育和进化过程有关。以上结果表明,瘤胃与鲸偶蹄目其他物种的第一胃室可能共享来自食道的发育起源,瘤胃不仅上调了食道表达的基因,还从其他组织募集了更多基因的表达,从而进化出增强的酮体代谢、不同的表皮结构和调控微生物定植的能力。2.通过反刍动物比较基因组得到的特异非编码保守元件和正选择基因的结果对瘤胃进化关键核心基因进行识别并进行功能验证。在846个瘤胃核心基因中,鉴定到657个附近有反刍动物特异保守非编码元件的基因和28个正选择基因,这些基因主要参与酮体代谢、角蛋白纤维锚定、细菌识别和皮肤屏障等生物学功能分类。大多数的（77.65%）瘤胃核心基因附近都有反刍动物特异非编码保守元件的分布,并部分地被瘤胃和食道的开放染色质区域验证。其中WDR66基因不仅具有反刍动物特异的氨基酸位点改变,并且与其他物种第一胃室、与食道相比,该基因在瘤胃中表达上调。其位于内含子的RSCNE与胚胎时期的瘤胃和食道差异峰重叠。通过构建含有该元件的荧光素酶报告载体并体外转染至绵羊和山羊的成纤维细胞进行荧光素酶活性检测,结果表明该元件具有增强子活性。在28个正选择基因中,受到正选择的酮体代谢通路关键限速酶基因HMGCS2发生了5个反刍动物特异的氨基酸位点改变,蛋白三维结构预测结果显示这些突变可能导致蛋白三维结构的改变。通过表达绵羊和人的5个反刍动物特异氨基酸位点正反向替换的蛋白并进行酶活性检测,结果显示反刍动物特异的氨基酸突变使得该蛋白比其他哺乳动物拥有更高的利用乙酰乙酰辅酶A合成羟甲基戊二酰辅酶A的酶活性。以上结果表明通过氨基酸突变和非编码调控元件改变的方式,瘤胃在进化过程中获得了增强的酮体代谢和上皮吸收能力。结果进一步证实调控改变是器官进化遗传机制中最活跃的方式,而蛋白编码区域的突变也是瘤胃关键功能创新进化中的重要遗传模式。3.获得了山羊出生后七个时间节点的瘤胃转录组和瘤胃内容物的宏基因组数据,并结合比较基因组分析结果,对早期瘤胃发育重编程的功能建立和微生物定植过程以及他们之间的功能互作关系进行探究。山羊断奶前瘤胃发育过程中,瘤胃的功能建立分为两个阶段,从d1到d14的免疫反应阶段和从d21到d56天的营养代谢阶段,微生物群落的演替则是从d7到d28的细菌素生物合成阶段和从d42到d56的糖酵解活性阶段。瘤胃基因功能的转换（第21天）要早于饲粮的介入（第25天）和微生物的阶段转换节点（第42天）。瘤胃基因转录谱在d14和d21之间的转变早于颗粒饲料的引入（d25）和微生物的转变（d28-d42）。通过加权基因共表达调控网络分析,瘤胃发育转录组和微生物宏基因组的表达动态谱分别鉴定出15个宿主基因模块和20个微生物属模块。宿主和微生物之间相关的功能主要包括瘤胃的pH稳态、氮代谢和免疫反应的生物学功能。反刍动物进化的两个新基因（DEFB1和LYZ1）在瘤胃发育过程中均在微生物阶段转换节点d42表达量达到最高,与此同时微生物的Alpha多样性指数在该时间点降到最低。通过表达山羊DEFB1和LYZ1蛋白,利用抑菌圈试验对这两个新基因进行抑菌能力检测,发现这两个新基因具有选择性抑制革兰氏阳性菌的活性。以上结果表明瘤胃的第一阶段的发育可能经历了不依赖于饲料和微生物刺激的程序化过程且瘤胃进化的新基因可能具有特异调控微生物群落的功能。综上,我们的研究探究了瘤胃在进化过程中的关键功能创新及涉及的多种遗传机制。本研究鉴定到的瘤胃核心基因及其特异突变为今后研究瘤胃发育基因调控网络,为了解瘤胃与微生物群之间的相互作用提供了一个起点。而这些将是进一步优化提高反刍家畜生产性能的关键,进而为操纵瘤胃发酵过程提供新的思路。
肖峰[3]（2020）在《基于GEO数据挖掘及纳米基因传递技术的前列腺癌靶向抑制作用研究》文中研究说明前列腺癌是发生在前列腺的上皮性恶性肿瘤,是男性泌尿生殖系统发病率较高的恶性肿瘤之一。前列腺癌全球每年新发病例约130万,死亡人数约为35万,是继肺癌之后全球男性恶性肿瘤的第二大病因,是肿瘤特异性死亡的第五大病因。它早期可以表现为无症状,只有在组织学检查时才能诊断。在美国,30%的50岁以上以及60-70%的80岁以上男性可能检测出前列腺癌灶。在我国前列腺癌的发病率约为1/10万。此外,由于大约80%的前列腺癌起源于前列腺后叶（70-75%的外周带,5-10%的中央带）,直肠膀胱陷凹的结构异常常与前列腺癌的局部浸润有关。当肿瘤累及和压迫输精管时,会导致同侧腹股沟和睾丸疼痛和射精痛;当肿瘤累及直肠上段时,输尿管、精囊和输精管壶腹可能会受压,可能导致输尿管受累和随后的上尿路症状;同样,当肿瘤累及膀胱三角区时,也可能导致输尿管口和上尿路交感神经受压;勃起功能障碍提示神经血管束下外侧可能受到侵犯。这些都严重影响人的健康。前列腺癌的治疗分为局部治疗和全身治疗。局部治疗主要为根治性切除及根治性放疗,但对于中晚期前列腺癌并不适用。全身治疗主要包括内分泌治疗、靶向治疗与免疫治疗。这些治疗方法都会存在较多的并发症,影响患者的预后及生存质量,急需寻找新的治疗方法。生物信息学为我们寻找可靠的治疗靶点提供了希望。生物信息学可以利用的肿瘤信息,并对其分析,并筛选出最佳的差异化表达基因。以筛选出的差异化表达基因作为靶点设计出该靶点的基因干扰质粒,利用构建的质粒对前列腺癌进行靶向基因治疗。肿瘤的发生需要三种基因的调控,即原癌基因、抑癌基因及稳定基因。哺乳动物细胞有许多防御措施来防止基因突变而导致的肿瘤的发生,除非当多个基因同时发生缺陷时,肿瘤才会发生。因此,更为恰当的说法是某一癌基因在肿瘤发生发展中起了某种作用,而不是导致肿瘤的发生。原癌基因在结构改变或在某种特定的野生型不存在的条件下被激活。原癌基因的激活可以由染色体易位、或在基因扩增或时基因内部调节基因产物活性的关键残基的突变引起,可以促进肿瘤生长,例细胞增殖、粘附、迁移、分化、血管生成、凋亡和防御逃逸等。抑癌基因的作用方式与原癌基因相反,它可以降低突变基因产物的活性。这种对原癌基因的失活作用是对维持其活性所必需的残基的错位配对而产生,错配的结果是其编码的蛋白产生变异。基因治疗在过去近30年已经发展,并且临床专家在临床试验中已经获得了许多经验,但仍然有一些需要解决的问题,如基因的如何传递至靶细胞也是一个重要挑战。由于基因分子量大子和亲水性质,它们不能通过被动扩散机制进入细胞。此外,由于存在于血浆和肾脏中的各种快速酶促消化、基因对穿过毛细血管内皮的有限穿透能力以及组织细胞的对基因的低效摄取率等,使得将裸基因体内传递至疾病部位存在相当大的挑战。理想的基因载体应具有靶向特异性、容易入胞、携带的基因可以在细胞内持续大量表达;此外,基因载体必须安全,没有任何副作用,并能够大规模生产。为了增加基因治疗的效果,我们构建了表面带有正电荷的磁性纳米粒子作为基因治疗的载体。磁性纳米粒子由于其纳米尺度、较大的比表面积、超顺磁性等忧点,已广泛应用于肿瘤的纳米治疗研究。通过Western blot实验,我们检测了利用生物信息学筛选的靶点基因在前列腺癌细胞的表达情况,并利用构建的质粒对靶点基因进行沉默及过表达,并利用SLC4A4-Sh RNA、流式细胞仪、平板克隆等实验对前列腺癌的增殖、凋亡、克隆能力等进行验证,证明该靶点的效性。利用构建的磁性纳米粒子与质粒结合后对前列腺癌细胞进行治疗,并验证该纳米粒子的生物安全性。结果表明,我们构建的磁性纳米粒子具有良好的生物安全性、较高的基因携载能力;我们利用生物信息学筛选的靶点基因对前列腺细胞的增殖、凋亡、克隆能力等具有强大的作用效果;利用磁性纳米粒子载基因质粒对前列腺癌进行靶向治疗在体内外对前列腺癌细胞都有较强的抑制作用,可以作为前列腺癌潜在的治疗方式。
韦茏芹[4]（2020）在《鸡卵清蛋白启动子功能分析及验证》文中认为转基因鸡输卵管生物反应器具有高产蛋能力,转基因鸡群快速扩繁能力和与人类相似的蛋白糖基化形式,在药用蛋白生产方面具有不可替代的作用。到目前为止,相继建立了鸡蛋卵白（eggwhite）中表达干扰素、溶菌酶、抗体、促红细胞生成素、表皮生长因子等重组蛋白的转基因鸡。但是对于不同长度卵清蛋白启动子（OVP）活性,以及雌激素应答元件（ERE）和卵清蛋白上游启动子转录因子（COUP-TF）调控作用缺乏系统研究;其次,作为外源基因转移的有效载体,鸡原始生殖细胞（PGCs）分离培养方法也待探讨。本研究的目的是确定鸡OVP核心区域,筛选高转录活性的OVP;探讨ERE和COUP-TF调控作用;摸索鸡PGCs适宜培养方法;通过体外和体内验证试验,确定可望用于制备输卵管生物反应器的OVP。1.CRISPR-d Cas9-VP64介导的鸡卵清蛋白启动子转录活性分析。将启动子cERE-cOVP-2785、cOVP-2785分别亚克隆至p GL3-Basic载体,构建了荧光素酶表达载体p GL3-cERE-cOVP-2785、p GL3-cOVP-2785。利用Lipofectamine?2000将上述2个质粒以及p GL3cOVP-1548分别与p RL-TK质粒共转染293T细胞,检测荧光素酶活性,评估三个启动子的转录活性。利用在线软件Optimized CRISPR Design,依据鸡卵清蛋白（OVA）基因第一内含子、转录起始位点上游区域DNA序列,共设计11对sg RNA;依据鸡ERE序列设计了2对sg RNA,分别构建了11个p GL3-U6-OVPsg RNA和2个p GL3-U6-EREsg RNA重组质粒;将p GL3-cERE-cOVP-2785、pc DNAd Cas9或pc DNA-d Cas9-VP64质粒分别与单个或多个sg RNA表达质粒共转染293T细胞,检测荧光素酶活性,评估启动子和ERE对荧光素酶表达的影响。结果表明,（1）cERE-cOVP-2785启动子片段的转录活性最高,cOVP-2785次之;（2）d Cas9-VP64对荧光素酶激活效应强于d Cas9;（3）多个sg RNA引导的d Cas9-VP64转录激活效应优于单个sg RNA;（4）第1内含子和转录起始位点上游以及ERE区域每个sg RNA均能靶向激活荧光素酶表达。（5）培养液中添加雌激素显着提升荧光素酶表达水平。2.鸡卵清蛋白上游启动子转录因子Ⅰ/Ⅱ（COUP-TFⅠ/Ⅱ）功能分析。构建pcDNA3.1-His C-COUP-TFⅠ及pc DNA3.1-His C-COUP-TFⅡ重组质粒,利用Lipofectamine?2000分别或共同将pc DNA3.1-His C-COUP-TFⅠ和pc DNA3.1-His C-COUP-TFⅡ与p GL3-cERE-cOVP-2785或p GL3-cOVP-2785以及p RL-TK质粒共转染293 T细胞,检测荧光素酶活性,以此评估COUPTFⅠ/Ⅱ对荧光素酶表达调控作用。结果表明,（1）COUP-TFI/II与cEREOVP2785联合作用,上调荧光素酶表达,发挥正调控作用;（2）COUP-TF I/II与OVP2785联合作用,下调荧光素酶表达,呈现负调控作用;（3）COUPTFI和COUP-TFII两个转录因子发挥协同作用,调控荧光素酶表达,且COUP-TFⅡ调控作用大于COUP-TFⅠ。3.鸡原始生殖细胞（PGCs）的分离及培养。分别采用Ficoll密度梯度离心法和酶消化法从HH-14期鸡胚血液和HH-28期鸡胚性腺中分离PGCs,分别接种至BRL、STO和CEF饲养层上,比较PGCs增殖能力,并对其生物学特性加以鉴定;此外,对DMSO和乙二醇的冻存效能进行了对比研究。结果表明,（1）来自性腺的PGCs（g PGCs）增殖能力优于来自血液的PGCs（b PGCs）;（2）以BRL为饲养层,在培养基中添加40%BRL条件培养液和细胞因子SCF（6ng/m L）、b FGF（4ng/m L）和LIF（10TU/m L）,可以使PGCs连续培养100天以上,是鸡PGCs培养的优选方法;（3）鸡PGCs对PAS和AKP染色,以及SSEA-1免疫荧光染色均呈现阳性反应,在体外分化培养时能形成类胚体;（4）与10%DMSO相比,用10%乙二醇冻存的鸡PGCs复苏后成活率较高,是鸡PGCs适宜的冻存剂。4.鸡卵清蛋白启动子体内外功能验证。采用X-treme GENE HP DNA Transfection Reagent,将慢病毒载体p Lenti6.4/cERE-cOVP-2785/c SLP-EGFP与包装质粒ps PAX2和p MD2.G以及p RSV-Rev共转染293T细胞,超速离心法浓缩慢病毒,La SRT法测定慢病毒滴度。慢病毒体外感染鸡OECs、鸡性腺PGCs以及293T细胞,以EGFP表达效率体外验证cERE-cOVP-2785功能;慢病毒注射2.5日龄鸡胚背主动脉,换壳培养,直至出壳。荧光蛋白手电筒和配套滤镜观察鸡胚性腺EGFP表达效率,PCR检测EGFP整合效率,体内验证cERE-cOVP-2785功能。结果表明,（1）EGFP在鸡OECs、性腺PGCs均有表达,但在293T细胞中没有表达,说明该启动子具有组织特异性;（2）EGFP在鸡胚性腺中表达,且EGFP可整合宿主性腺基因组,表明cERE-cOVP-2785能有效驱动外源基因在性腺中表达,但转基因表达稳定性尚需进一步验证。结论:卵清蛋白基因转录起始位点上游-54～-807bp区域和第1内含子均为卵清蛋白启动子核心序列;cERE-cOVP-2785是适宜的卵清蛋白启动子,因为其转录活性高,ERE具有增强子作用;COUP-TFⅠ/Ⅱ与cERE-cOVP-2785,对下游基因发挥正调控作用;以BRL为饲养层,在培养基中添加40%BRL条件培养液和细胞因子SCF（6ng/m L）、b FGF（4ng/m L）和LIF（10TU/m L）,是鸡g PGCs培养的优选方法;启动子cERE-cOVP-2785可以有效驱动EGFP体外和体内特异性表达,有望用于输卵管特异性表达转基因鸡研究。
张皓[5]（2016）在《基于基因和分子靶向治疗技术的C225/p5HRE-cfosp-iNOS-IFNG磁性白蛋白纳米球治疗肺癌的实验研究》文中研究表明肺癌是目前世界上发生率和死亡率最高的恶性肿瘤之一,并且呈明显上升趋势。最新的肿瘤流行病学调查显示,男性肺癌的发病率和死亡率居所有恶性肿瘤首位,女性肺癌死亡率也高居所有恶性肿瘤第二位。肺癌已经成为对人类健康和生命危害最大的恶性肿瘤之一。在本研究中,我们以肺癌为治疗目标,构建以IFN-y为目的基因的基因电路,以PEI-Fe3O4为基因载体,联合西妥昔单抗设计了靶向载基因磁性白蛋白纳米球,将分子靶向治疗、放疗和免疫基因治疗有效联合起来治疗肺癌。主要研究内容如下：第一章肿瘤治疗基因合成和表达研究：基于乏氧/辐射双调控基因电路技术的p5HRE-cfosp-iNOS-IFNG真核表达质粒的构建与鉴定及其在细胞内的诱导表达[目的]：构建pYr-ads-5HRE-cfosp-iNOS-IFNG（即p5HRE-cfosp-iNOS-IFNG）真核表达质粒,并对其进行鉴定。评价其在GLC-82细胞中的诱导表达情况。[方法]：①以pUC57-Simple-cfosp为模板,将cfosp片段酶切下来连接至pYr-adshuttle-8载体得到pYr-ads-8-cfosp典核表达质粒。②以pDONR223-IFNG为模板,PCR扩增IFNG片段（IFNG即IFN-y的基因片段）,然后将其亚克隆至pYr-adshuttle-8载体,构建pYr-ads-8-IFNG真核表达质粒。③将pUC57-SimpIe-cfosp及目的载体pYr-ads-8-IFNG双酶切,然后进行连接,构建pYr-ads-8-cfosp-IFNG真核表达质粒。④以pUC57-Simple-5HRE为模板,获得5HRE片段,并将其构建至pUC57-Simple-cfosp载体上,获得pUC57-Simple-5HRE-cfosp。再将其酶切,得到5HRE-cfosp片段,然后将其构建至pYr-adshuttle-8载体上,构建pYr-ads-8-5HRE-cfosp真核表达质粒。同时,将5HRE-cfosp片段,构建至pYr-ads-8-IFNG载体上,得到PYr-ads-8-5HRE-cfosp-IFNG真核表达质粒。⑤以pIRES2-ZsGreenl为模板,PCR扩增IRES片段,并将其构建至pYr-ads-1-iNOS载体上,构建pYr-ads-iNOS-TRESc再以pDONR223-IFNG为模板,PCR扩增IFNG基因片段,并将其构建至pYr-ads-iNOS-IRES载体上,得到pYr-ads-iNOS-IFNG。⑥ pUC57-Simple-cfosp为模板,PCR扩增cfosp片段,然后将其构建至pYr-ads-iNOS-IFNG载体上,得到pYr-ads-cfosp-iNOS-IFNG真核表达质粒。⑦将5HRE-cfosp片段,构建至pYr-ads-iNOS-IFNG载体上,获得PYr-ads-5HRE-cfosp-iNOS-IFNG真核表达质粒。⑧每个步骤后均需挑取阳性克隆,酶切测序鉴定后进行下一步构建,最后大量抽提质粒。⑨将pYr-ads-8-cfosp、pYr-ads-8-IFNG、pYr-ads-8-cfosp-IFNG、 pYr-ads-8-5HRE-cfosp-IFNG、pYr-ads-cfosp-iNOS-IFNG、pYr-ads-iNOS-IFNG、 pYr-ads-5HRE-cfosp-iNOS-IFNG分别转染GLC-82细胞,用2Gy X射线处理后,用QT-PCR分析IFN-y和iNOS（诱导型一氧化氮合酶）基因的表达量。评价基因电路的放大作用及乏氧序列的增强作用。⑩将P5HRE-cfosp-iNOS-IFNG质粒转染GLC-82细胞后,2Gy剂量的X射线照射后的6h、12h、24h、48h、72h收集细胞,分析IFN-y和iNOS基因的表达量。分别取转染后的细胞给予0、1、2、4、8Gy五种剂量进行X射射线照射后24h收集细胞,分析IFN-y和iNOS基因的表达量。[结果]：①酶切、测序鉴定结果表明每步均得到了目的质粒,测序发现插入片段序列无改变,并且开放读码框正确。②用QT-PCR检测IFN-y和iNOS基因的相对表达量,结果表明P5HRE-cfosp-iNOS-IFNG与其他质粒相比,表达量最高,与没有乏氧序列的组（⑥pYr-ads-cfosp-iNOS-IFNG）相比,IFN-y的表达量高了约1.46倍,iNOS的表达量高了2.11倍（p<0.05）。与没有基因电路的组（⑤Yr-ads-8-5HRE-cfosp-IFNG）相比,IFN-y的表达量高了约1.32倍（p<0.05）。③在处理后6h、12h、24h、48h、72h集细胞。用QT-PCR检测IFN-γ和iNOS基因的表达量发现,在诱导6h,IFN-γ和iNOS基因的表达量即开始升高,24h升到最高值。在24h之前,IFN-γ iNOS基因的表达量随时间的延长而增加,之后逐渐减低。④细胞给予0、1、2、4、8Gy五种剂量进行X射线照射后24h用QT-PCR检测IFN-y和iNOS基因的表达量发现,2Gy组的表达量最高,其IFN-y的表达量是1Gy组的4.37倍,4Gy组的1.52倍,8Gy组的2.05倍（p<0.05）。其iNOS的表达量是1Gy组的4.96倍,4Gy组的1.56倍,8Gy组的2.17倍（p<0.05）。[结论1：①成功构建了基于乏氧/辐射双调控基因电路技术的p5HRE-cfosp-iNOS-IFNG真核表达质粒及中间各用于比较的质粒。并且酶切鉴定、测序鉴定均证实构建成功。②用QT-PCR检测了C-fos启动子的时效性,C-fos启动子在2Gy的X射线诱导24小时后,靶基因的表达量最高。评价了p5HRE-cfosp-iNOS-IFNG在肺癌细胞内的诱导表达,验证了HRE在缺氧环境中对辐射启动子的增强作用,和基因电路技术的有效性。第二章C225-Fe304/p5HRE-cfosp-iNOS-IFNG（靶向载基因磁性白蛋白纳米球）的制备及靶向性研究[目的]：①制备表征Fe3O4磁性纳米粒,用PEI修饰Fe3O4磁性纳米粒并进行表征,研究PEI-Fe3O4复合物作为基因载体的可行性。②制备载基因磁性白蛋白纳米球及靶向载基因磁性白蛋白纳米球。③鉴定靶向载基因磁性白蛋白纳米球的免疫特性（即靶向性）并观察其转染效率。④从体内外水平,探讨靶向载基因磁性白蛋白纳米球对人肺癌细胞GLC-82细胞的靶向效应。[方法]：①采用化学共沉淀法制备Fe3O4磁性纳米粒,聚乙烯亚胺（PEI）对其进行表面修饰。②采用透射电镜（transmission electron microscope, TEM）, ZETA SIZER3000激光粒度分析仪,傅立叶红外光谱（fourier transform infrared spectroscopy, FTIR）对修饰前后纳米粒进行表征。③琼脂糖凝胶电泳检测PEI-Fe3O4结合DNA的情况。利用pEGFP-Cl观察PEI-Fe3O4介导外源基因转染的效率。④采用去溶剂化-交联法制备载基因磁性白蛋白纳米球,用异型双功能交联剂SPDP耦连纳米球和西妥昔单抗（C225）,制备成靶向载基因磁性白蛋白纳米球,运用TEM^ ZETA SIZER3000激光粒度分析仪对其表征,在不同时间点测其在PBS缓冲液和RPMI1640培养液中的粒径,评价其稳定性。动态测定其体外释放基因速率。用硫氰酸盐分光光度法测其含Fe量。⑤用靶向载基因磁性白蛋白纳米球转染GLC-82细胞,观察其转染效率。⑥运用玻片凝集实验、免疫荧光染色实验鉴定纳米球的免疫特性。⑦采用普鲁士蓝染色、细胞免疫荧光实验及细胞MRI实验观察靶向载基因磁性白蛋白纳米球与人肺癌细胞体外特异性结合的能力。⑧建立裸鼠肺癌移植瘤动物模型,待肿瘤直径达0.5cm左右用于实验,对裸鼠进行MRI。将裸鼠分成C225靶向组、非C225靶向组和C225抑制组。分别经尾静脉注射靶向载基因磁性白蛋白纳米球、非靶向载基因磁性白蛋白纳米球和靶向载基因磁性白蛋白纳米球+C225。在注射前及注射后2h、8h、24h、72h分别进行7.0 Tesla超高场强实验动物MRI系统成像,观察不同时间点肿瘤的信号变化,成像序列包括SE-TIWI、SE-T2WI、GRE-T2*WI。量化分析肿瘤组织信号改变的程度、范围、随时间的改变。测量感兴趣区（肿瘤、肌肉组织）T2WI及T2*WI信号强度,计算信号变化率。最后用SPSS 18.0统计软件进行统计、分析。病理组织学检查：包括常规HE染色、普鲁士蓝染色。[结果]：①制备的Fe3O4和PEI-Fe3O4磁性纳米粒表征：TEM检测显示磁性纳米粒电子密度高、大小较一致,并且修饰前后形态大小差别不大；FTIR结果显示了修饰后纳米粒的特征峰值,证明了PEI的成功吸附；激光粒度分析仪电位分析显示在pH为7的中性环境,Fe3O4纳米粒的zeta电位值为0±0.5mV,而PEI修饰后纳米粒子的电位值为36.3±0.6mV。②琼脂糖凝胶电泳检测到PEI-Fe3O4与DNA结合情况良好；PEI-Fe3O4可将外源基因转染至GLC-82细胞并高效表达。③自制的空载白蛋白纳米球及靶向载基因磁性白蛋白纳米球在TEM检测下为球形,大小均匀,并且在靶向载基因磁性白蛋白纳米球中明显地观察到在电子密度较低的白蛋白纳米球中包裹着电子密度较高的磁性纳米粒。ZETA SIZER3000激光粒度分析仪显示载基因磁性白蛋白纳米球的水合粒径为189.5±2.4nm；靶向载基因磁性纳米球的水和粒径约为211.9±3.1nm。在pH为7的中性环境中,载基因磁性白蛋白纳米球的zeta电位值是-37.9±0.4 mV,而耦联了C225的靶向载基因磁性白蛋白纳米球的电位值为-40.2±0.7 mV。在不同时间点测其在PBS缓冲液和RPMI1640培养液中的纳米球粒径差别不大,稳定性良好。④体外动态释放基因速率,计算其累积释放率显示,该材料15小时释放基因为96.45%,曲线平缓；硫氰酸盐分光光度法测含Fe量平均在2.2 mg/ml;转染实验结果显示靶向载基因磁性白蛋白纳米球能够有效转染GLC-82细胞,且转染效率高于非靶向载基因磁性白蛋白纳米球。⑤靶向载基因磁性白蛋白纳米球玻片凝集实验与对照组相比,靶向载基因磁性白蛋白纳米球组与抗血清孵育后观察到明显地凝集现象；免疫荧光染色显示靶向载基因磁性白蛋白纳米球表面发出明亮绿色荧光,而对照组未观察到荧光。⑥普鲁士蓝染色结果显示在靶向组与GLC-82细胞孵育后,细胞内有大量明显蓝染的铁颗粒存在,而非靶向组细胞内少见；细胞免疫荧光染色显示靶向组细胞的表面有绿色荧光,而非靶向组未观察到绿色荧光；细胞MRI实验结果显示靶向组与GLC-82细胞共孵育后在T2WI上信号强度不同程度的降低,而非靶向组与GLC-82细胞共孵育后在T2WI上信号强度无明显降低。⑦在体MRI成像结果显示,C225靶向组注射后肿瘤组织不同时间点的T2WI、 T2*WI强度及信号变化率均有明显下降,具有统计学差异（p<0.05）。而非C225靶向组和C225抑制组在注射后8h和24h两个时间点的信号亦有轻度下降,但下降幅度较C225靶向组小,且持续时间较靶向组短。不同时间点的T2弛豫时间,从24h时间点开始,C225靶向组与非靶向组和C225抑制组比较具有明显差异,结果有统计学意义（p<0.05）。⑧常规HE染色结果表明所建立的裸鼠荷肺癌皮下移植瘤动物模型符合小鼠肺癌的形态结构。普鲁士蓝染色结果显示：C225靶向组肿瘤组织内见较多的蓝染的颗粒,代表Fe颗粒多；而非C225靶向组和C225抑制组内少见蓝染的Fe颗粒存在。[结论]：①应用化学共沉淀法已成功制备了Fe304磁性纳米粒且PEI成功地修饰于Fe304磁性纳米粒。②修饰后的PEI-Fe3O4磁性纳米粒可以作为基因的载体。③成功制备了白蛋白纳米球、载基因磁性白蛋白纳米球,成功耦连了西妥昔单抗与载基因磁性白蛋白纳米球。④靶向载基因磁性白蛋白纳米球具有缓释作用,并且能高效转染人肺癌细胞GLC-82。⑤细胞实验和体内磁共振实验都说明靶向载基因磁性白蛋白纳米球对人肺癌细胞GLC-82具有良好的靶向效应。第三章基于基因和分子靶向治疗技术的靶向载基因磁性白蛋白纳米球治疗肺癌的体内外实验研究[目的]：①体外水平探讨靶向载基因磁性白蛋白纳米球治疗人肺癌的作用。②通过动物实验,从体内水平探讨靶向载基因磁性白蛋白纳米球对肺癌的治疗作用。[方法]：①体外采用CCK8及流式细胞技术测定靶向载基因磁性白蛋白纳米球体外治疗肺癌的效果。并用透射电镜观察细胞超微结构的变化。②建立裸鼠肺癌移植瘤模型,将靶向载基因磁性白蛋白纳米球经尾静脉注射入裸鼠,经辐射3次,6周后处死裸鼠。计算肿瘤体积抑制率和质量抑制率,制作肿瘤组织标本,进行常规病理学检查。③通过血清生化检查和血常规检测及各内脏器官组织病理学观察初步评价靶向辐射基因联合治疗的安全性。[结果]：①CCK8实验结果显示靶向载基因磁性白蛋白纳米球能明显抑制人肺癌细胞GLC-82的增殖,FCM检测显示其能诱导GLC-82细胞的凋亡,且其效果较其他组显着。透射电镜下可观察到各组细胞均有不同程度的凋亡,细胞内可见磁性材料沉积。②靶向辐射基因联合治疗组的肿瘤质量抑制率和肿瘤体积抑制率分别为82.54%和85.72%,明显高于单抗治疗组（36.51%、34.33%）、辐射放疗组（42.06%、40.89%）、辐射基因联合治疗组（64.29%、65.64%）和靶向辐射联合治疗组（70.63%、72.57%）（p<0.05）。③各治疗组肿瘤有不同程度坏死,部分坏死灶可见炎性细胞浸润。其中靶向辐射基因联合治疗组坏死程度最严重。可见大片坏死灶,坏死区域呈红染,肿瘤细胞崩解,胞核消失,部分细胞核固缩。其它治疗组也均有不同程度的坏死,程度较靶向辐射基因联合治疗组轻,但也可见肿瘤细胞的密度下降,细胞排列松散,胞浆呈红染。阴性对照组与各治疗组的心肝脾肺肾等内脏组织均没有发现明显的病理学变化。④建模前和治疗结束后各组裸鼠血细胞计数,各实验组与阴性对照组及建模前之间均无统计学差异（p>0.05）。提示建模和各治疗对骨髓造血系统无明显抑制作用。[结论]：①靶向辐射基因联合治疗能显着抑制培养人肺癌细胞GLC-82的增殖,诱导细胞凋亡。②分子靶向治疗、放疗和基因治疗三者联合治疗肺癌具有明显的协同作用,能有效抑制肺癌的生长,效果优于单一治疗也优于两两联合治疗。第四章靶向载基因磁性白蛋白纳米球治疗肺癌的分子机制研究[目的]：从分子水平探讨靶向载基因磁性白蛋白纳米球介导的分子靶向联合基因治疗肺癌的机制。[方法]：①采用免疫组织化学方法检测治疗后各组肿瘤组织中Bcl-2、Bax、 survivin、VEGF、EGFR、PCNA、p53、Ki67蛋白的表达。②采用western blot检测各治疗组中Bcl-2、Ki67、survivin、caspase-3与caspase-8的表达量,使用Gel-Pro32软件对结果进行灰度分析。从分子水平上探讨靶向载基因磁性白蛋白纳米球介导的分子靶向联合基因治疗肺癌的分子机制。[结果]：①单抗治疗组、辐射放疗组、辐射基因联合治疗组、靶向辐射联合治疗组、靶向辐射基因联合治疗组的Bax蛋白均有升高,但靶向辐射基因联合治疗组上升最明显。而单抗治疗组、辐射放疗组、辐射基因联合治疗组、靶向辐射联合治疗组、靶向辐射基因联合治疗组的Bcl-2、Ki67、p53、PCNA和survivin蛋白均有下降,其中靶向辐射基因联合治疗组下降得最明显。② Wesrern blot的结果显示,各治疗组与阴性对照组相比Bcl-2、Ki67、survivin均有下调,而caspase-3与caspase-8的表达上调。其中以靶向辐射基因联合治疗组最为显着。[结论]：靶向载基因磁性白蛋白纳米球介导的分子靶向联合基因治疗肺癌的机制可能与下调PCNA、Ki67蛋白表达而抑制肿瘤增殖；抑制Bcl-2、p53、survivin蛋白表达,上调Bax蛋白表达从而诱导肿瘤细胞凋亡；抑制肿瘤新生血管的形成,抑制EGFR表达有关。
刘霞,杜卫华,朱化彬,曹文广[6]（2013）在《基因枪转化技术在动物转基因中应用的研究进展》文中研究表明基因枪转化技术无论在动物还是植物方面都产生了巨大的影响,因粒子介导的转基因方法简单、安全、高效,而越来越被人们所重视。研究结果表明,该转化技术不仅能够用于组织、细胞、器官,甚至可用于一些较难转染的靶目标,同时还可用于体内和体外信息的转换。目前手提式基因枪已广泛应用于皮肤、组织、各种细胞或内脏器官的转染,应用最广的领域是基因治疗,主要包括基因免疫和抑制肿瘤生长。近几年,基因枪技术发展迅速,应用范围越来越广,已经取得了丰硕的成果。作者主要叙述了基因枪转化的基本原理及近年来人们对基因枪转化技术条件的改进,同时就基因枪在动物转基因中的应用和一些主要的研究成果作了阐述,主要包括利用基因枪基因免疫、基因治疗、自杀基因治疗癌症、胚胎转基因、各种动物细胞和器官组织转基因等,并对基因枪技术在动物上应用的优势和不足进行了一些分析,最后展望了基因枪转化技术在动物中的应用前景。
吕俊锋[7]（2012）在《Decorin基因靶向抑制肺癌A549细胞及增强铂类药物杀伤效率的体外实验研究》文中研究指明肺癌是导致死亡的主要原因之一，每年有近140万人死于肺癌。大多数病人被确诊时已属晚期，这是本病高死亡率的主要原因。肺癌的基因靶向治疗是近年新兴的一种治疗手段，具有高度选择性地杀死肿瘤细胞而不杀伤或仅很少损伤正常细胞的特点。然而，恰恰由于靶向治疗是为攻击特异性靶分子而设计，所以须找到合适靶点才能发挥其疗效。Decorin是一种主要存在于结缔组织中与胶原纤维相关的蛋白多糖，调节和控制组织形态发生、细胞分化、运动、增殖及胶原纤维形成等过程，对防止组织和器官纤维化的发生有重要意义。近年来随着decorin研究深入，发现其在多种恶性肿瘤呈现异常表达，特别是decorin可以和多种生长因子结合，负性调节肿瘤细胞生长，使之在肿瘤的发生及治疗中受到越来越多的关注。人分泌性白细胞蛋白酶抑制剂（human secretory leukoprotease inhibitor,hSLPI）是由呼吸道及生殖道粘膜上皮分泌的蛋白质，在非小细胞肺癌（non-smallcell lung cancer，NSCLC）中高表达，在正常组织尤其是肝中表达极低，具有肿瘤细胞特异性， hSLPI作为基因启动子具有相对更好的特异性属于肿瘤特异性启动子，可以调控decorin基因在肺癌细胞内特异性表达，靶向杀伤肺癌细胞而不影响正常肺组织细胞。本实验探讨通过构建由hSLPI启动子调控的decorin基因真核表达载体，在肺癌细胞中特异性表达并靶向抑制该细胞，以达到基因治疗靶向性的目的，从而提高肺癌基因治疗的安全性与有效性。研究取得了如下进展：1、应用基因工程重组技术成功构建了hSLPI启动子调控decorin真核表达载体通过PCR技术从外周血基因组克隆出1250bp的hSLPI启动子序列全长，经DNA测序分析表明，该启动子序列与Genebank中hSLPI基因上游的5′末端转录调控区的序列完全一致；将hSLPI启动子序列及decorin分别定向克隆入真核表达载体pcDNA3.1（+）中，经限制性内切酶鉴定及分子测序证实了hSLPI及decorin的插入位置正确，DNA序列与GeneBank数据库完全吻合，从而成功构建了pcDNA3.1-hSLPI-decorin真核表达载体，为实施hSLPI调控下的decorin靶向特异性抑制肺癌细胞奠定了实验基础。2、成功实现了hSLPI启动子调控的decorin基因靶向特异性肺癌细胞的表达应用脂质体介导的pcDNA3.1（+）、pcDNA3.1-decorin、pcDNA3.1-hSLPI-decorin分别稳定转染肺癌A549细胞株及肝癌HepG2细胞，RT-PCR、免疫组织化学、Westem blot及ELISA法的结果均证实：hSLPI启动子调控decorin基因只在肺癌A549细胞内表达，而在肝癌HepG2细胞内不表达，证实了本研究所构建的先进载体特异性地使decorin表达于肺癌细胞，实现了治疗基因靶向特异性表达功能，从分子载体设计层面为屏蔽导入基因普遍整合宿主细胞而引起的毒副作用提供分子结构基础。3、证实了decorin基因靶向特异性抑制肺癌细胞的生物学功能对真核表达载体pcDNA3.1-hSLPI-decorin靶向抑制肺癌细胞体外研究的结果表明，经脂质体介导的pcDNA3.1-hSLPI-decorin转染肺癌A549细胞后，从第四天起，肺癌A549细胞生长缓慢，细胞生长率明显下降，细胞生长受到明显抑制，与相同载体转染的HepG2细胞组，空质粒转染组相比具有明显的统计学差异，提示所构建的pcDNA3.1-hSLPI-decorin真核表达载体具有较强的表达效率及肺癌靶向抑制功能，为实现肺癌基因靶向治疗提供了实验依据。对真核表达载体pcDNA3.1-hSLPI-decorin抑制肺癌细胞生长的细胞周期分析，表明pcDNA3.1-hSLPI-decorin转染A549的细胞株，G1期向S期转变明显受到抑制，G1期细胞百分率较转染HepG2及空质粒细胞组明显增高，提示真核表达载体pcDNA3.1-hSLPI-decorin抑制肺癌生长作用可通过诱导细胞周期G1期停滞来抑制肺癌细胞的生长。4、真核表达载体pcDNA3.1-hSLPI-decorin转染与铂类化疗药物联用明显提高了肺癌细胞的杀伤效率不同浓度的化疗药物顺铂，卡铂分别作用于真核表达载体pcDNA3.1-hSLPI-decorin、pcDNA3.1（+）转染的肺癌A549细胞与无基因转染的A549细胞。MTT法检测结果表明卡铂、顺铂作用于真核表达载体pcDNA3.1-hSLPI-decorin转染的肺癌A549细胞的IC50明显降低了近3倍。荧光实时定量PCR技术检测各组A549细胞的Bcl-2及ERCC-1mRNA的表达情况，结果表明在pcDNA3.1-hSLPI-decorin基因转染的A549细胞组ERCC-1、Bcl-2mRNA表达水平明显降低，表明这可能是decorin基因可通过抑制ERCC-1、Bcl-2基因表达，从而表达提高对铂类药物A549细胞杀伤效率的机制。本研究通过成功的构建靶向肺癌细胞真核表达载体实现了decorin基因的在肺癌细胞的特异性表达及特异性抑制肺癌细胞的生长，该真核表达载体转染A549细胞后增强了铂类化疗药物对肺癌细胞的杀伤效率，这些结果充分说明经过分子优化层层组装的靶向表达载体pcDNA3.1-hSLPI-decorin能够特异地抑制肺癌细胞生长，为最终靶向载体治疗肺癌提供了实验基础。
苗雷英[8]（2012）在《磁性Fe3O4纳米微粒介导TRAIL基因治疗涎腺腺样囊性癌的研究》文中研究指明腺样囊性癌（Adenoid cystic carcinoma，ACC）是最常见的涎腺恶性肿瘤之一，约占涎腺上皮肿瘤的10%。其发生率在口腔颌面部肿瘤中占第二位。与其他涎腺恶性肿瘤相比，生长速度较慢，但预后相对较差。然而，现有的治疗方法包括手术、放疗、化疗及联合治疗均不能提高患者的生存率。为此，国内外的学者正试图寻找新的更有效的治疗方法。目前为止，恶性肿瘤仍然是导致人类死亡的主要问题，而他的治疗一直以来困扰人们。过去的几十年来，随着基因治疗的发展，恶性肿瘤的转基因治疗也开始兴起。转基因治疗是指将外源性基因导入体细胞以纠正遗传或后天获得的基因缺陷，经过20余年的探索与研究，转基因治疗在遗传性疾病、代谢性疾病、恶性肿瘤的治疗领域己经取得很大进步，个别己应用于临床。这一治疗方法具有巨大的潜力，但是安全有效的应用于人体之前，仍有很多问题需要解决，例如特异性、转染效率、毒副作用等等。在目前的研究中，我们努力开发一种新的纳米微粒系统达到特异的、高效的转染效率、低毒副作用的癌症转基因治疗。肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体TRAIL属于肿瘤坏死因子超家族。TRAIL可以诱导很多肿瘤细胞系凋亡。TRAIL的杀伤作用是肿瘤特异性的，对正常细胞及组织几乎没有副作用。虽然对于这种肿瘤特异性杀伤性作用的机制几乎不知道，但是TRAIL仍被认为是肿瘤治疗可能的有效的治疗肿瘤的有效基因，能为肿瘤治疗提供新的思路。人端粒酶逆转录酶（hTERT）在85-90%的恶性肿瘤中高表达，而在正常体细胞中几乎没有表达。所以hTERT被认为是肿瘤转基因治疗的特异性启动子。许多研究都将hTERT启动子使抗肿瘤基因在肿瘤细胞中靶向表达，对正常细胞没有杀伤作用，减少了其副作用。我们之前的研究表明，腺病毒载体编码TRAIL基因，并由hTERT启动子介导在体内可以有效杀伤ACC。本实验中我们设计使用质粒载体pACTERT-TRAIL。近年来，纳米技术飞速发展，并在很多医学领域有广泛的应用，尤其是多功能的纳米微粒的医学应用。纳米或者微米颗粒的表面可以与许多分子结合，例如DNA分子。磁性纳米微粒是一类特殊的纳米微粒，已经被用于药物输送、快速生物分离等方面。一些以前的研究表明DNA分子能通过共价键与磁性纳米微粒复合，在外加磁场作用下可以提高转染效率。在国家自然科学基金的资助下（30672338、30740420551、30830108），我们将转基因治疗与纳米技术联合开发了一种新的治疗方法。合成了以人端粒酶逆转录酶为启动子，表达肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体TRAIL的质粒载体pACTERT-TRAIL。此外合成了带正电的聚合物PEI修饰Fe3O4纳米微粒，使其与带负电的质粒载体复合，形成了Fe3O4-PEI-质粒复合物（FPP）。我们在碱性共沉淀方法里面加入了分枝状聚合物PEI，合成了PEI修饰Fe3O4纳米微粒作为载体。纳米微粒表面的胺基可以与质粒DNA的磷酸根通过静电作用复合形成含DNA的FPP。非病毒载体系统更加安全具有更小的副作用。它可以局部靶向输送DNA。溶酶体内聚合物PEI通过质子海绵效应保护DNA不被降解。并且FPP带正电可以与带负电的细胞膜复合，从而更快的进入细胞。研究表明：与带负电和中性的粒子相比，带正电的粒子可以与细胞结合从而更快的被细胞吞噬。PEI修饰的Fe3O4磁性纳米微粒组在Nd-Fe-B外加磁场作用下，将pACTERT-TRAIL转染SACC-83细胞，通过MTT、流式细胞仪等技术，观察其对SACC-83增殖和凋亡作用；体内以腺样囊性癌裸鼠移植瘤模型为研究对象，外加磁场作用下磁转染pACTERT-TRAIL，测量肿瘤的大小、检测目的基因的表达以及观察裸鼠脏器形态学和血液学等改变，探讨pACTERT-TRAIL对实验动物体内腺样囊性癌的治疗作用。结果发现，体外转染实验中，PEI修饰的Fe3O4磁性纳米微粒组在Nd-Fe-B外加磁场作用下，获得了更高的转染效率。MTT实验及Annexin V-FITC/PI双染测定SACC-83细胞的凋亡比率结果表明，PEI修饰的Fe3O4磁性纳米微粒组在Nd-Fe-B外加磁场作用下更加有效的杀伤靶细胞。体内实验中，磁性纳米载体组在外加磁场作用下，能显着抑制腺样囊性癌裸鼠移植瘤生长，并且荷瘤裸鼠的心脏、肝脏、肾脏、肺脏，未见明显的形态学改变，全血中红细胞、白细胞、血小板数目，血红蛋白含量也未见明显变化。人TRAIL具有选择性的肿瘤特异性杀伤活性，而对大多数正常细胞和组织几乎没有杀伤作用。然而以往的研究结果表明，高浓度的TRAIL在体外可诱发肝细胞和人脑细胞的毒性。TRAIL的毒性还包括对正常组织具有潜在的缺血性和出血性反应。为了尽量减少对TRAIL潜在的副作用，并限制在正常细胞中的表达，我们选择了hTERT启动子作为恶性肿瘤特异性启动子。我们以前的研究曾显示，hTERT启动子选择性介导的TRAIL在SACC-83中表达并有效杀伤了癌细胞。这些细胞的特异性杀伤肿瘤细胞作用中，我们使用的PEI修饰的氧化铁纳米粒子输送质粒进入靶细胞，通过在外加的Nd-Fe-B磁场作用下，可以将纳米质粒复合微粒进一步限制在肿瘤细胞。因此，PEI修饰的Fe3O4磁性纳米微粒在Nd-Fe-B磁场作用下与腺病毒载体相比更加简单，具体，高效，低毒性的转染方法。总之，这项研究表明，我们能够创建一个有效的PEI修饰的Fe3O4磁性纳米微粒，它可以连接质粒DNA，在磁场作用下可以有效地转染ACC的肿瘤细胞SACC-83，体内外均取得了较好的抑制肿瘤的作用。PEI修饰的Fe3O4磁性纳米微粒治疗具有很大的临床应用潜力。
高鹏[9]（2011）在《特异性介导DNA转导的多结构域嵌合蛋白的构建、表达及鉴定》文中研究说明利用基因工程操作技术克隆了4个分别含有表达产物为147个氨基酸的酵母转录激活因子核苷酸序列和（或）核定位信号（NLS）和（或）Ⅰ型人免疫缺陷病毒（HIV-1）穿膜肽（Tat）的嵌合核苷酸序列,并分别命名为GAL4/147、NLS-GAL4/147、Tat-GAL4/147和Tat-NLS-GAL4/147。将上述核苷酸序列克隆入原核表达载体pET28a（+）,分别构建了原核表达质粒pET28-G（含GAL4/147序列）、pET28-NG（含NLS-GAL4/147序列）、pET28-TG（含Tat-GAL4/147序列）和pET28-TNG（含Tat-NLS-GAL4/147序列）。将原核表达质粒转化感受态大肠杆菌BL21,利用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）进行诱导表达,并对诱导时间、培养温度、培养转速、IPTG浓度等表达条件进行优化,从获得目的蛋白G （pET28-G表达产物）、NG （pET28-NG表达产物）、TG （pET28-TG表达产物）和]NG （pET28-TNG表达产物）。结合本课题组构建的含有能够被GAL4识别和结合的半乳糖上游激活序列（UAS）、绿色荧光蛋白（EGFP）的真核表达质粒（pUAS-EGFP）,对所表达蛋白在细胞内和细胞外水平的UAS序列特异性结合和转导功能进行了探讨。结果表明,G、NG、TG和TNG均可有效的识别和结合含有UAS序列的质粒DNA；含有Tat片段的TG和TNG能够有效的将携带UAS序列的pUAS-EGFP质粒转导入真核细胞,且实现所转导pUAS-EGFP质粒外源基因（EGFP）的表达。结合本课题组构建的含有UAS序列、凋亡素基因（Apoptin）的真核表达质粒pUAS-Apoptin和所制备的多结构域嵌合蛋白,在体内、外分别对肝癌细胞HepG-2和C57BL/6小鼠荷肝癌模型进行了抑瘤作用研究。MTT检测、AO/EB检测、DAPI检测、Caspase酶检测、线粒体膜电位检测、细胞活性氧水平检测等细胞水平检测结果和免疫指标、抑瘤率、平均生存期、肿瘤生长趋势等模型动物体内检测结果表明,多结构域嵌合蛋白可以有效的介导pUAS-Apoptin对人肝癌细胞HepG-2和模型动物体内实体肿瘤的抑制。
曹兴[10]（2010）在《磁性纳米基因载体介导Mcl-1特异性shRNA治疗肝细胞癌的实验研究》文中进行了进一步梳理肝细胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC）是最常见的一种肝癌。乙肝、丙肝病毒感染或肝硬化引发的慢性炎症最终往往导致肝癌的发生。肝癌是我国癌症中的第2号杀手,每年死亡人数约占全世界死于肝癌人数的53%。凋亡的调节机制非常复杂,人们对凋亡调节基因,特别是其中的B细胞淋巴瘤／白血病基因-2（B cell lymphoma/leukemia-2,Bcl-2）这一基因家族进行了深入的研究。髓样细胞白血病基因-1（myeloid cell leukemia-1, Mcl-1）是Bcl-2基因家族中重要的抗凋亡成员,也是肝细胞癌中目前已知的重要抗凋亡因子,因此研究Mcl-1基因在肝癌组织中的异常表达对了解肝癌发生的可能机制及抗肿瘤治疗的可能途径有重要意义,是未来抗肿瘤治疗策略中的一个新靶点。RNA干扰技术（RNAi）是近年发展起来的新技术,RNAi引发的基因沉默作用是特异的和有效的,具有抑制作用强、稳定性高、细胞摄取相对容易等优点,为肿瘤的基因治疗提供新的、有前途的手段。是当前基因治疗研究最广为应用的基因沉默工具。小干扰RNA（siRNA）选择性抑制基因表达使基因治疗达到最大的特异性,但是弱小的细胞内导入能力、有限的血液稳定性及非特异的免疫原性阻碍了siRNA基因治疗的发展。相比普通的siRNA,具有短发卡结构的shRNA产生的RNAi效应更强,但国内外的研究都没能有效解决将siRNA导入体内细胞的转染效率低下的问题。基因转运需要合适的载体,理想的基因转运系统,应具有较高的基因转染效率、良好的靶向性和生物相容性、较高的稳定性及生物可降解性。目前的病毒载体和非病毒脂质体载体都存在不同程度的缺陷,因而寻找一种理想的基因载体就成为当务之急。纳米基因转运体的研制是目前国际纳米生物和肿瘤基因治疗研究领域重要的前沿性课题。纳米粒与DNA的连接多通过静电吸引作用来完成。DNA的磷酸骨架所带的负电荷只能与表面带正电性的载体结合。因此,需要利用生物活性分子对纳米颗粒的表面进行改性,使其表面携带阳离子物质,以起到防止纳米颗粒团聚,并有利于结合DNA分子的作用。Fe304磁性纳米粒兼具有磁靶向和被动靶向的特点,可以通过在其表面进行氨基功能化修饰,增加其稳定性和转染效率。基于以上背景和已有的研究成果,我们先用免疫化学Envision法测定抗凋亡因子Mcl-1在肝癌组织及癌旁组织中的表达,探讨凋亡机制失衡导致肝癌的发生的关系及临床病理学意义。结果显示,与高分化的肝癌组织相比,在低分化、增殖旺盛的肝癌组织中Mcl-1蛋白表达显着增强,62例肝癌组织中,Mcl-1阳性表达率为64.5%,高于临近癌旁组织,且与肝癌Edmonson grade分级、肿瘤直径、肝内外转移有关（P<0.05）,为下一步的肿瘤基因治疗提供了实验基础。我们设计、合成了Mcl-1siRNA,并且与空载体质粒psiRNA-Hhlneo链接构建重组质粒Mcl-1shRNA真核表达载体psiRNA1-3,通过酶切电泳、基因测序证实是否正确构建,通过转染高表达Mcl-1的人肝癌HepG2细胞检测Mcl-1mRNA下降水平,筛选出最佳的shRNA。结果重组质粒psiRNA-Hh 1 neo-shRNA经酶切电泳、基因测序证明寡核苷酸片段成功插入预计位点,且序列与我们设计合成的完全一致,说明我们成功地构建shRNA真核表达载体psiRNA1-3。重组质粒载体转染人肝癌HepG2细胞后,HepG2细胞Mcl-1 mRNA含量较转染前及对照组均有明显的下降（P<0.01）,说明我们制备的shRNA能有效抑制Mcl-1基因的表达,其中尤以psiRNA3抑制作用明显,抑制率达到58.3%。故在后续研究中,我们均以psiRNA3作为实验模板,探讨针对Mcl-1基因RNA干扰对肿瘤的治疗作用。通过改进的共沉淀法制备PLL修饰的Fe304磁性纳米粒（DMNP）,用透射电镜、激光粒度分析仪考察其形态、粒径、Zeta电位,MTT法观察其细胞毒性,不同的基因／纳米粒材料比制备基因纳米复合物,通过其形态、粒径、Zeta电位、基因保护实验考察磁性基因载体的理化特性,转染pEGFP-Cl绿色荧光蛋白质粒观察基因转染效率。结果制备的葡聚糖包裹的Fe304纳米粒径均一,分散性良好。PLL修饰的氨基功能化Fe304粒径（32±4）nm, Zeta电位为+18.23mV,对基因有较好的保护作用,选此条件下制备的基因纳米复合物进行基因转染,持续作用时间较脂质体和裸基因均要长。故后续研究中以此磁性纳米基因载体进行基因治疗研究。培养人肝癌HepG2细胞后,以DMNP进行转染,并观察外加磁场作用下对基因沉默效果的影响,72h后用RT-PCR和Western Blot检测Mcl-1 mRNA和Mcl-1蛋白的抑制率,用流式细胞仪及荧光显微镜检测细胞周期的改变和细胞凋亡情况,从体外考察基因治疗效果；建立裸鼠肝癌动物模型,以基因纳米复合物作瘤内多次注射,绘制肿瘤生长曲线,24天后切取肿瘤检测瘤重抑制率,从动物在体模型考察基因治疗效果。结果发现RNA干扰治疗组在外加磁场作用下Mcl-1mRNA和蛋白质的抑制率均明显提高,分别达到72.3%和54.2%,较未加磁场作用的治疗组与阴性治疗组抑制率均显着增强（均P<0.05）。移植瘤动物实验表明RNA干扰治疗组的肿瘤生长明显减慢,较假性治疗组明显增强（P<0.01）。说明我们制备的磁性纳米基因载体（DMNP）介导的Mcl-1shRNA对Mcl-1高表达的肝细胞癌有良好的治疗效果。
二、NANOPARTICLE AS A NEW GENE TRANSFERRING VECTOR IN SPECIFIC EXPRESSION GENE（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、NANOPARTICLE AS A NEW GENE TRANSFERRING VECTOR IN SPECIFIC EXPRESSION GENE（论文提纲范文）
（1）盐环境来源微生物多相分类及嗜盐古菌基因组适应性与演化研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 盐环境与微生物 |
| 1.1.1 盐环境的多样性 |
| 1.1.2 盐环境中微生物的多样性 |
| 1.1.3 微生物的耐盐或嗜盐机制 |
| 1.1.4 嗜盐微生物的应用 |
| 1.2 微生物多相分类学 |
| 1.2.1 微生物分类学的发展 |
| 1.2.2 微生物多相分类学的研究内容 |
| 1.2.3 组学时代微生物多相分类学的挑战 |
| 1.3 高通量测序技术 |
| 1.3.1 测序技术的发展历程 |
| 1.3.2 微生物基因组研究 |
| 1.3.4 宏基因组研究 |
| 1.4 嗜盐古菌 |
| 1.4.1 古菌——生命的第三域 |
| 1.4.2 嗜盐古菌概述 |
| 1.4.3 嗜盐古菌的基因组研究 |
| 1.4.4 基因组中新基因的起源与演化 |
| 1.5 本研究的目的、意义与内容概述 |
| 第二章 典型盐湖的微生物多样性和群落结构研究 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.1.1 环境和样品 |
| 2.1.2 培养基 |
| 2.1.3 菌株的分离与保藏 |
| 2.1.4 16S r RNA基因序列分析 |
| 2.1.5 多样性指数计算方法 |
| 2.1.6 宏基因组分析方法 |
| 2.2 结果与讨论 |
| 2.2.1 阿牙克库木湖群落结构分析 |
| 2.2.2 玛纳斯湖群落结构分析 |
| 2.2.3 其他盐湖可培养微生物多样性 |
| 2.2.4 盐湖可培养微生物多样性指数分析 |
| 2.2.5 盐湖可培养微生物群落结构比较 |
| 2.3 本章小结 |
| 第三章 6 株盐环境来源微生物多相分类学研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 菌株来源 |
| 3.1.2 菌株的培养与保藏 |
| 3.1.3 多相分类学研究方法 |
| 3.2 结果与讨论 |
| 3.2.1 菌株WM3~T的多相分类学研究结果 |
| 3.2.2 菌株B3~T的多相分类学研究结果 |
| 3.2.3 菌株15181~T的多相分类学研究结果 |
| 3.2.4 菌株15182~T的多相分类学研究结果 |
| 3.2.5 菌株63075~T的多相分类学研究结果 |
| 3.2.6 菌株W635~T的多相分类学研究结果 |
| 3.3 本章小结 |
| 第四章 嗜盐古菌基因组适应性与演化研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 菌株来源 |
| 4.1.2 测序方案的选择 |
| 4.1.3 菌株Salinigranum rubrum GX10~T基本信息 |
| 4.1.4 菌株GX10~T培养基和培养条件 |
| 4.1.5 基因组DNA的提取和检测 |
| 4.1.6 测序和组装 |
| 4.1.7 基因组注释及分析 |
| 4.1.8 菌株GX10~T新基因注释与分析 |
| 4.2 结果与讨论 |
| 4.2.1 测序所获得的基因组 |
| 4.2.2 菌株GX10~T基因组DNA提取结果 |
| 4.2.3 菌株GX10~T测序和组装结果 |
| 4.2.4 菌株GX10~T基因组基本特征 |
| 4.2.5 菌株GX10~T基因COG功能注释 |
| 4.2.6 菌株GX10~T对高盐环境的适应分析 |
| 4.2.7 菌株GX10~T对强辐射环境适应机制分析 |
| 4.2.8 菌株GX10~T CRISPR-Cas系统相关基因 |
| 4.2.9 菌株GX10~T基因组中重金属抗性与代谢相关的基因 |
| 4.2.10 菌株GX10~T新基因的起源与演化 |
| 4.2.11 菌株GX10~T基因组中嗜盐酶相关基因 |
| 4.2.12 菌株GX10~T基因组中PHA合成相关基因 |
| 4.3 本章小结 |
| 第五章 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 Ⅰ 细菌多相分类学鉴定方法 |
| 附录 Ⅱ 嗜盐古菌模式菌株基因组圈图 |
| 附录 Ⅲ 新基因注释用到的代码 |
| 攻读学位期间发表的学术论文(含待发表) |
| 致谢 |
（2）反刍动物瘤胃功能进化的遗传基础及与微生物互作的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 新器官起源研究进展 |
| 1.2.1 新器官起源的功能创新 |
| 1.2.2 新器官起源的结构创新 |
| 1.3 反刍动物瘤胃的概述 |
| 1.3.1 反刍动物瘤胃的解剖生理特征 |
| 1.3.2 反刍动物瘤胃的起源进化假设 |
| 1.3.3 反刍动物瘤胃的研究进展 |
| 1.4 进化系统生物学的研究方法及研究进展 |
| 1.4.1 进化系统生物学的研究方法 |
| 1.4.2 进化系统生物学的研究进展 |
| 1.5 研究目的与意义 |
| 第二章 反刍动物瘤胃结构和功能相关基因的筛选 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 系统发育树构建 |
| 2.1.2 样本采集、RNA提取和转录组测序 |
| 2.1.3 转录组分析 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 多室胃物种系统发育进化关系 |
| 2.2.2 用于比较转录组分析的数据生成 |
| 2.2.3 比较瘤胃与双峰驼和鲸豚物种第一胃室的基因表达谱 |
| 2.2.4 瘤胃募集基因分析 |
| 2.2.5 早期发育过程中瘤胃和食道比较转录组分析 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 瘤胃进化关键候选基因的识别和功能验证 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 进化分析 |
| 3.1.2 蛋白质跨膜螺旋、结构域和信号肽的预测 |
| 3.1.3 蛋白三维结构模拟 |
| 3.1.4 瘤胃和食道染色质开放性测序(ATAC-seq)与分析 |
| 3.1.5 瘤胃核心基因的功能实验验证 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 瘤胃进化增强的酮体合成能力 |
| 3.2.2 瘤胃进化出增强的免疫系统和调控微生物能力 |
| 3.2.3 新进化的调控元件参与瘤胃上皮吸收功能 |
| 3.2.4 正选择基因参与瘤胃上皮吸收功能 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 瘤胃基因表达动态、微生物演替及两者的功能相关性 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 动物和样本收集 |
| 4.1.2 瘤胃转录组测序与分析 |
| 4.1.3 瘤胃微生物宏基因组测序与分析 |
| 4.1.4 瘤胃基因表达模块与微生物属水平模块和KEGG通路丰度的互作分析 |
| 4.1.5 GO和KEGG富集分析 |
| 4.1.6 DEFB1和LYZ1基因在毕赤酵母表达系统中的表达 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 瘤胃早期发育的基因表达动态模式 |
| 4.2.2 瘤胃早期发育过程中微生物区系和功能的演替 |
| 4.2.3 瘤胃与微生物功能的相关性 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 结论与展望 |
| 第六章 创新点 |
| 附录 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（3）基于GEO数据挖掘及纳米基因传递技术的前列腺癌靶向抑制作用研究（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照 |
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 利用生物信息学的方法寻找前列腺癌靶向基因 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第二章 SLC4A4 基因在前列腺癌中的作用 |
| 1 材料与设备 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第三章 磁性纳米粒子MNP-APTES的合成 |
| 1 材料与设备 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第四章 纳米粒子复合物MNP-Sh-SLC4A4 在体内外对前列腺癌的抑制作用 |
| 1 材料与设备 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 全文总结 |
| 文献综述 前列腺癌的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
（4）鸡卵清蛋白启动子功能分析及验证（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩写符号说明 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 启动子的概念 |
| 1.1.1 核心启动子元件(CPE) |
| 1.1.2 上游启动子元件(UPE) |
| 1.2 鸡卵清蛋白 |
| 1.2.1 卵清蛋白简介 |
| 1.2.2 鸡卵清蛋白的组织特异性与诱导表达 |
| 1.2.3 卵清蛋白增强子序列 |
| 1.3 鸡卵清蛋白上游启动子转录因子 |
| 1.3.1 COUP-TFs作用的分子机制 |
| 1.3.2 COUP-TFs的生理功能 |
| 1.4 启动子研究分析方法 |
| 1.4.1 启动子预测工具 |
| 1.4.2 双荧光素酶报告基因检测 |
| 1.5 CRISPR-d Cas9 与基因转录后调控 |
| 1.5.1 dCas9简介 |
| 1.5.2 CRISPR-d Cas9 转录激活或转录抑制效应元件 |
| 1.6 鸡原始生殖细胞 |
| 1.6.1 鸡胚原始生殖细胞的起源 |
| 1.6.2 鸡胚原始生殖细胞超微结构 |
| 1.6.3 PGCs的分离 |
| 1.6.4 鸡PGCs分离培养相关影响因素 |
| 1.6.5 PGCs的生物学特性 |
| 1.6.6 PGCs在转基因家禽研究中的应用 |
| 1.7 输卵管特异性表达转基因鸡研究 |
| 1.7.1 转基因鸡研究方法 |
| 1.7.2 输卵管特异性表达转基因鸡研究简史 |
| 1.7.3 输卵管特异基因的高通量筛选及其启动子的应用 |
| 1.7.4 CRISPR/Cas9介导的输卵管特异性表达转基因鸡研究 |
| 1.8 本研究的目的与意义 |
| 第二章 CRISPR-d Cas9-VP64 介导的鸡卵清蛋白启动子转录活性分析 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料和试剂 |
| 2.2.1 主要试剂 |
| 2.2.2 主要仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 含雌激素应答元件的启动子片段(cERE-cOVP-2785)的克隆 |
| 2.3.2 重组表达载体p GL3-cERE-cOVP-2785 的构建 |
| 2.3.3 重组表达载体p GL3-cOVP-2785 的构建 |
| 2.3.4 sgRNA的设计 |
| 2.3.5 sgRNA表达载体构建 |
| 2.3.6 重组质粒中量抽提 |
| 2.3.7 转染 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 启动子载体构建结果 |
| 2.4.2 质粒与转染试剂转染最优比例筛选 |
| 2.4.3 不同长度启动子活性的比较 |
| 2.4.4 卵清蛋白启动子(cERE-cOVP-2785)不同区域转录活性分析 |
| 2.4.5 雌激素对启动子的影响 |
| 2.4.6 激活雌激素应答元件不同区域作用结果 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 小结 |
| 第三章 鸡卵清蛋白上游启动子转录因子Ⅰ/Ⅱ功能分析 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料和试剂 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 转录因子重组表达载体构建 |
| 3.3.2 去内毒素重组质粒提取 |
| 3.3.3 COUP-TFⅠ/Ⅱ调控作用 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 含转录因子载体构建结果 |
| 3.4.2 COUP-TFⅠ与COUP-TFⅡ的调控作用 |
| 3.4.3 两个转录因子协同作用分析 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 小结 |
| 第四章 鸡原始生殖细胞的分离及培养 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料和试剂 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 主要仪器 |
| 4.2.3 主要试剂 |
| 4.2.4 有关溶液的配制 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 饲养层的准备 |
| 4.3.2 从5.5日龄的鸡胚(28期)性腺中分离PGCs |
| 4.3.3 从2.5日龄的鸡胚(14期)血液中分离PGCs |
| 4.3.4 鸡PGCs的体外培养体系 |
| 4.3.5 PGCs的传代 |
| 4.3.6 PGCs的冷冻保存 |
| 4.3.7 PGCs的复苏 |
| 4.3.8 PGCs的鉴定 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 两种不同来源PGCs的分离培养 |
| 4.4.2 两种不同来源PGCs的克隆形成能力 |
| 4.4.3 不同培养体系对鸡PGCs增殖能力的影响 |
| 4.4.4 PGCs的冷冻保存 |
| 4.4.5 PGCs生物学特性鉴定 |
| 4.5 讨论 |
| 4.5.1 鸡PGCs的分离培养 |
| 4.5.2 鸡PGCs体外长期培养的难点 |
| 4.6 小结 |
| 第五章 鸡卵清蛋白启动子的功能验证 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与试剂 |
| 5.2.1 主要试剂 |
| 5.2.2 主要仪器 |
| 5.2.3 有关溶液配制 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 慢病毒的包装 |
| 5.3.2 鸡输卵管上皮细胞(OECs)的分离 |
| 5.3.3 慢病毒体外感染鸡OECs及 PGCs |
| 5.3.4 体外感染后外源基因表达情况检测 |
| 5.3.5 慢病毒体内注射 |
| 5.3.6 外源基因表达检测 |
| 5.4 实验结果 |
| 5.4.1 LaSRT法测定病毒滴度 |
| 5.4.2 OECs细胞分离培养 |
| 5.4.3 cERE-cOVP-2785 体外功能验证 |
| 5.4.4 cERE-cOVP-2785 体内功能验证 |
| 5.5 讨论 |
| 5.6 小结 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文情况 |
（5）基于基因和分子靶向治疗技术的C225/p5HRE-cfosp-iNOS-IFNG磁性白蛋白纳米球治疗肺癌的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 缩略语(Abbreviations) |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 技术路线 |
| 文献综述一 肺癌基因治疗的研究进展 |
| 参考文献 |
| 文献综述二 基因电路在肿瘤治疗中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 第一章 肿瘤治疗基因合成和表达研究：基于乏氧/辐射双调控基因电路的p5HRE-cfosp-iNOS-IFNG真核表达质粒的构建与鉴定及其在细胞内的诱导表达 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 小结 |
| 参考文献 |
| 第二章 C225-Fe3O4/p5HRE-cfosp-iNOS-IFNG(靶向载基因磁性白蛋白纳米球)的制备及靶向性研究 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 小结 |
| 参考文献 |
| 第三章 基于基因和分子靶向治疗技术的靶向载基因磁性白蛋白纳米球治疗肺癌的体内外实验研究 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 小结 |
| 参考文献 |
| 第四章 靶向载基因磁性白蛋白纳米球治疗肺癌的分子机制研究 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 小结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 博士在读期间发表文章 |
（7）Decorin基因靶向抑制肺癌A549细胞及增强铂类药物杀伤效率的体外实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩写词表 |
| 第一篇 前言 |
| 第二篇 实验研究 |
| 第1章 hSLPI 基因启动子的克隆及调控 decorin 基因真核表达载体的构建 |
| 1.1 主要材料与仪器 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 讨论 |
| 第2章 hSLPI 启动子调控 decorin 基因肺癌 A549 细胞表达与杀伤肺癌细胞的研究 |
| 2.1 主要材料和仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.4 讨论 |
| 第3章 靶向 decorin 转染对铂类化疗药物敏感性的影响及其机制的研究 |
| 3.1 材料和仪器 |
| 3.2 方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 第三篇 结论 |
| 第四篇 综述 |
| 第1章 肺癌基因靶向治疗的研究进展 |
| 1.1 肺癌基因治疗的靶向性转导 |
| 1.2 靶向性转录 |
| 1.3 靶向性增殖病毒在肺癌基因治疗中的应用 |
| 1.4 展望 |
| 第2章 Decorin 基因抗肿瘤作用研究进展 |
| 2.1 Decorin 的分子结构 |
| 2.2 Decorin 的一般特性 |
| 2.3 Decorin 的抗肿瘤作用 |
| 2.4 Decorin 在恶性肿瘤的表达 |
| 2.5 Decorin 的抗肿瘤作用机制 |
| 2.6 Decorin 联合化疗药物对恶性肿瘤细胞的作用 |
| 2.7 展望 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 作者简介 |
| 科研成果 |
| 致谢 |
（8）磁性Fe3O4纳米微粒介导TRAIL基因治疗涎腺腺样囊性癌的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第1章 引言 |
| 第2章 文献综述 |
| 2.1 涎腺疾病的转基因治疗 |
| 2.1.1 转基因治疗技术的发展 |
| 2.1.2 转基因治疗的临床应用 |
| 2.1.3 转基因治疗应用于涎腺疾病 |
| 2.2 转基因治疗中的载体系统 |
| 2.2.1 病毒载体 |
| 2.2.2 非病毒载体 |
| 2.2.3 纳米转基因载体 |
| 2.2.4 纳米载体靶向性 |
| 第3章 PEI 修饰的磁性 Fe_3O_4纳米基因载体的制备及表征 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 第4章 磁性纳米复合基因载体转染效率测定 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.3 讨论 |
| 第5章 Fe_3O_4-PEI 纳米微粒介导 TRAIL 基因对涎腺腺样囊性癌杀伤作用 |
| 5.1 材料和方法 |
| 5.2 结果 |
| 5.3 讨论 |
| 第6章 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间取得的科研成果 |
| 致谢 |
（9）特异性介导DNA转导的多结构域嵌合蛋白的构建、表达及鉴定（论文提纲范文）
| 内容提要 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 第1篇 绪论 |
| 第2篇 文献综述 |
| 第1章 基因治疗研究进展 |
| 1.1 概述 |
| 1.2 基因治疗的伦理学 |
| 1.3 严谨的遗传序列变化 |
| 1.4 体细胞基因治疗 |
| 1.5 转基因传递方法 |
| 1.6 内源性基因表达的抑制 |
| 1.7 体基因疗法:特殊途径 |
| 1.8 体基因疗法的伦理学 |
| 1.9 种系基因治疗 |
| 1.10 种系基因治疗的应用 |
| 1.11 种系基因治疗的伦理学 |
| 1.12 肿瘤基因治疗策略 |
| 第2章 基因治疗载体研究进展 |
| 2.1 概述 |
| 2.2 病毒载体 |
| 2.3 非病毒载体 |
| 2.4 结语 |
| 第3篇 研究内容 |
| 第1章 原核表达质粒的构建 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 第2章 多结构域嵌合蛋白在大肠杆菌中的表达、鉴定及纯化 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第3章 多结构域嵌合蛋白的体外转导作用研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第4章 多结构域嵌合蛋白的体内转导作用研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第4篇 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（10）磁性纳米基因载体介导Mcl-1特异性shRNA治疗肝细胞癌的实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 第一部分 肝癌组织中Mcl-1抗凋亡蛋白的表达及意义 |
| 一、前言 |
| 二、材料与方法 |
| 2.1 研究对象 |
| 2.2 仪器与试剂 |
| 2.3 免疫组织化学 |
| 2.4 结果判定 |
| 2.5 统计学分析 |
| 三、结果 |
| 3.1 光镜下观察 |
| 3.2 免疫组织化学结果 |
| 四、讨论 |
| 第二部分 靶向MCl-1的shRNA重组质粒载体的构建及评价 |
| 一、前言 |
| 二、材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 三、结果 |
| 3.1 psiRNA-hH1neo重组质粒酶切电泳鉴定 |
| 3.2 psiRNA质粒的浓度和纯度测定 |
| 3.3 不同的shRNA对Mcl-1 mRNA的抑制率 |
| 四、讨论 |
| 第三部分 生物磁性纳米基因载体的制备和及其与质粒DNA的连接 |
| 一、前言 |
| 二、材料与方法 |
| 2.1 试剂及仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 3.1 制备产物Fe_3O_4纳米粒子形貌表征 |
| 3.2 PLL修饰Fe_3O_4纳米粒子与DNA的结合效率测定结果 |
| 3.3 PLL修饰Fe_3O_4纳米粒子对DNA的保护实验结果 |
| 3.4 PLL修饰Fe_3O_4纳米粒基因转运体系的细胞毒性实验(MTT) |
| 3.5 普鲁士蓝染色结果 |
| 四 讨论 |
| 第四部分 磁性纳米介导的Mcl-1 shRNA体内外治疗肝细胞癌的实验研究 |
| 一、前言 |
| 二、材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 三、结果 |
| 3.1 RT-PCR检测Mcl-1 mRNA抑制情况 |
| 3.2 Western blot检测Mcl-1蛋白 |
| 3.3 不同组细胞生长曲线的绘制 |
| 3.4 流式细胞仪检测各组HepG2细胞周期 |
| 3.5 裸鼠肝癌移植瘤动物模型 |
| 四、讨论 |
| 参考文献 |
| 综述·一 |
| 参考文献 |
| 综述·二 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 研究成果 |
四、NANOPARTICLE AS A NEW GENE TRANSFERRING VECTOR IN SPECIFIC EXPRESSION GENE（论文参考文献）
- [1]盐环境来源微生物多相分类及嗜盐古菌基因组适应性与演化研究[D]. 韩帅波. 浙江大学, 2021(01)
- [2]反刍动物瘤胃功能进化的遗传基础及与微生物互作的研究[D]. 潘香羽. 西北农林科技大学, 2020
- [3]基于GEO数据挖掘及纳米基因传递技术的前列腺癌靶向抑制作用研究[D]. 肖峰. 重庆医科大学, 2020(01)
- [4]鸡卵清蛋白启动子功能分析及验证[D]. 韦茏芹. 广西大学, 2020(02)
- [5]基于基因和分子靶向治疗技术的C225/p5HRE-cfosp-iNOS-IFNG磁性白蛋白纳米球治疗肺癌的实验研究[D]. 张皓. 东南大学, 2016(02)
- [6]基因枪转化技术在动物转基因中应用的研究进展[J]. 刘霞,杜卫华,朱化彬,曹文广. 中国畜牧兽医, 2013(08)
- [7]Decorin基因靶向抑制肺癌A549细胞及增强铂类药物杀伤效率的体外实验研究[D]. 吕俊锋. 吉林大学, 2012(09)
- [8]磁性Fe3O4纳米微粒介导TRAIL基因治疗涎腺腺样囊性癌的研究[D]. 苗雷英. 吉林大学, 2012(09)
- [9]特异性介导DNA转导的多结构域嵌合蛋白的构建、表达及鉴定[D]. 高鹏. 吉林大学, 2011(10)
- [10]磁性纳米基因载体介导Mcl-1特异性shRNA治疗肝细胞癌的实验研究[D]. 曹兴. 中南大学, 2010(02)