一、鸡传染性支气管炎病毒感染的免疫致病机制（论文文献综述）
武奇[1]（2021）在《IBV S蛋白抗原表位鉴定及与宿主细胞互作的研究》文中指出传染性支气管炎（Infectious bronchitis,IB）是由传染性支气管炎病毒（Infectious bronchitis virus,IBV）引起鸡的一种急性、高度接触性传染病,主要表现为呼吸道与肾脏疾病。IBV目前仍是危害养禽业的重要病原体之一,给全球的养禽业造成了巨大的经济损失。疫苗免疫在控制IB方面扮演着重要作用,IBV抗原的不断变异严重制约了现有的疫苗研发策略和血清学诊断。S蛋白是含有丰富中和抗原表位的表面蛋白,也是病毒进入宿主细胞的关键蛋白。但是目前对于S蛋白功能的认识及其与宿主细胞的互作还知之甚少。因此,本研究围绕IBV防控关键技术的开发,从S蛋白广谱中和表位鉴定及S蛋白与宿主细胞互作两个方面进行了研究。具体内容如下:1、传染性支气管炎病毒S蛋白新的关键抗原表位鉴定本研究首先利用软件对IBV S蛋白进行分析,根据S蛋白序列的抗原性、亲水性、表面抗原指数、保守性等指标,选取并人工合成五条抗原性和亲水性好、高度保守的多肽。通过多肽和血清交叉反应,证明五条多肽均与IBV血清有反应原性,其中Pep1的反应性最好,可以与检测的5个血清型中的4个血清型血清有很好的交叉反应性,仅仅不与New cluster型毒株CK/CH/2010/JT1的血清发生交叉反应。人工合成CK/CH/2010/JT1株的该段多肽序列,命名Pep6。通过对多肽序列比较分析,发现Pep1与Pep6序列存在5个氨基酸差异。多肽血清交叉反应结果显示Pep6不仅可以与CK/CH/2010/JT1血清反应,同时与所有检测血清均发生交叉反应。为了确定影响抗原性改变的关键氨基酸,对多肽进行截短和单个氨基酸突变,最后确定16R氨基酸是决定抗原表位广谱性的关键氨基酸。对NCBI数据库中所有的全基因毒株进行序列分析,发现传统的Mass型毒株均是16K毒株,而目前在中国流行的QX型,TW-1型等毒株均是16R突变株,进一步分析发现,16R突变株自20世纪90年代开始出现,随后发展成为流行优势株,目前在全球各大洲均有分布。本研究鉴定了一个广谱的抗原表位,并证明了 16R氨基酸是该抗原表位具有广谱性的关键。这为新型广谱疫苗的研发和检测方法的建立提供了一定理论指导。2、检测IBV抗体多肽ELISA方法的建立及初步应用本实验室在前期的IBV流行病学调查过程中发现,现有的商品化IBV抗体检测试剂盒,不能很好的检测出新型IBV变异株的血清抗体。利用Pep6抗原表位多肽作为包被抗原,建立检测IBV抗体的pELISA方法。本研究首先对检测条件进行优化,确定pELISA最佳反应条件为:最佳包被浓度0.63 μg/mL;血清最佳稀释度为1:200;血清最佳孵育时间为60 min;酶标抗体最佳孵育时间60 min;底物最佳反应时间20 min。确定pELISA的临界值为0.185。批间和批内重复性检测结果显示变异系数均小于10%,具有很好的重复性。特异性检测结果表明pELISA其他禽类病毒阳性血清均不发生非特异性反应。以IFA为参考方法,测定了 250份临床血清样品,结果显示,pELISA的敏感性、特异性和准确性分别为99.14%、94.12%和98.80%,显着高于商品化试剂盒。为评估pELISA在检测IBV疫苗引起的免疫应答中的适用性,本研究测定了 IBVH52、4/91疫苗免疫后不同时间点采集的血清,结果显示pELISA最早在疫苗接种后7 d就能检测出IBV特异性抗体,而商品化试剂盒在免疫后14 d才能检测出IBV特异性抗体。进一步分析发现,pELISA检测出的阳性率明显高于商品化的ELISA试剂盒,提示本研究建立的pELISA在检测IBV抗体和评价IBV疫苗方面具有一定的应用价值。3、应用pELISA替代中和实验评估IBV疫苗免疫应答的初步研究鸡群中血清的中和抗体是反映鸡群免疫状况的主要指标,也是评价疫苗免疫效果的关键指标之一。传统上用中和试验测定血清中和抗体,但中和实验操作复杂,技术程度较高,制约了疫苗应用后的效率评价。然而,目前还没有简单、快速的检测IBV中和抗体的替代方法。为此,探究了 pELISA作为一种潜在替代中和实验评价IBV疫苗的免疫应答的可能。首先制备Pep6的多抗血清,ELISA结果显示,多肽血清与多肽能发生特异性反应。病毒与血清的交叉中和实验结果显示Pep6的多抗血清能够中和IBV病毒,中和效价为1:8,表明Pep6含中和抗原表位。随后,应用pELISA与中和实验比较检测IBV 阳性血清,结果显示血清中和效价与pELISA效价具有很好的正相关性。进一步比较检测了 M41、H52、CK/CH/2010/JT1、CK/CH/2014/FJ14 毒株免疫/攻毒后不同时间点采集的血清,结果显示免疫/攻毒后血清的中和效价和ELISA效价均随免疫时间逐渐升高。各毒株血清的中和效价与pELISA效价的具有明显的正相关性,总相关系数达到0.83。该方法的建立为临床基层IBV疫苗免疫效果评价提供了技术条件。4、IBV S1蛋白与宿主细胞膜蛋白互作的研究IBV S蛋白在病毒感染复制过程起关键作用,通常S1与识别宿主受体并结合细胞相关,而S2促进病毒囊膜与细胞膜融合。尽管IBV是最早发现的冠状病毒,目前对IBV S1与宿主细胞互作的认识仍非常有限,还没有鉴定出IBV的蛋白受体,同时对于IBV入胞机制仍知之甚少。为此本研究构建了正确表达S1-IgGFc融合蛋白的真核质粒pCAGGS-S1-IgGFc,利用Protein G纯化柱纯化了 S1-IgGFc融合蛋白,然后应用细胞膜提取试剂盒提取CEK细胞的膜蛋白,将纯化的融合蛋白与CEK细胞膜蛋白进行免疫共沉淀（Co-IP）,SDS-PAGE银染结果显示,与对照相比发现了 3条差异条带。将差异条带送质谱测序,共鉴定出GRP78、ANXA2、HSPA9、Vimentin等4种宿主蛋白与IBV S1蛋白互作,提示这些蛋白可能在病毒感染细胞发挥某种作用,为进一步探究IBV与宿主细胞膜蛋白的互作机制研究提供一定的材料和理论基础。5、GRP78蛋白促进IBV在CEK细胞中的复制GRP78蛋白又称HSPA5蛋白,是热休克蛋白家族的成员之一。传统上认为GRP78是一种ER伴侣蛋白,目前GRP78蛋白因在多种病毒的感染过程中发挥重要作用而被人们所熟知。在上一部分研究的基础上,通过Co-IP实验,进一步确定了 IBV S1蛋白与GRP78蛋白确实存在相互作用。本研究用抗GRP78多克隆抗体封闭CEK细胞,抑制GRP78蛋白的表达,结果发现抗GRP78多克隆能够有效抑制IBV M41在CEK细胞中的复制。进一步用siRNA干扰实验证明,当CEK细胞表面的GRP78的表达被抑制时,IBVM41的感染也被显着抑制。非易感细胞重建实验结果提示,不同浓度的GRP78真核质粒（0.25μg、0.5μg、1.0μg、2.0μg）转染CEF细胞,随着转染质粒浓度不断升高,IBVM41感染CEF细胞的感染能力逐渐增强,成明显的正相关。综上所述,GRP78蛋白在IBV感染CEK细胞过程中扮演了重要角色,该GPR78可能促进IBV进入宿主细胞。
乔清华[2]（2020）在《泰安及周边地区规模化蛋鸡场主要病毒性疾病临床诊断调查及免疫程序调整优化》文中研究表明近年来随着蛋鸡养殖业的快速发展,蛋鸡场养殖规模越来越大,养殖密度不断增加,饲养周期也有所延长,疫病防控压力有增无减,尤其是多种血清型禽流感、新城疫、传染性支气管炎、传染性喉气管炎、心包积液综合征等新老病毒性传染病在蛋鸡场广为流行,规模化蛋鸡场科学合理免疫程序制定显得尤为重要。科学合理免疫程序制定的依据主要基于相关疾病的流行病学调查和免疫效果的评估,在此基础上对免疫程序进行调整优化。本研究通过血清学、病理学及病原学检测方法,对泰安及周边地区的部分规模化蛋鸡场禽流感、新城疫、传染性支气管炎、传染性喉气管炎、心包积液综合征等病毒性传染病的流行情况进行了调查分析。调查结果显示,泰安及周边地区的大多数规模化蛋鸡场上述疫病的免疫防控效果较好,但H9亚型禽流感、非典型新城疫、传染性支气管炎、传染性喉气管炎、心包积液综合征等传染性疾病尚有较高的发病率,有的鸡场由此造成了较大的经济损失。结合鸡群发病特点、临床剖检、病理组织学检查,并使用PCR或RT-PCR方法进行检测,对常见病毒性疾病的阳性检出率进行统计。结果显示在临诊疑似病例中FAdV检出率最高,阳性率为86.60%（84/97）,其次为ILTV和IBV,阳性率分别55.56%（15/27）和48.28%（14/29）,低致病性禽流感和非典型新城疫临床疑似病例较多,对病鸡进行剖检时也常见明显的特征病变,但核酸检出率较低,H9N2亚型AIV阳性率为19.72%（19/106）,NDV阳性率为10.59%（9/85）。2018-2019年对泰安及周边部分地区规模化蛋鸡场采集血清进行禽流感（H5、H7、H9）、新城疫抗体水平检测及抗体合格率统计分析,结果显示部分鸡场抗体水平偏低或离散度过大,可能存在H9AIV和NDV野毒感染,疫病风险较大。分析其原因主要与免疫程序不合理或疫苗选择不当,缺乏科学的免疫效果评估有关。将2018-2019年检测的禽流感、新城疫抗体滴度按照季度进行抗体合格率统计,统计结果显示,不同季度的抗体合格率略有所不同。其中,H5、H7抗体在第二季度合格率最低分别为92.57%、87.32%,第四季度合格率最高分别为98.42%、95.02%;H9抗体第二季度合格率最低为82.49%,第一季度合格率最高为94.11%;ND抗体第三季度合格率最低为89.67%,第一季度合格率最高为94.64%。整体分析可知,禽流感抗体合格率由高到低依次为:一季度>四季度>三季度月>二季度。新城疫抗体合格率由高到低依次为:一季度>二季度>四季度>三季度。基于流行病学调查及抗体检测结果,以泰安市某规模化蛋鸡场为试验场,根据该场养殖情况对禽流感与新城疫的免疫程序进行了调整优化,制定了免疫效果检测评估方案和生物安全防控措施,跟踪检测显示,免疫程序调整之后,未再出现传染性支气管炎、传染性喉气管炎、心包积液综合征疑似病例;禽流感、新城疫免疫效果得到明显改善,未见H9亚型禽流感和非典型新城疫的发生,H7合格率由调整前的80%升高至100%,H9合格率由调整前的66.67%升高至93.33%,同时所有抗体水平的离散度明显降低,抗体水平合格率、保护力增加,鸡群的群体免疫力增强,有效化解主要病毒病的发生风险,具有一定的示范推广价值。本研究进一步丰富了泰安及周边地区规模化蛋鸡场流行病学调查资料,初步摸清了规模化蛋鸡场禽流感、新城疫疫苗免疫状态,免疫程序的调整优化及免疫效果检测评估方法将有助于蛋鸡场传染性疾病的有效防控。
廖凯[3]（2020）在《TW Ⅰ型传染性支气管炎病毒的致病性评价与实时荧光定量PCR检测方法的建立》文中提出传染性支气管炎（IB）是由传染性支气管炎病毒（IBV）引起的急性、高度接触性传染病,可导致鸡呼吸困难、肾脏尿酸盐沉积及死亡,给养鸡业造成了很大的经济损失。TW Ⅰ型IBV毒株于1996年中国台湾首次发现。自2009年传入大陆后,该型毒株在我国迅速蔓延。近几年,TW Ⅰ型IBV毒株分离率大约占我国IBV分离株总数的15%,成为了我国仅次于QX型的IBV第二大流行优势基因型。本研究系统地评价了 TW Ⅰ型毒株对雏鸡及产蛋鸡的致病性,建立了该型毒株的RT-qPCR检测方法,有利于遏制该型病毒在我国的进一步流行。1.TW Ⅰ型IBV毒株对鸡的致病性评价（1）早期感染TW Ⅰ型IBV毒株的致病性将1日龄SPF雏鸡随机分配到试验组和对照组,每组70只。通过滴鼻点眼方式,试验组雏鸡分别接种105.5 EID50/0.1 mL TW Ⅰ型IBV AH1103株,对照组雏鸡经相同方式接种等体积PBS。在200天的试验观察内,评价两组鸡的临床表现、生长发育、及产蛋情况;定期采集样品,进行病理组织学检查和带毒、排毒情况检查。感染初期,试验组雏鸡出现呼吸道症状,气管和肺脏充血、出血,肾脏尿酸盐沉积,以及输卵管膨大积液,死亡率约为10%。育成期期间,试验组输卵管膨大积液病理现象更加严重,生殖系统发育缓慢。产蛋观察期间,试验组总产蛋量相较对照组下降了 26%,所产鸡蛋的浓蛋白更稀薄,且输卵管组织细胞病理损伤明显,卵黄性腹膜炎的发病率为50%;试验组鸡的泄殖腔内重新检测到具有感染力的病毒,并证明了盲肠扁桃体是病毒持续存在鸡体内的部位。TW Ⅰ型IBV对雏鸡呼吸道、肾脏和输卵管具有致病性,影响鸡输卵管发育,降低产蛋数量及蛋品质,从而降低了蛋鸡饲养的经济价值。（2）产蛋期感染TW Ⅰ型IBV毒株的致病性将8只200日龄SPF产蛋母鸡随机分配到试验组和对照组,每组4只。通过滴鼻点眼方式,试验组各母鸡分别接种105.5 EID50/0.1 mL TW Ⅰ型IBV AH1103株,对照组经相同方式接种等体积PBS。连续观察8天,比较两组鸡的临床表现及蛋品质,检测病毒感染组织细胞部位,测定各组织病毒载量。试验组母鸡表现出明显的呼吸道症状,总产蛋量、蛋黄均重及蛋壳厚度较对照组分别下降了 14.5%,3.35%及10.8%,而蛋内肉斑率则增加了 87.5%。组织内病毒载量测定结果显示,病毒含量由多到少依次为卵泡、伞部、子宫部、及峡部。免疫组化结果显示,病毒感染了输卵管组织上皮细胞。TW Ⅰ型IBV对产蛋鸡呼吸道和输卵管损伤明显,可造成产蛋率和蛋品质下降,影响蛋鸡养殖的经济效益及鸡蛋营养价值。2.检测TW Ⅰ型IBV反转录-实时荧光定量PCR方法的建立通过序列比对,发现不同基因型IBV毒株的S1基因间存在部分显着差异的区域,据此分别设计了两套引物和探针,建立了检测TW Ⅰ型IBV毒株的RT-qPCR方法。两套引物和探针组合建立的qPCR方法特异性良好,与包括QX、MASS、TC07-2、793B和LDT3-A型在内的其它基因型IBV毒株无交叉反应;敏感性良好,对101～109拷贝/μL浓度范围的底物均具有准确检测能力;重复性良好,其CT值组内变异系数均低于2%,组间变异系数均低于5%。两套引物和探针组合中的任意一套检测阳性均可做出阳性结果判断,且两套引物和探针组合的检测结果可以相互印证,该方法可用于对IB疑似病例中TW Ⅰ型IBV毒株的定向筛查。
许普之[4]（2020）在《肾型传染性支气管炎病毒致鸡痛风的多组学研究》文中指出由肾型传染性支气管炎病毒（Nephropathogenic infectious bronchitis virus,NIBV）感染引起的鸡痛风给全球养鸡业带来了巨大的经济损失。为了研究肾型传染性支气管炎病毒感染造成鸡痛风的发病机制,选用240羽海兰褐蛋鸡并随机分成攻毒组和对照组,每组设置3个重复,每个重复40羽。于试验第0天（28日龄）攻毒组按鸡胚半数致死量测定结果（105 ELD50/0.2mL）人工滴鼻攻毒,0.2mL/羽;对照组滴鼻无菌生理盐水,0.2mL/羽。观察记录鸡的临床症状,于试验第10天从每个重复中随机选取4羽鸡进行采样,然后分别使用RNA-Seq和GC-TOF/MS检测了鸡肾脏转录组学和代谢组学图谱,以及利用16S rRNA-seq分析鸡盲肠微生物组成的变化,进一步对这三种表型数据进行相关性分析。试验结果如下:（1）对照组鸡正常;攻毒组鸡肾脏肿大,色苍白,输尿管增粗且有白色粘液;肾小管上皮细胞脱落,肾小管结构丧失,以及间质扩张和大量的炎性细胞浸润。（2）攻毒组肝脏、脾、法氏囊、肾、回肠、空肠均检测到NIBV病毒,其中空肠中病毒载量最低,肾脏中最高;对照组鸡各组织则均未检测到病毒。（3）与对照组相比,肾脏代谢组学分析共检出160个差异代谢物,通路富集分析显示NIBV感染显着改变了鸡肾脏氨基酸代谢,糖代谢以及嘌呤代谢。（4）与对照组相比,肾脏转录组学分析共检出2868个差异表达基因,包括1521个上调基因和1347个下调基因。KEGG通路富集分析显示“细胞因子-细胞因子受体相互作用”是最具代表性的上调基因富集通路,“过氧化物酶体”是下调基因富集最显着的通路。其中“Toll样受体信号通路”,“NOD样受体信号通路”和“RIG-I样受体信号通路”是显着富集的参与先天免疫的模式识别受体信号通路。（5）与对照组相比,16S rRNA-seq分析结果显示NIBV感染改变了攻毒组鸡盲肠的微生物结构组成,并降低了微生物的多样性。LEfSe分析筛选出7个组间具有统计学差异的用于区分NIBV感染的潜在生物标志物（LDA Score>4）,即与对照组相比,攻毒组中变形菌门（Proteobacteria,P=0.037）的相对丰度显着上升;拟杆菌科（Bacteroidaceae,P=0.037）,拟杆菌属（Bacteroides,P=0.037）,Bacteroides vulgatus（P=0.016）,乳杆菌目（Lactobacillales,P=0.037）乳杆菌科（Lactobacillaceae,P=0.025）,乳杆菌属（Lactobacillus,P=0.025）的相对丰度显着下降。结论:NIBV病毒可以在鸡的肝脏、脾、法氏囊、肾,回肠和空肠组织中进行复制。NIBV感染显着下调过氧化物酶体的作用,并显着激活先天免疫系统中的模式识别受体信号通路,从而激活免疫应答,促进肾脏的炎症及损伤,最终导致肾脏尿酸排泄障碍。嘌呤代谢发生改变并显示出尿酸合成增加的趋势。此外,NIBV感染能够引起的盲肠菌群结构的改变并降低微生物的多样性。本研究为进一步揭示NIBV感染致鸡痛风的发病分子机制提供了新的理论依据。
李根[5]（2019）在《鸡传染性腺胃炎相关病毒-圆圈病毒3型的分离鉴定及致病机制研究》文中研究说明鸡病毒性传染性腺胃炎（Transmissible viral proventriculitis,TVP）主要引起鸡的消瘦、粪便过料、腺胃肿大等症状。该病最早在1978年由荷兰科学家Kouwenhoven发现,并蔓延至全世界各个国家。中国在1994年的江苏省最先出现,随后在全国各省市呈爆发式流行。该病能够显着增加料肉比,降低鸡肉的产量,给肉鸡养殖业带来巨大的经济损失,已成为困扰肉鸡养殖业的重要问题。尽管国内外众学者分离到多种相关病毒,如网状内皮增生症病毒、传染性支气管炎病毒、传染性法氏囊病病毒、呼肠孤病毒、J亚群禽白血病病毒、马立克氏病病毒、鸡传染性贫血病毒、腺胃坏死病毒等,但均无法使用纯病毒复制出该病,因此,鸡TVP的病因一直未明。根据大量流行病学调查结果及前人的研究,我们推测该病是由一种未知的新病毒引起。为了鉴定此未知病毒,本研究通过深入流行病学调查,排除现有已知的TVP相关病毒,筛选典型单感染TVP病例,建立TVP疾病模型,利用PacBio三代测序平台进行病毒宏基因组高通量测序,分离鉴定病毒,进而研究病毒的致病机制。为临床生产提供理论指导和技术支撑。为了获得无现有已知TVP相关病毒感染的单纯TVP病例,本研究通过流行病学调查,采集了80多个TVP发病鸡场的336份样品,通过大体剖检及病理组织学检测,对发病类型进行归纳总结,利用病理学方法进行分类。从中筛选出病理组织学病变为黏膜层和腺管间淋巴细胞浸润的TVP病例。通过PCR检测排除上述已知8种腺胃炎相关病毒的感染,并且接种营养肉汤培养基排除细菌感染。为排除无关病毒的干扰,确保后续病毒鉴定的准确性。本研究以筛选出的病例的病料为原始材料回归SPF鸡,成功复制出TVP疾病模型,感染鸡表现表现出典型TVP症状。再次对回归动物进行已知腺胃炎相关病毒的PCR检测,检测结果显示8种已知TVP相关病毒均为阴性,排除已知相关病毒污染。为了鉴定病毒,首先通过电镜观察到病毒粒子的大小和形态,发现病毒粒子呈圆形或二十面体对称,无囊膜,直径为26-28 nm。使用PacBio三代测序平台进行病毒宏基因组高通量测序,并与2017年NCBI最新病毒库进行BLAST比对。比对上的序列均显示同一种病毒-圆圈病毒3型（Gyrovirus 3,GyV3）。使用反向PCR扩增病毒全长序列,最终得到病毒的全长序列为2356 bp,将其命名为SDAU-1株。GyV3-SDAU-1株基因组中含有3个重叠的开放阅读框,编码三种蛋白,分别为衣壳蛋白VP1,骨架蛋白VP2,凋亡蛋白VP3。NCBI查找圆环病毒科和细环病毒科共30株病毒全基因组序列构建系统发育进化树,结果显示GyV3-SDAU-1与GyV3-FecGy同源关系最近,属于细环病毒科圆圈病毒属。GyV3为单链环状DNA病毒,2012年首次在智利和香港发生急性胃肠炎的儿童粪便中分离鉴定,说明该病毒与胃肠炎关系密切,本研究首次从发生TVP的商品肉鸡中检测到GyV3,证实GyV3来源于鸡。根据柯赫氏法则,需证明GyV3是否是引起TVP的主要原因。首先对采集的336份TVP病例和102份正常鸡样品,进行了回顾性流行病学调查。结果显示,336份腺胃炎病例中GyV3阳性率为12.5%（42/336）,在正常鸡中未检测到GyV3（0/102）。表明GyV3在TVP病例中普遍存在,而在健康鸡体内不存在。为了纯化GyV3,体外培养鸡胚腺胃原代细胞,并将GyV3感染鸡腺胃组织处理后接种于鸡胚腺胃原代细胞。收集接种GyV3的细胞,通过电子显微镜可以观察到GyV3粒子,PCR检测显示GyV3为阳性,8种已知腺胃炎相关病毒均为阴性,说明病毒可以在腺胃原代细胞中复制,并且未污染其他病毒。然后将纯培养的GyV3接种1日龄SPF鸡,接毒鸡表现消瘦、腺胃肿大、腺胃乳头肿胀、腺胃黏膜层和固有层大量淋巴细胞浸润,呈现典型的TVP症状,并且从发病鸡中能够再次分离到GyV3,证明GyV3确实能够引起鸡的TVP。为明确GyV3的致病性及发病规律,将腺胃原代细胞培养的GyV3接种SPF鸡,通过大体剖检观察和病理组织学观察病变情况,表明鸡腺胃组织从7日龄开始出现明显炎症,14-21日龄之后达到高峰,35日龄症状减轻,这与临床生产中鸡TVP的发病日龄吻合。接毒鸡除表现典型的TVP症外,还引起鸡的贫血和免疫抑制症状。为明确GyV3的可能感染途径,通过腹腔、静脉、皮下、口服注射4种不同方式接种SPF鸡,发现不同接种方式均表现出相同的病理变化和病程变化。说明GyV3可以经多种途径感染。为明确GyV3对不同日龄SPF鸡的感染力,将GyV3接种不同日龄（7日龄、14日龄、21日龄、28日龄）SPF鸡,结果显示,不同日龄的鸡均表现出相同的病理变化和病程变化,说明鸡只对GyV3无日龄抗性,即GyV3可感染不同日龄的鸡只。为了探究GyV3的发病机制,本研究研究通过绝对荧光定量PCR检测8个时间段,29种鸡组织器官内的病毒含量。结果显示,病毒含量最高的组织为肾上腺、骨髓,其次是神经、卵巢和羽髓,而腺胃的病毒载量则相对较低。肾上腺和神经高病毒含量表明其引起腺胃炎的原因可能是间接的,病毒入侵肾上腺和神经后,导致体液调节和神经调节的腺胃出现炎症。而骨髓作为最大的造血器官,病毒入侵后,导致造血干细胞及早期免疫细胞发育不良,造成贫血和免疫抑制。为探索GyV3发病的分子机制,以GyV3的主要结构蛋白VP1构建真核表达载体并转染细胞,通过免疫共沉淀联合质谱分析技术分析与其互作的宿主蛋白,结果显示,信号转导和转录激活子3、T细胞受体、胱天蛋白酶募集域蛋白9和酪蛋白激酶1四种蛋白可能分别参与了病毒入侵机体及逃避宿主免疫、机体对病毒的识别和信号传递、激活先天性免疫和特异性免疫等过程,说明GyV3感染改变了细胞的生物进程,激活或抑制了一系列信号通路。综上所述,本研究在大量临床调查的基础上,利用病毒宏基因组高通量测序的方法从无现有TVP相关病毒感染的、单纯TVP病例中分离鉴定出一种新病毒,GyV3。并使用纯培养的GyV3复制出TVP,证明GyV3是引起鸡TVP的直接病因,同时GyV3也能够引起贫血和免疫抑制。而GyV3诱导腺胃炎的原因可能是GyV3感染肾上腺和骨髓间接引起。此外,GyV3的结构蛋白VP1主要通过信号转导和转录激活子3、胱天蛋白酶募集域蛋白9、酪蛋白激酶1和T细胞受体四种蛋白与宿主细胞发生互作以改变宿主细胞的生物进程。我们的研究为后续GyV3的致病机制研究和TVP的防控提供了科学基础。
潘力[6]（2019）在《传染性支气管炎病毒SD/04/18株感染鸡体内各组织中病毒的动态分布及排毒规律研究》文中认为禽传染性支气管炎（Avian Infectious Bronchitis,AIB）是由传染性支气管炎病毒（IBV）引起的一种高度接触性传染病。IBV可引起鸡呼吸道、肾脏和生殖道等部位病变,并造成死亡,给养鸡业造成巨大经济损失。IBV不同血清型之间交叉保护性低,新IBV血清型的不断出现给本病的防控带来困难。目前,国内外还没有制定统一的IBV分型标准,但众多学者多采用IBV的S1基因序列分型法。由于不同基因型的IBV在组织嗜性和致病性方面有着较大的差异,因此需要对新分离株进行系统研究,为该病的防控提供依据。本试验从山东某地疑似患鸡传染性支气管炎（IB）的送检病死鸡中分离到一株病毒,经RT-PCR鉴定及测序分析,确定为IBV并命名为SD/04/18株。根据测序结果,对其S1基因进行遗传分析,发现该毒株与我国主要流行的QX基因型IBV同源性最高。经胰蛋白酶消化液处理的SD/04/18株测得了血凝效价;将SD/04/18株接种8日龄SPF鸡,复制出了与自然感染病例相同的临床症状。为系统性研究IBV SD/04/18株,首先,根据GenBank中已发表的IBV的N基因序列设计引物,建立IBV Real-TimePCR检测方法,该方法最低能检测到39.7 copies/μL的病毒核酸;其次,将经典呼吸型IBV-M41标准株与分离的SD/04/18株先通过SPF鸡胚连续传代,再经鸡胚肾原代细胞（CEK）和非洲绿猴肾细胞（Vero）盲传至引起细胞明显病变,同时定量检测每一代次病毒。结果显示,IBV-M41株在CEK原代细胞和Vero细胞上分别传至第4代、第5代时出现明显病变;而SD/04/18株在上述两种细胞上分别传至第5代、第6代时出现明显病变;经连续传代,最终获得能稳定增殖的IBV-M41标准株和SD/04/18分离株。为探讨SD/04/18株在不同感染阶段对宿主相关器官的病理损伤、组织嗜性、动态分布、排毒规律及宿主抗体水平的影响,进行了下列试验。首先建立IBV SD/04/18株雏鸡感染模型,并在感染后的3 d、7 d、30 d采集气管、肺、肾、脾、胸腺、法氏囊制作病理切片及免疫组化分析;其次,在感染后不同时间点采集12种组织器官进行病毒动态分布检测,同时定期检测感染鸡只的呼吸道和泄殖腔的排毒情况、统计体重及抗体水平。结果显示,不同感染阶段的相同器官病理变化存在差异,感染发病30 d时,气管、肺、脾、胸腺得到了很好的恢复,但肾脏和法氏囊病变依然严重;免疫组化法检测到上述器官均有可见抗原聚集;感染后6 h,在气管、喉头、肺等部位首先检测到相应载量的病毒,整个过程中,脑、胰脏病毒载量较为稳定,其余各器官的病毒载量整体呈现先增多后减少的趋势;人工感染第1 d和第3 d分别在呼吸道和泄殖腔检测到病毒核酸,30 d时仍能从上述两个部位检出病毒核酸;5 d时在被感染鸡群中检测到IBV抗体阳性,抗体滴度峰值出现在感染后27 d;感染发病鸡临床症状明显,两组试验鸡体重差异显着。总之,通过对分离到的QX基因型IBV SD/04/18株的系统性研究,确定了SD/04/18株在临床分型上属肾型IBV。该毒株主要引起发病鸡肾脏病变,对宿主的免疫器官也具有不同程度的损伤,发病鸡排毒时间长,增重慢;靶器官带毒时间长、病毒载量高,各器官病毒载量与宿主抗体水平整体呈现负相关。经过鸡胚、细胞盲传后,SD/04/18株能在体外稳定增殖。以上实验结果,将为抗IBV药物的研究提供理想的动物模型并为后续IBV的相关机制研究提供理论依据和实验素材。
李智超[7]（2018）在《鸡传染性支气管炎强毒与新城疫强毒在新城疫免疫鸡群中的协同致病作用》文中研究说明鸡传染性支气管炎病毒（Infectious bronchitis virus,IBV）和鸡新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）均在我国鸡群中普遍流行,且近年来关于IBV与NDV混合感染的报道越来越多,但目前关于这两种病原的共感染的致病性还未见相关报道。鉴于NDV对鸡具有高致病性,故本研究选择在新城疫免疫鸡群中建立鸡传染性支气管炎强毒与新城疫强毒混合感染模型,并通过临床观察、组织病理学分析、血清学试验、Real-time PCR等方法对各组鸡的临床症状、死亡情况、组织病理变化、抗体水平、病毒复制滴度和攻毒后天然免疫相关因子表达水平的变化进行了系统研究。研究内容如下:首先本研究分离到一株QX型IBV强毒将其命名为CK/CH/HD/171018,随后对其进行全基因组序列测定（登录号为MH020185）,结果表明其1a基因发生重组。然后本研究将152羽SPF鸡随机分成8组,其中A～F组于50日龄免疫La Sota灭活苗,G、H组作为未免疫对照,随后于64日龄以滴鼻点眼的途径对A～F组分别接种PBS、ZJ1、QX、QX+ZJ1（+24h）、ZJ1+QX（+24h）、QX+ZJ1,G、H组接种ZJ1和QX。连续观察20天,记录死亡情况。期间,于攻毒后2d、3d、5d、7d,分别采集每组SPF鸡的气管、肺脏、脾脏、肾脏、盲肠及法氏囊,进行组织病理学观察和用于脏器含毒量以及细胞因子的表达水平检测。结果表明G组（ZJ1阳性对照）于攻毒后第5天全部死亡,H组（QX阳性对照）及免疫后单独接种PBS、ZJ1和QX组（A～C组）未死亡,而混合感染QX+ZJ1（+24h）、ZJ1+QX（+24h）和QX+ZJ1组死亡率分别为30%、20%和30%,明显高于单独感染QX或ZJ1组。与单独感染QX或ZJ1组相比,混合感染组的临床症状及病理损伤情况均更加严重。此结果证实,新城疫免疫鸡群中IBV强毒与NDV强毒之间存在明显的协同致病增强作用。本研究随后比较了NDV和IBV的抗体水平,结果表明,攻毒后第二天各组NDV抗体水平均有明显升高,但是IBV的抗体直到攻毒后第7天才有显着上升。本研究分别建立了NDV和IBV的绝对定量Real-time PCR的方法,并检测了各组鸡泄殖腔排毒情况,对其气管、肺脏、脾脏、肾脏、盲肠和法氏囊进行了病毒滴度测定,并同时用相对定量Real-time PCR法检测了脏器中的IFNα、IFNβ、1L-1β、1L-6、MX和PKR表达水平。结果表明,混合感染能够导致泄殖腔两种病毒的排毒率和排毒量均显着上升,排毒周期明显延长,且两种病毒在各脏器中的含毒量均显着上升。天然免疫相关因子的检测结果显示,在单独感染QX或ZJ1早期,各种细胞因子均有较高水平的表达;而在混合感染早期,各组织中的抗病毒因子表达水平较低,在后期则会出现强烈的细胞因子免疫应答。基于以上结果,本研究认为这一现象可能与QX和ZJ1的协同致病相关。综上所述,本研究成功建立了IBV和NDV的混合感染模型,系统地检测了混合感染后两种病毒的动态变化以及宿主的抗病毒反应,为证实IBV和NDV混合感染后致病力增强提供了有力论据,同时也为我国IBV和NDV的综合防治提供了参考信息。
周海生[8]（2017）在《2001～2016年间华东地区IBV分子流行病学、致病性及S1蛋白的天然免疫应答研究》文中认为传染性支气管炎（Infectious bronchitis,IB）是由传染性支气管炎病毒（Infectious bronchitis virus,IBV）引起鸡的一种急性、高度接触性传染病,主要引起鸡群呼吸道与肾脏疾病,是影响养禽业重要的病毒性病原之一。虽然IBV疫苗广泛使用,但IB仍然频繁爆发,特别是以引起肾脏损伤的肾型IBV分离报道较多,给我国养禽业造成巨大的经济损失。由于IBV血清型众多,且各血清型间交叉保护作用较低,同时IBV很容易发生基因突变和同源重组,导致新基因型甚至新血清型不断出现,这给养禽业IB的防控带来巨大的困难。提示我们在防控IB中对病毒进行流行病学监测,并对新型病毒或变异株的流行病学特点进行分析,从而为制定IB有效的免疫防控策略提供重要的理论依据。目前IBV临床分型包括呼吸型、肾型、生殖道型和腺胃型等,其中肾型IBV是近年来我国主要的IB病变型。肾型IBV主要引起鸡肾脏肿大,尿酸盐沉积,进而引起鸡群死亡率增加。病毒S蛋白在IBV的血清学分型、基因分型、病毒组织嗜性及致病性中发挥了决定性的作用,而S蛋白中中和抗原位点、受体结合区域都是位于S1亚基上。因此,研究IBVS1蛋白与宿主之间相互作用,可以为病毒组织嗜性与致病性方面的机理提供一定参考。本研究主要内容包括以下4个部分。1、2001～2016年间华东地区IBV分子流行病学分析2010～2016年间,本研究共从华东地区疑似IB发病鸡群分离到IBV 36株,其中从肉鸡分离毒株35株,从蛋鸡分离毒株1株。在所有分离株中,我们发现1例IB与H9亚型AIV混合感染。对36株IBV S1基因序列进行测定,发现S1基因长度存在4种:1620/540（28 株）、1617/539（4 株）、1611/537（3 株）及 1638/546（1 株）。S 蛋白裂解位点存在 5种:HRRRR（25 株）、RRFRR（6 株）、RRSRR（3 株）、RRLRR（1 株）及 HRRKR（1株）。序列比对显示本研究分离的36株IBV之间的S1基因核苷酸序列同源性在65.2%～99.9%,分离株与参考株之间S1基因核苷酸序列同源性在65.0%～99.9%。S1基因分型结果表明,36株IBV可划分为七个基因型:QX型（26株）、Mass型（3株）、4/91型（3 株）、tl/CH/LDT3/03 型（1 株）、TW-Ⅰ型（1 株）、TC07-2 型（1 株）和新发现的 New-Ⅰ型（1株）。结合GenBank中2001～2016年中国分离的396株IBV毒株S1基因序列,S1基因分型结果显示,2001～2016年间我国流行的432株IBV可以分为13个基因型,包括QX（321 株）、tl/CH/LDT3/03（25 株）、TW-I（20 株）、4/91（18 株）、Mass（18 株）、CK/CH/LSC/99I（7 株）、TC07-2（4 株）、TW-II（2 株）、Ck/CH/LDL/97I（1 株）、Arkansas（1株）、Vis S（1株）、及新鉴定的基因分支New-Ⅰ（8株）与New-Ⅱ（3株）。值得注意的是,属于美国相关基因分支的ck/CH/LSD/110712已在我国出现。重组分析显示,新出现的New-Ⅰ基因型IBV S1基因来源于4/91与tl/CH/LDT3/03型毒株之间的重组,基因分支New-Ⅱ病毒S1基因来源于tl/CH/LDT3/03型与QX型毒株重组。研究结果表明我国华东地区2001～2016年间流行的IBV基因型众多,基因重组导致IBV新的基因型或变异株出现。本研究为今后IBV疫苗的研发和IB的防控提供一些参考。2、2001～2016年间我国IBV基因组序列重组分析为了解我国IBV分离株基因组重组特点,特别是疫苗株基因参与IBV基因重组情况,本研究对分离株 CK/CH/2010/JT-1、CK/CH/2014/FJ14 及 CK/CH/2014/QL1403 全基因组序列进行测定,同时收集2001～2016年间分离于我国的55株全基因组序列,并与参考株进行了序列重组分析。序列分析显示分离株CK/CH/2010/JT-1与CK/CH/2014/QL1403基因组中共鉴定出4个重组事件,分别位于CK/CH/2010/JT-1基因组24709-365、17160-19811、21136-21770片段及CK/CH/2014/QL1403基因组20395-24840片段。进一步对基因组序列重组来源分析显示 CK/CH/2010/JT-1 来源于 QX、CK/CH/LSC/99I、tl/CH/LDT3/03 及 4/91基因型IBV重组,CK/CH/2014/QL1403来源于QX与TC07-2型毒株重组,而CK/CH/2014/FJ14是一株典型的QX型IBV。应用RDP4对我国2001～2016年间分离的55株IBV基因组序列进行重组分析,结果显示我国2001～2016年间流行的55株IBV中有52株IBV基因组存在重组事件,其中25个IBV分离株基因组中发现有疫苗型（Mass,tl/CH/LDT3/03及4/91型等）病毒基因组片段的重组,这一结果在SimPlot分析中进一步得到确认。根据生物信息学分析结果,证明流行于我国的IBV基因组序列存在许多基因重组事件,而且疫苗毒株基因频繁参与了 IBV基因重组,导致IBV新的基因型或变异株出现,提示在防控IB时注意合理使用IBV疫苗。3、我国IBV分离株致病性分析及交叉保护研究为了探究分离株 CK/CH/2010/JT-1、CK/CH/2014/FJ14 及 CK/CH/2014/QL1403 致病特点及不同毒株间抗原关系,本研究对分离株进行动物攻毒、交叉中和及交叉保护实验。动物攻毒实验结果显示CK/CH/2010/JT-1与CK/CH/2014/FJ14可引起雏鸡严重的呼吸道症状、肾脏病变及高死亡率（43.75%与50%）,而CK/CH/2014/QL1403不引起雏鸡产生明显的临床症状与病理变化。中和实验结果表明现有抗H120与4/91疫苗株鸡多抗血清不能有效中和 IBV 分离株 CK/CH/2010/JT-1 与 CK/CH/2014/FJ14,而抗 QX 型毒株 CK/CH/2014/FJ14鸡多抗血清能够有效中和TC07-2型IBV CK/CH/2014/QL1403。交叉保护实验结果表明CK/CH/2014/QL1403免疫雏鸡后能为鸡群提供有效保护来抵抗QX型毒株CK/CH/2014/FJ14 攻击。本研究结果显示 CK/CH/2010/JT-1 与 CK/CH/2014/FJ14 属于 IBV强毒株,且目前常用H120与4/91疫苗株不能有效防控该毒株,而CK/CH/2014/QL1403是一株天然弱毒株,而且可以作为疫苗候选株来防控QX型IBV。4、IBV S1蛋白的天然免疫应答研究为了探究IBV S1蛋白引起鸡胚肾细胞（Chickenembryokidneycell,CEKC）天然免疫应答反应,特别是肾型与呼吸型毒株S1蛋白引起CEKC天然免疫应答差异,本研究成功构建了肾型毒株CK/CH/2010/JT1、CK/CH/2014/FJ14与呼吸型IBVM41株S1基因真核表达载体,通过转染CEKC研究其在细胞中的天然免疫应答。结果表明IBV S1基因在CEKC中成功获得了瞬时表达,而且S1蛋白主要表达于细胞浆中。在mRNA水平上,转染后12 h,IBV 肾型毒株 CK/CH/2010/JT1、CK/CH/2014/FJ14 S1 蛋白引起 TLR3、MDA5 的表达明显高于呼吸型M41;转染后24h,肾型毒株CK/CH/2010/JT1、CK/CH/2014/FJ14 S1蛋白引起TLR3、MDA5、IFN-β及IL-6的表达显着高于呼吸型M41。在蛋白水平上,S1蛋白在 CEKC 中瞬时表达后 24h,肾型毒株 CK/CH/2010/JT1、CK/CH/2014/FJ14 引起 TLR3、IFN-β及IL-6的表达显着高于经典株M41。重组质粒转染CEKC 24 h时,使用配体poly（I:C）和LPS刺激后,IBV不同致病性毒株S1蛋白引起肾细胞天然免疫没有产生进一步放大作用。本研究结果表明肾型与呼吸型毒株S1蛋白引起CEKC天然免疫应答中TLR3、MDA5、IFN-β及IL-6的表达存在差异,暗示IBV对肾脏致病性差异可能与毒株S1蛋白引起肾细胞天然免疫中TLR3、MDA5、IFN-β及IL-6表达差异相关。
谢智文[9]（2015）在《IBV M41株感染对鸡MDA5信号通路关键分子表达的影响》文中研究指明鸡传染性支气管炎（Infectiousbronchitis,IB）是由冠状病毒鸡传染性支气管炎病毒（Infectious bronchitis virus,IBV）感染引起的一种急性呼吸道传染病。IBV可感染不同品种、日龄的鸡,引起呼吸道粘膜和肾脏等器官不同程度的损伤,造成蛋鸡产蛋量和产蛋品质的下降,肉鸡生产效益的下降,严重影响养禽业的健康发展。而IBV众多的血清型、不同血清型间交叉保护效果差的特点,给IBV防控带来了巨大的挑战。因此进一步了解IBV致病机理和免疫机制,对于IB防控意义重大。固有免疫是宿主抵御各种病毒入侵的第一道屏障,在机体非特异性抗感染免疫过程、特异性免疫应答的启动、调节和效应中起着重要作用。固有免疫防御功能主要通过细胞中的模式识别受体（PRR）来完成。RIG-I样受体（RLRs）是一类重要的PRR,其家族的三个成员维甲酸诱导基因I（retinoic acid-inducible gene I,RIG-I）、黑色素瘤相关基因 5（melanoma differentiation-associated gene 5,MDA5）和LGP2（laboratory of genetics and physiology gene 2,LGP2）可以识别侵入胞内的RNA链,诱导Ⅰ型干扰素的产生。与哺乳动物不同,鸡缺乏RIG-I基因,只有MDA5和LGP2。目前关于IBV感染对鸡MDA5信号通路影响的研究比较欠缺。本研究应用建立的实时荧光定量PCR方法,对IBVM41毒株人工感染 SPF 鸡后 1、3、5、8、11、14、21 和 28 天（days post inoculation,DPI）气管和肾脏中MDA5信号通路关键分子（MDA5、LGP2、MAVS和STING）、下游接头蛋白（TRAF3和TRAF6）、相关激酶（TBK1和 IKKε）、转录因子（NF-κB 和 IRF7）、细胞因子（IL-8、IL-12、IFNα和 IFNβ）和干扰素刺激基因（Mx、PKR、OAS、Viperin、IFITM3和IFIT5）mRNA转录水平和IBV病毒载量进行检测,同时应用ELISA方法对气管和肾脏中IL-8、IL-12、IFNα和IFNβ蛋白含量及外周血IBV特异性抗体进行检测,旨在探讨IBV感染对鸡MDA5信号通路的影响。研究结果显示,建立的检测MDA5、LGP2、MAVS、STING、IL-8、IL-12、PKR、OAS、Viperin、IFITM3 和 IFIT5 mRNA 转录水平的荧光定量PCR方法扩增效率在0.956-1.093之间,相关系数R2在0.9963～0.9999之间,表明所建立的曲线扩增效率高、线性关系好、定量准确度良好。溶解曲线均呈现单一峰,无二聚体,表明特异性好。敏感性试验结果显示,当质粒标准品稀释至1×10copies/μL时,仍可检测到特异性扩增,说明所建立的荧光定量PCR方法灵敏度高。批内和批间重复性试验的变异系数（CV）均小于3.05%,表明所建立的实时荧光定量PCR方法重复性好、稳定性高。人工感染结果表明,试验组气管和肾脏组织病毒载量1DPI至11DPI维持较高水平,分别在5DPI和3DPI达到峰值,且气管中病毒载量较肾脏高很多,表明IBV M41毒株对不同组织器官的嗜性存在差异。外周血IBV特异性抗体水平在1 DPI和3DPI变化不明显,从5DPI开始逐渐升高,至14DPI达到峰值,随后开始下降。IgG抗体水平与病毒载量成负相关性,表明血清抗IBV特异性IgG抗体在抵抗和清除病毒中发挥重要的作用。3DPI-14DPI 期间,气管中 MDA5、LGP2、MAVS、STING、TRAF3、TRAF6、TBK1、IKKε、NFκB、IRF7、IL-8、IL-12、IFNα、IFNβ、Mx、PKR、OAS、Viperin、IFITM3 和 IFIT5 mRNA 转录水平在多个时间点显着（P<0.05）或极显着（P<0.01）上调,IL-8、IL-12、IFNα和IFNβ蛋白含量在多个时间点试验组显着（P<0.05）或极显着（P<0.01）高于对照组,提示在气管组织中,这些基因可能参与抗IBV固有免疫应答。在肾脏组织中,MDA5、LGP2、TRAF3、TRAF6、IRF7、IL-8、Mx、PKR、OAS、Viperin、IFITM3和IFIT5 mRNA 转录水平在3DPI-14DPI有多个时间点显着（P<0.05）或极显着（P<0.01）上调,但 MAVS、STING、TBK1、IKKε、NFκB、IL-12、IFNα和IFNβ mRNA转录水平明显下调;同时肾脏中IFNα和IFN[3蛋白含量在多个时间点试验组也低于对照组,这可能是某些未知的因素阻断了病毒信号从MDA5和LGP2传递至MAVS和STING,抑制MAVS和STING的活化,减少Ⅰ型干扰素等的产生。但是转录因子IRF7、IL-8 和干扰素刺激基因 Mx、PKR、OAS、Viperin、IFITM3 和 IFIT5显着上调,可能是在肾脏组织中可能存在某些不同于RLR的信号通路或者调节方式,协同获得性免疫最终起到清除IBV的作用。综上所述,IBV M41毒株感染初期激活了气管组织中MDA5信号通路,诱导多种抗病毒基因的表达,协同获得性免疫,将病毒从感染部位清除。在肾脏组织中可能存在某些未知因素阻断了 MDA5和LGP2与MAVS和STING的联系,而使病毒信号无法通过MDA5信号途径向下游传递。因此,IBV M41毒株感染对鸡气管和肾脏的MDA5信号通路产生明显影响,但影响机制不完全相同。本研究首次研究IBV感染对宿主MDA5信号通路的影响,探索IBV感染对天然免疫信号通路影响的分子机制,为IBV致病机理、免疫防治和抗病毒药物研究提供新的思路。
宋丽丽[10]（2015）在《鸡传染性支气管炎病毒GX-YL5株M和E基因在重组杆状病毒中的构建和初步表达》文中进行了进一步梳理鸡传染性支气管炎（Infectious bronchitis,IB）是由鸡传染性支气管炎病毒（Infectious bronchitis virus,IBV）引起的一种鸡的急性、高度接触性传染病,严重危害养殖业的健康发展,现有疫苗在免疫效果、安全性等发面均存在缺陷,研制高效安全的IBV新型疫苗十分必要。病毒样颗粒（virus-like particles,VLPs）疫苗是由病毒的一个或多个结构蛋白自动组装而成但不含病毒核酸的空壳结构,具有安全性高、免疫原性好的优点,是一种重要的新型疫苗。目前IBV病毒样颗粒疫苗的研究非常有限。与其它表达系统比较,昆虫杆状病毒表达系统具有良好的翻译后加工能力,可同时表达多种外源蛋白,并且昆虫细胞易于进行悬浮培养,有利于大规模生产,目前已广泛用于疫苗研制等方面。研究表明,在昆虫杆状病毒表达系统中引入昆虫细胞可识别的蜂素信号肽（honey bee melittin signal peptide,HBM）可使重组蛋白高效、分泌性表达且具有天然蛋白活性。本研究以IBV广西优势血清型毒株GX-YL5为研究对象,应用昆虫杆状病毒表达系统并引入HBM,将GX-YL5的M蛋白与E蛋白进行单表达与共表达,为下一步IBV病毒样颗粒疫苗的研制奠定基础,具体研究内容如下:一、通过融合PCR的方法将HBM与IBV的M、E基因进行融合,获得HBM1-M、HBM2-E和HBM1-E1,连接T载体酶切后各自连接到双元转座载体pFastBacTMDual的PH或p10启动子处,转化DH1OBac,转座后筛选纯化获得重组杆状rHBM1-M、rHBM2-E和rHBM1-E1。二、将融合的HBM1-M和HBM2-E连接T载体酶切后分别连接到双元转座载体pFastBac TMDual的PH和p10启动子处,转化DH1OBac,转座后筛选纯化获得共表达M、E蛋白的重组杆状rHBM-M-E。三、将构建的4个重组杆状rHBM1-M、rHBM2-E、rHBM1-E1和rHBM-M-E转染Sf9昆虫细胞,间接免疫荧光试验显示4个重组杆状病毒均能够在Sf9细胞中表达相应的蛋白。综上所述,本研究构建了包含GX-YL5 IBV毒株M和E基因的4个重组杆状病毒表达载体,并成功地在Sf9昆虫细胞中表达出相应的蛋白,为研究M、E蛋白的生物学功能和下一步IBV病毒样颗粒疫苗的研制打下了基础。本研究的创新点是首次利用昆虫杆状病毒表达系统构建了共表达IBV M和E蛋白的重组杆状病毒,并引入了昆虫细胞能够识别的HBM信号肽,为今后研制IBV新型疫苗奠定基础。
二、鸡传染性支气管炎病毒感染的免疫致病机制（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、鸡传染性支气管炎病毒感染的免疫致病机制（论文提纲范文）
（1）IBV S蛋白抗原表位鉴定及与宿主细胞互作的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一部分 文献综述 |
| 综述一 传染性支气管炎病毒研究进展 |
| 1 病原学 |
| 1.1 发现和分类 |
| 1.2 IBV的形态 |
| 1.3 IBV的理化特征 |
| 1.4 IBV培养特性 |
| 1.5 IBV致病性 |
| 1.6 IBV生活周期 |
| 2 IBV分子生物学特性 |
| 2.1 IBV基因组 |
| 2.2 IBV主要编码蛋白及功能 |
| 2.3 IBV毒株分型 |
| 3 IBV流行病学 |
| 3.1 自然宿主 |
| 3.2 实验室宿主 |
| 3.3 传播方式 |
| 3.4 IBV流行现状 |
| 4 IBV变异机制 |
| 4.1 点突变 |
| 4.2 基因缺失或插入 |
| 4.3 同源重组 |
| 5 诊断技术 |
| 5.1 分离鉴定 |
| 5.2 血清学诊断 |
| 5.3 分子生物学检测 |
| 综述二 IBV疫苗研究进展 |
| 1 疫苗接种 |
| 1.1 疫苗 |
| 1.2 接种时间 |
| 1.3 疫苗接种程序 |
| 2 疫苗的应用 |
| 2.1 喷雾疫苗接种 |
| 2.2 凝胶疫苗接种 |
| 3 疫苗接种后的保护评价 |
| 3.1 病毒分离 |
| 3.2 纤毛停滞 |
| 3.3 qRT-PCR |
| 3.4 血清中和抗体水平评价 |
| 综述三 IBV S蛋白研究进展及与宿主细胞互作研究进展 |
| 1 IBV S蛋白研究进展 |
| 1.1 结构特点 |
| 1.2 序列多样性 |
| 1.3 IBV S蛋白功能 |
| 1.4 影响病毒吸附的宿主因素 |
| 2 IBV与宿主互作的研究进展 |
| 2.1 病毒感染对细胞凋亡的影响 |
| 2.2 病毒感染过程中自噬的激活 |
| 2.3 冠状病毒感染与天然免疫反应 |
| 第二部分 研究内容 |
| 第一章 IBV S蛋白关键抗原表位的鉴定 |
| 1 材料方法 |
| 1.1 病毒、多肽和血清样品 |
| 1.2 主要试剂和仪器 |
| 1.3 主要试剂配方 |
| 1.4 多肽库合成 |
| 1.5 IBV毒株EID_(50)测定 |
| 1.6 IBV S蛋白序列保守性和抗原性比较分析 |
| 1.7 pELISA实验步骤 |
| 1.8 IDEXX检测试剂盒实验步骤 |
| 1.9 IBV S2蛋序列比较分析 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 IBV S蛋白抗原性和保守性分析 |
| 2.2 多肽与IBV阳性血清的交叉反应 |
| 2.3 多肽抗原性关键氨基酸的确定 |
| 2.4 16R变异株的流行情况 |
| 3 讨论 |
| 第二章 检测IBV抗体多肽酶联免疫吸附试验(pELISA)方法建立及应用 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 生物材料 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 pELISA方法步骤 |
| 1.5 pELISA方法条件的优化 |
| 1.6 pELISA方法性能的评价 |
| 2 结果 |
| 2.1 Pep6与不同基因型毒株的血清具有很好的反应性 |
| 2.2 pELISA抗体检测方法条件的优化 |
| 2.3 pELISA临界值、重复性和特异性测定 |
| 2.4 pELISA性能的评价 |
| 3 讨论 |
| 第三章 pELISA评价疫苗免疫效力的潜在作用 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 生物材料 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 ELISA方法实验步骤 |
| 1.4 多肽血清的制备 |
| 1.5 血清中和滴度的测定 |
| 2 结果 |
| 2.1 多肽血清中和效果 |
| 2.2 pELISA与中和实验比较测定血清抗体滴度 |
| 2.3 免疫血清pELISA滴度与中和滴度的相关性 |
| 3 讨论 |
| 第四章 IBV S1蛋白互作蛋白的宿主蛋白 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 生物材料 |
| 1.2 生物试剂 |
| 1.3 引物设计 |
| 1.4 病毒总RNA提取 |
| 1.5 真核表达载体的构建 |
| 1.6 CEK细胞的制备 |
| 1.7 质粒转染 |
| 1.8 间接免疫荧光(IFA) |
| 1.9 Western-blot |
| 1.10 S1-IgGFc融合蛋白的纯化 |
| 1.11 CEK细胞膜蛋白提取 |
| 1.12 免疫共沉淀(Co-IP) |
| 1.13 SDS-PAGE(银染) |
| 1.14 质谱 |
| 2 结果 |
| 2.1 sp-S1-IgGFc片段PCR扩增结果 |
| 2.2 重组质粒酶切鉴定 |
| 2.3 重组质粒转染IFA鉴定FJ14S1-IgGFc融合蛋白表达 |
| 2.4 激光共聚焦鉴定重组S1-IgGFc融合蛋白表达 |
| 2.5 Western blot鉴定重组融合蛋白S1-IgGFc的表达 |
| 2.6 重组S1-IgGFc融合蛋白的纯化 |
| 2.7 免疫共沉淀(Co-IP) |
| 2.8 质谱鉴定 |
| 3 讨论 |
| 第五章 GRP78蛋白协助IBV感染宿主细胞 |
| 1 材料方法 |
| 1.1 生物材料 |
| 1.2 生物试剂 |
| 1.3 主要试剂溶液配制 |
| 1.4 主要仪器 |
| 1.5 引物设计 |
| 1.6 真核质粒构建 |
| 1.7 CEKC的制备 |
| 1.8 质粒转染 |
| 1.9 共聚焦鉴定真核蛋白表达 |
| 1.10 免疫沉淀(IP) |
| 1.11 抗体封闭实验 |
| 1.12 siRNA干扰 |
| 1.13 GRP78转染293T重建实验 |
| 1.14 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 酶切鉴定构建的真核表达载体 |
| 2.2 共聚焦鉴定蛋白表达 |
| 2.3 GRP78蛋白与IBV S1蛋白的互作 |
| 2.4 多克隆抗体封闭CEK细胞膜表面GRP78蛋白抑制IBV复制 |
| 2.5 siRNA干扰GRP78的表达能抑制IBV的复制 |
| 2.6 非易感细胞感染实验 |
| 3 讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
（2）泰安及周边地区规模化蛋鸡场主要病毒性疾病临床诊断调查及免疫程序调整优化（论文提纲范文）
| 符号说明 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 禽流感 |
| 1.1.1 病原学及致病机制 |
| 1.1.2 病理学变化 |
| 1.1.3 免疫防控 |
| 1.2 鸡新城疫 |
| 1.2.1 病原学及致病机制 |
| 1.2.2 临床症状 |
| 1.2.3 病理学变化 |
| 1.2.4 免疫防控 |
| 1.3 传染性支气管炎 |
| 1.3.1 病原学及致病机制 |
| 1.3.2 临床症状及病理变化 |
| 1.3.3 免疫防控 |
| 1.4 传染性喉气管炎 |
| 1.4.1 流行病学 |
| 1.4.2 临床症状及其病理变化 |
| 1.4.3 免疫防控 |
| 1.5 心包积液综合征 |
| 1.5.1 病原学及致病机制 |
| 1.5.2 临床症状 |
| 1.5.3 病理学变化 |
| 1.5.4 免疫防控 |
| 1.6 研究目的及意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 样品采集 |
| 2.1.2 主要实验材料 |
| 2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.1.4 试剂配制 |
| 2.2 试验方法与步骤 |
| 2.2.1 常规石蜡切片方法 |
| 2.2.2 病料DNA/RNA的提取 |
| 2.2.3 引物设计与合成 |
| 2.2.4 PCR反应 |
| 2.2.5 血清采集与处理 |
| 2.2.6 血凝试验与血凝抑制实验 |
| 2.2.7 泰安某示范鸡场疫病综合防控能力提升 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 典型病例剖检及病理组织学检查结果 |
| 3.1.1 禽流感 |
| 3.1.2 新城疫 |
| 3.1.3 传染性支气管炎 |
| 3.1.4 传染性喉气管炎 |
| 3.1.5 腺病毒 |
| 3.2 临床发病情况统计 |
| 3.2.1 RT-PCR检测结果 |
| 3.2.2 临床发病率统计结果 |
| 3.3 血清学检测结果 |
| 3.3.1 禽流感、新城疫免疫情况调查结果 |
| 3.3.2 禽流感、新城疫抗体滴度检测结果 |
| 3.3.3 各季度禽流感、新城疫抗体分布情况 |
| 3.4 泰安市某蛋鸡场禽流感免疫程序调整优化试验结果 |
| 3.4.1 免疫程序调整前禽流感发病情况及抗体水平检测 |
| 3.4.2 免疫程序调整前其他病毒性疾病发病情况调查 |
| 3.4.3 免疫程序调整优化及免疫效果检测评价 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（3）TW Ⅰ型传染性支气管炎病毒的致病性评价与实时荧光定量PCR检测方法的建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第一章 文献综述 传染性支气管炎病毒及国内疫情控制 |
| 1 传染性支气管炎病毒 |
| 1.1 病原 |
| 1.2 病毒分型 |
| 1.3 国内流行基因型 |
| 1.4 致病性 |
| 2 我国IB疫情的控制 |
| 2.1 免疫接种 |
| 2.2 面临的问题 |
| 3 IBV的检测 |
| 3.1 病毒的分离与鉴定 |
| 3.2 血清学检测 |
| 3.3 分子生物学检测 |
| 第二章 TW Ⅰ型IBV致病性评价 |
| 1 材料 |
| 1.1 生物材料 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 仪器设备 |
| 2 方法 |
| 2.1 鸡早期感染TWI型IBV毒株 |
| 2.2 鸡产蛋期感染TWI型IBV毒株 |
| 3 结果 |
| 3.1 早期感染TWI型毒株 |
| 3.2 产蛋期感染TWI毒株 |
| 4 讨论 |
| 第三章 特异性检测TW Ⅰ型IBV RT-qPCR方法的建立 |
| 1 材料 |
| 1.1 毒株 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 引物和探针设计 |
| 2.2 建立标准曲线 |
| 2.3 特异性检测 |
| 2.4 敏感性检测 |
| 2.5 重复性检测 |
| 3 结果 |
| 3.1 标准曲线 |
| 3.2 特异性 |
| 3.3 敏感性 |
| 3.4 重复性 |
| 4 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
（4）肾型传染性支气管炎病毒致鸡痛风的多组学研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 鸡痛风发病机制研究进展 |
| 1.1 鸡痛风简介 |
| 1.2 鸡痛风的致病因素 |
| 1.2.1 鸡痛风的非传染性致病因素 |
| 1.2.2 鸡痛风的传染性致病因素 |
| 1.3 鸡痛风发病机制研究 |
| 1.4 鸡痛风的病理学变化及诊断 |
| 1.5 鸡痛风的预防及治疗 |
| 2 传染性支气管炎病毒研究进展 |
| 2.1 IBV病原学 |
| 2.2 IBV的流行病学调查 |
| 2.3 IBV的病理学研究 |
| 2.4 IBV的致病性研究 |
| 2.5 IBV的检测及诊断 |
| 3 多组学技术及其应用 |
| 3.1 转录组学及其应用 |
| 3.2 代谢组学及其应用 |
| 3.3 肠道微生物组学及其应用 |
| 4 本研究目的与意义 |
| 第二章 试验研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.1.1 实验动物与分组 |
| 1.1.2 主要仪器 |
| 1.1.3 主要试剂 |
| 1.1.4 试剂、培养基的制备 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.2.1 样品采集 |
| 1.2.2 组织病理学检查及血清尿酸检测 |
| 1.2.3 各组织中病毒载量的测定 |
| 1.2.4 肾脏代谢组检测 |
| 1.2.5 肾脏转录组测序 |
| 1.2.6 16S rRNA测序分析 |
| 2 试验结果 |
| 2.1 临床病理变化及血清尿酸检测 |
| 2.2 各组织中病毒载量测定 |
| 2.3 NIBV感染状态下肾脏代谢组学特征 |
| 2.3.1 肾脏代谢组主成分分析(PCA) |
| 2.3.2 肾脏代谢组正交偏最小二乘法-判别分析(OPLS-DA) |
| 2.3.3 肾脏差异代谢物分析 |
| 2.3.4 肾脏差异代谢物的代谢通路分析 |
| 2.4 NIBV感染对肾脏基因转录水平的影响 |
| 2.4.1 测序数据质量整体分析 |
| 2.4.2 转录组测序重复相关性评估 |
| 2.4.3 差异表达基因分析 |
| 2.4.4 GO功能富集分析 |
| 2.4.5 差异基因KEGG富集分析 |
| 2.5 NIBV感染状态下鸡盲肠菌群的影响 |
| 2.5.1 16S rRNA测序数据处理与质控统计 |
| 2.5.2 OTU分析和物种注释 |
| 2.5.3 Alpha多样性分析 |
| 2.5.4 Beta多样性分析 |
| 2.6 相关性分析 |
| 3 讨论 |
| 3.1 NIBV感染对模式识别受体信号通路的影响 |
| 3.2 NIBV感染对过氧化物酶体的影响 |
| 3.3 NIBV感染对机体代谢水平的影响 |
| 3.4 差异表达基因与差异代谢物的相关性分析 |
| 3.5 NIBV感染对盲肠菌群的影响 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表的论文 |
（5）鸡传染性腺胃炎相关病毒-圆圈病毒3型的分离鉴定及致病机制研究（论文提纲范文）
| 符号说明 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 概述 |
| 1.2 腺胃炎流行病学 |
| 1.2.1 发生和分布 |
| 1.2.2 流行特点 |
| 1.3 腺胃炎病理变化 |
| 1.3.1 临床症状 |
| 1.3.2 剖检病变 |
| 1.3.3 组织学病变 |
| 1.4 腺胃炎致病因素研究进展 |
| 1.4.1 非传染性因素 |
| 1.4.2 传染性因素 |
| 1.4.3 多因素协同 |
| 1.5 高通量测序在未知病毒鉴定上的应用 |
| 1.5.1 高通量测序技术的发展 |
| 1.5.2 二代测序平台 |
| 1.5.3 三代测序平台 |
| 1.5.4 高通量测序鉴定未知病毒 |
| 1.6 GyV3病原学特征 |
| 1.6.1 圆圈病毒属概述 |
| 1.6.2 Gyrovirus3(GyV3)研究概述 |
| 1.7 免疫共沉淀联合质谱分析技术鉴定互作蛋白 |
| 1.7.1 信号转导和转录激活子(Signal transducers and activators of transcription,STAT) |
| 1.7.2 酪蛋白激酶(casein kinase，CK) |
| 1.7.3 胱天蛋白酶募集域蛋白9(casein kinase，CARD9) |
| 1.7.4 T细胞受体(T Cell Receptor，TCR) |
| 1.8 研究目的及意义 |
| 2 实验材料及方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物,鸡胚 |
| 2.1.2 引物合成 |
| 2.1.3 主要试剂和试剂盒 |
| 2.1.4 主要缓冲液及试剂配制 |
| 2.1.5 主要仪器设备 |
| 2.1.6 分子生物学分析软件 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 流行病学调查 |
| 2.2.1.1 病料采集 |
| 2.2.1.2 大体剖检诊断 |
| 2.2.1.3 病理组织学诊断 |
| 2.2.1.4 PCR诊断 |
| 2.2.2 未知病毒单感染病例筛选 |
| 2.2.3 未知病毒单感染病例复制动物疾病模型 |
| 2.2.3.1 病料处理 |
| 2.2.3.2 回归动物 |
| 2.2.3.3 大体剖检病变观察 |
| 2.2.3.4 病理组织学病变观察 |
| 2.2.3.5 PCR诊断 |
| 2.2.4 未知病毒鉴定 |
| 2.2.4.1 电子显微镜观察 |
| 2.2.4.2 高通量测序上机样品处理 |
| 2.2.4.3 PacBio三代测序平台高通量病毒宏基因组测序 |
| 2.2.4.4 病毒宏基因组测序数据分析 |
| 2.2.4.5 Inverse PCR扩增病毒全长序列 |
| 2.2.4.6 GyV3基因结构预测及序列同源性比对分析 |
| 2.2.4.7 GyV3全基因组进化树分析 |
| 2.2.5 GyV3回顾性流行病学调查 |
| 2.2.6 GyV3培养 |
| 2.2.6.1 原代鸡胚腺胃细胞制作 |
| 2.2.6.2 接种GyV3 |
| 2.2.6.3 电子显微镜观察病毒粒子 |
| 2.2.6.4 PCR检测已知TVP相关病毒 |
| 2.2.7 GyV3致病特征 |
| 2.2.7.1 纯培养GyV3对SPF鸡致病性实验 |
| 2.2.7.2 GyV3不同接种方式对SPF鸡致病性实验 |
| 2.2.7.3 GyV3对不同日龄SPF鸡致病性实验 |
| 2.2.8 GyV3在鸡体内各器官的分布 |
| 2.2.8.1 构建绝对荧光定量标准曲线 |
| 2.2.8.2 组织DNA的提取 |
| 2.2.8.3 荧光定量PCR检测各器官病毒载量 |
| 2.2.9 初步筛选GyV3衣壳蛋白VP1 相互作用蛋白 |
| 2.2.9.1 构建真核表达载体 |
| 2.2.9.2 CEF细胞真核表达 |
| 2.2.9.3 免疫共沉淀 |
| 2.2.9.4 质谱分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 流行病学调查结果 |
| 3.1.1 大体剖检病变类型 |
| 3.1.2 病理组织学病变类型 |
| 3.1.3 病原检测结果 |
| 3.2 筛选未知病毒单感染病例 |
| 3.2.1 已知腺胃炎相关病毒PCR检测 |
| 3.2.2 临床、大体及剖检病变 |
| 3.3 未知病毒单感染TVP动物疾病模型 |
| 3.3.1 回归动物临床、大体及剖检病变 |
| 3.3.2 回归动物病理组织学变化进程 |
| 3.3.3 PCR检测排除已知TVP相关病毒感染 |
| 3.4 未知病毒鉴定结果 |
| 3.4.1 电子显微镜观察病毒形态 |
| 3.4.2 病毒宏基因组测序数据分析结果 |
| 3.4.3 GyV3全长序列扩增结果 |
| 3.4.4 GyV3基因结构预测结果 |
| 3.4.5 GyV3同源性比对结果 |
| 3.4.6 GyV3基因结构比对结果 |
| 3.4.7 GyV3全基因组进化树分析结果 |
| 3.5 GyV3回顾性流行病学调查结果 |
| 3.6 GyV3在原代鸡胚腺胃细胞上纯培养 |
| 3.7 GyV3致病特征 |
| 3.7.1 纯培养GyV3回归动物致病特征 |
| 3.7.2 GyV3不同接种方式对SPF鸡致病性结果 |
| 3.7.3 GyV3对不同日龄SPF鸡致病性结果 |
| 3.8 GyV3在鸡体内各器官的分布 |
| 3.8.1 绝对荧光标准曲线构建结果 |
| 3.8.2 荧光定量PCR检测各器官病毒载量结果 |
| 3.9 Co-IP筛选GyV3衣壳蛋白VP1 相互作用蛋白 |
| 3.9.1 flag-VP1 基因扩增结果 |
| 3.9.2 T-flag-VP1 载体和pcDNA3.1(+)载体双酶切结果 |
| 3.9.3 pcDNA3.1(+)-flag-VP1 重组载体测序结果 |
| 3.9.4 pcDNA3.1(+)-flag-VP1 重组载体测序结果 |
| 3.9.5 免疫共沉淀后上清SDS-PAGE结果 |
| 3.9.6 质谱分析结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 流行病学调查和单感染 TVP 疾病模型建立 |
| 4.2 PacBio 三代宏病毒测序鉴定未知病毒 |
| 4.3 GyV3发病规律及致病机理 |
| 4.4 GyV3衣壳蛋白VP1 互作蛋白筛选 |
| 5 结论 |
| 6 参考文献 |
| 7 致谢 |
| 8 附录 |
| 1.GyV3-SDAU-1 株全基因组序列 |
| 2.pcDNA3.1(+)-flag-VP1 重组载体序列 |
| 9 个人简历 |
（6）传染性支气管炎病毒SD/04/18株感染鸡体内各组织中病毒的动态分布及排毒规律研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 1.引言 |
| 1.1 鸡传染性支气管炎 |
| 1.2 鸡传染性支气管炎病毒病原学研究进展 |
| 1.2.1 IBV的病原学简介 |
| 1.2.2 IBV的结构蛋白及功能 |
| 1.2.3 IBV的非结构蛋白及功能 |
| 1.3 IBV的基因型和血清型研究进展 |
| 1.3.1 国外的IBV基因型和血清型研究进展 |
| 1.3.2 国内的IBV基因型和血清型研究进展 |
| 1.4 IBV的分子遗传变异机制研究进展 |
| 1.5 IBV诱导的天然免疫应答研究进展 |
| 1.6 鸡传染性支气管炎病毒体外培养研究概况 |
| 1.7 鸡传染性支气管炎的诊断技术简介 |
| 1.8 鸡传染性支气管炎的防控措施简介 |
| 1.9 研究目的与意义 |
| 2.材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 主要试剂 |
| 2.3 主要仪器 |
| 2.4 常用试剂的配制 |
| 2.4.1 抗生素的配制 |
| 2.4.2 不同浓度氯化钠溶液的配制 |
| 2.4.3 胰蛋白酶-EDTA溶液的配制 |
| 2.4.4 不同浓度胰蛋白酶溶液的配制 |
| 2.4.5 PBS的配制 |
| 2.4.6 LB液体培养基的配制 |
| 2.4.7 LB固体培养基的配制 |
| 2.4.8 氨苄西林固体培养基的配制 |
| 2.4.9 细胞培养基的配制 |
| 2.4.10 1×TE电泳液的配制 |
| 2.4.11 琼脂糖凝胶的制作 |
| 2.4.12 1%红血球的制备 |
| 2.4.13 4%甲醛组织固定液的配制 |
| 2.5 试验方法 |
| 2.5.1 引物设计 |
| 2.5.2 病料的处理 |
| 2.5.3 病毒核酸的提取 |
| 2.5.4 目的基因的RT-PCR扩增 |
| 2.5.5 RT-PCR产物的纯化回收 |
| 2.5.6 目的基因的连接、转化 |
| 2.5.7 重组质粒的提取、鉴定与测序分析 |
| 2.5.8 SD/04/18 株的S1 基因遗传进化分析 |
| 2.5.9 重组质粒的浓度测定与稀释 |
| 2.5.10 标准质粒Real-TimePCR扩增 |
| 2.5.11 IBV实时定量PCR检测标准曲线的建立 |
| 2.5.12 SD/04/18 株的EID50 测定 |
| 2.5.13 SD/04/18 株的血凝效价测定 |
| 2.5.14 细胞复苏 |
| 2.5.15 细胞传代 |
| 2.5.16 鸡胚肾原代细胞的制备 |
| 2.5.17 动物回归试验 |
| 2.5.18 SD/04/18 株体外增殖与细胞病变情况 |
| 2.5.19 病毒定量检测 |
| 2.5.20 SD/04/18 株多克隆抗体的制备与特异性验证 |
| 2.5.21 人工感染发病 |
| 2.5.22 病料采集与处理 |
| 2.5.23 病理组织切片制作 |
| 2.5.24 免疫组织化学法分析 |
| 2.5.25 病毒动态分布检测 |
| 2.5.26 排毒检测 |
| 2.5.27 人工感染SD/04/18 株的抗体水平检测 |
| 2.5.28 数据处理与分析 |
| 3.结果与分析 |
| 3.1 病毒分离鉴定结果 |
| 3.2 SD/04/18 株的S1 基因测序分析结果 |
| 3.3 重组质粒PCR鉴定结果 |
| 3.4 IBV实时定量PCR检测标准曲线的建立 |
| 3.4.1 标准曲线的灵敏度 |
| 3.4.2 扩增曲线的重复性 |
| 3.4.3 标准曲线的特异性 |
| 3.4.4 标准曲线相关参数 |
| 3.5 SD/04/18 株的EID50 测定与胚胎发育情况 |
| 3.6 SD/04/18 株的血凝效价测定 |
| 3.7 动物回归试验与临床症状 |
| 3.8 SD/04/18 株致细胞病变结果 |
| 3.9 两株IBV体外培养增殖情况 |
| 3.10 SD/04/18 株多克隆抗体特异性验证 |
| 3.11 人工感染后的临床症状与剖检变化 |
| 3.12 病理组织变化 |
| 3.13 免疫组织化学法分析结果 |
| 3.14 两组试验鸡的体重差异 |
| 3.15 各器官不同时间点病毒载量的动态变化 |
| 3.16 相同时间点各器官病毒载量的比较 |
| 3.17 SD/04/18 株的排毒规律 |
| 3.18 抗体水平检测结果 |
| 4.讨论 |
| 4.1 SD/04/18 株分离鉴定与遗传进化分析 |
| 4.2 IBV实时定量PCR检测方法建立与应用 |
| 4.3 SD/04/18 株和M41 株的体外增殖分析 |
| 4.4 SD/04/18 株的致病性与排毒规律 |
| 4.5 SD/04/18 株在各组织器官的动态分布与宿主抗体水平的关系 |
| 5.结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 硕士期间的主要学术成果 |
（7）鸡传染性支气管炎强毒与新城疫强毒在新城疫免疫鸡群中的协同致病作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 引言 |
| 1.1 新城疫病毒的研究进展 |
| 1.1.1 新城疫病毒概述 |
| 1.1.2 NDV的分子生物学 |
| 1.2 鸡传染性支气管炎的研究进展 |
| 1.2.1 鸡传染性支气管炎病毒概述 |
| 1.2.2 IBV的分子生物学 |
| 1.2.3 IBV的血清型分类 |
| 1.2.4 IBV的流行情况 |
| 1.2.5 IBV的致病性 |
| 第2章 基于中国知网数据库的鸡传染性支气管炎病毒混合感染分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 检索方法 |
| 2.1.2 鸡传染性支气管炎病毒混合感染地区分布 |
| 2.1.3 鸡传染性支气管炎病毒混合感染疾病类型分析 |
| 2.1.4 鸡传染性支气管炎病毒与NDV和 AIV混合感染情况分析 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 鸡传染性支气管病毒混合感染地区分布 |
| 2.2.2 鸡传染性支气管病毒混合感染病原类型 |
| 2.2.3 IBV和 NDV、AIV三种病毒混合感染情况 |
| 2.3 讨论 |
| 第3章 鸡传染性支气管炎病毒分离株CK/CH/HD/171018 的生物学特性测定及全基因组序列分析 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 毒株、SPF鸡和SPF鸡胚 |
| 3.1.2 菌种、载体及主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器设备 |
| 3.1.4 引物设计及合成 |
| 3.1.5 病毒增殖与鉴定及EID50的测定 |
| 3.1.6 SPF鸡致病性实验 |
| 3.1.7 病毒基因组的扩增 |
| 3.1.8 目的基因克隆 |
| 3.1.9 序列拼接和基因组全序列的生物信息学分析 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 CK/CH/HD/171018 病毒对SPF鸡胚致病性 |
| 3.2.2 CK/CH/HD/171018 病毒对SPF鸡致病性 |
| 3.2.3 CK/CH/HD/171018 全基因组序列测定结果 |
| 3.2.4 CK/CH/HD/171018 序列测定和拼接 |
| 3.2.5 CK/CH/HD/171018 遗传进化分析 |
| 3.2.6 CK/CH/HD/171018 的重组分析 |
| 3.3 讨论 |
| 第4章 鸡传染性支气管炎强毒与新城疫强毒在新城疫免疫鸡群中混合感染模型的建立 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 毒株、SPF鸡和SPF鸡胚 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要仪器设备 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 ZJ1的扩增及EID50的测定 |
| 4.2.2 QX的扩增及EID50的测定 |
| 4.2.3 QX和 ZJ1的SPF鸡混合感染试验分组 |
| 4.2.4 病理组织学检查 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 临床症状 |
| 4.3.2 死亡率的统计 |
| 4.3.3 组织病理学观察 |
| 4.4 讨论 |
| 第5章 鸡传染性支气管炎强毒与新城疫强毒在新城疫免疫鸡群中协同致病作用的研究 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 病毒 |
| 5.1.2 主要试剂 |
| 5.1.3 主要仪器设备 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 QX N基因与ZJ1 M基因Real-time PCR检测方法的建立 |
| 5.2.2 QX和 ZJ1的SPF鸡混合感染试验 |
| 5.2.3 鸡抗体水平的测定 |
| 5.2.4 泄殖腔排毒水平的测定 |
| 5.2.5 鸡体内病毒组织分布情况旳测定 |
| 5.2.6 细胞因子表达水平的测定 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 NDV抗体水平的测定 |
| 5.3.2 IBV抗体水平的测定 |
| 5.3.3 N基因与M基因Real-time PCR检测方法的建立 |
| 5.3.4 泄殖腔QX的排毒率及排毒量统计 |
| 5.3.5 泄殖腔ZJ1的排毒率及排毒量统计 |
| 5.3.6 鸡体内QX的组织分布情况 |
| 5.3.7 鸡体内ZJ1的组织分布情况 |
| 5.3.8 气管中细胞因子的表达情况 |
| 5.3.9 肺脏中细胞因子的表达情况 |
| 5.3.10 肾脏中细胞因子的表达情况 |
| 5.3.11 脾脏中细胞因子的表达情况 |
| 5.3.12 法氏囊中细胞因子的表达情况 |
| 5.4 讨论 |
| 全文小结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（8）2001～2016年间华东地区IBV分子流行病学、致病性及S1蛋白的天然免疫应答研究（论文提纲范文）
| 摘要 ABSTRACT 中英对照缩略词 第一部分 文献综述 |
| 综述一 传染性支气管炎病毒研究进展 |
| 1 病原学 |
| 1.1 发现、命名与分类 |
| 1.2 生物学特性 |
| 1.3 基因组结构与主要功能蛋白 |
| 1.4 生活周期 |
| 1.5 致病机理 |
| 1.6 毒株分型 |
| 2 流行病学 |
| 2.1 自然宿主 |
| 2.2 实验室宿主 |
| 2.3 传播方式 |
| 3 临床症状及病理变化 |
| 3.1 呼吸道 |
| 3.2 肾脏 |
| 3.3 生殖道 |
| 3.4 消化道 |
| 3.5 其它 |
| 4 诊断 |
| 4.1 病原的分离鉴定 |
| 4.2 血清学诊断技术 |
| 4.3 分子生物学检测技术 |
| 5 防治 |
| 5.1 免疫预防 |
| 5.2 治疗 |
| 综述二 传染性支管炎病毒在世界范围内流行现状 |
| 1 亚洲国家IBV流行现状 |
| 2 欧洲国家IBV流行现状 |
| 3 非洲国家IBV流行现状 |
| 4 北美洲国家IBV流行现状 |
| 5 南美洲国家IBV流行现状 |
| 6 大洋洲国家IBV流行现状 |
| 综述三 禽冠状病毒纤突蛋白研究进展 |
| 1 禽冠状病毒S蛋白概述 |
| 1.1 结构特点 |
| 1.2 序列多样性 |
| 1.3 其它禽类冠状病毒S蛋白 |
| 2 禽冠状病毒S蛋白功能 |
| 2.1 组织吸附中的作用 |
| 2.2 细胞亲和性中的作用 |
| 2.3 体内组织嗜性与致病性中的作用 |
| 3 病毒吸附中宿主影响因素 |
| 3.1 唾液酸 |
| 3.2 蛋白受体 |
| 3.3 凝集素 |
| 3.4 硫酸肝素 |
| 3.5 宿主蛋白酶 |
| 4 禽冠状病毒S蛋白引起宿主天然免疫反应 |
| 参考文献 第二部分 研究内容 |
| 第一章 2001～2016年间华东地区传染性支气管炎病毒分子流行病学分析 |
| 1 材料 |
| 1.1 生物材料 |
| 1.2 试剂与载体 |
| 1.3 主要试剂溶液配制 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 引物设计 |
| 2.2 病毒增殖 |
| 2.3 病毒总RNA提取 |
| 2.4 S1基因扩增与序列测定 |
| 2.5 S1基因序列分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 病毒分离结果 |
| 3.2 分离株S1蛋白长度与裂解位点的多样性 |
| 3.3 分离株S1基因分型的多样性 |
| 3.4 新分支New-Ⅰ与New-Ⅱ基因型IBV S1基因的来源 |
| 4 讨论 |
| 第二章 2001～2016年间我国传染性支气管炎病毒基因组序列重组分析 |
| 1 材料 |
| 1.1 生物材料 |
| 1.2 试剂与载体 |
| 1.3 主要试剂溶液配制 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 分离株全序列扩增引物设计 |
| 2.2 分离株全基因组序列RT-PCR |
| 2.3 病毒基因组5'与3'端序列扩增 |
| 2.4 分离株基因组序列测定与分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 分离株基因组结构 |
| 3.2 分离株CK/CH/2010/JT-1基因组的重组来源 |
| 3.3 分离株CK/CH/2014/QL1403基因组的重组来源 |
| 3.4 我国2001～2016年间IBV基因组重组现象普遍 |
| 4 讨论 |
| 第三章 我国鸡传染性支气管炎病毒分离株致病性分析及交叉保护研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 生物材料 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 病毒扩增 |
| 2.2 SPF鸡致病性实验 |
| 2.3 病毒中和实验 |
| 2.4 交叉保护实验 |
| 2.5 鸡IBV血清抗体ELISA |
| 3 结果 |
| 3.1 IBV分离株致病性 |
| 3.2 交叉中和实验结果 |
| 3.3 天然弱毒CK/CH/2014/QL1403对QX型IBV交叉保护实验 |
| 4 讨论 |
| 第四章 传染性支气管炎病毒S1蛋白的天然免疫应答研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 生物材料 |
| 1.2 试剂与载体 |
| 1.3 主要试剂溶液配制 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 引物设计 |
| 2.2 真核表达载体的构建 |
| 2.3 CEKC的制备 |
| 2.4 CEKC的质粒转染 |
| 2.5 共聚焦显微镜荧光分析 |
| 2.6 Western-blot |
| 2.7 荧光定量PCR方法检测相关因子 |
| 2.8 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 S1基因RT-PCR扩增结果 |
| 3.2 重组质粒酶切鉴定 |
| 3.3 重组质粒转染CEKC后S1蛋白的表达 |
| 3.4 IBV S1蛋白引起CEKC天然免疫相关因子表达差异 |
| 3.5 配体刺激后IBV S1蛋白引起CEKC天然免疫相关因子表达差异 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 全文总结 致谢 攻读博士期间所获成果 |
（9）IBV M41株感染对鸡MDA5信号通路关键分子表达的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 鸡传染性支气管炎 |
| 1.2 免疫系统 |
| 1.3 鸡固有免疫细胞 |
| 1.3.1 异嗜性细胞 |
| 1.3.2 巨噬细胞 |
| 1.3.3 NK细胞 |
| 1.3.4 树突状细胞(DC) |
| 1.4 模式识别受体 |
| 1.4.1 TLR受体 |
| 1.4.2 RLR信号通路 |
| 1.4.3 NOD样受体 |
| 1.5 干扰素刺激基因(ISG) |
| 1.6 课题研究的目的及意义 |
| 第二章 鸡MDAS信号通路相关因子及干扰素刺激基因实时荧光定量PCR标准曲线的建立 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 试验材料 |
| 2.1.2 主要试剂及仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 引物的设计及合成 |
| 2.2.2 总RNA的提取及cDNA的合成 |
| 2.2.3 目的基因PCR扩增 |
| 2.2.4 阳性克隆株测序鉴定 |
| 2.2.5 质粒抽提 |
| 2.2.6 阳性标准品的制备 |
| 2.2.7 实时荧光定量PCR标准曲线的建立 |
| 2.2.8 敏感性及重复性试验 |
| 2.3 试验结果 |
| 2.3.1 总RNA质量检测结果 |
| 2.3.2 目的基因PCR结果及阳性克隆株测序结果 |
| 2.3.3 质粒浓度及拷贝数 |
| 2.3.4 标准曲线的建立 |
| 2.3.5 溶解曲线分析及敏感性分析 |
| 2.3.6 重复性试验结果 |
| 2.4 分析与讨论 |
| 第三章 IBV M41感染对鸡MDA5信号通路关键分子及干扰素刺激基因表达的研究 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 病毒及试验动物 |
| 3.1.2 主要试剂及仪器 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 动物试验 |
| 3.2.2 样品的采集及处理 |
| 3.2.3 样品总RNA的提取及反转录 |
| 3.2.4 IBV M41感染后鸡血清IgG抗体水平及病毒载量变化的检测 |
| 3.2.5 IBV M41感染后鸡气管和肾脏MDA5信号通路关键分子mRNA转录水平的检测 |
| 3.2.6 IBV M41感染后鸡气管和肾脏中MDA5信号通路相关分子及部分细胞因子相关表达的检测 |
| 3.2.7 IBV M41感染鸡后干扰素刺激基因mRNA转录水平的检测 |
| 3.2.8 数据处理及分析 |
| 3.3 试验结果 |
| 3.3.1 临床症状及剖检病变 |
| 3.3.2 IBV M41感染后鸡血清IgG抗体水平 |
| 3.3.3 IBV M41感染鸡后气管及肾脏组织病毒载量 |
| 3.3.4 IBV M41感染鸡后气管和肾脏MDA5信号通路关键分子mRNA转录水平 |
| 3.3.5 IBV M41感染鸡后气管和肾脏中MDA5信号通路相关分子及部分细胞因子表达 |
| 3.3.6 IBV M41感染鸡后干扰素刺激基因mRNA转录水平 |
| 3.4 分析与讨论 |
| 3.4.1 IBV M41感染后鸡临床症状、病毒载量和血清特异性抗体相关性 |
| 3.4.2 IBV M41感染后MDA5信号通路上关键分子mRNA转录水平变化 |
| 3.4.3 IBV M41感染后MDA5信号通路相关分子mRNA转录水平变化 |
| 3.4.4 IBV M41感染后IL-8、IL-12、IFNα和IFNβ表达水平变化 |
| 3.4.5 IBV M41感染后干扰素刺激基因mRNA转录水平变化 |
| 3.4.6 IBV M41感染对气管和肾脏组织MDA5信号通路影响分析 |
| 第四章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
| 攻读学位期间发表论文情况及参加科研项目 |
（10）鸡传染性支气管炎病毒GX-YL5株M和E基因在重组杆状病毒中的构建和初步表达（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩写、符号说明 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 鸡传染性支气管炎概述 |
| 1.1.1 IBV的分类 |
| 1.1.2 IBV的结构蛋白及生物学功能 |
| 1.2 IBV疫苗的种类 |
| 1.2.1 灭活疫苗 |
| 1.2.2 弱毒疫苗 |
| 1.2.3 亚单位疫苗 |
| 1.2.4 基因重组载体疫苗 |
| 1.2.5 DNA疫苗 |
| 1.3 杆状病毒表达系统概述 |
| 1.3.1 杆状病毒表达系统简介 |
| 1.3.2 Bac-to-Bac系统 |
| 1.3.3 杆状病毒表达系统在疫苗研制中的应用 |
| 1.3.4 蜂素信号肽 |
| 1.4 杆状病毒表达系统在常见冠状病毒疾病中的应用 |
| 1.4.1 鸡传染性支气管炎病毒 |
| 1.4.2 其他常见冠状病毒 |
| 1.5 本课题研究的目的和意义 |
| 第二章 鸡传染性支气管炎病毒GX-YL5株M和E蛋白在重组杆状病毒中的单表达 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 IBV毒株 |
| 2.1.2 载体、菌株与细胞 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 主要仪器 |
| 2.1.5 常用培养基、试剂的配制 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 引物设计 |
| 2.2.2 目的基因的扩增 |
| 2.2.3 重组克隆载体的构建与鉴定 |
| 2.2.4 重组转座载体的构建与鉴定 |
| 2.2.5 重组杆粒的获取及纯化 |
| 2.2.6 重组杆粒转染Sf9昆虫细胞 |
| 2.2.7 重组杆状病毒转染后的PCR鉴定 |
| 2.2.8 IFA检测目的蛋白表达 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 目的基因的扩增 |
| 2.3.2 重组克隆载体的构建与鉴定 |
| 2.3.3 重组转座载体的构建与鉴定 |
| 2.3.4 重组杆粒的获取及纯化 |
| 2.3.5 重组杆状病毒感染Sf9细胞 |
| 2.3.6 重组杆状病毒转染后的PCR鉴定 |
| 2.3.7 IFA检测蛋白表达情况 |
| 2.4 小结与讨论 |
| 2.4.1 获得重组杆状病毒rHBM1-M、rHBM2-E和rHBM1-E1 |
| 2.4.2 重组杆状病毒的构建策略 |
| 2.4.3 重组杆状病毒的纯化方法 |
| 2.4.4 重组杆状病毒在研制IBV新型疫苗中的应用 |
| 第三章 鸡传染性支气管炎病毒GX-YL5株M和E蛋白在重组杆状病毒中的共表达 |
| 3.1 材料 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 引物设计 |
| 3.2.2 HBM1、HBM2、M和E基因的获得 |
| 3.2.3 重组克隆载体的构建与鉴定 |
| 3.2.4 重组转座载体pFast-HBM-M-E的构建与鉴定 |
| 3.2.5 重组杆粒rHBM-M-E的获取及纯化 |
| 3.2.6 重组杆粒转染Sf9昆虫细胞 |
| 3.2.7 重组杆状病毒转染后的PCR鉴定 |
| 3.2.8 IFA检测目的蛋白表达 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 目的基因的扩增 |
| 3.3.2 重组克隆载体的构建与鉴定 |
| 3.3.3 pFast-HBM-M-E的构建与鉴定 |
| 3.3.4 rHBM-M-E的获取及纯化 |
| 3.3.5 重组杆状病毒感染Sf9细胞 |
| 3.3.6 重组杆状病毒转染后的PCR鉴定 |
| 3.3.7 IFA检测蛋白表达情况 |
| 3.4 小结与讨论 |
| 3.4.1 获得重组杆状病毒rHBM-M-E |
| 3.4.2 构建VLPs表达系统的选择 |
| 3.4.3 VLPs疫苗在家禽疾病中的应用前景 |
| 第四章 结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
| 攻读硕士学位期间论文发表情况及参与的科研项目 |
| 附录 |
四、鸡传染性支气管炎病毒感染的免疫致病机制（论文参考文献）
- [1]IBV S蛋白抗原表位鉴定及与宿主细胞互作的研究[D]. 武奇. 扬州大学, 2021
- [2]泰安及周边地区规模化蛋鸡场主要病毒性疾病临床诊断调查及免疫程序调整优化[D]. 乔清华. 山东农业大学, 2020(01)
- [3]TW Ⅰ型传染性支气管炎病毒的致病性评价与实时荧光定量PCR检测方法的建立[D]. 廖凯. 扬州大学, 2020
- [4]肾型传染性支气管炎病毒致鸡痛风的多组学研究[D]. 许普之. 江西农业大学, 2020(07)
- [5]鸡传染性腺胃炎相关病毒-圆圈病毒3型的分离鉴定及致病机制研究[D]. 李根. 山东农业大学, 2019(01)
- [6]传染性支气管炎病毒SD/04/18株感染鸡体内各组织中病毒的动态分布及排毒规律研究[D]. 潘力. 山东农业大学, 2019(01)
- [7]鸡传染性支气管炎强毒与新城疫强毒在新城疫免疫鸡群中的协同致病作用[D]. 李智超. 新疆农业大学, 2018(06)
- [8]2001～2016年间华东地区IBV分子流行病学、致病性及S1蛋白的天然免疫应答研究[D]. 周海生. 扬州大学, 2017(05)
- [9]IBV M41株感染对鸡MDA5信号通路关键分子表达的影响[D]. 谢智文. 广西大学, 2015(05)
- [10]鸡传染性支气管炎病毒GX-YL5株M和E基因在重组杆状病毒中的构建和初步表达[D]. 宋丽丽. 广西大学, 2015(05)
标签：鸡传染性支气管炎论文; 血清蛋白论文; 基因合成论文; 重组蛋白论文; 抗原抗体论文;