一、胃癌、大肠癌与端粒酶活性及DNA倍体的关系（论文文献综述）
王一同[1]（2021）在《华蟾素注射液治疗结肠癌腹水的优效人群分析及对VM的作用机制研究》文中进行了进一步梳理研究背景恶性腹水是晚期结肠癌患者的常见并发症,是临床治疗的难点。西医目前主要采用腹腔穿刺置管引流、全身化疗或联合腹腔灌注化疗等方法,但恶性腹水患者多为肿瘤晚期,经过多程放、化疗治疗,体质较差,再次化疗的敏感性及耐受性降低,且恶性腹水多为血性,无法大量置管引流,使腹胀、喘憋等症状持续存在,严重影响生活质量。因此需探索更为温和、有效的治疗方法。中药腹腔灌注,可避免口服汤药引起的胃肠不适,副反应小,近年来广泛应用于恶性腹水的临床治疗。本团队致力于华蟾素注射液腔内灌注治疗研究多年,发现华蟾素注射液对恶性浆膜腔积液有一定的疗效,庄等研究发现,华蟾素注射液腔内灌注治疗恶性浆膜腔积液,有效率为66.42%;杨等研究发现,华蟾素注射液腔内灌注对于恶性胸水有效率为60.00%;袁等研究发现,华蟾素注射液对于消化系统肿瘤来源恶性腹水有效率为75.4%,疗效更好,但前期研究对于不同癌种患者分层后病例数较少,未进行具体分层讨论。恶性腹水的生成与血管新生密切相关。本团队前期基础研究发现华蟾素注射液能够降低恶性腹水中的红细胞数量,使腹水颜色变浅,推测华蟾素注射液可能通过抑制肿瘤血管新生干预恶性腹水的生成。血管生成拟态（Vasculogenic Mimicry,VM）是近年来提出的全新肿瘤血管新生模式,可能与传统内皮细胞参与的肿瘤血管新生共同促进恶性腹水的生成。既往多数研究关注在华蟾素对内皮细胞参与的肿瘤血管新生的影响,鲜有研究探究华蟾素对VM形成的影响。研究目的临床部分:明确华蟾素注射液腹腔灌注治疗对于结肠癌这一单一病种来源的恶性腹水的疗效及该治疗方法对应的优效人群特征,以期为华蟾素注射液腹腔灌注治疗结肠癌恶性腹水提供更为个体化的临床指导。实验部分:由临床现象探索内在机制。以VM为新切入点,通过体内、体外实验观察华蟾素注射液对结肠癌HCT116细胞VM形成的影响及作用机制,从而更为全面地从肿瘤血管新生角度阐述华蟾素注射液腹腔灌注抑制结肠癌恶性腹水的作用机制。研究方法临床部分:采用单臂回顾性研究方法,收集2010年1月1日～2020年12月31日于北京中医药大学东方医院肿瘤科行华蟾素注射液腹腔灌注治疗的结肠癌恶性腹水的患者临床资料,从腹水量控制率、腹水质改善率、KPS评分改善情况及患者生存期方面进行疗效评价,同时评价安全性。进一步对比不同因素（如肿瘤原发病特点、转移情况、整体及局部中医辨证分型、合并全身治疗等）对疗效的影响,从中筛选优效病例,总结优效人群特征。实验部分:（1）采用结肠癌HCT116细胞腹腔+脾脏原位接种法建立BALB/C裸鼠结肠癌血性腹水模型;观察造模前后及华蟾素注射液干预前后裸鼠一般体征、体重、腹围、腹水量、腹水红细胞数量及腹腔转移瘤瘤重等。（2）采用CoCl2化学诱导建立结肠癌HCT116细胞体外缺氧模型;采用CCK-8实验、细胞划痕实验、Transwell实验检测缺氧微环境及华蟾素注射液对结肠癌HCT116细胞增殖、迁移及侵袭能力的影响。（3）采用Matrigel基质胶细胞三维培养建立结肠癌HCT116细胞体外VM模型;通过PAS-CD31组织化学与免疫组化双染法显示结肠癌HCT116细胞体内VM的形成;显微镜下计数VM形成数目,观察缺氧微环境及华蟾素注射液对结肠癌HCT116细胞体内、体外VM形成的影响。（4）采用RT-qPCR、Western-blot实验检测缺氧微环境及华蟾素注射液对结肠癌 HCT116 细胞 VM 形成相关靶点 HIF-1α、VEGF、MMP2、MMP9、VE-cadherin mRNA及蛋白表达的影响。研究结果临床部分:（1）腹水量疗效评价:研究共纳入135例患者。灌注后腹围较灌注前显着减小（P<0.01）;完全缓解2例,部分缓解25例,稳定56例,合计有效83例,无效52例,总有效率61.5%。（2）腹水质疗效评价:灌注后腹水红细胞数、腹水肿瘤标记物、腹水乳酸脱氢酶水平较灌注前显着下降（P<0.01）;腹水红细胞较治疗前下降≥25%者94例,总有效率74.0%;腹水肿瘤标记物较灌注前下降≥25%者70例,总有效率55.1%,其中CEA、CA199、CA724水平下降显着,铁蛋白水平较灌注前差异无统计学意义（P>0.05）;腹水乳酸脱氢酶较治疗前下降≥25%者50例,总有效率39.4%。（3）KPS评分疗效评价:灌注后KPS评分较灌注前显着提高（P<0.01）;较治疗前提高者41例,较治疗前稳定者82例,较治疗前减少者12例。（4）生存情况疗效评价:纳入患者截至末次随访,仍存活者2例,腹水生存期为1～31个月,平均腹水生存期5.66±4.59个月,中位腹水生存期4.00个月;腹水1年生存率为9.6%,2年生存率为3.7%,未见大于3年生存者。（5）安全性评价:出现不良反应者27例,占比20.0%,主要不良反应为腹痛（10例）、发热（11例）、恶心呕吐（3例）、腹泻（3例）,多可耐受或对症治疗后可较快缓解,为1级轻度不良反应。未见由药物引起的骨髓抑制、肝、肾功能异常及心电图改变,未见腹腔感染、肠梗阻、消化道出血等严重并发症,安全性良好。（6）短期疗效优效人群特征分析:对于男性、有饮酒史、左半结肠、灌注前血液NLR≤2.81、初诊即诊断恶性腹水、血性腹水、全身辨证含瘀毒证,全身辨证非肝肾阴虚证、局部辨证为湿热毒证及合并全身中医治疗患者的腹水量控制方面疗效更好,其中结肠癌位置、腹水性质、合并全身中医治疗是影响腹水量控制率的独立预后因素;对于有饮酒史、无肝转移、有腹腔淋巴结转移、无胆红素升高、血性腹水、局部辨证为湿热毒证及合并全身中医治疗患者的腹水颜色改善方面疗效更好,其中肝转移、胆红素升高、腹水性质、局部辨证为影响腹水颜色改善率的独立预后因素。（7）长期疗效优效人群特征分析:有家族史、左半结肠、无肝转移、无脑转移、转移部位≤2个、灌注前无血中乳酸脱氢酶升高、初诊即诊断恶性腹水、全身辨证非肝肾阴虚证、无不良反应及腹水量得到控制的患者腹水生存期更长,但与外部研究结果对比生存期未见明显延长。实验部分:（1）结肠癌HCT116细胞腹腔+脾脏原位接种可建立较为稳定的BALB/C裸鼠结肠癌血性腹水模型;Matrigel基质胶细胞三维培养可建立结肠癌HCT116细胞体外VM模型。（2）华蟾素注射液腹腔注射可抑制结肠癌血性腹水的生成、降低腹水中红细胞数目,抑制结肠癌腹腔转移瘤的生成。（3）缺氧微环境可促进结肠癌HCT116细胞迁移、侵袭,增强体外VM的形成能力。（4）华蟾素注射液可逆转缺氧对HCT116细胞造成的不良影响,抑制其增殖、迁移、侵袭及体内、体外VM的形成。（5）缺氧微环境可上调HCT116细胞HIF-1α、VEGF、MMP2、MMP9、VE-cadherin mRNA及蛋白的表达,华蟾素注射液干预后可抑制HIF-1α、VEGF、MMP2、VE-cadherinmRNA及蛋白表达,对MMP9 mRNA及蛋白未见显着影响。研究结论临床部分:（1）华蟾素注射液腹腔灌注可有效抑制结肠癌恶性腹水的产生,延缓病情进展,降低腹水中的红细胞数量,提高KPS评分,改善患者生活质量,安全性良好;（2）左半结肠癌、无肝转移、无胆红素升高、血性腹水、局部辨证为湿热毒证及合并全身中医治疗的患者是华蟾素注射液腹腔灌注治疗的优效人群,通过人群特征初步筛选后用药可提高临床疗效。实验研究:华蟾素注射液腹腔灌注抑制结肠癌血性腹水的机制,可能与其逆转肿瘤缺氧微环境,下调HIF-1α、VEGF、MMP2、VE-cadherin mRNA及蛋白的表达从而抑制结肠癌细胞体内、体外VM的形成,同时抑制结肠癌细胞增殖、迁移及腹腔侵袭有关。
韩玮[2]（2021）在《苦豆碱通过调节miR-296-5p/STAT3轴抑制结直肠癌细胞的增殖和转移及其机制研究》文中研究说明目的:观察苦豆碱（ALO）对结直肠癌（CRC）细胞生物学行为的影响,研究苦豆碱在CRC中对miR-296-5p和转导和转录激活因子3（STAT3）的表达影响,从而进一步探讨苦豆碱抗CRC的作用及其潜在机制。方法:1.用不同浓度的ALO处理细胞,MTT法检测CRC细胞增殖。2.qRT-PCR检测不同浓度的ALO处理CRC细胞中miR-296-5p的表达。3.利用生物信息网站TargetScan V7.2对基于miRNA序列的靶基因进行预测,并采用双荧光素酶报告分析（dual-luciferase reporter assay）对预测结果进行验证。4.在室温下转染或共转染miR-296-5p mimics、过表达 STAT3 质粒、miR-296-5p inhibitor、siSTAT3,并且予以 ALO 处理。采用 qRT-PCR 检测处理后CRC细胞miR-296-5p的表达情况,Western blot检测STAT3的表达情况。5.采用细胞克隆形成实验检测ALO处理后转染的HCT116和SW480细胞增殖影响情况,使用流式细胞仪检测细胞凋亡影响情况,最后采用western-blot检测细胞凋亡蛋白相关影响情况。6.采用划痕愈合实验检测ALO对采用不同转染方案的HCT116和SW480细胞迁移影响,使用Transwell侵袭试验细胞侵袭影响。7.采用western-blot检测处理后EMT相关蛋白N-cadherin和E-cadherin的表达影响况。结果:1.采用MTT法检测,结果表明ALO对不同CRC细胞增殖具有不同程度抑制作用,并且具有剂量依耐性。其中针对不同的CRC细胞抑制作用不同,以对SW480细胞增殖的抑制作用最强,但对HCT116细胞增殖的抑制作用最弱,并且SW480细胞的IC50为 0.611mmol/L,而 HCT116 细胞的 IC50 为 1.141mmol/L。2.通过 StarBasev3.0 分析比较了结直肠腺癌和正常样本miR-296-5p,明确了 miR-296-5p再结直肠腺癌中低表达,再通过 qRT-PCR 验证了 CRC 细胞系（SW480、HCT116、HT29、SW620）内 miR-296-5p 的表达低于人肠上皮细胞HIEC,并且miR-296-5p在SW480细胞表达最高,HCT116表达最低。选择SW480细胞和HCT116细胞做为代表,经过ALO处理24h后,检测两者miR-296-5p表达,结果表明ALO能够上调SW480细胞和HCT116细胞miR-296-5p的表达,并且呈现剂量依赖性。3.采用TargetScan V7.2对miR-296-5p进行靶基因预后,结果提示STAT3是靶基因,并且目标位点位于3’-UTR。构建野生型（STAT3-WT）和突变型（STAT3-MUT）基因靶点STAT3的3’UTR-荧光素酶表达载体。对miR-296-5p表达最低的HCT116细胞行miR-296-5p mimic共转染,对miR-296-5p表达最高的SW480细胞进行miR-296-5p inhibitor共转染。双荧光素酶报告基因系统分析后,结果提示与STAT3-MUT共转染的细胞相比,miR-296-5p mimic和STAT3-WT共转染的HCT116细胞的荧光素酶活性明显抑制,而与miR-296-5p inhibitor和STAT3-WT共转染的SW480细胞的荧光素酶活性增强,从而证明STAT3是miR-296-5p靶基因。4.miR-296-5p mimics和ALO都抑制了 CRC细胞中STAT3的表达,但miR-296-5p inhibitor增强了 STAT3的表达。从而得出结论:上调MIR-296-5p和ALO处理均抑制STAT3的表达。5.上调miR-296-5p和ALO抑制了 CRC细胞的增殖以及Bcl-2的表达,但促进凋亡以及Bax表达,并且这些作用都通过过表达的STAT3逆转。实验结果表明ALO通过调节miR-296-5p/STAT3通路调控CRC细胞增殖和凋亡。6.上调miR-296-5p和ALO抑制了 CRC细胞的迁移、侵袭,并且通过过表达的STAT3逆转。实验结果表明ALO通过调节miR-296-5p/STAT3通路调控CRC细胞迁移和侵袭。7.上调miR-296-5p和ALO抑制CRC细胞的N-cadherin的表达,但促进E-cadherin的表达,这些作用可以被过表达的STAT3逆转,结果表明:ALO通过调节miR-296-5p/STAT3通路调控EMT相关蛋白的表达。结论:ALO以剂量依赖性的方式抑制CRC细胞增殖。miR-296-5p在CRC组织和细胞中低表达,ALO促进miR-296-5p的表达。STAT3是mi R-296-5p的靶基因,上调miR-296-5p和ALO均抑制STAT3的表达。ALO可以通过调节miR-296-5p/STAT3通路调控CRC的增殖、凋亡、迁移、侵袭和EMT。
黄超[3]（2017）在《TGF-β1诱导肠上皮表型转变相关表观遗传机制及中药单体干预》文中研究指明背景和目的大肠癌（CRC）对人类生活健康构成了极大的危险,深入了解肠癌发生发展机制及开发有效药物的形势已刻不容缓。研究发现肿瘤微环境（TME）中的肿瘤细胞与基质细胞通过其分泌到微环境中的转化生长因子-β（TGF-β）发生串扰从而促进基质细胞之间的表型转变,而且研究发现在表型转变过程中伴随有表观遗传学的改变,而组蛋白修饰作为表观遗传学中的重要成分因结构特性因而可通过各种化学基团修饰对周围环境进行即时快速响应,因此组蛋白修饰可能参与了细胞表型转变相关机制。中药单体吴茱萸碱和小檗碱对肿瘤细胞均具有较强的抗肿瘤活性,然而对其具体的抗癌机制尚不明确,因此,本研究旨在通过TGF-β1体外诱导结肠上皮细胞系NCM460构建表型转变模型探讨组蛋白修饰变化机制以及吴茱萸碱和小檗碱的干预效应。方法将含有10ng/mlTGF-β 1培养基培养永生化结肠上皮细胞系NCM460至15天（d）后采用细胞免疫荧光进行细胞表型标志物E-cadherin、ZO-1和vimentin的免疫荧光检测,同时采用免疫印迹（westernblotting）对此三种表型标志物及表型相关转录因子Snail和Slug的蛋白表达进行了测定。为了探索细胞表型转变中染色体不稳定及组蛋白修饰模式的变化,分别采用分选式流式细胞仪（FACS）和western blotting检测TGF-β 1诱导表型转变后的细胞中非整倍体细胞百分比情况和五种组蛋白修饰标记物（H3K4me2、H3K4me3、H3K9me2、H3K9ac、H3K27me3）蛋白表达水平。为了探讨左金丸主要活性成分吴茱萸碱和小檗碱对TGF-β 1的生物学效应的干预作用,将TGF-β 1诱导表型转变后的细胞进行不同浓度吴茱萸碱（5μg/ml、10μg/ml和20μg/ml）和小檗碱（50μg/ml、75μg/ml和100μg/ml）处理后72h后,分别按照上述方法检测表型标志物及Snail、Slug表达,非整倍体细胞百分比变化以及异常组蛋白修饰模式的影响。结果（1）TGF-β 1对NCM460细胞表型转变及中药单体干预的影响10ng/mlTGF-β 1诱导NCM460细胞15d后细胞发生了 EMT样表型转变,细胞呈现出纺锤样的形态学改变,同时上皮细胞标志物E-cadherin和紧密连接复合物ZO-1的表达出现显着下调,而间质性标志物vimentin的表达出现了明显升高,其荧光强度与光密度值与未加入TGF-β 1处理的细胞相比差异具有统计学意义（P<0.05）。此外与TGF-β 1诱导表型转变相关的转录因子Snail和Slug也出现了显着上调（P<0.05）。而加入不同浓度吴茱萸碱和小檗碱处理72h后,均能不同程度上调E-cadherin和ZO-1和下调vimentin表达,表明吴茱萸碱和小檗碱可对抗TGF-β1引起的细胞表型转变效应。（2）表型转变中TGF-β1对细胞中非整倍体性的影响及中药单体的干预效应NCM460细胞受到10ng/mlTGF-β 1诱导15d发生表型转变后,非整倍体细胞数百分比明显高于阴性对照组（P<0.05）,整倍体亚群分析显示,转化细胞中亚二倍体.细胞数明显多于超二倍体和多倍体数目（P<0.05）,而诱导20d和25天后细胞中分别以超二倍体和多倍体细胞为主。但是经高浓度和中浓度的吴茱萸碱和小檗碱处理72h后,非整倍体细胞数（亚二倍体和超二倍体）与对照组相比均出现了显着的减少（P<0.05）。（3）TGF-β1诱导表型转变中组蛋白修饰变化及中药单体干预的影响与对照组细胞相比,TGF-β 1诱导表型转变细胞中H3K4me2、H3K4me3、H3K9me2、H3K9ac和H3K27me3均出现了显着互不相同的变化,其中H3K4me2、H3K9me2和H3K9ac的表达显着上调（P<0.05）,而H3K4me3和H3K27me3的表达出现了明显下调反应（P<0.05）。然而H3K4me3和H3K27me3的表达经吴茱萸碱和小檗碱处理出现了不同程度的上调,而H3K9me2和H3K9ac的表达呈现出不同程度下调,但是H3K4me2的表达经10μg/ml吴茱萸碱和100μg/ml以及50μg/ml小檗碱处理后下调。结论（1）结肠上皮细胞在体外受TGF-β 1诱导表型转变后出现了非整倍体性的染色体不稳定以及异常组蛋白修饰,表明TGF-β1可能通过与组蛋白修饰相关机制从而导致基因组不稳定性而发挥出促表型转变效应。（2）一定浓度吴茱萸碱和小檗碱可能通过多机制包括稳定染色体数目或调控异常组蛋白修饰模式而发挥出一定的抗肿瘤活性作用。
郝思雨,于景翠[4]（2012）在《Shelterin复合体与消化系恶性肿瘤》文中认为Shelterin复合体是端粒结合蛋白的核心成分,他的复杂调控与端粒酶、端粒延长替代途径（ALT机制）在保护端粒功能中发挥重要的作用.端粒是包含一段重复序列的DNA-蛋白复合体,通过端粒酶募集到染色体末端,稳定染色体末端,从而防止染色体融合.端粒的保护与基因组的稳定密不可分,而基因组的不稳定是肿瘤形成的分子基础.目前,恶性肿瘤已成为危害人类健康的主要疾病,其中消化系恶性肿瘤的发病率和死亡率均位居前列.许多研究表明端粒结合蛋白在胃癌、大肠癌和肝癌等消化系肿瘤中发挥重要作用.本文着重总结Shelterin复合体在消化系恶性肿瘤中的作用,为消化系恶性肿瘤的预防及靶向治疗提供重要依据.
曹先乾[5]（2012）在《塞来昔布及丁酸盐对大肠腺瘤和大肠癌细胞作用的实验研究》文中研究表明目的：观察非甾体抗炎药（NSAIDs）塞来昔布及丁酸钠对大肠腺瘤细胞和大肠癌HCT-116细胞株抗增殖作用的影响，并探讨其可能的作用机制。。方法：不同浓度的塞来昔布（100,200,400umol/L）、丁酸钠（0.5,1.0,2.0mmol/L）及联合用药（塞来昔布100umol/L+丁酸钠0.5mmol/L）处理对数生长期的大肠腺瘤细胞与大肠癌HCT-116细胞株，培养不同时间（24,48,72h）后收集细胞，采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法检测细胞增值的变化，流式细胞仪检测细胞凋亡与细胞周期分布的变化，PCR-ELSA检测端粒酶活性，RT-PCR法检测端粒酶逆转录酶hTERTmRNA和COX-2mRNA水平表达的变化。结果：1.塞来昔布及丁酸钠在一定时间范围（24,48,72h）内呈剂量、时间依赖性地抑制大肠腺瘤细胞与大肠癌HCT-116细胞的增殖，各浓度组与对照组比较有显着性差异，（P<0.05）。塞来昔布与丁酸钠联合用药对大肠腺瘤细胞和大肠癌HCT-116细胞增殖的抑制效应明显高于单一用药，与单一用药组比较具有统计学意义，（P<0.05）。2.不同浓度的塞来昔布与丁酸钠处理大肠腺瘤细胞和大肠癌HCT-116细胞，48h后收集细胞，流式细胞仪检测结果提示随着药物浓度的升高，大肠腺瘤细胞与大肠癌HCT-116细胞G1期百分率明显升高，各药物浓度组与对照组比较，差异具有统计学意义，（P<0.05）。塞来昔布与丁酸钠联合用药组G1期比例明显高于单一用药组，与单一用药组比较具有统计学意义，（P<0.05）。3.不同浓度的塞来昔布与丁酸钠处理大肠腺瘤细胞和大肠癌HCT-116细胞，48h后收集细胞，流式细胞仪检测结果发现随着药物浓度越高，大肠腺瘤细胞与大肠癌HCT-116细胞凋亡率越高，各药物浓度组与对照组比较有显着性差异，（P<0.05）。塞来昔布与丁酸钠联合用药组细胞凋亡率明显高于单一用药组，与单一用药组比较具有统计学意义（P<0.05）。4.不同浓度的塞来昔布与丁酸钠处理大肠腺瘤细胞和大肠癌HCT-116细胞，48h后收集细胞，PCR-ELSA检测结果提示伴随着药物浓度的升高，大肠腺瘤细胞和大肠癌HCT-116细胞内的端粒酶活性逐渐降低，不同药物浓度组与对照组比较有显着性差异，（P<0.05），而RT-PCR检测结果提示端粒酶逆转录酶hTERT与COX-2mRNA表达也逐渐降低，各药物浓度组与对照组比较，差异具有统计学意义，（P<0.05）。塞来昔布与丁酸钠联合用药组端粒酶活性、hTERT及COX-2mRNA表达均明显低于单一用药组，与单一用药组比较均具有统计学意义，（P<0.05）。结论：1.塞来昔布与丁酸钠对大肠腺瘤细胞和大肠癌HCT-116细胞有明显的增殖抑制作用，并呈现剂量与时间依赖性。塞来昔布与丁酸钠联合应用具有协同抑制效应。细胞周期阻滞可能是塞来昔布与丁酸钠抑制大肠腺瘤细胞和大肠癌HCT-116细胞增殖的机制。2.塞来昔布与丁酸钠对大肠腺瘤细胞和大肠癌HCT-116细胞的增殖抑制作用可能与通过抑制COX-2、端粒酶逆转录酶hTERT的表达，降低端粒酶活性，减少前列环素的合成及诱导细胞凋亡有关。
冯建英,邵建国[6]（2011）在《中药抑制消化道恶性肿瘤端粒酶活性作用研究进展》文中研究指明消化道恶性肿瘤为临床上最常见的恶性肿瘤之一,严重威胁着人类的健康。我国是世界上食管癌的高发国家,也是世界上食管癌死亡率最高的国家之一。胃癌是我国最常见的肿瘤之一,每年新诊断的癌症病例中,胃癌位居第四位,在癌症病死率中排列第二位,
蔡艳玲[7]（2011）在《RNAi靶向人端粒酶逆转录酶基因治疗大肠癌的实验研究》文中研究指明目的构建含有小发夹RNA （shRNA）的针对hTERT基因的重组真核质粒pGPU6/GFP/Neo-hTERT-shRNA,并探讨RNA干扰人端粒酶逆转录酶（human telomerase reverse transcriptase, hTERT）的表达对大肠癌SW480细胞凋亡的影响。方法设计合成3条针对hTERT基因的siRNA,将筛选出最有效的siRNA合成shRNA寡核苷酸片段插入到真核质粒pGPU6/GFP/Neo中,进行酶切和测序鉴定。将构建好的重组真核质粒pGPU6/GFP/Neo-hTERT-shRNA,采用脂质体法转染人大肠癌SW480细胞。在荧光显微镜下观察细胞转染效率及细胞形态学变化。RT-PCR法检测不同转染时间SW480细胞中hTERTmRNA的表达水平。TRAP-PCR-ELISA法检测转染48小时后SW480细胞的端粒酶活性。免疫组化法检测SW480细胞中hTERT蛋白的表达。流式细胞仪检测转染后细胞周期分布。TUNEL法检测转染后细胞凋亡状况。激光共聚焦显微镜观察细胞线粒体跨膜电位（MMP）的变化。透射电镜观察转染后细胞超微结构。结果将筛选出干扰效率较好的的siRNA序列合成shRNA片段后,将其成功插入质粒pGPU6/GFP/Neo中,构成重组真核质粒pGPU6/GFP/ Neo-hTERT-shRNA。SW480细胞以质粒与脂质体比例为1：2.5、转染48h时的转染效率较高,其转染率达59%。RT-PCR结果显示,hTERT-shRNA组的hTERTmRNA表达水平在转染48h时降低较明显,与空白组、脂质体组、NC-shRNA组比较,抑制率分别是39.20%,33.28%,27.95%。TRAP-PCR-ELISA结果示,hTERT-shRNA组SW480细胞端粒酶活性显着降低18.7%,与其它三组比较,差别均有统计学意义（P<0.05）。免疫组化结果示,hTERT-shRNA组被染色的阳性细胞明显少于其他组,经病理图像分析软件分析灰度值后得出,转染48h后hTERT-shRNA组与空白组比较,差异有明显统计学意义（P<0.05）,同时与脂质体组和NC-shRNA组比较,差异均有统计学意义（P<0.01）。流式细胞仪结果示,hTERT-shRNA组G0/G1期细胞显着增加,S期细胞减少,提示hTERT-shRNA质粒转染SW480细胞后,使进入静止状态的细胞增多,细胞增殖指数下降约14.2%,与NC-shRNA组比较,差别有显着统计学意义（P<0.05）。TUNEL结果示,与其他组比较,hTERT-shRNA组凋亡细胞数显着增多,凋亡指数为21.5%,明显比其他组增高,差异有统计学意义（P<0.01）。激光共聚焦显微镜观察结果,hTERT-shRNA组可见多个含有核分裂相的细胞,细胞Rh123荧光强度明显增强,MMP显着下降,与其他组比较,差异有统计学意义（P<0.01）。透射电镜观察结果示,SW480细胞体积明显缩小,表面突起及微绒毛减少,甚至消失,细胞核固缩,染色质不均匀地沿核膜下聚集,空泡增多。结论成功构建了针对hTERT基因的重组真核表达质粒pGPU6/GF P/Neo-hTERT-shRNA。它能有效沉默hTERT基因,因而能有效抑制人大肠癌SW480细胞增殖生长,降低端粒酶活性,最终促使肿瘤细胞凋亡。目的研究靶向hTERT基因的重组质粒pGPU6/GFP/Neo-hTERT-shRNA对人大肠癌SW480细胞裸鼠移植瘤的治疗作用。方法于裸鼠右侧腋下皮下注射人大肠癌SW480细胞建立大肠癌移植瘤动物模型,待肿瘤长到一定大小时,随机分为生理盐水组（NS组）、NC-shRNA组和hTERT-shRNA组。各组连续进行相应治疗6次后,观察肿瘤的生长状况,测量肿瘤体积,绘制肿瘤生长曲线,HE染色观察肿瘤组织细胞形态学变化,免疫组化法检测移植瘤组织中hTERT蛋白的表达,TUNEL法检测肿瘤组织中细胞凋亡情况,RT-PCR法检测瘤组织中hTERTmRNA的表达,PCR-TRAP-ELISA法检测肿瘤组织的端粒酶活性。结果所有裸鼠在接种SW480细胞第14天后,皮下肿瘤结节直径达5-7mm,成功构建了裸鼠移植瘤模型,成瘤率为100%。荷瘤裸鼠开始治疗后,hTERT-shRNA组瘤体积增长速度慢于NS组和NC-ShRNA组,并于第18天开始明显减慢。HE染结果示,hTERT-shRNA组肿瘤组织出现局部坏死区,瘤组织细胞形态发生明显改变。免疫组化法检测结果示,hTERT-shRNA组肿瘤组织中hTERT蛋白表达水平下降,可见少量hTERT蛋白阳性细胞,细胞呈浅棕色。TUNEL法检测结果示,hTERT-shRNA组凋亡细胞数明显增多,细胞分布密集,与NS组和NC-shRNA组比较,凋亡指数分别增加29.4%和31.1%,差异有显着统计学意义（P<0.01）；RT-PCR法检测结果示,hTERT-shRNA组hTERT mRNA表达水平较NS组和NC-shRNA组分别下降52.1%和48.3%,差异具有显着性意义（P<0.01）。PCR-TRAP-ELISA法检测结果示,hTERT-shRNA组与NS组和NC-shRNA组比较,端粒酶活性降低较明显,抑制率分别为48.5%和53.0%,差异有统计学意义（P<0.05）。结论重组质粒pGPU6/GFP/Neo-hTERT-shRNA通过下调hTERTmRNA和hTERT蛋白的表达,促进肿瘤细胞的凋亡,从而抑制大肠癌移植瘤的生长。
房信博[8]（2011）在《Bmi-1和hTERT在胃癌中的表达及相关性研究》文中进行了进一步梳理目的：检测Bmi-1和hTERT蛋白在胃癌中的表达及其与临床病理特征的关系,并探讨二者在胃癌发生发展中的作用及其之间的相关性。方法：采用免疫组化PV-9000法分别检测70例胃癌、20例慢性萎缩性胃炎及10例癌旁相对正常胃粘膜组织标本中Bmi-1和hTERT蛋白的表达。结果：（1）胃癌组Bmi-1和hTERT蛋白的阳性表达率分别为71.43%、78.57%,均明显高于正常组0%、0%及慢性萎缩性胃炎组20%、15%,且差别均有高度统计学意义（Z=-5.032～-3.793,P均<0.01）。（2）胃癌组中Bmi-1和hTERT蛋白阳性表达均与癌组织的浸润深度、临床分期及淋巴结转移有关（Z=-5.198～30.971,P均<0.01）,而与患者的性别、Borrmann分型及分化程度等无关（Z=-1.825～1.940,P均>0.05）。（3）胃癌组中Bmi-1和hTERT蛋白的表达呈显着正相关（r=0.940,P=0.000）。结论：（1）Bmi-1及hTERT均与胃癌的发生、发展关系密切。（2）Bmi-1与hTERT蛋白在胃癌中表达成正相关,提示两者在胃癌发生、发展中具有协同作用，共同促进胃癌的发生和发展。（3）两者联合检测有可能成为胃癌早期诊断、预测转移和判断预后的重要参考指标。亦可望为胃癌的分子治疗提供新的靶点。
王大虎[9]（2011）在《端粒酶和PinX1基因在食管癌中的表达及生物学意义》文中进行了进一步梳理目的:食管癌（esophageal carcinoma, EC）是全世界最常见的消化道恶性肿瘤之一,我国的食管癌发病率较高,河北省磁县更是食管癌的高发区,严重影响着人们的生活质量和生命健康。端粒、端粒酶在肿瘤细胞的永生化和演进中扮演重要角色。端粒酶的激活可以导致细胞无限制地增殖和肿瘤的发生。端粒（telomere）作为分子钟控制着人类细胞的复制与衰老,与细胞的寿命密切相关。正常细胞每次分裂,端粒DNA长度会缩短55～200 bp,经历多次分裂后缩短至其下限时,细胞最终凋亡或死亡。端粒酶（telomerase）是一种以自身RNA为模板的逆转录酶,其核心组分之一端粒酶逆转录酶（human telomerase reverse transcriptase , hTERT）是端粒酶发挥活化作用的重要途径,它的表达调控在端粒酶活性调节中起关键作用,是细胞呈现端粒酶活性的决定因素。已有大量研究发现,在恶性肿瘤的发生中存在有端粒DNA长度的缩短,并且端粒酶的激活维持了大多数组织的端粒长度,抵消了细胞分裂导致的端粒DNA消耗。说明端粒缩短在恶性肿瘤的演变中起重要作用。已有大量研究表明,人体正常细胞除少量细胞如精原细胞、胚胎细胞、干细胞外,大多数细胞的端粒酶几乎都是无活性的,而与之相反在绝大多数恶性肿瘤中端粒酶活性高表达,表达率高达90%以上。因此端粒酶的活化可能是恶性肿瘤发生发展的多种基因改变中起到了至关重要的作用,并且可以作为最具普遍性和特异性的肿瘤分子标记物,在肿瘤的诊断和治疗中具有重要的地位。而抑制端粒酶的活性,将有可能阻止肿瘤细胞恶性增殖,这种特性使端粒酶成为当今肿瘤诊治研究的热点。本实验利用了多项实验方法检测端粒DNA长度、端粒酶hTERT蛋白含量及细胞内DNA含量在食管癌高发区现场人食管癌、异型增生及正常食管的表达,探讨与食管癌发生及生物学行为的关系,试图为食管癌的早期诊断提供客观参考指标,并为揭示食管癌的发生、发展的机制提供理论依据。采用端粒重复序列扩增反应（TRAP）-ELISA和TRAP -银染法半定量技术,检测食管癌及异型增生组织中端粒酶活性的表达,探讨端粒酶活性与食管癌发生发展及其与临床病理因素的关系。PinX1基因作为端粒酶的内源性抑制基因,近年来被认为是一种潜在的抑癌基因,其表达可能与多种肿瘤的发生发展有关。有实验证实在胃癌、大肠癌及白血病患者中PinX1表达明显下降,端粒酶活性增强。但是也有研究显示PinX1在肝癌细胞中的表达与正常组织无显着差异,而与之相应的是此类肿瘤中大部分端粒酶活性也增强。目前PinX1基因在肿瘤细胞中的作用和对端粒酶活性的调控及在细胞癌变中的机制尚不十分清楚。有关PinX1基因在食管癌中的研究国内外也鲜有报道。PinX1基因的作用越来越引起人们的重视,但到目前为止,PinX1基因在食管癌中生物学意义、作用机理国内外的报道很少,并且没有适合研究PinX1基因的食管癌细胞模型。由于基因转染已经成为治疗肿瘤等基因表达异常的有效手段,那么,通过外源性过表达PinX1基因能否抑制食管癌细胞的增殖?是否可以抑制端粒酶活性?本实验中利用多项技术,应用细胞模型研究PinX1在人食管癌、异型增生组织及正常食管组织中的表达,探讨PinX1与食管癌发生发展及与食管癌临床分期、病理分型及预后的相关性,并分析与端粒酶活性表达的相关性。研究转染PinX1基因前后细胞增殖凋亡等的变化,初步了解该基因对食管癌细胞的生物学影响。同时我们应用TRAP-ELISA和TRAP-银染法检测转染前后Eca109细胞端粒酶活性的变化,进一步探讨PinX1基因与端粒酶的关系。方法:1端粒DNA长度及端粒酶hTERT在食管癌高发区人群中的表达及生物学意义收集采集自河北省磁县食管癌高发区现场的咬检组织1000例,所有患者未接受过化疗和放疗。从中选取130例,根据病情分为3组,第1组为正常食管组织36例,第2组为异型增生组织50例,第3组为食管鳞癌组织44例。经病理组织学诊断,50例异型增生食管粘膜组织中,22例为轻度增生组织,28例为重度增生组织;44例食管鳞状细胞癌中,20例为高分化鳞癌、11例为中分化鳞癌,13例为低分化鳞癌,25例侵及纤维膜及周围软组织,19例未侵及纤维膜;20例为淋巴结转移,24例为无淋巴结转移。采用流式细胞术方法（flow cytometry, FCM）和免疫组织化学方法（immunohistochemistry, IHC）检测测端粒DNA长度、端粒酶hTERT蛋白含量及细胞内DNA含量在食管癌高发区现场人食管癌、异型增生及正常食管的表达,分析与食管癌发生及与临床病理特征的关系。2食管癌中的端粒酶活性和PinX1的表达及其生物学意义收集食管鳞状细胞癌手术切除标本130例,每例标本分别取癌组织、癌旁组织（距癌边缘2-5cm）及手术切缘正常食管粘膜（距癌边缘5cm以上）。从中选取50例食管鳞状细胞癌、异型增生及正常食管粘膜组织。经病理组织学诊断,50例食管鳞状细胞癌,39例为高中分化鳞癌,11例为低分化鳞癌,34例侵及纤维膜,16例未达到纤维膜,17例淋巴结转移,33例未转移。采用逆转录聚合酶链反应（reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR）、流式细胞术方法（flow cytometry, FCM）、TRAP-ELISA和TRAP-银染法检测食管癌组织、异型增生、正常粘膜组织中端粒酶活性和PinX1基因和蛋白的表达,分析端粒酶活性和PinX1表达与食管癌临床病理特征的关系。3基因转染PinX1对食管癌Eca109细胞增殖和凋亡以及端粒酶活性的影响利用分子生物学技术构建pCDNA3.1（+）-PinX1重组质粒。采用脂质体转染方法将pCDNA3.1（+）-PinX1重组质粒转染Eca109细胞,同时也设置空载体pCDNA3.1转染组。转染72小时后用G418进行稳定转染细胞的筛选,筛选出来的阳性细胞分别命名为Eca109/PinX1、Eca109/pCDNA3.1细胞。应用激光共聚焦方法测定转染效率,MTS方法检测过表达PinX1对Eca109/ PinX1、Eca109/pCDNA3.1、Eca109细胞生长抑制作用。FCM方法检测细胞生长周期和细胞凋亡。RT-PCR、FCM、Western-blot方法检测Eca109/PinX1、Eca109/pCDNA3.1、Eca109细胞中PinX1基因及蛋白的表达,TRAP-ELISA和TRAP-银染法检测端粒酶活性在细胞中表达。结果:1端粒DNA长度及端粒酶hTERT在食管癌高发区人群中的表达及生物学意义FCM检测端粒长度结果显示,端粒DNA长度在食管癌组织中表达量与正常食管组织相比明显缩短,在食管正常组织、异型增生组织、癌组织的表达量呈现逐渐降低趋势（P<0.01）;端粒DNA长度在食管轻度增生、重度增生之间呈逐渐降低趋势,重度增生组与轻度增生组相比明显缩短（P<0.01）,轻度增生组与正常组比较无显着性差异（P>0.05）。随着细胞学分级增高,端粒DNA长度Q-FISH值逐渐降低,端粒DNA长度与细胞学分级呈负相关（r=-0.79, P <0.01）。FCM检测端粒酶hTERT基因蛋白含量,在癌、重度增生、轻度增生和正常食管的FI值分别为1.84±0.21、1.39±0.24、1.13±0.19和0.87±0.18,癌组hTERT含量高于重度增生组（P <0.01）、重度增生组高于轻度增生组（P<0.01）,轻度增生组与正常组相比无显着性差别。随着细胞学分级增高, hTERT的FI值随之升高, hTERT蛋白含量与细胞学分级呈正相关关系（r=0.83, P<0.01）。根据FI值>1.0为阳性表达的判断标准,轻度增生组、重度增生组和癌组hTERT蛋白阳性表达率分别为68.18%、92.86%和95.45%,重度增生组和癌组的表达率都高于轻度增生组（P<0.01）。FCM检测正常组、轻度增生组、重度增生组和癌组细胞DNA含量,DI值分别为1.03±0.34、1.06±0.28、1.17±0.25和1.54±0.37,正常组、轻度增生组和重度增生组的DI值呈上升趋势（P>0.05）,癌组的DI值明显高于重度增生组。DI值与细胞学分级正相关（r=0.62, P<0.01）;正常组、轻度增生组、重度增生组和癌组DNA异倍体率分别为11.11（4/36）、9.09（2/22）、28.57（8/28）和81.82（36/44）,癌组异倍体率高于重度增生组（P<0.01）,重度增生组高于轻度增生组（P<0.05）;从正常组到癌组PI值分别为10.98±4.11、14.15±4.76、18.97±5.27和28.79±5.47,随着细胞学分级的升高,PI值增大,癌组显着高于重度增生组（P<0.01）,重度增生组高于轻度增生组（P<0.05）。PI值与细胞学分级正相关（r=0.64, P<0.01）。130例食管样本的DI值与PI值高度正相关（r=0.76, P<0.01）;端粒长度Q-FISH值与端粒酶hTERT蛋白FI值负相关（r=-7.49, P<0.01）;端粒Q-FISH值与DI值负相关（r=-0.41, P<0.01）。IHC结果显示:端粒酶hTERT蛋白阳性颗粒呈棕黄色,阳性物质全部位于上皮细胞和癌细胞的核内。在异型增生组织,端粒酶hTERT蛋白的阳性表达部位主要集中在基底细胞层及其上方的细胞核内,随着食管黏膜上皮增生程度的加重,hTERT阳性细胞逐渐增多,阳性细胞带上移。正常食管粘膜组织中阳性表达率为11.1%（4/36）,异型增生组织和癌组织hTERT蛋白阳性表达率分别为44.0%（22/50）和86.37%（38/44）。三者阳性率比较,癌组织显着高于异型增生组织（P<0.01）,异型增生组织高于正常上皮组织（P<0.01）。2食管癌中的端粒酶活性和PinX1的表达及其生物学意义端粒酶活性检查结果显示,在食管癌、异型增生和正常食管组织中,阳性表达率分别为84.0%、62.0%及6.0%,食管癌及异型增生组织与正常食管粘膜比较具有显着统计学差异（P<0.05）。端粒酶活性的平均A值分别为食管癌组织1.457±0.838、食管异型增生组织0.429±0.346和正常食管粘膜组织0.073±0.039。三组间两两比较端粒酶活性的平均A值均存在高度显着统计学差异（P<0.05）。按正常食管粘膜组织、食管异型增生组织和食管鳞癌组织的序列,端粒酶阳性表达率和平均A值依次明显增高。食管癌组织中端粒酶阳性表达率与组织学分级和淋巴结转移无关,而端粒酶活性的平均A值与组织学分级和淋巴结转移有关;食管癌组织中端粒酶阳性表达率及端粒酶活性的平均A值与其他临床病例因素如年龄、性别和浸润深度等无关。RT-PCR及FCM检测PinX1结果显示,PinX1 mRNA及蛋白在食管癌组织中表达均显着低于食管正常粘膜（P <0.01）,在食管正常粘膜、异型增生、癌组织之间呈现逐渐降低趋势（P <0.05）。食管癌组织中,PinX1 mRNA和蛋白与分化程度、浸润深度及有无淋巴结转移密切相关（P <0.05）,与性别和年龄无明显相关（P >0.05）。食管癌组织中端粒酶活性表达与PinX1蛋白表达呈负相关性（rs =-0.883,P=0.000）。3基因转染PinX1对食管癌Eca109细胞增殖和凋亡以及端粒酶活性的影响应用脂质体转染方法,将pCDNA3.1（+）-PinX1重组质粒及空载体pCDNA3.1成功转染入Eca109细胞中,并应用G418成功筛选出稳定转染细胞,转染pCDNA3.1- PinX1重组质粒与空载体pCDNA3.1的阳性克隆细胞分别记为Eca109/ PinX1、Eca109/pCDNA3.1细胞。MTS法测定增殖情况结果显示,转染PinX1基因后,Eca109细胞生长明显减慢（P<0.05）;而Eca109细胞与仅转染入空载体的Eca109细胞生长比较,两者无明显差异（P>0.05）。FCM测定细胞生长周期实验结果显示,转染PinX1基因的Eca109细胞的G0/G1期细胞数（%）为70.58±5.26,明显高于未转染或仅转染空载体的食管癌Eca109细胞的G0/G1期细胞数（%）（分别为53.14±4.83及47.27±3.73）（P<0.05）。说明转染PinX1基因后,细胞的增殖明显变慢,细胞生长阻滞于G0/G1期（Fig. 3-9）。FCM测定细胞凋亡实验结果显示,流式细胞仪检测细胞凋亡表明:转染PinX1基因的Eca109细胞的凋亡率（%）为23.28±5.73,明显高于未转染或仅转染空载体的食管癌Eca109细胞的凋亡率（%）（分别为0.27±0.18及3.40±1.09）（P<0.05）。说明转染入PinX1基因后,细胞发生早期凋亡改变。RT-PCR、Western-blot和FCM检测结果显示,Eca109/ PinX1细胞中PinX1 mRNA和蛋白表达水平较Eca109/pCDNA3.1、Eca109细胞显着升高（P <0.05）。细胞端粒酶活性的检测结果显示,转染PinX1基因后,细胞端粒酶活性明显降低（P<0.05）。转染前后Eca109中端粒酶活性表达与细胞增殖指数（PI）表达呈正相关性（rs=0.451,P=0.000）。结论:1端粒DNA长度在食管癌前细胞及癌细胞中明显缩短,并且随病变程度加重而递减。端粒酶hTERT、细胞内DNA含量和PI值在食管上皮癌变发生中明显递增,提示食管癌变与三者密切相关。端粒DNA长度、端粒酶hTERT在食管癌前病变早期即出现变化,可以做为监测食管癌发生发展的参考指标。端粒酶hTERT与食管癌的临床病理特征无关,不能做为食管癌病人预后的指标。端粒缩短、端粒酶hTERT高表达都与食管癌变密切相关,有望以上述二者为靶点指导抗肿瘤的基因治疗。2食管癌及异型增生组织中存在端粒酶活性表达,并存在量的差异。端粒酶活性在异型增生即呈现高表达,随着病变的加重,端粒酶活性依次显着增高,提示端粒酶参与了食管癌的发生与发展,端粒酶的激活是食管癌的早期事件。端粒酶可望成为食管癌的病情监测及早期诊断的生物学指标。端粒酶活性A值与食管癌的组织学分级和淋结转移有关,提示食管癌端粒酶活性A值可作为判断疗效和评价预后的指标。PinX1在食管癌组织中表达显着低于食管正常组织,在食管正常组织、异型增生组织、癌组织之间呈现逐渐降低趋势。PinX1在食管癌中表达和病理分级呈负相关,分级越高,PinX1表达越低。浸润深度达到纤维膜者、有淋巴结转移者的PinX1表达要低于浸润深度未达到纤维膜者、无淋巴结转移者。认为PinX1是一种潜在的食管癌相关基因,检测PinX1的表达水平可能对评价食管癌恶性程度、转移潜能和预后评估有重要的临床价值。食管癌组织中端粒酶活性与PinX1表达呈显着负相关性,证实PinX1抑制端粒酶活性。3首次应用脂质体转染方法建立食管癌细胞株Eca109/PinX1,目前国内外文献尚未见相关报道。Eca109细胞转染PinX1基因后,细胞的增殖明显变慢,细胞生长阻滞于G0/G1期,细胞发生早期凋亡改变。Eca109细胞转染PinX1基因后,端粒酶活性明显降低,并且端粒活性与细胞增殖指数呈显着正相关,考虑在食管癌细胞中PinX1基因通过降低端粒的活性,减弱细胞的增殖,有望成为食管癌治疗的分子靶点。
葛莲英[10]（2010）在《端粒酶与大肠癌相关性及RNAi沉默hTERT基因治疗大肠癌的研究》文中进行了进一步梳理在我国,消化道恶性肿瘤中大肠癌发病占有很高的比率。目前以手术治疗为主的综合治疗仍存在局限性,疗效不尽人意。因此,能否找到一个有效的分子治疗靶点,是丰富大肠癌治疗方法和最终应用于临床提高综合疗效的关键。有研究表明,大肠癌标本中端粒酶活性表达高达85%以上,而正常组织表达仅5%左右。端粒酶全酶由端粒酶RNA （hTR）、端粒酶相关蛋白（TPI）和端粒酶催化亚基（hTERT）三部分组成。hTR和TPI在正常组织和肿瘤组织均有表达,与端粒酶活性无相关性。而hTERT与端粒酶的活性相一致,hTERT基因是合成端粒酶全酶的限速因素,与肿瘤的关系尤为密切,因此将端粒酶作为肿瘤分子靶点的研究是极有意义的研究领域。本研究从本院临床收集30例大肠癌组织、癌旁组织及正常大肠组织,通过对端粒酶活性的检测,探讨端粒酶与大肠癌的相关性,并进一步验证端粒酶催化亚基（hTERT）的表达是否与端粒酶活性一致。同时回顾性分析本院178例大肠癌患者病理标本中hTERT表达水平和临床病理学参数之间的相关性；通过临床随访资料分析,阐明影响大肠癌患者生存预后的风险因素,明确hTERT能否作为判断大肠癌预后的标志物及作为大肠癌治疗的分子靶点。通过RNAi沉默技术,观察hTERT沉默对大肠癌细胞生长增殖和凋亡的影响,最终阐明hTERT基因RNAi沉默技术对大肠癌靶向治疗的可行性。本研究将从细胞、分子和整体水平上,为开展大肠癌hTERT基因靶向治疗提供实验和临床依据。第一部分端粒酶与大肠癌相关性研究第一章端粒酶活性与大肠癌相关性研究目的探讨端粒酶与大肠癌相关性,进一步验证端粒酶催化亚基（hTERT）的表达是否与端粒酶活性一致。方法运用PCR-TRAP-ELISA及免疫组织化学方法对大肠癌组织及其癌旁组织、大肠正常组织各30例检测端粒酶活性、hTERT的表达水平,并研究端粒酶与临床病理学特征之间的关系。结果（1）端粒酶阳性检出率在大肠癌组织、癌旁组织、大肠正常组织分别为83.33%13.33%3.33%,癌组织中检出率明显高于其他组织（P<0.05）。（2）大肠癌组织端粒酶活性随组织分化程度变低而升高,低分化大肠癌组织中的端粒酶阳性表达率高于中分化及高分化大肠癌（P<0.05）。（3）通过用免疫组化检测hTERT的表达与PCR-TRAP-ELISA法检测得端粒酶活性相比较,显示端粒酶活性与hTERT表达具有一致性,两法检测无显着差异。结论（1）大肠癌组织端粒酶阳性率明显高于癌旁组织及正常大肠组织,大肠癌组织中hTERT表达高于癌旁组织及正常组织。（2） hTERT的表达与端粒酶活性一致。第二章端粒酶催化亚基与大肠癌预后因素分析目的通过对178例大肠癌患者的临床资料回顾性分析,阐明hTERT表达水平与大肠癌临床病理特征及预后的关系,为大肠癌患者的预后评估提供一定的理论指导。方法选取有完整临床资料的178例大肠癌石蜡包埋组织标本及60例癌旁组织标本作为实验组,30例大肠正常组织石蜡包埋标本作为对照组。采用免疫组化的方法检测大肠癌组织中hTERT蛋白表达水平。查阅病例获得相关临床参数资料及随访资料,分析hTERT表达水平与大肠癌进展及临床预后的关系。结果（1） hTERT蛋白在大肠癌组、癌旁组与大肠正常组中阳性率分别为94.4%、6.67%、3.33%,其差异有统计学意义（P<0.001）;（2） hTERT在大肠癌组织中的表达与性别、年龄、淋巴结转移、肿瘤直径无关（P>0.05）,与肿瘤分化程度、浸润深度、Dukes分期、临床分期及远处转移有关（P<0.05）。（3）经多因素Cox模型分析,不同浸润深度、远处转移、淋巴结转移、hTERT表达4项指标是影响大肠癌患者术后预后的独立危险因子；hTERT表达水平与患者术后无瘤生存时间呈负相关。结论hTERT在大肠癌组织中呈高表达。经多因素Cox分析,大肠癌浸润深度、远处转移、淋巴转移、hTERT表达与大肠癌患者预后存在显着性相关,是影响预后的危险因子。大肠癌组织中hTERT高表达者预后相对较差,低表达者预后相对较好。第二部分RNAi沉默hTERT基因治疗大肠癌的实验研究第一章hTERT基因shRNA真核表达载体的构建目的构建人端粒酶催化亚基（hTERT）基因shRNA真核表达载体质粒,为大肠癌RNAi介导的基因治疗打下基础。方法化学合成3条hTERT基因siRNA,通过脂质体转染大肠癌细胞SW480,48h后采用RT-PCR方法筛选出一条对hTERT mRNA有明显沉默作用的siRNA。将筛选出的siRNA设计并合成shRNA寡核苷酸片段,退火形成双链后,插入到pGPU6/GFP/Neo真核表达载体中,并进行酶切和测序鉴定。结果酶切和DNA测序证实构建的ShRNA已插入载体中。结论成功构建的hTERT基因shRNA真核表达载体pGPU6/GFP/Neo-hTERT shRNA,为进一步开展hTERT基因在人大肠癌细胞中的作用机制及体内外RNAi实验研究奠定了基础。第二章RNAi沉默hTERT基因对大肠癌SW480细胞生物学特性的影响目的观察hTERT基因对SW480细胞生物学特性的影响。方法将重组质粒pGPU6/GFP/Neo-hTERT shRNA （hTERT-shRNA）用脂质体转染法导入SW480大肠癌细胞,含无效序列的pGPU6/GFP/Neo-NC shRNA （NC-shRNA）作为阴性对照,单纯SW480细胞作为空白对照,等量转染试剂脂质体作为脂质体对照组,分别于转染后24h、48h、72h,在荧光显微镜下观察重组质粒转染效率和细胞形态学变化。采用MTT法检测各组细胞的生长增殖情况,RT-PCR法检测不同转染时间细胞hTERT mRNA的表达水平,免疫细胞化学法检测hTERT特异性蛋白表达；PCR-TRAP-ELISA法检测转染后48小时端粒酶活性；流式细胞仪检测转染后细胞周期分布,TUNEL法和透射电镜观察转染后细胞凋亡变化及线粒体膜电位（MMP）的改变检测。结果（1） hTERT-shRNA质粒转染24h、48h及72h比较,转染48h其转染效率明显高于24h和72h的转染效率,质粒与脂质体比例为1：2.5时,其转染效率显着高于其它各组,转染率达59%。（2）MTT检测结果显示：hTERT-shRNA质粒转染组对SW480细胞的生长增殖有明显抑制作用,于转染后第2d达到峰值,增殖率减少达28.22%,与对照组比较差异有统计学意义（P<0.05）。（3）半定量RT-PCR结果显示,转染48小时的hTERT-shRNA组的hTERT mRNA表达量明显低于转染24h和72h组的表达量。转染48小时的hTERT-shRNA组和空白对照组、脂质体对照组、NC-shRNA组比较,其抑制率分别是39.20%,33.28%,27.95%。（4）免疫细胞化学结果示：hTERT-shRNA组染色阳性细胞明显少于对照组。经病理图像分析软件进行灰度测量后比较发现,转染48h的hTERT-shRNA组较空白对照组灰度值下降约30.2%,同时和脂质体对照组和NC-shRNA组相比,差异均有明显统计学意义（P<0.01）。（5）PCR-TRAP-ELISA端粒酶活性检测显示：较空白对照组相比,hTERT-shRNA转染组细胞端粒酶活性下降了18.7%,与较其它三组之间差别均有显着性意义（P<0.05）。（6）流式细胞术检测：与对照组比较,hTERT-shRNA组G0/G1期细胞显着增加。与NC-shRNA组比较,hTERT-shRNA组增殖指数（PI）下降14.2%,差别有显着学意义（P<0.05）。（7） TUNEL法检测：hTERT-shRNA组凋亡细胞数显着多于对照组,因而其凋亡指数较其它组也明显增高,hTERT-shRNA组较空白对照组AI增高20%。（8）转染48h后透射电镜观察：可见凋亡细胞体积明显缩小,表面突起和微绒毛减少,甚至消失,染色质不均匀地地沿核膜下聚集。部分可见细胞核新月体,空泡形成增多。（9）与空白对照组相比,转染48h后线粒体跨膜电位（MMP）显示：hTERT-shRNA组线粒体Rhodamine123荧光强度明显增强（增加约24.2%）,MMP显着下降,与对照组比较,差异有统计学意义（P<0.01）。结论RNAi沉默hTERT基因能有效抑抑制SW480肿瘤细胞生长和增殖,并降低端粒酶活性,诱导肿瘤细胞凋亡。第三章RNAi沉默hTERT基因治疗大肠癌移植瘤的动物实验研究目的探讨重组pGPU6/GFP/Neo-hTERT shRNA质粒对SW480细胞裸鼠移植瘤的生长抑制作用。方法（1）经皮下接种SW480细胞株（1×107个细胞/只）建立裸鼠人大肠癌细胞移植瘤模型。（2）24只裸鼠随机地分为3组,每组8只。以瘤内接种pGPU6/GFP/Neo-hTERT shRNA简称hTERT-shRNA)质粒组为实验组,以瘤内注射pGPU6/GFP/Neo-NC shRNANC （简称NC-shRNA）作为阴性对照,以瘤内注射生理盐水作为空白对照组。（3）观察各组裸鼠皮下肿瘤生长情况,绘制肿瘤生长曲线,计算肿瘤抑制率。（4）治疗结束后取标本进行病理学检查、hTERT mRNA及hTERT蛋白表达分析,端粒酶活性及组织凋亡检测。结果（1）所有裸鼠均于7天后可见皮下肿瘤形成。（2） hTERT-shRNA组裸鼠肿瘤生长较慢,生理盐水对照组和NC-shRNA阴性对照组裸鼠肿瘤仍较快增大。（3）hTERT-shRNA组肿瘤组织切片HE染色,部分肿瘤可见大片坏死区,细胞结构消失。生理盐水组和NC-shRNA组肿瘤生长良好,细胞形态不规则,可见病理性核分裂相。（4）半定量RT-PCR检测hTERT mRNA水平,发现hTERT-shRNA组较生理盐水对照组和NC-shRNA阴性对照组分别下降52.1%和48.3%,差异具有显着性意义（P<0.01）。（5）免疫组化结果表明：hTERT-shRNA组肿瘤组织中hTERT阳性细胞明显减少,蛋白表达下调。hTERT蛋白平均灰度较生理盐水组和NC-shRNA组分别降低19.9%和14%。（6）端粒酶活性检测表明,pGPU6/GFP/Neo-hTERT组较生理盐水组和NC-shRNA组端粒酶活性明显降低,差异有统计学意义（P<0.05或P<0.01）。端粒酶活性抑制率分别为48.5%和53.0%。（7）TUNEL法检测发现,hTERT-shRNA组肿瘤细胞凋亡明显多于对照组,AI（凋亡指数）较生理盐水组和NC-shRNA组增加29.4%,31.1%,差异有统计学意义（P<0.01）。结论hTERT基因的shRNA瘤内注射能延缓大肠癌细胞SW480裸鼠皮下移植瘤的生长,其机理可能是通过抑制hTERT mRNA和蛋白的表达、抑制端粒酶的活性、促进肿瘤细胞凋亡而发挥作用。
二、胃癌、大肠癌与端粒酶活性及DNA倍体的关系（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、胃癌、大肠癌与端粒酶活性及DNA倍体的关系（论文提纲范文）
（1）华蟾素注射液治疗结肠癌腹水的优效人群分析及对VM的作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一部分 文献综述 |
| 综述一 恶性腹水的中西医研究进展 |
| 1. 恶性腹水的西医研究进展 |
| 1.1 恶性腹水的形成机制 |
| 1.2 恶性腹水的西医诊断 |
| 1.3 恶性腹水的西医治疗 |
| 2. 恶性腹水的中医研究进展 |
| 2.1 恶性腹水的中医病因病机 |
| 2.2 恶性腹水的中医辨证 |
| 2.3 恶性腹水的中医治疗 |
| 3. 结语 |
| 参考文献 |
| 综述二 血管生成拟态(VM)在结肠癌中的研究进展 |
| 1. 结肠癌VM的发现及生物学特性 |
| 2. VM的形成机制 |
| 2.1 肿瘤缺氧微环境与VM |
| 2.2 肿瘤干细胞与VM |
| 2.3 上皮间质转化与VM |
| 2.4 促血管生成相关因子与VM |
| 2.5 VM形成相关信号通路 |
| 3. VM与结肠癌不良预后的相关性 |
| 4. VM与结肠癌的治疗 |
| 5. 结语 |
| 参考文献 |
| 综述三 华蟾素注射液干预肿瘤血管生成作用的研究进展 |
| 1. 肿瘤血管生成的病理机制 |
| 2. 华蟾素注射液的主要化学成分及其抗肿瘤作用 |
| 3. 华蟾素注射液干预肿瘤血管生成的机制 |
| 3.1 VEGF/VEGFR通路抑制作用 |
| 3.2 MMPs/TIMPs通路抑制作用 |
| 3.3 肿瘤血管内皮细胞诱导凋亡作用 |
| 3.4 其他潜在靶点 |
| 4. 结语 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 第二部分 临床研究 华蟾素注射液腹腔灌注治疗结肠癌恶性腹水的疗效评价及优效人群分析 |
| 1. 资料与方法 |
| 1.1 研究方法 |
| 1.2 研究对象 |
| 1.3 病例筛选方法 |
| 1.4 治疗方法 |
| 1.5 提取指标 |
| 1.6 疗效评价 |
| 1.7 安全性评价 |
| 1.8 统计方法 |
| 1.9 技术路线图 |
| 2. 研究结果 |
| 2.1 总体资料分析 |
| 2.2 疗效评价 |
| 2.3 安全性评价 |
| 2.4 优效人群特征筛选 |
| 3. 讨论 |
| 3.1 结肠癌恶性腹水的治疗现状 |
| 3.2 优效人群研究的必要性 |
| 3.3 华蟾素注射液治疗结肠癌恶性腹水的潜在机制 |
| 参考文献 |
| 第三部分 实验研究 基于血管生成拟态(VM)研究华蟾素注射液抑制结肠癌血性腹水的机制 |
| 实验一: 华蟾素注射液抑制裸鼠结肠癌血性腹水生成的研究 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 讨论 |
| 实验二: 华蟾素注射液体外抑制结肠癌细胞增殖、迁移、侵袭的研究 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 讨论 |
| 实验三: 华蟾素注射液体内、体外抑制结肠癌细胞VM形成的研究 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 讨论 |
| 实验四: 华蟾素注射液抑制结肠癌VM形成的机制研究 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 讨论 |
| 参考文献 |
| 结语 |
| 1. 研究结论 |
| 2. 研究创新性 |
| 3. 不足与展望 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（2）苦豆碱通过调节miR-296-5p/STAT3轴抑制结直肠癌细胞的增殖和转移及其机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一章 文献研究 |
| 祖国医学部分 |
| 1. 祖国医学对肿瘤的认识(历史沿革) |
| 2. 祖国医学对结直肠癌的认识 |
| 2.1 祖国医学对结直肠癌疾病的认识 |
| 2.2 祖国医学对结直肠癌病因病机的认识 |
| 2.3 祖国医学对结直肠癌证型的认识 |
| 2.4 祖国医学对结直肠癌辨病、辩证治疗的认识 |
| 2.5 祖国医药抗结直肠肿瘤的优势 |
| 2.6 中药治疗结直肠癌的研究进展 |
| 3. 中药苦豆子及其成分苦豆碱的研究进展 |
| 3.1 中药苦豆子的研究进展 |
| 3.2 苦豆碱的药理学作用及其机制研究进展 |
| 现代医学部分 |
| 1 现代医学对结直肠癌病因及机制的研究 |
| 1.1 结直肠癌分子标志物 |
| 1.2 结直肠癌相关信号通路 |
| 2 microRNAs与结直肠癌的研究进展 |
| 2.1 microRNAs与结直肠癌相关机制研究 |
| 2.2 microRNAs在结直肠癌临床应用 |
| 3 结直肠癌EMT的研究进展 |
| 第二章 实验研究 |
| 第一部分 ALO抑制结直肠癌细胞增殖 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 实验细胞株 |
| 1.2 实验主要试剂和耗材 |
| 1.3 实验主要仪器设备 |
| 1.4 实验常用试剂配制 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 细胞株的培养 |
| 2.2 ALO处理结直肠癌细胞 |
| 2.3 MTT实验 |
| 2.4 统计学方法 |
| 3. 结果 |
| 3.1 不同浓度ALO对不同结直肠癌细胞增殖的抑制作用 |
| 3.2 ALO对不同结直肠癌细胞的IC50 |
| 4. 总结 |
| 第二部分 ALO对miR-296-5p在结直肠癌细胞中表达的影响 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 实验细胞株 |
| 1.2 实验主要试剂和耗材 |
| 1.3 实验主要仪器设备 |
| 1.4 实验常用试剂配制 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 细胞培养 |
| 2.2 利用生物信息网站StarBasev3.0分析miR-296-5p的表达 |
| 2.3 qRT-PCR检测miR-296-5p在不同人结直肠癌细胞及人肠上皮细胞中的表达 |
| 2.4 qRT-PCR检测ALO处理后SW480和HCT116细胞miR-296-5p的表达 |
| 2.5 统计学方法 |
| 3. 结果 |
| 3.1 StarBasev3.0分析miR-296-5p的表达 |
| 3.2 qRT-PCR检测miR-296-5p在不同人结直肠癌细胞及人肠上皮细胞中的表达 |
| 3.3 qRT-PCR检测ALO处理后SW480和HCT116细胞miR-296-5p的表达 |
| 4. 总结 |
| 第三部分 STAT3和miR-296-5p存在结合位点 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 实验细胞株 |
| 1.2 实验主要试剂和耗材 |
| 1.3 实验主要仪器设备 |
| 1.4 实验常用试剂配制 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 结直肠癌细胞(SW480、HCT116)的培养 |
| 2.2 TargetScan V7.2靶基因预测 |
| 2.3 野生型(WT)和突变型(MUT)-STAT3 3'UTR片段设计和合成 |
| 2.4 质粒的建立、提取及鉴定 |
| 2.5 细胞转染 |
| 2.6 双荧光素酶报告基因分析 |
| 2.7 统计学方法 |
| 3. 结果 |
| 3.1 生物信息学网站TargetScan V7.2显示STAT3是miR-296-5p的靶基因 |
| 3.2 miR-296-5p mimics能够抑制STAT3-荧光素酶活性 |
| 3.3 miR-296-5p inhibitor增强STAT3-荧光素酶活性 |
| 4. 总结 |
| 第四部分 ALO和miR-296-5p对结直肠癌细胞STAT3表达的影响 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 实验细胞株 |
| 1.2 实验主要试剂和耗材 |
| 1.3 实验主要仪器设备 |
| 1.4 实验常用试剂配制 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 结直肠癌细胞(SW480、HCT116)的培养 |
| 2.2 细胞转染 |
| 2.3 ALO处理结直肠癌细胞 |
| 2.4 qRT-PCR实验 |
| 2.5 Western blot实验 |
| 2.6 统计学方法 |
| 3. 结果 |
| 3.1 qRT-PCR检测miR-296-5p mimics、STAT3过表达、ALO等不同处理后HCT116细胞中miR-296-5p的表达 |
| 3.2 qRT-PCR检测miR-296-5p inhibitor、siSTAT3、ALO等处理后SW480细胞中miR-296-5p的表达 |
| 3.3 Western blot检测miR-296-5p mimics、STAT3过表达、ALO等处理后HCT116细胞中STAT3的表达 |
| 3.4 Western blot检测miR-296-5p inhibitor、siSTAT3、ALO等不同处理后SW480细胞STAT3的表达 |
| 4. 总结 |
| 第五部分 ALO通过调节miR-296-5p/STAT3通路调控结直肠癌细胞增殖和凋亡 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 实验细胞株 |
| 1.2 实验主要试剂和耗材 |
| 1.3 实验主要仪器设备 |
| 1.4 实验常用试剂配制 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 结直肠癌细胞(SW480、HCT116)的培养 |
| 2.2 细胞转染 |
| 2.3 细胞克隆形成实验(Clone formation assay) |
| 2.4 细胞凋亡检测(Cell apoptosis detection) |
| 2.5 Western-blot检测细胞凋亡相关蛋白 |
| 2.6 统计学方法 |
| 3. 结果 |
| 3.1 克隆形成实验验证ALO通过调节miR-296-5p/STAT3通路调控HCT116细胞增殖 |
| 3.2 克隆形成实验验证ALO通过调节miR-296-5p/STAT3通路调控SW480细胞增殖 |
| 3.3 细胞凋亡实验验证ALO通过调节miR-296-5p/STAT3通路调控HCT116细胞凋亡 |
| 3.4 细胞凋亡实验验证ALO通过调节miR-296-5p/STAT3通路调控SW480细胞增殖 |
| 3.5 HCT116细胞凋亡相关蛋白的检测 |
| 3.6 SW480细胞凋亡相关蛋白的检测 |
| 4. 总结 |
| 第六部分 ALO通过调节miR-296-5p/STAT3通路调控结直肠癌细胞迁移和侵袭 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 实验细胞株 |
| 1.2 实验主要试剂和耗材 |
| 1.3 实验主要仪器设备 |
| 1.4 实验常用试剂配制 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 结直肠癌细胞(SW480、HCT116)的培养 |
| 2.2 细胞转染 |
| 2.3 划痕愈合实验 |
| 2.4 Transwell细胞侵袭实验 |
| 3. 结果 |
| 3.1 划痕愈合实验验证ALO通过调节miR-296-5p/STAT3通路调控HCT116细胞迁移 |
| 3.2 划痕愈合实验验证ALO通过调节miR-296-5p/STAT3通路调控SW480细胞迁移 |
| 3.3 Transwell细胞侵袭实验验证ALO通过调节miR-296-5p/STAT3通路调控HCT116细胞侵袭 |
| 3.4 Transwell细胞侵袭实验验证ALO通过调节miR-296-5p/STAT3通路调控SW480细胞侵袭 |
| 4. 总结 |
| 第七部分 ALO通过调节miR-296-5p/STAT3通路调控EMT相关蛋白的表达 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 实验细胞株 |
| 1.2 实验主要试剂和耗材 |
| 1.3 实验主要仪器设备 |
| 1.4 实验常用试剂配制 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 结直肠癌细胞(SW480、 HCT116)的培养 |
| 2.2 细胞转染 |
| 2.3 Western blot实验 |
| 3. 结果 |
| 3.1 Western blot检测HCT116细胞EMT相关蛋白N-cadherin(N-cad)和E-cadherin(E-cad)的表达 |
| 3.2 Western blot检测SW480细胞EMT相关蛋白N-cadherin (N-cad)和E-cadherin (E-cad)的表达 |
| 4. 总结 |
| 第三章 讨论 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（3）TGF-β1诱导肠上皮表型转变相关表观遗传机制及中药单体干预（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 引言 |
| 第一部分 文献研究 |
| 第一章 肿瘤微环境内的TGF-β在肿瘤发生发展中的研究进展 |
| 第二章 组蛋白修饰在肿瘤发生中的研究进展 |
| 第三章 吴茱萸碱和小檗碱抗肿瘤活性机制研究进展 |
| 第二部分 实验研究 |
| 前言 |
| 第一章 大肠上皮细胞表型转变体外模型的构建 |
| 第一节 NCM460细胞系的基本生物学特性 |
| 第二节 TGF-β1体外诱导NCM460细胞构建表型转变模型 |
| 第二章 TGF-β1诱导的NCM460细胞模型中染色体不稳定性的检测 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 第三章 TGF-β1诱导的NCM460细胞模型中组蛋白修饰模式的变化 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 讨论 |
| 第四章 中药单体吴茱萸碱和小檗碱对TGF-β1诱导NCM460细胞表型转变的干预效应 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 讨论 |
| 第五章 中药单体吴茱萸碱和小檗碱对TGF-β1诱导的NCM460细胞模型中染色体不稳定性的干预效应 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 讨论 |
| 第六章 中药单体吴茱萸碱和小檗碱对TGF-β1诱导的NCM460细胞模型中组蛋白修饰模式变化的干预效应 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 讨论 |
| 总结与展望 |
| 研究结论 |
| 本研究创新之处 |
| 本研究不足及改进之处 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 详细摘要 |
（4）Shelterin复合体与消化系恶性肿瘤（论文提纲范文）
| 0 引言 |
| 1 Shelterin复合体的结构和功能 |
| 2 Shelterin复合体与消化系恶性肿瘤 |
| 2.1 胃癌 |
| 2.2 大肠癌与肝癌 |
| 2.3 食管癌与胰腺癌 |
| 3 结论 |
（5）塞来昔布及丁酸盐对大肠腺瘤和大肠癌细胞作用的实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 致谢 |
（7）RNAi靶向人端粒酶逆转录酶基因治疗大肠癌的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 主要英文缩写索引 |
| 前言 |
| 第一部分 shRNA真核表达载体构建及其对大肠癌SW480细胞凋亡的影响 |
| 1.材料与方法 |
| 2.结果 |
| 3.讨论 |
| 4.小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 RNAi沉默hTERT基因对人大肠癌SW480细胞荷瘤裸鼠的治疗作用 |
| 1.材料与方法 |
| 2.结果 |
| 3.讨论 |
| 4.小结 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士研究生学位期间发表的论文 |
| 致谢 |
（8）Bmi-1和hTERT在胃癌中的表达及相关性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一章 材料和方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 主要试剂和主要仪器 |
| 1.3 研究方法 |
| 1.4 结果判定 |
| 1.5 统计学处理 |
| 第二章 结果 |
| 2.1 Bmi-1和hTERT蛋白在胃癌、癌旁及远癌组织中的表达 |
| 2.2 Bmi-1和hTERT蛋白在胃癌组织中的表达与临床病理参数的关系 |
| 2.3 胃癌组织中Bmi-1和hTERT蛋白表达的相关性 |
| 第三章 讨论 |
| 3.1 Bmi-1与胃癌临床病理因素的关系 |
| 3.2 hTERT与胃癌临床病理因素的关系 |
| 3.3 胃癌组织中Bmi-1和hTERT蛋白的关系 |
| 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 致谢 |
（9）端粒酶和PinX1基因在食管癌中的表达及生物学意义（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩写 |
| 引言 |
| 第一部分 端粒DNA 长度及端粒酶hTERT 在食管癌高发区人群中的表达及生物学意义 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 食管癌中的端粒酶活性和PinX1 的表达及其生物学意义 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 基因转染PinX1 对食管癌Eca109 细胞增殖和凋亡以及端粒酶活性的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述 端粒、端粒酶和PinX1 与肿瘤的关系 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（10）端粒酶与大肠癌相关性及RNAi沉默hTERT基因治疗大肠癌的研究（论文提纲范文）
| 主要名词的中英文对照缩略词表 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一部分 端粒酶与大肠癌相关性研究 |
| 前言 |
| 第一章 端粒酶活性与大肠癌相关性研究 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 4. 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第二章 端粒酶催化亚基与大肠癌预后因素分析 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 4. 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 RNAi沉默hTERT基因治疗大肠癌的实验研究 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一章 靶向hTERT基因的RNAi真核表达载体的构建和鉴定 |
| 技术路线 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 结果 |
| 3.讨论 |
| 4.本章小结 |
| 参考文献 |
| 第二章 RNAi沉默hTERT基因对大肠癌SW480细胞生物学特性的影响 |
| 技术路线 |
| 1.材料与方法 |
| 2.结果 |
| 3.讨论 |
| 4.本章小结 |
| 参考文献 |
| 第三章 RNAi沉默hTERT基因治疗大肠癌移植瘤的动物实验研究 |
| 技术路线 |
| 1.材料与方法 |
| 2.结果 |
| 3.讨论 |
| 4.本章小结 |
| 参考文献 |
| 研究的创新性 |
| 攻读博士学位期间发表的论文 |
| 综述 |
| 综述1：大肠癌的治疗研究进展 |
| 参考文献 |
| 综述2：RNA干扰在肿瘤中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
四、胃癌、大肠癌与端粒酶活性及DNA倍体的关系（论文参考文献）
- [1]华蟾素注射液治疗结肠癌腹水的优效人群分析及对VM的作用机制研究[D]. 王一同. 北京中医药大学, 2021(01)
- [2]苦豆碱通过调节miR-296-5p/STAT3轴抑制结直肠癌细胞的增殖和转移及其机制研究[D]. 韩玮. 南京中医药大学, 2021(01)
- [3]TGF-β1诱导肠上皮表型转变相关表观遗传机制及中药单体干预[D]. 黄超. 广州中医药大学, 2017(01)
- [4]Shelterin复合体与消化系恶性肿瘤[J]. 郝思雨,于景翠. 世界华人消化杂志, 2012(32)
- [5]塞来昔布及丁酸盐对大肠腺瘤和大肠癌细胞作用的实验研究[D]. 曹先乾. 大连医科大学, 2012(01)
- [6]中药抑制消化道恶性肿瘤端粒酶活性作用研究进展[J]. 冯建英,邵建国. 上海中医药杂志, 2011(07)
- [7]RNAi靶向人端粒酶逆转录酶基因治疗大肠癌的实验研究[D]. 蔡艳玲. 广西医科大学, 2011(09)
- [8]Bmi-1和hTERT在胃癌中的表达及相关性研究[D]. 房信博. 青岛大学, 2011(06)
- [9]端粒酶和PinX1基因在食管癌中的表达及生物学意义[D]. 王大虎. 河北医科大学, 2011(10)
- [10]端粒酶与大肠癌相关性及RNAi沉默hTERT基因治疗大肠癌的研究[D]. 葛莲英. 广西医科大学, 2010(10)