一、胰岛素样生长因子1基因转染对大鼠肌腱细胞生长的促进作用（论文文献综述）
邓亚鹏[1]（2021）在《富血小板血浆联合体外冲击波治疗低氧环境下兔跟腱病的实验研究》文中研究说明目的:跟腱病是常见的临床疾病和运动损伤疾病之一,过度使用造成跟腱损伤退变是其主要原因,表现为局部疼痛和功能受损,严重影响患者的工作和生活。富血小板血浆（Platelet-Rich Plasma,PRP）和体外冲击波（Extracorporeal Shock-Wave,ESW）是肌腱病治疗的可选方案,各具优势及良好的应用前景,但两种治疗方法疗效缺乏稳定性,本研究拟通过筛选ESW治疗兔跟腱病的最佳治疗参数,将PRP生物治疗与ESW物理治疗相结合,探索跟腱病治疗的最佳方案,并验证进一步推广至低氧环境下兔跟腱病治疗的有效性,以期为临床肌腱病治疗提供一种新的可替代方案。方法:本实验由三部分组成1.ESW治疗兔跟腱病模型最佳能量参数评价和筛选:（40）型胶原酶注射构建双侧兔跟腱病模型,造模成功后按照试验预设的体外冲击波治疗（Extracorporeal Shock-Wave Therapy,ESWT）能量参数（1.0bar、1.5bar、2.0bar和2.5bar）随机将实验兔分为4组,各组选择相同脉冲次数2000脉冲和脉冲频率10Hz间隔5天治疗3次,治疗完成观察4周后进行兔跟腱超声、组织H&E染色、TEM（Transmission Electron Microscope,透射电镜）扫描评价ESWT对跟腱胶原纤维的排列与分布的影响;生物力学性能检测评价跟腱最大拉伸断裂载荷及刚度;RT-PCR检测其基质胶原蛋白、生长因子和炎症因子的相对表达量,采用统计学分析比较不同能量水平ESW治疗结果从而筛选出最佳能量参数。2.ESW治疗兔跟腱病模型最佳脉冲数参数评价和筛选:以上部分实验筛选的ESW治疗兔模型跟腱病的最佳能量参数为依据,兔跟腱病模型构建成功后,依据试验预设的ESWT脉冲数参数（500脉冲、1000脉冲、1500脉冲和2000脉冲）随机将实验兔分为4组,以相同能量和脉冲频率10Hz间隔5天治疗3次,治疗完成观察4周后进行兔跟腱超声、组织H&E染色、TEM、生物力学性能检测和RT-PCR检测评价跟腱愈合结果,采用统计学分析比较不同脉冲数ESW治疗效果从而筛选出最佳脉冲数参数。3.超声引导下PRP注射联合ESW治疗对模拟高原低氧环境下兔跟腱病修复能力的研究:选择12只实验兔,其中4只为空白对照组,另外8只实验兔选择左侧后肢行超声引导下PRP注射联合ESW治疗,作为空白联合治疗组;选择32只实验兔随机分为4组,其中3组在常氧环境下（40）型胶原酶注射构建双侧兔跟腱病模型,造模成功后分为ESW治疗组、超声引导下PRP注射治疗组、超声引导下PRP注射联合ESW治疗组完成兔模型跟腱病治疗;剩余1组在模拟高原低氧环境下（模拟海拔5500米高原环境）（40）型胶原酶注射建立兔双侧跟腱病模型,建模成功后完成超声引导下PRP注射联合ESW治疗。以前部分实验筛选的最佳能量参数和最佳脉冲数以及脉冲频率10Hz为ESW治疗参数,间隔5天治疗3疗程;PRP注射联合ESWT模式为在第一疗程ESW治疗完成后24小时进行跟腱及跟腱周围PRP注射,之后4天后完成第2疗程ESW治疗,之后间隔5天后完成第3疗程ESW治疗。治疗完成观察4周后完成各项指标检测并进行统计学分析（同摘要方法1）,通过比较超声引导下PRP注射联合ESW治疗、单独超声引导下PRP注射以及单独ESW治疗对兔跟腱病模型的组织修复能力,评价超声引导下PRP注射联合ESW的治疗效果;通过评价PRP注射联合ESWT对正常跟腱的影响探讨PRP联合ESW治疗的安全性;并进一步评价超声引导下PRP注射联合ESWT在高原低氧环境下对兔跟腱病模型的治疗效果,探究PRP注射联合ESWT对模拟高原环境下兔跟腱病治疗的有效性。结果:1.1.5bar能量水平ESW治疗对兔跟腱病组织修复能力最强,超声弹性评价结果显着改善（P<0.001）、极限拉伸载荷值表现出更大的趋势（P=0.00）、TEM检测发现胶原原纤维平均截面积明显较大（P<0.0001）,总胶原原纤维和>0.1（?）m直径胶原原纤维体积比增加（P<0.01）,组织H&E染色评价明显优于其他能量水平组（P<0.05）,胶原蛋白Collagen（40）,生长因子b FGF、VEGF和TGF-β表达显着上调。2.1000脉冲数ESW治疗对兔跟腱病组织修复能力最强,超声弹性评价值显着增加（P<0.0001）,极限拉伸载荷值显着增大（P<0.05）,较1500脉冲数组有较大趋势（P>0.05）,胶原原纤维平均截面积和体积比明显增大（P<0.001）,组织切片H&E染色综合评分明显改善（P<0.05）,明显上调了胶原蛋白Collagen（40）和生长因子b FGF、VEGF和TGF-β表达（P<0.05）。3.ESW联合PRP治疗能够有效协同促进兔跟腱病跟腱组织修复,较单独ESW治疗和单独PRP治疗表现出更好的超声截面积改善程度（P=0.009）,剪切波弹性值明显增加（P<0.05）,超声结构和血流信号有更好的改善趋势（P>0.05）,组织极限拉升载荷显着增大（P<0.05）,总胶原原纤维和>0.1（?）m直径的胶原原纤维截面积及直径明显增加（P<0.05）,组织学评分显着优于其他干预组（P<0.05）,胶原蛋白Collagen（40）和生长因子b FGF、VEGF和TGF-β表达显着上调（P<0.05）,胶原蛋白Collagen III和炎症因子TNF-α、IL-10显着下调（P<0.05）。通过正常跟腱与PRP联合ESWT对正常跟腱组织干预后结果比较,评价PRP联合ESWT治疗的安全性发现,联合治疗后正常跟腱组织超声截面积轻度增加,结构无明显损伤,血流轻度改善,剪切波弹性值、组织极限拉伸载荷和组织刚度与正常跟腱无差异（P>0.05）,>0.1（?）m直径的胶原原纤维截面积较正常跟腱明显增加（P<0.05）,组织学评分最低,但与M&EP组无显着差异（P>0.05）,胶原蛋白Collagen（40）表达最高（P<0.05）,生长因子（b FGF、VEGF和TGF-β）低表达。PRP联合ESW治疗应用于模拟高原低氧环境下兔跟腱病治疗的适用性研究表明其对跟腱病修复能力明显受限,各项检测结果明显差于常氧环境下ESWT联合PRP治疗组（P<0.05）,但优于模型组结果（P<0.05）。结论:ESWT治疗兔跟腱病的最佳治疗参数为1.5bar、1000脉冲数。相比于单独超声引导下PRP注射和单独ESW治疗,PRP注射联合ESW治疗更能促进兔跟腱病模型跟腱的愈合,且无明显组织损伤作用,是肌腱病治疗的更优选择。此外,PRP注射联合ESWT治疗对模拟高原低氧环境下兔跟腱病的修复能力受限。
尹一童[2]（2021）在《Lnc00839通过miR-19-3p/IGF-1分子轴对阴道壁成纤维细胞COL-1分泌影响及其分子机制探究》文中认为目的:盆腔脏器脱垂（Pelvic organ prolapse,POP）指的是由于女性盆底支持组织力量薄弱,盆腔内脏器经由阴道脱出于体外的一组疾病。盆腔脏器脱垂的发生通常与盆底结构支持系统松弛息息相关。从分子生物学角度探寻该疾病的发病机制,从而实现对疾病的早期诊断及早期干预,可以延缓疾病进程,减轻患者的痛苦,具有较重要的临床意义。在针对人体多个系统的多项研究结果显示,IGF-1的表达与成纤维细胞胶原蛋白表达程度相关。因此,我们推测,IGF-1表达异常可能与盆腔脏器脱垂的发病存在相关性。根据生信学分析结果,我们预测Lnc00839与IGF-1可能存在靶向调控关系,从而影响盆底结构中成纤维细胞胶原蛋白的表达。本文拟探寻IGF-1与盆腔脏器脱垂之间的关系,并进一步研究Lnc00839在盆腔脏器脱垂这一疾病中发挥的作用,以寻找与盆腔脏器脱垂相关的分子生物学机制,为疾病的早期诊断及早期干预提供潜在解决方案。方法:1.利用PCR及Western-blot等方法,检测并比较脱垂组患者阴道壁组织中与正常对照组患者阴道壁组织中Lnc00839、mi R-19-3p、IGF-1,IGF-1R,COL-1,COL-3的表达情况,并与器官脱垂临床严重程度进行相关性分析。2.对脱垂组及对照组组织中凋亡及自噬情况进行分析:TUNEL检测两组间组织凋亡情况,Western-blot检测两组中自噬标记物Beclin1、LC3II/I及凋亡标记物Bax、Bcl-2的表达情况。3.上调IGF-1后,检测下游COL-1及LC3II/I表达情况,上调Lnc00839后,检测下游IGF-1及IGF-1R表达情况。4.实验验证Lnc00839与mi R-19-3p的靶向作用关系。5.实验验证mi R-19-3p与IGF-1的靶向作用关系。6.Western-blot检测脱垂组及对照组中AKT,m TOR,p70s6k,p-AKT,p-m TOR,p-p70s6k的表达情况。7.构建高转Lnc00839的成纤维细胞,并滴加不同浓度的IGF-1后,检测下游通路蛋白AKT,m TOR,p70s6k,p-AKT,p-m TOR,p-p70s6k的表达情况,同时检测下游COL-1,IGF-1和IGF-1R的表达情况及自噬标记物表达情况。结果:1.在POP患者的阴道壁组织中,Lnc00839,COL-1及IGF-1,IGF-1R表达水平降低,且其表达水平与盆腔脏器脱垂严重程度呈负相关,mi R-19-3p表达水平增高,其表达水平与脱垂严重程度呈正相关。2.POP患者的阴道壁组织中自噬水平和凋亡水平增加,IGF-1可以通过抑制细胞过度自噬水平,促进COL-1的分泌。3.上调IGF-1后,下游COL-1表达水平增加,Lnc00839可以上调阴道壁成纤维细胞IGF-1表达。4.Lnc00839可以与mi R-19-3p靶向结合。5.mi R-19-3p与IGF-1可以靶向结合,从而抑制Lnc00839对下游IGF-1及COL-1的上调作用。mi R-19-3p通过促进细胞凋亡与过度自噬调节成纤维细胞的COL-1表达。6.AKT-m TOR-p70s6k是IGF-1调控成纤维细胞COL-1分泌的通路。7.Lnc00839调控IGF-1表达最终也可以经过AKT-m TOR-p70s6k通路调控成纤维细胞自噬水平,从而调控成纤维细胞COL-1分泌。结论:1.Lnc00839在盆腔脏器脱垂的阴道壁组织中表达降低,且与盆腔脏器严重程度呈负相关。2.IGF-1与COL-1的低表达可能和盆腔脏器脱垂发病相关。3.Lnc00839可以正向调控IGF-1的表达。成纤维细胞的过度自噬和凋亡可能是盆腔脏器脱垂发生的病理生理基础。4.Lnc00839可能通过与mi R-19-3p相互作用靶向作用于IGF-1,调节成纤维细胞的自噬及凋亡水平,从而COL-1的表达水平。5.Lnc00839通过mi R-19-3p靶向作用于IGF-1后,通过AKT-m TOR-p70s6k通路作用于成纤维细胞,从而调节成纤维细胞COL-1的表达。
李帅峰[3]（2020）在《周期性机械牵伸调节CREB/TGF-β3信号通路影响肌腱愈合的作用研究》文中认为前言随着生活水平的提高和体育运动的推广,肌腱损伤成为日常生活中极为常见的问题。近些年来,肌腱损伤的综合治疗方式已十分成熟,但是术后出现的并发症仍难以解决,肌腱粘连就是其中最为突出的问题。屈指肌腱由于其特殊的生理结构和重要功能作用,损伤发生后愈合效果缓慢。因此,如何促进肌腱的愈合,减少瘢痕粘连的形成,是临床工作中需要解决的问题。常用的方法包括改进手缝合方式、使用生物物理学屏障、局部应用药物和术后物理治疗等。这其中早期机械牵伸活动作为主要的物理治疗方式已获得临床认可,但具体的机制不明确。有相关研究报道其机制与TGF-β信号通路有关。研究表明转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1,TGF-β1）与组织愈合密切相关,其在肌腱组织的成纤维细胞募集,增殖和胶原纤维分泌,改建等多个环节发挥重要作用,但同时也是瘢痕形成的主要原因。而在动物胚胎的无瘢痕愈合过程中,TGF-β1的表达含量远低于其同分异构体TGF-β3,表明TGF-β3可能发挥对抗组织修复过程中粘连形成的作用,但其具体的作用机制并不清楚。另一方面,环磷酸腺苷应答元件结合蛋白（cAMP response element binding protein,CREB）作为转录因子TGF-β3的调节,在组织纤维化调控和瘢痕形成等方面发挥重要作用。但是TGF-β/CREB在肌腱愈合过程中的具体机制仍不明确,其与力学刺激的关系也未见相关报道。因此,本课题的研究目的是:1.验证周期性机械牵伸促进肌腱愈合的作用效果及对TGF-β1,TGF-β3和CREB的分布影响;2.初步探明周期性机械牵伸调节CREB/TGF-β的具体机制。方法1.健康雄性SD大鼠36只,随机分为3组,每组12只。A组为牵伸组,组内大鼠双侧后趾建立屈趾肌腱损伤修复模型,72小时后予以持续1周的被动机械牵伸;B组为损伤组,按上述方式建立模型后不予干预;C组为假手术组,仅切开皮肤而不损伤肌腱,不做干预。2.术后第1、2、4、8周分别在肌腱愈合处取材,通过解剖学观察,HE染色,生物力学检测,实时荧光定量PCR检测和免疫组织化学染色等方法观察肌腱愈合情况和TGF-β1、TGF-β3与CREB等目的基因在肌腱愈合过程中的表达情况。结果1.组织学观察显示牵伸组肌腱组织术后早期胶原纤维排布更加规则,炎症反应降低;损伤组肌腱组织与周围组织粘连广泛,分离暴露困难;统计分析表明愈合过程中各时间点牵伸组相较于损伤组成纤维细胞数目减少,粘连程度减轻,肌腱具有更好的滑动性（P<0.05）。2.生物力学检测显示牵伸组与损伤组肌腱各项生物力学指标均低于假手术组,差异有统计学意义（P<0.05）;随着术后时间的延长,两组肌腱生物力学指标逐渐升高;牵伸组肌腱的生物力学指标稍低于损伤组,但没有统计学意义。3.实时荧光定量PCR显示牵伸组早期出现TGF-β1,TGF-β3和CREB的差异性表达,其中以TGF-β3的高表达出现、长时间持续为主要特点;损伤组肌腱组织中TGF-β1表达水平高于同时期牵伸组,TGF-β3和CREB表达水平低于同时期牵伸组,差异有统计学意义（P<0.05）。4.免疫组织化学染色显示牵伸组三种生长因子的表达存在时间差异,其中CREB表达的变化早于TGF-β1和TGF-β3表达的变化。结论1.早期施加的周期性被动机械牵伸可以促进肌腱愈合,并减少愈合过程中的瘢痕形成。2.早期施加的周期性被动机械牵伸可能通过TGF-β3促进肌腱内源性愈合。3.可能存在CREB调控的TGF-β信号通路,以影响肌腱愈合过程。4.适当的早期活动在促进肌腱愈合的过程中不会降低肌腱的愈合强度。
买买艾力·玉山[4]（2020）在《rhPDGF-BB基因修饰的BMSCs促进大鼠股骨牵张成骨的研究》文中指出目的:1)建立一个合理的可重复的大鼠负重长骨牵张成骨（Distraction Osteogenesis,DO）模型,为今后进一步探讨和深入研究促进牵张成骨区骨再生与矿化的方法以及分子机制奠定基础;2)建立稳定的大鼠骨髓间充质干细胞（Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）的获取和体外培养体系,并进一步扩增,纯化及鉴定。通过人重组血小板衍生生长因子-BB（rhPDGF-BB）基因慢病毒体外转染BMSCs并观察对BMSCs的影响;3)以大鼠自体BMSCs作为载体,通过体外携带rhPDGF-BB基因的慢病毒转染后,将rhPDGF-BB基因修饰的BMSCs导入大鼠股骨牵张间隙中,探讨rhPDGF-BB基因修饰的BMSCs对大鼠股骨牵张间隙新生骨再生矿化的影响,进一步为临床上应用牵张成骨技术（骨传送技术）治疗四肢大段骨缺损探讨一种快速而有效的缩短治疗周期的治疗方法。方法:1)大鼠单侧股骨牵张成骨动物模型的建立:选择雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠为实验动物,<6月龄,350-400g。使用自行研制的延长型外固定器,用10%水合氯醛腹腔注射麻醉后,选择大鼠右侧股骨中段行截骨后用4枚螺钉固定延长型外固定器。术后经过7天潜伏期后进行缓慢牵张,速度为0.5mm/天（分两次）,连续牵张14天,共牵张延长7mm,牵张结束后固定牵张器。分别于牵张结束后第0周,2周,4周及8周四个时间点处死3只动物,处死前麻醉状态下行X线检查,处死后取出右侧股骨标本进行大体观察,组织学HE染色及番红固绿染色观察;2)大鼠BMSCs的分离培养,鉴定及rhPDGF-BB基因体外转染:大鼠自体BMSCs的培养和传代,通过细胞活性检测,碱性磷酸酶（ALP）染色及茜素红染色方法进行细胞鉴定,通过应用密度梯度离心法获取生长状态良好第3代大鼠BMSCs经上述方法鉴定后进一步应用基因转染和下一步的治疗。构建同时携有绿色荧光蛋白（GFP）报告基因和rhPDGF-BB基因的重组慢病毒载体后经体外扩增,纯化后转染大鼠BMSCs观察其体外对BMSCs的影响;3)rhPDGF-BB修饰的骨髓MSCs促进大鼠股骨牵张成骨效果的检测:应用自行研制的延长型外固定器将54只SD大鼠随机分为3组,每组于术后21天分别在牵张区局部注射等剂量rhPDGF-BB修饰的骨髓MSCs（实验组）,骨髓MSCs（实验对照组）,PBS（空白对照组）,活体X线检查于DO牵张结束后不同时间点进行4次,检测时间点为牵张结束（术后天21天）,矿化期2周（术后第35天）,矿化期4周（术后第49天）,矿化期8周（术后第77天）。矿化期第8周末处死动物取双侧股骨,并小心剔除骨组织表面肌肉进行Micro-CT,生物力学及组织病理学检测分析。结果:1)纳入本次实验研究的实验动物活体观察提示所有入组实验动物均耐受手术且顺利完成术后牵张成骨过程,观察期间所有实验动物的饮食及大小便均正常,牵张结束后延长侧股骨较对侧相比达到预定目标长度。通过标准X线检查和组织学观察证实大鼠股骨牵张模型牵张间隙成骨良好;2)应用密度梯度离心法成功分离了大鼠BMSCs,细胞活性检测结果提示细胞生长良好,碱性磷酸酶（ALP）染色及茜素红染色结果提示表达高水平的ALP活性,矿化细胞外基质,形成矿化结节。构建出的rhPDGF-BB基因体外转染鉴定过的大鼠BMSCs,转染后对细胞的生长无明显影响;3)rhPDGF-BB基因修饰的大鼠BMSCs局部应用于大鼠股骨牵张模型。X线片显示,矿化期第8周实验组10只延长区均达到骨性愈合,实验对照组和空白对照组分别为5只和4只达到骨性愈合的标准。生物力学测试（三点力学测试）结果表明实验组所有抗扭强度指标均显着优于其他两个对照组,且实验组抗扭强度指标与自体对侧未牵张正常股骨的抗扭强度相当。Micro-CT扫描后获得的数据结果分析提示矿化期第8周实验组牵张区间隙内新生骨骨痂的主要构成结构由皮质骨构成而松质骨结构极为少见,此外牵张间隙新生骨矿化区可见骨髓腔部分或全部与牵张两骨端骨髓腔基本贯通,其构成和结构与自身长骨管状骨的结构基本类似,而其他两对照组牵张区间隙内新生的骨组织以松质骨结构为主且骨髓腔结构改建较差。矿化期第8周获取的股骨标本行组织学切片后HE和Safranin O染色结果提示,实验组牵张间隙新生骨痂内软骨组织残留较少而两个对照组牵张区间隙新生骨组织结构上仍有部分软组织结构,新生骨已经矿化,皮质骨已连续,骨髓腔开始重建,提示rhPDGF-BB基因修饰的大鼠BMSCs治疗处理后新生骨痂矿化明显。免疫组化结果提示三组中实验组OPN、OCN、VEGF和CD31表达高于两对照组。结论:1)自制延长型外固定器能够满足大鼠单侧股骨牵张的要求,牵张成骨的潜伏期成骨与骨折愈合过程类似,但牵张成骨在其特有的牵张期和矿化期的时间段里牵张区间隙新骨再生具有其特有的组织学变化特点。本实验部分通过所获得的大鼠股骨参数,自制研发出适用于研究SD大鼠股骨牵张成骨模型的微型单边可延长型外固定装置,并顺利构建出可重复性较高适合大批量SD大鼠DO实验研究的动物模型,为今后利用DO动物实验模型并通过细胞或基因治疗缩短治疗周期或DO过程中的细胞分子机制的研究提供动物模型实验平台;2)密度梯度离心法获取的大鼠BMSCs体外培养结果提示其增殖活性较强,鉴定结果提示其可作为本次实验研究进行细胞治疗以及基因治疗较为理想的种子细胞。目的基因靶细胞转染后在不同时间点通过不同倍数荧光显微镜下观察结果提示,脂质载体介导的瞬时转染可以使rhPDGF-BB基因在BMSCs中成功表达;3)X线,Micro-CT,生物力学,组织学和免疫组织化学观察都证实,与单纯BMSCs及PBS相比,rhPDGF-BB基因修饰的BMSCs可较为有效的促进大鼠股骨牵张间隙区成骨过程中新骨的形成和矿化。应用rhPDGF-BB基因体外转染BMSCs于牵张结束后局部应用能够促进牵张成骨中的骨再生从而缩短DO治疗周期,为临床上应用牵张成骨（骨传送）技术治疗骨缺损提供了一个新的策略。
王璐[5]（2019）在《淫羊藿素调控人脐带间充质干细胞的凋亡及线粒体自噬的机理研究》文中进行了进一步梳理干细胞是一类具有自我复制能力的多潜能细胞,具有十分广阔的应用前景,已被广泛应用至多种疾病的临床研究中,但是临床上移植入体内的干细胞存活率低,限制了其推广应用。因此,亟需新的治疗策略改进干细胞抵御体内恶劣微环境的能力。天然药物独具优势,前期实验发现淫羊藿素（icaritin,ICT）预处理后的人脐带间充质干细胞（hUC-MSCs）治疗急性肝衰竭大鼠,死亡率进一步降低,肝脏病理、肝功能得到进一步改善,但是内在机理尚不清楚。预实验发现ICT可以增加体外培养的hUC-MSCs的细胞活力,调节多种细胞因子的分泌,并减少细胞的凋亡,电镜下可见ICT减少了自噬小体包裹的线粒体数量,因此,本研究将从细胞凋亡与线粒体自噬入手,探索淫羊藿素影响人脐带间充质干细胞的机制,为中药联合干细胞疗法提供理论依据。目的:本研究首先通过文献综述,为实验提供理论支持;随后在体外采用无血清培养部分模拟体内微循环障碍的环境,使用ICT干预hUC-MSCs,探索其是否具有抗凋亡作用,并深入研究是否通过HGF（肝细胞生长因子）/c-Met通路发挥作用;观察ICT能否干预hUC-MSCs的线粒体自噬过程;同时采用蛋白质谱,分析ICT预处理后的hUC-MSCs的差异表达蛋白,并进行GO分析、KEGG分析、蛋白互作分析等生物信息学分析,评估淫羊藿素参与的生物学过程。方法:人脐带间充质干细胞无血清培养72小时作为基本的造模方式,模拟微循环障碍的体内环境。不同浓度的ICT干预造模细胞,用MTS法测定其0D值,筛选最佳处理浓度。BrdU掺入试验检测Control组（正常培养组）、Serum free组（无血清培养组）、ICT组（淫羊藿素组）、HGF组（肝细胞生长因子组）的细胞增殖率。ELISA法检测ICT促进hUC-MSCs的HGF分泌情况。WB与qRT-PCR法检测ICT影响hUC-MSCs的c-Met受体表达情况。转染构建c-Met+MSCs,通过qRT-PCR和WB检验其转染效率。使用CCK8法筛选c-Met受体抑制剂克唑替尼（crizotinib）的最佳作用浓度。采用AnnexinV-FITC/PI凋亡检测,评估各组细胞凋亡率。qRT-PCR与WB检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Caspase-3、Bax的表达。MTS法检测不同浓度的自噬抑制剂3MA对造模细胞的影响。使用qRT-PCR、WB以及免疫荧光显微镜检测线粒体外膜蛋白tomm20、线粒体内膜蛋白timm23、线粒体基质蛋白细胞色素c氧化酶亚基II（MT-C02）、自噬相关蛋白LC3B的表达情况。透射电镜观察各组细胞的超微结构,重点观察其线粒体自噬水平。采用qRT-PCR筛选ICT干预hUC-MSCs线粒体自噬的相关通路。使用JC-1膜电位检测试剂盒检测膜电位情况。采用蛋白质谱进行各组细胞差异蛋白的生物信息学分析。结果:1.不同浓度的淫羊藿素处理无血清培养hUC-MSCs,各处理浓度均提高了其细胞活力,但是仅50ng/ml（0.1uM）、100ng/ml具有统计学意义（P<0.05）。选择50ng/ml为最佳处理浓度进行后续实验。BrdU检测显示较Control组,Serum free组增殖率下降（P<0.05）,而使用ICT或者HGF均提高了细胞增值率（P<0.05）。2.人脐带间充质干细胞本身可分泌HGF,也表达HGF的受体c-Met,而ICT能够促进其表达更高水平的HGF与c-Met受体（P<0.05）。构建c-Met+MSCs后,WB与qRT-PCR法证实了基因转染成功。根据细胞抑制率,筛选4 u M为克唑替尼（c-Met受体抑制剂）的最佳处理浓度。MSCs在无血清培养72h时凋亡率较高,c-Met+MSCs的细胞凋亡率显着降低（P<0.01）,克唑替尼处理后,细胞凋亡率显着增高（P<0.01）,提示HGF/c-Met通路对于MSCs具有抗凋亡作用。WB显示,对比MSCs组,c-Met+MSCs组Bcl-2的表达上调且Cleaved caspase-3、Bax表达下调（P<0.05）,克唑替尼则使Bcl-2蛋白水平降低,Cleaved caspase-3和Bax蛋白表达增加,qRT-PCR验证了上述结论。提示HGF/c-Met通路通过调控凋亡蛋白的表达发挥抗凋亡作用。3.MSCs在无血清培养72h时凋亡率较高,ICT或HGF处理后,MSCs凋亡率显着降低（P<0.05）。当使用c-Met受体抑制剂克唑替尼时,拮抗了 ICT的抗凋亡作用,差异有统计学意义（P<0.01）。这表明克唑替尼可以抑制ICT对MSCs的保护作用,ICT对MSCs的抗凋亡作用与HGF/c-Met通路相关。WB显示,ICT或HGF处理后的MSCs的Bcl-2表达上调且Cleaved caspase-3、Bax表达下调（P<0.05）,对比ICT组,加用克唑替尼后可使Bcl-2蛋白水平降低,使Cleaved caspase-3和Bax蛋白的表达增加,qRT-PCR验证了上述结论。提示ICT通过HGF/c-Met通路调控凋亡蛋白的表达发挥抗凋亡作用。4.低浓度的自噬抑制剂3-MA对造模细胞的活性具有促进作用（P<0.05）,而高浓度的自噬抑制剂3-MA抑制了细胞活性（P<0.01）。提示无血清培养条件下,适度的抑制细胞自噬有利于细胞的存活,而过度的抑制细胞自噬则会降低细胞活力,不利于细胞存活。5.与Control组比较,Serum free组MSCs的线粒体外膜蛋白tomm20、线粒体内膜蛋白timm23、线粒体基质蛋白细胞色素c氧化酶亚基Ⅱ（MT-C02）均会减少,自噬蛋白LC3Ⅰ和LC3Ⅱ表达均增加,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比率提高,线粒体膜电位降低,提示线粒体自噬水平被上调,电镜可见细胞内“线粒体自噬体”（被自噬小体包裹的线粒体）显着增多,损伤线粒体增加,细胞形态不佳,证实了无血清培养增加了线粒体自噬;而ICT或者HGF干预后上述线粒体蛋白表达增加,自噬蛋白LC3Ⅰ和LC3Ⅱ表达均减少,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比率降低,线粒体膜电位升高,提示线粒体自噬水平被下调。电镜可见胞内“线粒体自噬体”减少,损伤线粒体减少,细胞形态得到一定的改善,证实了ICT和HGF均减少了线粒体自噬。6.采用qRT-PCR进行Pink1/Parkin通路,FUNDC1通路以及Bnip3/Nix通路的筛选,结果如下:Pink1、Bnip3的mRNA与前述线粒体自噬趋势相符,Nix、FUNDC1的mRNA呈现出相矛盾的趋势。7.蛋白质谱分析:通过GO分析,发现Control组与Serum free组的差异蛋白,以及ICT组与Serum-free组之间,HGF组与Serum free组之间的差异蛋白,均参与细胞凋亡、自噬、线粒体自噬相关的生物过程（P<0.05）。对ICT组与Serum free组的差异蛋白进行分析,AKT1位于蛋白互作中心节点位置,KEGG分析PI3K-AKT通路具有统计学意义,可作为研究的重点通路。对于HGF组与Serum free组之间的差异蛋白进行分析,筛选出NF-κ B通路作为研究重点通路。结论:1.淫羊藿素能够通过HGF/c-Met通路降低无血清培养的人脐带间充质干细胞的凋亡率,与调节Cleaved Caspase-3、Bax及Bcl-2蛋白表达水平有关。2.淫羊藿素或肝细胞生长因子均可降低无血清培养的人脐带间充质干细胞的线粒体自噬水平,减少损伤线粒体数目,改善细胞形态,增加线粒体蛋白tomm20、timm23、MTC02的表达,提高线粒体膜电位。3.蛋白质谱分析发现淫羊藿素或肝细胞生长因子介导的差异蛋白参与细胞凋亡、自噬、线粒体自噬相关的生物过程,对于ICT,PI3K-AKT通路可作为研究重点通路,对于HGF,NF-κ B通路可作为研究重点。
卢宗孝[6]（2018）在《电针“委中”穴对BPVC致大鼠腰多裂肌损伤后组织形态学及IGF-1R、IGFBP3的影响》文中提出研究背景“腰背委中求”是古代针灸临床经验的高度总结,体现了“经脉所过,主治所及”的特点。“委中”穴已作为2016年《中国急慢性非特异性腰背痛管理指南》中推荐的首选穴位之一,是针对非特异性腰痛的临床常用穴位。多裂肌位于脊柱最内侧,是附着面积最大的椎旁肌,由多束组成,起于脊柱椎板、棘突,止于横突或骶骨背面,在腰部比较发达,对维持腰椎的稳定性尤为重要。以多裂肌为代表的腰部骨骼肌功能紊乱或损伤与非特异性腰痛关系密切,因此促进损伤多裂肌的修复和功能重建对治疗腰痛有至关重要的作用。IGF-1是已知的参与骨骼肌损伤修复过程非常重要的生长因子之一,具有调控炎症反应、抗细胞凋亡、促肌卫星细胞增殖、促成肌分化等诸多作用。前期的研究已经发现,电针委中穴可以促进布比卡因引起的腰多裂肌损伤后的再生修复,同时伴随IGF-1的高表达,说明IGF-1可能是电针“委中”穴促进骨骼肌再生修复的关键蛋白之一。在IGFs系统中,IGF-1的受体与结合蛋白是IGF-1发挥其生物作用的关键。IGF-1只有与受体IGF-1R结合才能发挥相应的作用,而IGFBP3则是可以调节IGF-1生物活性的重要蛋白。研究目的与意义本研究通过观察多裂肌组织形态学的变化,以及IGF-1R、IGFBP3的表达含量的变化,进一步探讨针刺、骨骼肌损伤修复、IGF-1三者的关系,探讨针刺促进骨骼肌再生修复的作用靶点和部分作用机制。研究方法将90只雄性SD大鼠随机分成空白组、模型组、电针组各30只。模型组和电针组腹腔麻醉后往双侧L4-5多裂肌注射0.5%布比卡因溶液制造大鼠腰多裂肌损伤模型。空白组不做处理,造模后电针组行电针“委中”穴治疗,治疗频率为20min/次,1次/d。3组分别于治疗1d、2d、3d、7d、14d后同步取材,通过HE染色观察多裂肌的组织形态学变化,并测量肌纤维平均横截面积和每肌纤维细胞核数,通过Western Blotting法和免疫组化法观察多裂肌中IGF-1R、IGFBP3的表达含量的动态变化。研究结果1.大鼠多裂肌HE染色的组织形态学变化:空白组可见排列紧密、整齐的肌纤维,肌纤维粗细均匀,肌间隙紧密而大小基本一致,若干个细胞核被分布于每个肌纤维膜边缘。治疗1d,模型组骨骼肌纤维大面积变性坏死,排列紊乱,肌间隙增大,并见大量坏死肌纤维碎片,大面积炎性细胞浸润,电针组骨骼肌纤维大小不均,排列不整齐,存在肌纤维缺失部分和炎性细胞浸润。治疗3d,模型组骨骼肌纤维排列紊乱,大小不均,形态不规则,部分细胞水肿,存在肌纤维碎片,伴有大面积炎性细胞浸润。电针组肌纤维大小不均,伴有少量炎性细胞浸润。治疗7d,模型组仍存在炎性细胞浸润,同时可见新生的中央核纤维,并开始融合,电针组未见到炎性细胞浸润,同时大量新生肌纤维产生,并开始融合,部分肌纤维的细胞核已迁移到细胞边缘并恢复大小。治疗14d,模型组损伤的区域已经被新生的肌纤维代替,部分肌纤维的细胞核已经移至细胞膜边缘,电针组的肌纤维已基本恢复大小,若干个细胞核被分布于每个肌纤维膜边缘,肌纤维排列紧密,尚欠整齐。2.肌纤维平均横截面积和每肌纤维细胞核数比较:模型组与空白组的腰多裂肌肌纤维平均横截面积比较,差异有统计学意义（P<0.05）。电针组与模型组比较,差异有统计学意义（P<0.05）,与空白组比较,差异无统计学意义（P>0.05）。模型组与空白组的腰多裂肌每肌纤维细胞核数比较,差异有统计学意义（P<0.05）,电针组与模型组比较,差异有统计学意义（P<0.05）,而与空白组比较,差异无统计学意义（P>0.05）。3.IGF-1R表达的变化:治疗1d后,模型组与空白组腰多裂肌IGF-1R的表达比较,差异无统计学意义（P>0.05）,电针组的表达相比空白组和模型组,差异均有统计学意义（P<0.05）;2d,模型组与空白组比较,差异有统计学意义（P<0.05）,电针组的表达相比空白组和模型组,差异有统计学意义（P<0.05）;3d、7d、14d,模型组和电针组的IGF-1R的表达相比空白组,差异具有统计学意义（P<0.05）,电针组IGF-1R表达与模型组比较,差异无统计学意义（P>0.05）。电针组IGF-1R的变化趋势表现为早期升高,而后维持在高水平。4.IGFBP3表达的变化:治疗1d后,三组间腰多裂肌IGFBP3的表达相比较,差异无统计学意义（P>0.05）,但电针组已有下降的趋势;2d,模型组与空白组比较,差异无统计学意义（P>0.05）,而电针组的表达相比空白组和模型组,差异均有统计学意义（P<0.05）;7d,模型组的表达与空白组比较,差异有统计学意义（P<0.05）,电针组相比模型组和空白组,差异无统计学意义（P>0.05）;14d,模型组的表达与空白组比较,差异有统计学意义（P<0.05）,电针组与模型组比较,差异有统计学意义（P<0.05）,而与空白组相比,差异无统计学意义（P>0.05）。电针组IGFBP3的变化趋势均表现为早期低水平,而后逐渐升高,恢复至正常水平。研究结论:1.电针“委中”穴能通过促进肌纤维平均横截面积与每肌纤维细胞核数等局部组织形态学的恢复,促进大鼠腰多裂肌损伤后的再生修复过程。2.在大鼠多裂肌损伤修复过程中,电针“委中”穴能下调IGFBP3的表达,增加IGF-1的活性;通过上调IGF-1R的表达,促进IGF-1与IGF-1R的结合而发挥其生物学功能,加速多裂肌的损伤后的再生修复过程。
刘洋[7]（2017）在《不同界面处理对腱-骨愈合影响及TNC作用机制初步研究》文中研究指明前言腱-骨界面愈合一直是临床面临的棘手问题。腱-骨愈合问题存在于全身所有腱-骨连接部,其中,肩袖止点、跟腱止点等部位尤为明显。肩袖损伤重建后2年内11%-94%的患者影像学上观察到修复失败;这些都对社会和家庭造成巨大的负担,腱止点的修复与重建相关研究是国家在人口与健康领域的重大需求。不同界面的处理方式影响腱-骨界面愈合的质量。传统观点认为,肌腱止点修复前必须对腱-骨界面进行彻底清创让其新鲜化,腱-骨界面新鲜化处理包括去皮质和保留皮质两种主要形式。然而,不同界面处理对腱-骨愈合影响有待进一步探讨,相关机制尚不清楚。影响腱-骨愈合的因素主要有:止点修复前的界面处理、修复方式、促进腱-骨愈合的组织工程手段（如:生长因子、基因治疗、骨膜封闭肌腱、成骨诱导材料、细胞治疗、生物可降解支架和仿生补片等）以及个体的性别、年龄、术后康复策略等,这些因素使得愈合的腱-骨界面无论在功能上和生物学上与生理性腱-骨界面均有较大差别。前期研究发现,腱糖蛋白-C（Tenascin-C,TNC）与腱-骨愈合过程可能存在密切的联系,肌肉和肌腱损伤时有大量TNC表达,TNC可能是影响腱-骨愈合的关键因素之一。本课题拟通过制作跟腱止点急性损伤完全断裂后不同界面处理修复的大鼠模型,并对愈合腱-骨界面进行各种检测,寻找TNC与不同界面处理后腱-骨愈合的关系;采用不同比例肌腱干细胞（TSCs）、骨髓间充质干细胞（BMSCs）混合共培养的方式模拟这两种细胞在腱-骨愈合界面相遇的情况,并检测TNC对TSCs、BMSCs及不同比例混合共培养细胞增殖以及特定条件下与分化有关基因表达的影响。方法第一部分:制作大鼠急性跟腱止点断裂修复模型,采用保留原有止点纤维软骨层、去除原有止点纤维软骨层和骨隧道的界面处理方式进行修复跟腱;通过最大破坏负荷和刚度这两个生物力学测试指标,检测腱-骨愈合质量和强度;采用microCT扫描测定BMD、BV/TV这两个指标观察腱-骨界面骨结构动态变化情况;对腱-骨界面组织进行HE、Masson、番红O染色,观察界面组织形态,了解腱-骨界面愈合情况。第二部分:采用免疫组化方法对不同界面处理方式手术修复的腱-骨愈合界面及跟腱近端腱-肌连接处骨钙素、SOX-9和TNC不同时间点的表达进行检测,通过Image-Pro Plus软件将图像（200×）转化为灰度图提取数据后计算出平均光密度值,从而对这三种蛋白的表达进行半定量分析。采用不同比例TSCs、BMSCs混合共培养的方式模拟这两种细胞在腱-骨愈合界面相遇的情况,检测不同剂量的TNC对TSCs、BMSCs及不同比例混合共培养细胞增殖的影响以及TNC对TSCs、BMSCs及等比例直接混合共培养细胞在固定的培养时间（3d）,固定TNC剂量（1μg/ml）条件下成软骨（SOX-9）、成骨（RUNX2）、成肌腱（SCX）、成脂（PPARγ）基因标志物mRNA表达的影响。结果第一部分:1.通过对不同界面处理后愈合的大鼠跟腱-跟骨复合体的力学测试发现:术后4w（34.42±4.65 N vs 60.78±6.63N）和8w（41.21±3.38 N vs 60.05±5.25 N）保留原有止点纤维软骨组织修复愈合的大鼠跟腱-跟骨复合体的最大破坏负荷均较自身对照显着降低;术后8w各组刚度均较自身对照显着降低（分别为G1:33.96±5.59 N vs 58.59±6.54 N/mm;G2:25.96±2.80 N vs 50.20±8.29 N/mm;G3:32.73±5.20 N vs 59.12±10.17 N/mm）。而同一时间点各组手术组之间以及各组对照组之间对比没有显着统计学差异。2.术后4w和8w时,去除原有止点纤维软骨组织后手术修复的界面骨端的BMD（4w:0.378±0.041 g/cm3 vs 0.808±0.014 g/cm3;8w:0.349±0.009 g/cm3 vs 0.795±0.030 g/cm3）和BV/TV（4w:33.82±4.35%vs 76.24±1.77%;8w:37.33±5.80 vs 70.28±2.39%）均较自身对照组假手术组显着降低。3.保留原有止点纤维软骨组织手术修复界面中的软骨样细胞存在一个减少后重新出现的过程,表现为:纤维结构逐渐紊乱,原有止点处肥大软骨样细胞逐渐减少,至术后4w又开始出现至术后8w逐渐增多。去除原有止点纤维软骨层后修复愈合界面术后1w即开始出现巢团样软骨,至术后8w巢团样软骨样细胞团逐渐增多,软骨样细胞团之间可见Sharpey’s纤维,纤维排列较保留原有止点纤维软骨层的手术组更有序。去除原有止点纤维软骨层后修复止点的腱骨界面明显可见更多番红O染色的软骨细胞。第二部分:1.术后4w和8w时,两种界面处理方式修复大鼠跟腱止点的腱-骨界面骨端的骨钙素染色的平均光密度值均较对照组低（4w control vs G1 vs G2:0.0438±0.0062 vs0.0116±0.0009 vs 0.0067±0.0008;8w:0.0837±0.0244 vs 0.0269±0.0066 vs 0.0066±0.0005）。2.术后1w两种界面处理方式的手术修复组腱-骨界面处软骨样细胞SOX-9的平均光密度值显着升高,并且达到峰值（Control vs G1 vs G2:0.039±0.004 vs 0.068±0.006 vs 0.069±0.006）,在随后的2w、4w、8w时间点则呈逐渐下降的趋势（2w:0.057±0.007 vs 0.045±0.002 vs 0.027±0.004;4w:0.021±0.002 vs 0.040±0.002 vs 0.023±0.003;8w:0.029±0.008 vs 0.024±0.006 vs 0.035±0.003）。3.不同界面处理后修复止点的大鼠跟腱近端腱-肌连接处TNC免疫组化染色在不同组别、不同时间点呈现不同的变化趋势:保留原有止点纤维软骨结构修复止点的大鼠表现为在术后4w达到峰值水平（0.119±0.001）随后降低;去除原有止点纤维软骨结构修复止点的大鼠表现为在术后2w达到峰值（0.082±0.003）,且其峰值在三组中最低;对照组表现为在术后2w达到峰值（0.159±0.006）,且在术后8w时与手术组有显着差异（Control vs G1 vs G2:0.013±0.001 vs 0.038±0.005 vs 0.040±0.006）。4.BMSCs的增殖速率显着低于TSCs。直接混合共培养细胞增殖速率在培养3d后增殖曲线与TSCs比较无显着差异。2d和3d时,1:1直接混合共培养细胞在无论加入何种剂量（1μg/ml、10μg/ml和100μg/ml）TNC其增殖均与未加入TNC有显着差异。5.在BMSCs-TSCs直接混合共培养系统中,RUNX2和SOX-9基因表达在TNC刺激下显着增加,且TNC能明显抑制TSCs SCX基因的表达。而在BMSCs-TSCs的间接共培养系统中,BMSCs和TSCs的各向分化的基因标志物表达在TNC刺激下没有显着的统计学差异。6.Y-27632,PQ 401和PD 98059能影响TNC促进1:1直接混合共培养细胞RUNX2和SOX-9基因表达和抑制TSCs SCX基因表达的效应。结论1.大鼠跟腱急性断裂后修复模型中采用去除原有止点纤维软骨层修复和骨隧道修复这两种界面处理方式的腱-骨愈合质量较保留原有跟腱止点原有纤维软骨组织界面处理方式的愈合质量更好。采用去除原有止点纤维软骨层界面处理方式会导致修复后早期重建止点骨端的骨量持续、显着的减少。去除原有止点纤维软骨层的界面处理方式具有更好的界面形态。2.大鼠跟腱急性断裂后手术修复前的不同界面处理方式造成了腱-骨界面骨钙素、SOX-9及跟腱近端腱-肌交界处TNC表达差异。这种差异可能与腱-骨界面的纤维软骨层形成有关。3.1:1直接混合共培养能改变BMSCs和TSCs对TNC刺激条件下的增殖。在培养3d,TNC剂量1μg/ml条件下:TNC能改变等比例直接混合共培养细胞的增殖,促进RUNX2和SOX-9基因表达。TNC能单独抑制TSCs细胞SCX基因表达。TNC改变等比例直接共培养细胞和TSCs分化基因标志物表达的效应与ROCK,IGF-1R和ERK相关的信号通路有关。
张冰玉[8]（2015）在《力生长因子对大鼠肌腱细胞运动能力及损伤肌腱修复的影响》文中认为肌腱是连接肌肉与骨的单轴致密纤维结缔组织,传递由肌肉产生的力从而带动骨的活动,在机体运动中起着重要作用。但运动、训练不当或重复牵拉过剧常会导致肌腱损伤甚至断裂,对人的身体健康和生活质量产生严重影响。由于肌腱组织血管分布少、新陈代谢率低,因此损伤肌腱的自愈能力很差,修复过程十分缓慢,并很难恢复其损伤前的正常水平。如何促进损伤肌腱的修复、提高治疗效果并完全恢复其功能,目前仍然是临床面临的重要挑战。已有研究发现,细胞因子/生长因子对损伤肌腱的修复具有良好的促进作用。力生长因子（mechano-growth factor,MGF）是由胰岛素样生长因子1（insulin-like growth factor-I,IGF-1）基因选择性剪接产生的一种变异体,由于最初研究时发现其对力学刺激十分敏感,因此被命名为力生长因子。在人体中,IGF-1基因能够产生3种亚型,IGF-1 Ea,IGF-1 Eb和IGF-1 Ec,在啮齿动物中产生两种类型,IGF-1Ea和IGF-1 Eb。人的IGF-1 Ec和啮齿动物的IGF-1 Eb被称为MGF。MGF的主要特点是在IGF-1的羧基端多出1个延伸肽（extention peptide,E肽）,所以具有与成熟IGF-1不同的生物学作用。研究已经证实,MGF在治疗肌肉缺损、预防心肌损伤、修复受损神经、加速血管生成和促进骨修复等方面起着重要作用,但是其在损伤肌腱修复中的作用及其分子机制尚不清楚。肌腱细胞的运动是肌腱损伤修复过程中的重要环节。肌腱损伤后,正常的肌腱细胞会迁移到损伤位点,增殖并分泌细胞外基质,从而促进损伤肌腱修复。本文以大鼠为动物模型,研究了MGF-C25E（一种合成的大鼠MGF E肽）对肌腱细胞运动能力的作用及其分子机制,并在此基础上进一步研究了MGF-C25E对损伤肌腱修复的影响。主要实验结果如下:①MGF-C25E通过FAK-ERK1/2信号通路促进大鼠肌腱细胞运动划痕法和Transwell法检测结果表明,MGF-C25E明显促进肌腱细胞的迁移和侵袭能力,并在一定浓度范围内呈现浓度相关性。Western blot检测结果发现,MGF-C25E作用肌腱细胞后,粘着斑激酶（focal adhesion kinase,FAK）和细胞外信号调节激酶1/2（extracellular signal regulated kinase 1/2,ERK1/2）磷酸化水平明显增加,抑制FAK或ERK1/2激活后,MGF-C25E促进的肌腱细胞迁移和侵袭受到明显抑制。此外,FAK抑制剂亦阻断MGF-C25E诱导的ERK1/2磷酸化。因此,MGF-C25E可能通过FAK-ERK1/2信号通路促进大鼠肌腱细胞迁移和侵袭。明胶酶谱实验表明,MGF-C25E促进肌腱细胞基质金属蛋白酶2（matrix metalloproteinase 2,MMP-2）分泌,对基质金属蛋白酶9（matrix metalloproteinase 9,mmp-9）分泌没有明显影响。抑制mgf-c25e激活的mmp-2后,mgf-c25e促进的细胞侵袭受到明显抑制。此外,通过免疫荧光染色观察mgf-c25e对细胞骨架蛋白f-actin的影响,实验结果显示,mgf-c25e可显着促进肌腱细胞f-actin重排和伪足增加。抑制fak和erk1/2激活后,mgf-c25e促进的伪足增加和f-actin重排受到明显抑制。进一步利用原子力显微镜（atomicforcemicroscopy,afm）检测mgf-c25e作用肌腱细胞后细胞杨氏模量的变化,结果发现mgf-c25e显着降低肌腱细胞的杨氏模量。抑制fak或erk1/2激活后,mgf-c25e降低的细胞杨氏模量得到明显恢复。上述结果提示,mgf-c25e可能通过fak-erk1/2信号通路促进伪足形成,增加mmp-2分泌和降低细胞硬度,从而增加肌腱细胞的运动能力。②mgf-c25e通过fak-erk1/2信号通路增加细胞核硬度促进肌腱细胞迁移利用afm直接测量肌腱细胞核杨氏模量,实验结果显示,mgf-c25e通过fak-erk1/2信号通路增大肌腱细胞核的杨氏模量,使细胞核硬度增加。mgf-c25e对细胞核骨架蛋白lamina/c的表达没有明显影响,但可以促进染色质浓缩。抑制fak或erk1/2激活后,mgf-c25e促进的染色质浓缩受到明显抑制。此外,mgf-c25e促进肌腱细胞dna甲基化,dna甲基化抑制剂（methylthioadenosine,mta）作用后,mgf-c25e促进的染色质浓缩、细胞核硬度及细胞迁移受到明显抑制。fak和erk1/2的抑制剂亦阻断mgf-c25e促进的dna甲基化。上述结果表明,mgf-c25e可能通过fak-erk1/2信号通路促进染色质浓缩,增加细胞核硬度,从而提高肌腱细胞迁移能力。③mgf-c25e降低大鼠肌腱细胞炎症因子的表达通过机械拉伸或肿瘤坏死因子-α（tumornecrosisfactorα,tnf-α）构建大鼠肌腱细胞损伤模型,利用qrt-pcr检测i型胶原（collageni）、iii型胶原（collageniii）、环氧化酶-2（cyclooxygenase2,cox-2）和前列腺素e2（prostaglandine2,pge2）基因的表达确定肌腱细胞损伤模型是否构建成功。实验结果显示,机械拉伸显着降低大鼠肌腱细胞collageni和collageniiimrna表达,对炎症因子cox-2和pge2mrna表达无明显作用。tnf-α作用大鼠肌腱细胞后,炎症因子cox-2和pge2mrna水平明显上调,collageni和collageniiimrna水平显着下调。机械过载和tnf-α均能对大鼠肌腱细胞产生一定的损害作用。进一步在tnf-α诱导的损伤条件下检测mgf-c25e对损伤肌腱细胞的影响。结果显示,mgf-c25e降低了tnf-α促进的cox-2和pge2mrna表达,对collageni和collageniiimrna表达没有影响,提示mgf-c25e可能对损伤肌腱细胞具有一定的保护作用。④mgf-c25e对大鼠跟腱损伤修复的影响通过手术切割缝合术构建大鼠跟腱损伤模型,利用跟腱功能指数（achillesfunctional index,AFI）、生物力学评价和组织学评价等确定MGF-C25E对损伤跟腱修复的影响。实验结果显示,高浓度MGF-C25E（1000 ng/mL）显着增加修复跟腱的AFI和力学强度。进一步研究MGF-C25E对修复肌腱组织结构的影响,苏木素-伊红（Hematoxylin and eosin,H&E）染色结果显示高浓度MGF-C25E处理组肌腱较对照组（生理盐水处理组）具有更丰富的细胞外基质,并且细胞数量减少。此外,Masson’s trichrome染色证明高浓度MGF-C25E处理组比对照组含有更加丰富的胶原纤维。通过组织学评分系统进行评分,结果显示高浓度MGF-C25E处理组相较于对照组具有更高的组织学分数。综合上述结果,MGF-C25E可能通过促进大鼠肌腱细胞运动、降低肌腱细胞炎症反应和增加细胞外基质合成等促进损伤肌腱修复。本研究结果为深入认识MGF在损伤肌腱修复中的作用及其机制提供了实验依据,为临床上应用MGF等生长因子修复损伤肌腱提供了理论指导。
高晓嶙,白云飞,王若晗,张晓兰[9]（2015）在《过度使用中肱二头肌长头肌腱相关生长因子基因表达规律》文中研究指明目的:研究生长因子在肌腱退行性变病理机制中的作用。方法:本研究采用SD大鼠8周下坡跑过度使用模型造成肱二头肌长头肌腱结节沟段退行性变,采用实时定量PCR法检测运动各阶段肌腱胰岛素样生长因子1（IGF-1）、转化生长因子β1（TGF-β1）、骨形态发生蛋白12（BMP12）、碱性成纤维细胞生长因子（b FGF）的基因表达情况。结果:在过度使用中,肱二头肌长头肌腱结节沟段IGF-1基因表达没有显着性变化;TGF-β1、BMP12、b FGF基因在第4周都出现了显着下降,然后又迅速上升。在第8周TGF-β1、BMP12基因表达呈下降趋势,而b FGF基因表达则继续保持上升趋势。结论:与肌腱断裂修复相比,过度使用中肌腱生长因子基因表达紊乱,有可能导致细胞功能异常,推动肌腱退行性变的进程。
高晓嶙[10]（2014）在《过度运动中肌腱细胞增殖、凋亡与相关生长因子蛋白表达特征的研究》文中认为过度运动引起肌腱退行性变病理机制至今尚不清楚,研究提示腱病组织存在大量细胞凋亡、生长因子高表达,且细胞对生长因子反应异常。因此,我们推测过度运动中肌腱可能存在持续异常生长因子蛋白表达,导致细胞功能异常,推动肌腱发生退变。为探索生长因子在过度运动中表达规律及其在肌腱退行性变中的作用,本研究利用下坡跑台建立了大鼠肱二头肌肌腱过度运动模型（10度下坡跑台,速度22米／秒,1.5小时／天,6天／周,共运动8周）,分别于2、4、6、8周取肱二头肌长头肌腱,HE染色分析病理损伤、EDU染色检测细胞增殖,TUNNEL法检测凋亡,免疫组化染色检测细胞生长因子蛋白表达。结果：1.大鼠肱二头肌肌腱结节间沟段病理总评分逐渐升高趋势,在第4、6周达到最高（P<0.01）,以胶原纤维排列、细胞核形态、细胞分布、胶原可染性的变化最具显着性（P<0.05）。2.肌腱结节间沟部位细胞凋亡在运动第2周有显着性升高（P<0.05）,第4周达到并维持较高水平（P<0.01）。各时间点均未发现明显肌腱细胞增殖现象。3.在肱二头肌长头整体肌腱中,只有bFGF表达有显着性增加,TGF β1、bFGF、BMP12表达均无显着性变化。bFGF在过度运动第2周有显着性升高（P<0.01）,第4周下降,第6周（P<0.05）和第8周（P<0.01）再次持续升高。4.在肌腱结节间沟部位中,IGF1表达无显着性变化,TGFβ1、 bFGF、BMP12表达均显着性增高。TGFβ1表达逐渐升高,第6周达到高峰（P<0.05）,第8周迅速下降；bFGF表达在第4周迅速升高到峰值（P<0.01）,然后下降,第8周与对照组无显着性差异；BMP12蛋白表达逐渐增加,第6周达到高峰（P<0.05）,第8周略下降。结论：1.采用下坡跑SD大鼠运动模型能造成肱二头肌长头肌腱结节间沟部位退行性改变,可用于肌腱退行性变相关研究。2.肌腱细胞过度凋亡、增生不足是大鼠过度运动所致肌腱退行性变的重要病理特征。3.相关生长因子长期异常表达是大鼠肌腱修复与退行性变的一个重要病理区别。4.大鼠肱二头肌长头肌腱过度运动中肌腱整体与结节间沟部位的生长因子表达规律不一致,提示生长因子表达种类和变化与承受的机械负荷大小有关。5.大鼠肱二头肌长头肌腱过度运动中并非所有生长因子表达都出现变化
二、胰岛素样生长因子1基因转染对大鼠肌腱细胞生长的促进作用（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、胰岛素样生长因子1基因转染对大鼠肌腱细胞生长的促进作用（论文提纲范文）
（1）富血小板血浆联合体外冲击波治疗低氧环境下兔跟腱病的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 缩略词表 |
| 第一章 体外冲击波治疗兔跟腱病模型最佳能量参数的评价和筛选 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 实验动物 |
| 1.1.2 主要实验试剂和耗材 |
| 1.1.3 主要实验仪器设备 |
| 1.2 实验内容 |
| 1.2.1 I型胶原酶溶液的配制 |
| 1.2.2 兔跟腱病模型实验分组 |
| 1.2.3 兔跟腱病模型的建立 |
| 1.2.4 ESWT治疗兔跟腱病模型最佳能量参数的筛选 |
| 1.2.5 跟腱超声评价 |
| 1.2.6 跟腱组织H&E染色病理评价 |
| 1.2.7 跟腱组织力学测试 |
| 1.2.8 跟腱组织透射电镜检测 |
| 1.2.9 RT-PCR检测跟腱组织基因相对表达量 |
| 1.2.10 统计学分析 |
| 1.3 实验结果 |
| 1.3.1 一般情况观察 |
| 1.3.2 兔跟腱病动物模型有效性评价 |
| 1.3.3 超声检测 |
| 1.3.4 力学性能测试 |
| 1.3.5 透射电镜检测 |
| 1.3.6 组织学评价 |
| 1.3.7 RT-PCR检测相关基因相对表达水平 |
| 1.4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 体外冲击波治疗兔跟腱病模型最佳脉冲参数的评价和筛选 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 主要实验试剂和耗材 |
| 2.1.3 主要实验仪器设备 |
| 2.2 实验内容 |
| 2.2.1 兔跟腱病模型的建立和实验分组 |
| 2.2.2 ESWT治疗兔跟腱病模型最佳能量参数的筛选 |
| 2.2.3 跟腱超声评价 |
| 2.2.4 跟腱组织H&E染色病理评价 |
| 2.2.5 跟腱组织力学性能测试 |
| 2.2.6 跟腱组织透射电镜检测 |
| 2.2.7 RT-PCR检测跟腱组织基因相对表达量 |
| 2.2.8 数据统计和分析 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 一般情况观察 |
| 2.3.2 超声检测 |
| 2.3.3 力学性能测试 |
| 2.3.4 透射电镜检测 |
| 2.3.5 组织学评价 |
| 2.3.6 RT-PCR检测相关基因相对表达水平 |
| 2.4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 超声引导下PRP注射联合ESWT治疗对模拟低氧环境下兔跟腱病修复的实验研究 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验动物 |
| 3.1.2 主要实验试剂及耗材 |
| 3.1.3 主要仪器设备 |
| 3.2 实验内容 |
| 3.2.1 兔跟腱病模型的建立和实验分组 |
| 3.2.2 PRP制备 |
| 3.2.3 ESWT治疗干预和超声引导下PRP注射 |
| 3.2.4 跟腱超声评价 |
| 3.2.5 跟腱组织 H&E 染色病理评价 |
| 3.2.6 跟腱组织力学性能测试 |
| 3.2.7 跟腱组织透射电镜检测 |
| 3.2.8 RT-PCR检测跟腱组织基因相对表达量 |
| 3.2.9 统计分析 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 一般情况观察 |
| 3.3.2 PRP制备结果 |
| 3.3.3 超声检测 |
| 3.3.4 力学性能检测 |
| 3.3.5 透射电镜检测 |
| 3.3.6 组织学评价 |
| 3.3.7 RT-PCR检测相关基因相对表达水平 |
| 3.4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 结论 |
| 4.1 主要结论 |
| 4.2 研究展望 |
| 文献综述 体外冲击波治疗肌腱病有效性研究现状 |
| 参考文献 |
| 在学期间的研究成果 |
| 致谢 |
（2）Lnc00839通过miR-19-3p/IGF-1分子轴对阴道壁成纤维细胞COL-1分泌影响及其分子机制探究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分:Lnc00839 激活IGF-1 促进成纤维细胞COL-1 分泌 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试剂与仪器 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要试剂的配置 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 qRT-PCR检测m RNA表达水平 |
| 2.2.2 Western-blot |
| 2.2.3 细胞荧光原位杂交实验 |
| 2.2.4 细胞原代培养及纯化 |
| 2.2.5 细胞传代培养、冻存及复苏 |
| 2.2.7 ELISA |
| 2.2.8 细胞转染 |
| 2.3 统计方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 Lnc00839在POP患者中的表达降低 |
| 3.1.1 PCR检测两组间Lnc00839 表达差异 |
| 3.1.2 荧光原位杂交检测两组间表达差异 |
| 3.2 Lnc00839 降低与POP-Q评分相关性分析 |
| 3.3 在POP患者阴道壁组织中,IGF-1 及其受体中表达降低,COL-1 型胶原分泌减少,二者呈正相关 |
| 3.4 POP患者自噬与凋亡水平升高 |
| 3.4.1 TUNEL检测POP患者中凋亡水平增加 |
| 3.4.2 Western-blot检测自噬标记物 |
| 3.4.3 Western-blot检测凋亡标记物 |
| 3.5 IGF-1 可促进成纤维细胞的COL-1 分泌。IGF-1 可抑制自噬标记物表达水平 |
| 3.6 Lnc00839 可上调IGF-1 的表达 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分:Lnc00839 通过mi R-19-3p调控IGF-1 促进成纤维细胞COL-1 型胶原分泌 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料与试剂 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要试剂的配置 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 生物信息学预测 |
| 2.2.2 细胞复苏 |
| 2.2.3 组织RNA提取及PCR检测 |
| 2.2.4 细胞RNA提取及PCR |
| 2.2.5 细胞荧光原位杂交实验 |
| 2.2.6 细胞转染 |
| 2.2.7 双荧光素酶实验 |
| 2.2.8 Western-blot |
| 2.2.9 流式检测凋亡 |
| 2.3 统计学方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 生物信息学预测LncRNA及靶向miRNA |
| 3.2 miR-19-3p在脱垂组织中的表达 |
| 3.2.1 PCR检测两组间miR-19-3p的表达差异 |
| 3.2.2 荧光原位杂交检测两组间mi R-19-3p的表达情况 |
| 3.3 Lnc00839与miR-19-3p的相互作用 |
| 3.3.1 Lnc00839 抑制mi R-19-3p表达 |
| 3.3.2 双荧光素酶实验验证Lnc00839与miR-19-3p的靶向关系 |
| 3.3.3 Lnc00839 通过miR-19-3p上调成纤维细胞IGF-1 表达促进COL-1 分泌 |
| 3.4 miR-19-3p靶向作用于IGF-1 |
| 3.4.1 PCR鉴定转染效果 |
| 3.4.2 miR-19-3p对成纤维细胞IGF-1 表达的影响 |
| 3.4.3 双荧光素酶实验验证miR-19-3p与 IGF-1 的靶向关系 |
| 3.5 miR-19-3p激活POP患者成纤维细胞自噬水平,促进细胞凋亡 |
| 3.5.1 PCR鉴定转染效果 |
| 3.5.2 miR-19-3p对成纤维细胞自噬水平的影响 |
| 3.5.3 miR-19-3p对成纤维细胞凋亡水平的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第三部分:Lnc00839 通过miR-19-3p/IGF-1 分子轴调控AKT-mTOR-p70s6k通路促进阴道壁成纤维细胞COL-1 分泌 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料与试剂 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要试剂的配置 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 western-blot |
| 2.2.2 ELISA |
| 2.2.3 细胞转染 |
| 2.2.4 RT-PCR |
| 2.3 统计方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 脱垂组及对照组中AKT-mTOR-p70s6k通路蛋白表达情况 |
| 3.2 IGF-1 通过AKT-mTOR-p70s6k通路调控COL-1 的分泌 |
| 3.3 Lnc00839 通过miR-19-3p/IGF-1 分子轴激活AKT-mTOR-p70S6K通路 |
| 3.4 Lnc00839 激活AKT-mTOR-p70S6K通路抑制自噬促进阴道壁成纤维细胞COL-1 分泌 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 胰岛素样生长因子(IGF-1)在盆底功能障碍相关疾病中的作用及机制研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（3）周期性机械牵伸调节CREB/TGF-β3信号通路影响肌腱愈合的作用研究（论文提纲范文）
| 缩写语表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 周期性机械牵伸调节CREB/TGF-β3 信号通路影响肌腱愈合的作用研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.5 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 肌腱损伤的愈合及其治疗进展 |
| 参考文献 |
| 研究生期间发表论文情况 |
| 致谢 |
（4）rhPDGF-BB基因修饰的BMSCs促进大鼠股骨牵张成骨的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 大鼠单侧股骨牵张成骨动物模型的建立 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 实验试剂 |
| 1.2 实验设备 |
| 1.3 实验动物及伦理 |
| 1.4 单边可延长式微型外固定架的设计与研制 |
| 1.5 大鼠股骨牵张成骨模型的建立 |
| 1.6 观察与检测指标 |
| 1.7 统计学方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二部分 大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养、鉴定及慢病毒介导RHPDGF-BB体外转染 |
| 1 内容与方法 |
| 1.1 实验材料与试剂 |
| 1.2 实验设备 |
| 1.3 实验动物 |
| 1.4 实验方法 |
| 1.5 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三部分 rh PDGF-BB基因转染BMSCS促进大鼠股骨牵张成骨区新生骨矿化的作用 |
| 1 内容与方法 |
| 1.1 实验试剂 |
| 1.2 实验设备 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.4 实验动物及分组 |
| 1.5 观察与检测指标 |
| 1.6 统计学方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间获得的学术成果 |
| 个人简历 |
| 导师评阅表 |
（5）淫羊藿素调控人脐带间充质干细胞的凋亡及线粒体自噬的机理研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一部分 研究背景 |
| 一、补肾中药调控干细胞的相关研究 |
| 1. 淫羊藿对干细胞的调控 |
| 2. 其他补肾中药对干细胞的调控 |
| 二、HGF在干细胞领域的研究进展 |
| 1. HGF的概述 |
| 2. HGF对干细胞的影响 |
| 三、线粒体自噬的研究进展 |
| 1. 线粒体自噬的概述 |
| 2. 中药调控线粒体自噬 |
| 第二部分 淫羊藿素通过HGF/c-Met通路增强人脐带间充质干细胞抗凋亡能力的实验研究 |
| 一、实验材料 |
| 1. 实验细胞 |
| 2. 实验仪器 |
| 3. 实验试剂与耗材 |
| 4. 主要试剂的配制 |
| 二、实验方法 |
| 1. 细胞培养 |
| 2. MTS法测细胞活力 |
| 3. CCK8法测细胞活力 |
| 4. BrdU掺入试验测细胞增殖率 |
| 5. 流式细胞仪检测细胞凋亡 |
| 6. western blot(化学)方法检测蛋白表达 |
| 7. qRT-PCR检测mRNA表达水平 |
| 8. 质粒提取与细胞转染 |
| 9. ELISA法测蛋白表达 |
| 10. 统计学方法 |
| 三、实验结果 |
| 1. 淫羊藿素促进人脐带间充质干细胞的细胞活力与增殖活性 |
| 2. HGF/c-Met通路在人脐带间充质干细胞中具有抗凋亡作用 |
| 3. 淫羊藿素通过HGF/c-Met通路抑制人脐带间充质干细胞凋亡 |
| 四、讨论 |
| 第三部分 淫羊藿素调控人脐带间充质干细胞线粒体自噬的实验研究 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 1. MTS法测细胞活力 |
| 2. western blot(荧光)方法检测蛋白表达 |
| 3. qRT-PCR检测mRNA表达水平 |
| 4. MitoTracker与目标蛋白共标记进行免疫荧光显微镜检测 |
| 5. 线粒体膜电位检测(JC-1) |
| 6. 电镜检测 |
| 7. 统计学方法 |
| 三、实验结果 |
| 1. 自噬抑制剂3-MA对无血清培养人脐带间充质干细胞的影响 |
| 2. 淫羊藿素增加无血清培养人脐带间充质干细胞的线粒体蛋白 |
| 3. 淫羊藿素抑制无血清培养人脐带间充质干细胞的线粒体自噬 |
| 4. 淫羊藿素提高无血清培养人脐带间充质干细胞的线粒体膜电位 |
| 四、讨论 |
| 第四部分 淫羊藿素预处理人脐带间充质干细胞蛋白质组学分析 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 1. 蛋白浓度测定结果 |
| 2. 差异蛋白筛选结果 |
| 3. 生物信息学分析 |
| 四、讨论 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在校期间发表论文情况 |
| 致谢 |
| 附件 |
（6）电针“委中”穴对BPVC致大鼠腰多裂肌损伤后组织形态学及IGF-1R、IGFBP3的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词表 |
| 第一部分 文献综述 |
| 综述一 “腰背委中求”的病种研究 |
| 1 非特异性腰痛 |
| 2 急性腰扭伤 |
| 3 腰椎间盘突出症 |
| 4 第三腰椎横突综合征 |
| 5 其他 |
| 参考文献 |
| 综述二 IGF-1对骨骼肌再生修复作用的研究 |
| 1 IGF-1的分子结构及特点 |
| 2 IGF-1的发现 |
| 3 IGF-1的作用途径及其调控 |
| 3.1 IGF-1的内分泌、旁分泌与自分泌作用 |
| 3.2 GH-IGF 1内分泌轴对IGF-1的调控 |
| 3.3 肠道菌群对IGF-1的调控 |
| 4 IGF-1在骨骼肌损伤修复中的作用 |
| 4.1 调节炎症反应 |
| 4.2 促进肌卫星细胞的增殖 |
| 4.3 促成肌分化作用 |
| 4.4 对小血管及神经的影响 |
| 4.5 其他作用 |
| 参考文献 |
| 综述三 IGF-1受体及结合蛋白的研究 |
| 1 IGF-1R的蛋白结构与基本作用 |
| 2 IGF-1R介导的细胞信号通路 |
| 2.1 PI3K/AKT信号通路 |
| 2.2 MAPK/ERK信号通路 |
| 3 IGFBPs对IGF-1的活性调控 |
| 参考文献 |
| 第二部分 实验研究 |
| 前言 |
| 技术路线图 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 实验动物 |
| 1.1.2 主要仪器 |
| 1.1.3 主要试剂与配制方法 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 动物分组 |
| 1.2.2 动物造模 |
| 1.2.3 处理方法 |
| 1.2.4 取材 |
| 1.3 指标检测 |
| 1.3.1 HE染色 |
| 1.3.2 IGF-1R、IGFBP3免疫组织化学染色 |
| 1.3.3 Western Blot蛋白印记法测定IGF-1R、IGFBP3含量 |
| 1.4 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 腰多裂肌组织形态学变化 |
| 2.1.1 腰多裂肌组织HE染色 |
| 2.1.2 肌纤维平均横截面积(cross sectional area,CSA) |
| 2.1.3 每肌纤维细胞核数(nuclei per fiber,NPF) |
| 2.2 大鼠腰多裂肌IGF-1R含量变化的情况 |
| 2.2.1 Western Blottin法测定IGF-1R的表达情况 |
| 2.2.2 免疫组化法测定IGF-1R的表达情况 |
| 2.3 大鼠腰多裂肌IGFBP3的含量变化情况 |
| 2.3.1 Western Blotting法测定IGFBP3的表达情况 |
| 2.3.2 免疫组化法测定IGFBP3的表达情况 |
| 3 讨论 |
| 3.1 0.5%布比卡因致大鼠腰多裂肌损伤模型的采用 |
| 3.2 大鼠腰多裂肌的组织形态学改变 |
| 3.3 IGF-1R表达的变化 |
| 3.4 IGFBP3表达的变化 |
| 4 结论 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（7）不同界面处理对腱-骨愈合影响及TNC作用机制初步研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 不同界面处理方式对腱-骨愈合的影响 |
| 2.1 不同界面处理方式对腱-骨愈合界面生物力学性能的影响 |
| 2.1.1 引言 |
| 2.1.2 材料和方法 |
| 2.1.3 结果 |
| 2.1.4 讨论 |
| 2.1.5 结论 |
| 2.2 不同界面处理方式对跟腱止点“印迹”骨结构的影响 |
| 2.2.1 引言 |
| 2.2.2 材料和方法 |
| 2.2.3 结果 |
| 2.2.4 讨论 |
| 2.2.5 结论 |
| 2.3 不同界面处理方式对腱-骨愈合界面组织形态的影响 |
| 2.3.1 引言 |
| 2.3.2 材料和方法 |
| 2.3.3 结果 |
| 2.3.4 讨论 |
| 2.3.5 结论 |
| 第三章 TNC在腱-骨愈合中的作用及机制初步研究 |
| 3.1 不同界面处理的腱-骨愈合界面及腱-肌连接处相关蛋白表达的影响 |
| 3.1.1 引言 |
| 3.1.2 材料和方法 |
| 3.1.3 结果 |
| 3.1.4 讨论 |
| 3.1.5 结论 |
| 3.2 TNC对 TSCs、BMSCs及不同比例直接混合共培养细胞增殖的影响 |
| 3.2.1 引言 |
| 3.2.2 材料和方法 |
| 3.2.3 结果 |
| 3.2.4 讨论 |
| 3.2.5 结论 |
| 3.3 TNC对 TSCs、BMSCs及等比例混合培养细胞分化基因表达的影响及可能参与的分子途径 |
| 3.3.1 引言 |
| 3.3.2 材料和方法 |
| 3.3.3 结果 |
| 3.3.4 讨论 |
| 3.3.5 结论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 腱-骨愈合的基本原理和腱-骨界面修复的组织工程进展 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表论文情况 |
| 致谢 |
（8）力生长因子对大鼠肌腱细胞运动能力及损伤肌腱修复的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英汉缩略名词对照表 |
| 1 绪论 |
| 1.1 问题的提出 |
| 1.2 国内外研究现状 |
| 1.2.1 肌腱的组成及功能特性 |
| 1.2.2 肌腱损伤 |
| 1.2.3 损伤肌腱的修复 |
| 1.2.4 力生长因子 |
| 1.3 研究意义 |
| 1.4 本文研究目的、主要内容和技术路线 |
| 1.4.1 研究目的 |
| 1.4.2 研究内容 |
| 1.4.3 技术路线 |
| 2 大鼠肌腱细胞的原代分离培养及鉴定 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 实验动物 |
| 2.2.2 主要仪器设备和耗材 |
| 2.2.3 主要实验药品与试剂 |
| 2.2.4 主要实验试剂的配制 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 大鼠肌腱细胞的分离培养 |
| 2.3.2 RT-PCR检测肌腱细胞相关标志物的表达 |
| 2.3.3 Western blot检测肌腱细胞相关标志物的表达 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 形态学观察 |
| 2.4.2 标志分子的mRNA检测结果 |
| 2.4.3 标志分子的蛋白检测结果 |
| 2.5 分析讨论 |
| 2.6 本章小结 |
| 3 MGF-C25E对大鼠肌腱细胞运动能力的影响 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 主要仪器、耗材 |
| 3.2.2 主要实验药品与试剂 |
| 3.2.3 主要实验试剂的配制 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 MTT测量 |
| 3.3.2 细胞运动的测量 |
| 3.3.3 Western blot检测蛋白表达 |
| 3.3.4 明胶酶谱检测MMPs分泌 |
| 3.3.5 免疫荧光染色观察细胞骨架蛋白F-actin |
| 3.3.6 原子力显微镜（AFM）测量细胞杨氏模量 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 MGF-C25E对肌腱细胞增殖的影响 |
| 3.4.2 MGF-C25E对肌腱细胞运动能力的影响 |
| 3.4.3 MGF-C25E通过FAK-ERK1/2 信号通路促进肌腱细胞迁移和侵袭 |
| 3.4.4 MGF-C25E通过FAK-ERK1/2 信号通路增加MMP-2 分泌促进肌腱细胞侵袭 |
| 3.4.5 MGF-C25E对肌腱细胞杨氏模量的影响 |
| 3.4.6 MGF-C25E对肌腱细胞F-actin的影响 |
| 3.5 分析讨论 |
| 3.5.1 MGF-C25E对肌腱细胞增殖无影响 |
| 3.5.2 FAK-ERK1/2 信号通路在MGF-C25E影响的细胞迁移及侵袭中的作用 |
| 3.5.3 MMP-2 在MGF-C25E促肌腱细胞侵袭中的作用 |
| 3.5.4 MGF-C25E影响的细胞硬度与细胞骨架重排的关系 |
| 3.6 本章小结 |
| 4 核力学特性在MGF-C25E促大鼠肌腱细胞迁移中的作用 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 主要仪器、耗材 |
| 4.2.2 主要实验药品与试剂 |
| 4.2.3 主要实验试剂的配制 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 细胞核的提取 |
| 4.3.2 原子力显微镜测量细胞核杨氏模量 |
| 4.3.3 q RT-PCR 检测 Lamin A/C 基因水平的表达 |
| 4.3.4 Western blot实验 |
| 4.3.5 免疫荧光染色 |
| 4.3.6 原位DNaseI敏感性实验 |
| 4.3.7 MTT测量同 3.3.1 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 MGF-C25E通过FAK-ERK1/2 信号通路增加肌腱细胞核硬度 |
| 4.4.2 MGF-C25E 对细胞核骨架蛋白 Lamin A/C 表达的影响 |
| 4.4.3 MGF-C25E对细胞核染色质浓缩的影响 |
| 4.4.4 MGF-C25E对DNA甲基化的影响 |
| 4.4.5 DNA甲基化对MGF-C25E影响的染色质浓缩、细胞核硬度以及细胞迁移的影响 |
| 4.5 分析讨论 |
| 4.5.1 细胞核硬度对细胞运动的影响 |
| 4.5.2 细胞核骨架蛋白Lamin A/C对细胞核硬度的影响 |
| 4.5.3 染色质浓缩对细胞核硬度及细胞迁移的影响 |
| 4.5.4 DNA甲基化对染色质浓缩的影响 |
| 4.5.5 MGF-C25E对大鼠肌腱细胞硬度与细胞核硬度的不同影响 |
| 4.6 本章小结 |
| 5 MGF-C25E对损伤肌腱细胞的影响 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料 |
| 5.2.1 主要仪器、耗材 |
| 5.2.2 主要实验药品与试剂 |
| 5.2.3 主要实验试剂的配制 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 大鼠肌腱细胞损伤模型的构建 |
| 5.3.2 qRT-PCR检测相关基因的表达方法同 4.3.3 |
| 5.4 实验结果 |
| 5.4.1 机械拉伸构建大鼠肌腱细胞损伤模型 |
| 5.4.2 TNF-α 构建大鼠肌腱细胞损伤模型 |
| 5.4.3 MGF-C25E对损伤肌腱细胞的影响 |
| 5.5 分析讨论 |
| 5.5.1 10%形变、1Hz机械加载 24 h对大鼠肌腱细胞炎症因子的表达无明显作用 |
| 5.5.2 TNF-α 构建大鼠肌腱细胞损伤模型 |
| 5.5.3 MGF-C25E降低TNF-α 促进的COX-2 和PGE2 mRNA表达 |
| 5.5.4 MGF-C25E对TNF-α 降低的Collagen I和Collagen III mRNA表达无明显作用 |
| 5.6 本章小结 |
| 6 MGF-C25E对大鼠损伤跟腱的在体修复作用 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 实验材料 |
| 6.2.1 实验动物 |
| 6.2.2 主要仪器、耗材 |
| 6.2.3 主要实验药品与试剂 |
| 6.2.4 主要实验试剂的配制 |
| 6.3 实验方法 |
| 6.3.1 实验设计和分组 |
| 6.3.2 大鼠跟腱损伤模型的构建 |
| 6.3.3 给药 |
| 6.3.4 跟腱功能指数（Achilles functional index，AFI）测量 |
| 6.3.5 组织形态观察 |
| 6.3.6 生物力学评估 |
| 6.3.7 组织学评估 |
| 6.4 实验结果 |
| 6.4.1 MGF-C25E对损伤大鼠跟腱AFI的影响 |
| 6.4.2 修复肌腱的形态观察 |
| 6.4.3 MGF-C25E对损伤大鼠跟腱生物力学特性的影响 |
| 6.4.4 MGF-C25E对损伤大鼠跟腱组织结构的影响 |
| 6.5 分析讨论 |
| 6.5.1 MGF-C25E对损伤大鼠跟腱功能恢复的影响 |
| 6.5.2 MGF-C25E对损伤大鼠跟腱力学特性的影响 |
| 6.6 本章小结 |
| 7 全文总结与展望 |
| 7.1 主要结论 |
| 7.2 后续工作展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| A. 作者攻读博士学位期间参与的科研项目 |
| B. 作者攻读博士学位期间的论文 |
（9）过度使用中肱二头肌长头肌腱相关生长因子基因表达规律（论文提纲范文）
| 1研究材料与方法 |
| 1.1实验动物 |
| 1.2运动方案 |
| 1.3取材与病理切片 |
| 1.4实时定量PCR |
| 1.5统计学处理 |
| 2结果 |
| 2.1组织病理 |
| 2.2基因表达 |
| 3讨论 |
| 4小结 |
（10）过度运动中肌腱细胞增殖、凋亡与相关生长因子蛋白表达特征的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语说明 |
| 1. 前言 |
| 2. 综述 |
| 2.1 肌腱 |
| 2.2 运动与肌腱退行性交 |
| 2.2.1 运动对肌腱的影响 |
| 2.2.2 肌腱退行性变病理特征 |
| 2.2.3 肌腱退行性变动物模型 |
| 2.3 生长因子与肌腱损伤、修复 |
| 2.3.1 胰岛素样生长因子1 |
| 2.3.2 转化生长因子β 1 |
| 2.3.3 碱性成纤维细胞生长因子 |
| 2.3.4 骨形态发生蛋白12 |
| 2.3.5 其他生长因子 |
| 3. 研究材料与方法 |
| 3.1 肱二头肌肌腱过度运动模型 |
| 3.1.1 实验对象 |
| 3.1.2 运动方案 |
| 3.2 取材 |
| 3.2.1 取材时机 |
| 3.2.2 取材步骤 |
| 3.3 切片与染色 |
| 3.3.1 石蜡包埋与切片 |
| 3.3.2 HE染色 |
| 3.3.3 免疫组化染色 |
| 3.3.4 EDU法染色 |
| 3.3.5 Tunnel染色 |
| 3.4 ELASA |
| 3.5 Westen Blot |
| 3.6 实验试剂、耗材与仪器 |
| 3.7 图像的采集和分析 |
| 3.7.1 HE染色切片病理评分 |
| 3.7.2 免疫组化染色分析蛋白表达 |
| 3.7.3 EDU染色分析细胞增殖 |
| 3.7.4 Tunnel染色分析细胞凋亡 |
| 3.7.5 Westen Blot分析蛋白表达 |
| 3.8 统计学处理 |
| 3.9 研究技术路线 |
| 4. 结果与讨论 |
| 4.1 结果 |
| 4.1.1 肱二头肌长头肌腱大体与结节间沟部位组织改变 |
| 4.1.2 肱二头肌长头肌腱结节间沟部位病理评分 |
| 4.1.3 肱二头肌长头肌腱结节间沟部位细胞增生 |
| 4.1.4 肱二头肌长头肌腱结节间沟部位细胞凋亡 |
| 4.1.5 肱二头肌长头肌腱结节间沟部位生长因子蛋白表达 |
| 4.1.5.1 IGF1蛋白表达 |
| 4.1.5.2 TGF β 1蛋白表达 |
| 4.1.5.3 bFGF蛋白表达 |
| 4.1.5.4 BMP12蛋白表达 |
| 4.1.6 肱二头肌长头肌腱整体生长因子蛋白表达 |
| 4.1.6.1 IGF1蛋白表达 |
| 4.1.6.2 TGF β 1蛋白表达 |
| 4.1.6.3 bFGF蛋白表达 |
| 4.1.6.4 BMP12蛋白表达 |
| 4.2 讨论 |
| 4.2.1 肱二头肌长头肌腱过度运动动物模型建立 |
| 4.2.2 过度运动中大鼠肌腱细胞的凋亡、增殖规律 |
| 4.2.3 过度运动中大鼠肌腱相关生长因子蛋白表达规律 |
| 4.2.3.1 IGF1蛋白表达规律 |
| 4.2.3.2 TGF β 1蛋白表达规律 |
| 4.2.3.3 bFGF蛋白表达规律 |
| 4.2.3.4 BMP12蛋白表达规律 |
| 4.2.4 生长因子在肌腱过度运动中的作用机制 |
| 5. 结论与建议 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 建议 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 个人简历 在读期间发表的学术论文与研究成果 |
四、胰岛素样生长因子1基因转染对大鼠肌腱细胞生长的促进作用（论文参考文献）
- [1]富血小板血浆联合体外冲击波治疗低氧环境下兔跟腱病的实验研究[D]. 邓亚鹏. 兰州大学, 2021(12)
- [2]Lnc00839通过miR-19-3p/IGF-1分子轴对阴道壁成纤维细胞COL-1分泌影响及其分子机制探究[D]. 尹一童. 中国医科大学, 2021(02)
- [3]周期性机械牵伸调节CREB/TGF-β3信号通路影响肌腱愈合的作用研究[D]. 李帅峰. 中国人民解放军陆军军医大学, 2020(01)
- [4]rhPDGF-BB基因修饰的BMSCs促进大鼠股骨牵张成骨的研究[D]. 买买艾力·玉山. 新疆医科大学, 2020(07)
- [5]淫羊藿素调控人脐带间充质干细胞的凋亡及线粒体自噬的机理研究[D]. 王璐. 广州中医药大学, 2019(08)
- [6]电针“委中”穴对BPVC致大鼠腰多裂肌损伤后组织形态学及IGF-1R、IGFBP3的影响[D]. 卢宗孝. 北京中医药大学, 2018(08)
- [7]不同界面处理对腱-骨愈合影响及TNC作用机制初步研究[D]. 刘洋. 中国人民解放军陆军军医大学, 2017(03)
- [8]力生长因子对大鼠肌腱细胞运动能力及损伤肌腱修复的影响[D]. 张冰玉. 重庆大学, 2015(07)
- [9]过度使用中肱二头肌长头肌腱相关生长因子基因表达规律[J]. 高晓嶙,白云飞,王若晗,张晓兰. 中国运动医学杂志, 2015(07)
- [10]过度运动中肌腱细胞增殖、凋亡与相关生长因子蛋白表达特征的研究[D]. 高晓嶙. 北京体育大学, 2014(04)