一、一种新颖的棉铃虫单粒包埋核多角体病毒表达系统（论文文献综述）
邹爽[1]（2014）在《暗黑鳃金龟几丁质酶基因hpChi的克隆、表达及活性分析》文中研究表明几丁质（chitin）是N-乙酰氨基葡萄糖的同聚物,在昆虫生长发育的各个时期,几丁质的含量和分布都需要相应发生变化。几丁质酶（chitinase）属水解酶类,能够将几丁质长链降解为寡聚物。昆虫几丁质酶存在于昆虫的中肠、蜕皮液及某些昆虫的毒腺中,表达水平随昆虫不同生长发育阶段而变化,对昆虫几丁质的代谢起重要调控作用。为了得到鞘翅目特异性几丁质酶基因,本研究免疫筛选已构建的暗黑鳃金龟（Holotrichia parallela Motschulsky）中肠cDNA表达文库,得到暗黑鳃金龟几丁质酶基因,命名为hpChi,并对其特性进行分析。hpChi基因全长1591bp,开放读码框（ORF）1443bp,编码480个氨基酸,预测的分子量大小为51.4kDa,等电点（pI）为5.08。氨基酸序列分析显示其具有3个区域组成的多功能区结构,分别为N-端的酶活性催化区（catalytic domain）,C-端富含半胱氨酸的几丁质结合区（chitin-binding domain, CBD）及富含丝氨酸和苏氨酸的连接区（Linker）。利用PDB网站对HpChi蛋白的结构进行预测,表明HpChi蛋白具有几丁质酶第18家族（Family18）典型的“（β／a）8圆桶型结构”。利用NCBI网站和MEGA软件构建系统发育树,结果显示暗黑鳃金龟几丁质酶HpChi与近缘种的华北大黑鳃金龟亲缘关系最近,其次与直翅目东亚飞蝗（Locusta migratoria manilensis）和鞘翅目赤拟谷盗（Tribolium castaneum）亲缘关系较近,与鞘翅目昆虫黄粉虫（Tenebrio molitor）、墨松天牛（Monochamus alternatus）、辣根猿叶甲（Phaedon cochleariae）统属一大类,与膜翅目和鳞翅目昆虫亲缘关系较远。构建原核重组表达载体pET30a-hpChi,转化大肠杆菌BL21。诱导表达并优化表达条件,经SDS-PAGE电泳和Western Blot分析,成功表达分子量51.4kDa的几丁质酶蛋白,与预测结果相符。将以包涵体形式存在的外源蛋白HpChi超声破碎后,通过Ni+-NTA树脂亲和层析纯化蛋白,并制备多克隆抗体。构建重组酵母表达载体pPICK9K-hpChi,转化缺陷性毕赤酵母GS115,经抗性筛选、表型和分子鉴定表明重组酵母GS115（pPICK9K-hpChi）构建成功。但甲醇诱导表达后,Western Blot检测未能成功表达目的蛋白。构建真核（重组杆状病毒）表达载体pFast-hpChi,转化大肠杆菌DH10Bac,利用其载体自带质粒转座将目的基因插入Bacmid杆状病毒进一步构建得到Bacmid-hpChi。转染昆虫细胞（草地贪夜蛾细胞系sf9）,分别获得P1、P2、P3病毒,取上清进行Western Blot检测,证明HpChi在昆虫细胞sf9中获得成功表达。以几丁质为底物通过DNS比色检测还原糖的原理测定细胞表达的几丁质酶的酶活,结果显示其有几丁质酶的活性并且在微酸环境下活性较强。本研究通过对暗黑鳃会龟幼虫（蛴螬）几丁质酶生物信息学分析和活性测定,为深入了解鞘翅目昆虫几丁质酶生物学功能提供理论依据,也为其生物防治提供参考。
姚润贤[2]（2013）在《含冰核基因重组杆状病毒构建及其应用》文中认为冰核细菌（ice nucleation activity bacteria, INA细菌）可在低温条件下催化过冷却水形成细腻规则冰晶,已在促冻杀虫、病原微生物高敏检测、作物抗寒育种、植物冻害防除、食品冷藏保鲜和冷冻浓缩等多个领域有广泛应用。冰核细菌可显着提高不耐结冰型害虫的过冷却点,增加其冻杀死亡率,但野生冰核细菌、含冰核基因工程菌难以直接防治田间越冬害虫。本文结合昆虫杆状病毒安全性好、对人畜无害；不污染环境、专一性强,对非目标生物很少杀伤；能造成疾病的流行传播,持效性强；害虫不易产生抗药性等优点,从冰核细菌Erwinia ananas110中PCR获得高冰核活性的冰核基因iceA,将其插入苜蓿夜蛾核型多角体病毒（Autographa Califonica mutiple nuclear polyhedrosis virus,AcMNPV）多角体基因（polyhedrin,polh）下游构建重组杆状病毒AcMNPV-ice。结果如下：（1）高冰核活性iceA获得：将从冰核细菌Erwinia ananas110扩增的冰核基因iceA插入pET-23a（+）,构建重组表达载体pET-23a（+）-ice,在大肠杆菌BL21（DE3）pLysS经IPTG诱导表达和SDS-PAGE分析及小液滴冻结法冰核活性测定：冰核蛋白分子量约为180KD,并以包涵体形式存在；重组菌BL21/pET-ice冰核活性与野生冰核细菌Erwinia ananas110在温度-5、-4、-3℃冻滴率均为100%,在-2℃下冻滴率均为0%,经IPTG诱导的BL21在温度-5、-4、-3、-2℃下冻滴率均为0%。表明所扩增冰核基因iceA与野生冰核细菌冰核活性无明显差别,且表现为A型冰核活性。（2）重组杆状病毒Bacmid/polh-ice构建与应用：利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统将iceA基因和polh基因插入转移质粒pFASTBacTM Dual,构建重组转移质粒pFASTBacTMual-polh-ice,转化含穿梭载体（Bacmid）和辅助质粒的DH10Bac感受态细胞,经转座得到重组穿梭载体Bacmid/polh-ice;经PCR检测,iceA和polh插入位置正确。Bacmid/polh-ice经转染sf9细胞,收集重组杆状病毒（命名为AcV/polh-ice）上清,对获得的细胞沉淀进行SDS-PAGE电泳检测表明多角体蛋白条带约29KD,与预测分子量相一致；对注射AcV/polh-ice上清的20头甜菜夜蛾3龄幼虫,4天后虫体全部液化死亡,而作对照的20头未作处理甜菜夜蛾可继续继代繁殖。
侯艳玲[3]（2013）在《水稻条纹病毒NSvc2-N与NSvc2-C蛋白互作的研究》文中提出水稻条纹病毒（Rice stripe virus, RSV）是最重要的水稻病毒之一,可引起水稻条纹叶枯病,给水稻生产造成了严重的损失。该病毒主要由介体灰飞虱（Laodelphax steiatellus）以循回增殖的方式传播,灰飞虱一旦染毒可以持久传毒,并且可经卵传递给下一代幼虫,因此给防治工作带来了困难。RSV隶属于纤细病毒属（Tenuivius）,是该属的典型成员,其基因组由4条单链RNA组成,共编码7种蛋白质。其中NSvc2蛋白由RSV RNA2的反义链编码,分子量为94kDa。因为NSvc2蛋白分子量比较大,翻译后要经历复杂的修饰过程,并且可能具细胞毒性,因此造成了它的研究困难。相对RSV编码的其它蛋白,NSvc2相关的研究工作开展较少。NSvc2蛋白可以在病株和灰飞虱中检测到,暗示NSvc2蛋白可能在介导病毒传播及诱导宿主植物症状的发生中起作用,是一个重要的多功能蛋白。另外,我们前期的研究结果表明NSvc2蛋白在宿主细胞中被切割成两部分（NSvc2-N和NSvc2-C）,这两部分之间可能存在互作。基于前期的研究结果,本文对NSvc2-N和NSvc2-C间的互作展开研究,从而为深入研究NSvc2蛋白的结构、在病毒侵染、致病及传播过程中所起的作用奠定基础,为控制病害的发生提供一定理论依据。本文第一章以综述的形式论述了RSV的研究概况,包括其危害、分类、基因组结构及其编码蛋白的功能。另外,简单介绍了本实验所用到的几种实验技术,如：酵母双杂交、荧光共振能量转移等技术的原理及其优缺点。另外,还介绍了利用杆状病毒AcMNPV作为人类干细胞基因治疗载体的相关内容,对杆状病毒的结构和功能及杆状病毒表达载体系统的相关技术进行了简单介绍。第二章利用酵母双杂交系统来验证NSvc2-N和NSvc2-C蛋白间的互作。构建分别含编码NSvc2-N和NSvc2-C基因片段的酵母双杂交载体,进而验证两者间的互作。结果显示,含NSvc2-N和NSvc2-C基因片段的酵母在含有X-a-gal四缺培养基上出现了明显的蓝斑,表明NSvc2-N和NSvc2-C蛋白间存在互作。第三章利用荧光共振能量转移技术来进一步验证NSvc2-N和NSvc2-C蛋白间的互作。通过原核表达载体成功构建出NSvc2蛋白的N端和C的一些片段,将其导入昆虫Sf9细胞中,利用共聚焦显微镜来观察它们之间的相互作用,发现它们之间发生了FRET,表明存在相互作用。第四章利用杆状病毒AcMNPV载体将绿色荧光蛋白（Green fluorescence protein, GFP）和人生长因子（Human growth factor, HGF）基因转入兔子骨髓间充质干细胞（BMSCs）中表达。PCR扩增eGFP和HGF基因片段,克隆于原核表达载体得到重组质粒pFast-Tet-egfp和pFast-Tet-hgf,利用Bac-to-Bac系统获得Ac-eGFP和Ac-HGF Bacmid DNA,将其转染昆虫Sf9细胞获得重组的杆状病毒vAcrtTA2-Ptight-GFP和vAcrtTA2-Ptight-HGF。第五章对本文进行了总结和分析。综上所述,本论文对RSV NSvc2-N和NSvc2-C蛋白间互作用进行了研究,证明了两者间的互作。通过NSvc2蛋白N端和C端间的互作研究可明确NSvc2的结构,也为进一步研究NSvc2蛋白的功能、阐明病毒的侵染机理和传播机制奠定基础。本文还成功构建了杆状病毒表达载体系统,为基因治疗奠定了基础。
周国梅[4]（2012）在《鸭甲肝病毒1型一个保守的中和性线性B细胞表位的确定》文中认为鸭病毒性肝炎（Duck viral hepatitis）是由鸭甲肝病毒（Duck hepatitis A virus, DHAV）和鸭星状病毒（Duck astrovirus）引起的雏鸭的一种高度致死、传播迅速的病毒性疾病,主要感染1～3周龄雏鸭,死亡率高达90%以上。其中DHAV型鸭肝炎呈世界范围分布,是对养鸭业威胁最大的一种传染病。但是有关DHAV病毒蛋白功能的研究较少。本研究是在已经研制了DHAV-1单克隆抗体的基础上,通过对毒株LY0801的结构蛋白VP1及其分段的基因克隆,表达,免疫活性的检测,对具有病毒中和作用的DHAV-1单克隆抗体4F8所识别的抗原表位进行准确定位,为DHAV-1的诊断、分子流行病学调查、新型表位疫苗的研制提供科学依据。本研究主要包括以下内容：1、5株DHAV-1特异性单克隆抗体识别抗原表位的初步分析本研究通过腹腔注射小白鼠的方法制备了针对5株具有中和性能的DHAV-1的特异性单克隆抗体。以DHAV-1LY0801株的cDNA为模板,通过PCR扩增DHAV-1完整的VP1基因,将其克隆入杆状病毒表达载体中,转染sf9昆虫细胞后,通过IFA确定实验室制备的5株单克隆抗体识别的抗原表位均位于DHAV-1的VP1蛋白上；Western blot试验结果表明：单抗4F8和5G4识别的是线性表位,而单抗1E10、4E6和5E11识别的是构象性表位。2、单克隆抗体4F8识别线性表位的准确定位研究本研究采用交叉重叠法设计引物,构建了13段VP1分段蛋白的pET-32a （+）重组表达质粒,转化到Rosetta菌株中,用IPTG诱导表达融合蛋白,对表达产物SDS-PAGE蛋白质凝胶电泳确定表达后,用单克隆抗体4F8分别进行Western blot分析,根据Western blot（?）（?）果结合引物设计推测4F8识别的抗原表位；构建表达DHAV-1不同长度VP1蛋白的杆粒,转染sf9昆虫细胞后对蛋白进行诱导表达,使用单克隆抗体4F8对转染昆虫细胞进行IFA检测。根据Western blot和IFA检测结果,使用分子生物学软件对单克隆抗体4F8识别的抗原表位序列进行分析,结果表明,4F8识别的抗原表位是DHAV-1中VP1蛋白的74-82位氨基酸,即74SGEIILTIV82通过与NCBI上发表的序列中DHAV各血清型病毒序列的分析发现,该抗原表位在DHAV-1高度保守,而DHAV-2和DHAV-3分离株均在该位点内存在变异。因此单克隆抗体4F8为DHAV-1的特异性单抗,可用于DHAV-1的免疫诊断。
刘小民[5]（2011）在《华北大黑鳃金龟中肠cDNA文库的构建及其围食膜靶标蛋白的分离与鉴定》文中进行了进一步梳理华北大黑鳃金龟（Holotrichia oblita）为鞘翅目鳃金龟科昆虫,是国内外公认的难防治的土栖性害虫。围食膜（peritrophic membrane, PM）是昆虫体内保护其中肠的第一道天然屏障,在昆虫中肠的消化过程及保护昆虫免受微生物和寄生虫侵害等方面发挥着重要作用。昆虫中肠围食膜蛋白的分离鉴定能够为深入研究害虫的生防机制,寻找生物防治新靶标,以及进一步明确围食膜与病原微生物之间相互作用的分子机理等提供前提和基础。本研究在构建华北大黑鳃金龟中肠cDNA表达文库的基础上,对其进行免疫筛选,并对筛选得到的围食膜靶标蛋白进行了分离与鉴定,所得的主要结果如下:1.提取华北大黑鳃金龟幼虫中肠总RNA,分离得到mRNA,利用Uni-ZAP XR载体,成功构建高质量的华北大黑鳃金龟幼虫中肠cDNA表达文库。经鉴定,该cDNA文库滴度为5.18×106pfu/mL,重组率为98.8%,扩增后文库滴度为2.36×109pfu/mL,插入cDNA片段的长度平均为1.85kb。其后,以棉铃虫（Helicoverpa armigera）围食膜蛋白血清为抗体,对该文库进行免疫筛选。经过筛选,共得到阳性克隆254个。其中包括4个全长基因HoCBP2、HoCBP76、HoSCP、HoChi,以及1个基因片段HoIIM。2. HoCBP2基因及HoCBP76基因,编码华北大黑鳃金龟幼虫围食膜几丁质结合蛋白。其中HoCBP2基因全长2226bp,GenBank登录号为JF681185,开放阅读框长1947bp,编码649个氨基酸。HoCBP2蛋白N-端具有19个氨基酸的前导信号序列,预期蛋白分子量70.2kDa,等电点3.52。Blast比对结果显示,其序列与鞘翅目昆虫赤拟谷盗（Tribolium castaneum）围食膜蛋白PMP14（GenBank登录号GU128106）相似性最高,为35%。结构域分析表明HoCBP2蛋白包含8个具有peritrophin-A结构特征的几丁质蛋白结合功能域（CBD, chitin binding domain）。HoCBP76基因全长2019bp,GenBank登录号为JF681186,开放阅读框长1725 bp,编码575个氨基酸。HoCBP76蛋白N-端具有19个氨基酸的前导信号序列,预期蛋白分子量62.3kDa。等电点3.51。Blast比对结果表明,其序列与Tribolium castaneum围食膜蛋白PMP14相似性最高,为34%。结构域分析表明HoCBP76蛋白包含7个CBD。成功构建原核表达载体pET21b-HoCBP2和pET21b-HoCBP76,分别表达了约120 kDa及110 kDa的目的蛋白。利用Bac-to-Bac昆虫杆状病毒表达系统成功构建了重组表达载体Bac-HoCBP2及Bac-HoCBP76,转染BTI-Tn-5B1-4细胞,实现了其在昆虫细胞中的成功表达。Western blot检测表明,重组后的HoCBP2和HoCBP76蛋白表达的蛋白分子量约为120kDa和110kDa。几丁质结合活性试验结果表明,HoCBP2和HoCBP76重组蛋白均具有几丁质结合活性,重组蛋白经PBS及1M NaCl处理后,不能从几丁质/蛋白复合物中解离,而用强变性剂6M尿素及1% Calcoflour处理后,重组蛋白从几丁质/蛋白复合物中大量释放。成功分离得到HoCBP2及HoCBP76的特异抗体,Western blot检测发现HoCBP2和HoCBP76在华北大黑鳃金龟幼虫中肠前、中,后部均匀分布,围食膜、中肠、粪便及卵中均存在CBP蛋白,而在其体壁、消化液、脂肪体、蜕及马氏管中未见阳性信号。3. HoChi基因,编码华北大黑鳃金龟幼虫几丁质酶,该基因全长1636bp,GenBank登录号为HM596340,开放阅读框长1458bp,编码486个氨基酸,预期蛋白分子量为51.8kDa,等电点为5.58。其5’端和3’端各有一个长27bp和145bp的非翻译区,在polyA末端上游39bp处有一个多聚腺甘酸终止信号序列AAGAAA。该蛋白具有典型的几丁质酶特性,即一个信号肽、一个几丁质酶活性位点、一个C端苏氨酸富集区和一个几丁质结合域,属于几丁质酶18家族。其氨基酸序列与赤拟谷盗几丁质酶蛋白（GenBank登录号NM001044629）具有较高的相似性。将该基因与pET28b载体重组后,经IPTG诱导,Western blot鉴定,该蛋白在大肠杆菌中得到表达。利用Bac-to-Bac昆虫杆状病毒表达系统成功构建重组表达载体pFastBac-HoChi,转染BTI-Tn-5B1-4细胞后,实现了其在昆虫细胞中的成功表达。4. HoSCP基因,编码华北大黑鳃金龟幼虫丝氨酸羧肽酶,GenBank登录号为JF681184。该基因全长1830bp,开放阅读框长1371 bp,编码457个氨基酸。推导的蛋白质分子量为51.2kDa,等电点为6.12。其5’端具有78bp的非翻译区及起始密码子ATG,3’端具有381bp的非翻译区,并且含有终止密码子TAA,在polyA末端上游14bp处有一个多聚腺甘酸终止信号序列AATAAA。N-末端具有15个氨基酸的前导信号序列,表明其是分泌型蛋白。序列分析表明,HoSCP含有一个保守的S10肽酶结构域、一个丝氨酸活性位点序列IAGESYAG、一个组氨酸活性位点序列FAFLkVYGAGHMVPMDQP以及两个N-联糖基化位点,并且含有丝氨酸羧肽酶保守催化三联体位点Ser-185,Asp-361,His-418。将该基因与pET28b载体重组后,经IPTG诱导,Western blot鉴定,该蛋白在大肠杆菌中得到表达。利用Bac-to-Bac昆虫杆状病毒表达系统成功构建重组表达载体pFastBac-HoSCP,转染BTI-Tn-5B1-4细胞后,实现了其在昆虫细胞中的成功表达。5. HoIIM基因,编码华北大黑鳃金龟肠幼虫围食膜粘蛋白,长1879bp,最长读码框长1707bp,编码569个氨基酸,GenBank登录号为JF681187。结构域分析表明,HoIIM蛋白5个具有peritrophin-A结构特征的几丁质结合功能域、5个粘蛋白结构域。其粘蛋白结构域富含苏氨酸（Thr,T）、脯氨酸（Pro,P）和丝氨酸（Ser,S）,分别占29.3%、15.5%及3.91%,并含有大量重复序列,其中PTTTPTT共重复15次,PTSTTTPTTITT及STTTT分别重复5次,TTPTTP重复4次。对华北大黑鳃金龟幼虫围食膜蛋白组分的银染分析表明,其围食膜蛋白种类较多。其中分子量大小大约为160kDa和80kDa的两条蛋白条带,与经PAS方法检测到的呈明显红色的两种糖蛋白大小相符。从粉纹夜蛾颗粒体病毒中分离得到增效蛋白Enhancin,离体处理华北大黑鳃金龟幼虫围食膜后,Western blot检测发现有一条分子量较大的围食膜蛋白条带明显消失,而相应的一些小分子量的围食膜蛋白条带有所增加。
白书婉[6]（2011）在《家蚕膜蛋白Baxinhibitor-1与多角体蛋白融合在家蚕杆状病毒表达系统中的表达及鉴定》文中指出家蚕杆状病毒核型多角体蛋白（polyhedron, Polh）是昆虫杆状病毒的重要结构蛋白,其在外界极稳定,能保护病毒粒子免受物理和生化降解。将野生杆状病毒感染家蚕BmN细胞,待发病后收集细胞,根据天然Polh能溶解在碱性溶液中的性质,用pH 10.8的缓冲液溶解发病细胞裂解后的沉淀,离心,得到的上清中Polh含量达85%以上,通过阴离子交换柱和分子筛进一步纯化,得到纯度高达99%以上的天然Polh。将纯化的Polh免疫小鼠获得特异性高的多克隆抗血清,以此抗体作为一抗,通过Western blotting方法检测融合Polh的融合蛋白的表达。多角体蛋白基因作为融合伴侣与增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因融合构建到原核表达载体pET-28a中,并在二者之间引入一个烟草蚀纹病毒（tobacco etch virus, TEV）蛋白酶酶切位点,使其在E.coli中表达,发现表达的重组蛋白显示了与天然多角体蛋白几乎完全一样的特性,在碱性缓冲液下快速的溶解,而且形成了稳定且易于分离的包涵体。通过差速离心与缓冲液pH变化,分离纯化得到Polh-EGFP融合蛋白,其纯度高达95%,融合蛋白的得率为79.3%。再用TEV酶切除多角体标签,获得纯的EGFP。本实验成功建立了原核表达的基于多角体蛋白融合的快速高效的纯化方案。Bax inhibitor-1（BI-1）是一种包含多个跨膜结构域的抗凋亡蛋白,其蛋白家族中的成员定位于内质网膜,通过Bcl-2调节细胞的凋亡。我们对本实验室构建的家蚕cDNA文库进行筛查时,发现一条与小鼠Bax inhibator-1有52%同源性的基因,生物信息学分析后,初步命名为BmBI-1（家蚕Bax inhibator-1）, GenBank登录号是DN237509。为了进一步证实多角体基因在融合表达与纯化中的优势,将BmBI-1与Polh在家蚕杆状病毒表达系统进行融合表达。首先利用杆状病毒载体pFastBac HTb作为转座载体,将Polh-BmBI-1基因转座到杆状病毒基因组（Bacmid）上,构建Bacmid-Polh-BmBI-1。然后通过脂质体将Bacmid-Polh-BmBI-1转染家蚕BmN细胞得到重组病毒vBmPolh-BmBI-1 。以扩增后的重组病毒感染家蚕细胞,收集发病细胞,Western blotting和荧光定量PCR分析发现,Polh-BmBI-1基因在家蚕细胞中成功表达而作为对照的未融合Polh的BmBI-1无法表达。最后,将重组病毒vBmPolh-BmBI-1接种于五龄家蚕幼虫体内,待大部分蚕出现明显病毒感染症状后,大量收集蚕血淋巴。Western blotting检测发现Polh-BmBI-1融合蛋白在家蚕幼虫及蛹中成功表达,表达产物分子量在60 kDa左右,和融合蛋白预测的分子量一致。荧光定量PCR结果显示,在病毒感染细胞72 h后蛋白表达量最高。
黄光镁[7]（2009）在《抗人CD28单链抗体基因在Sf9细胞及家蚕中的表达研究》文中指出鼠源性单抗在人体使用后可产生人抗鼠抗体（Human Anti-Mouse Antibody, HAMA）反应,而且分子量大,不能有效进入病灶部位,临床使用受到限制。单链抗体（single chain Fv, ScFv）是由一条连接肽将IgG分子的重链和轻链的可变区连接而成的,减少了免疫原性,分子小,实体组织穿透力强,血浆半衰期短,因而在临床疾病的诊断和治疗中具有重要的应用价值。将抗人CD28的鼠源单链抗体基因（mouse anti-human CD28 ScFv ）亚克隆到杆状病毒转移载体pFastBacHTa中,得到重组转移载体pFastBacHTa-ScFv转化大肠杆菌DH10Bac,获得重组杆粒rBacmid-ScFv。脂质体介导转染Sf9昆虫细胞后获得重组杆状病毒rBV-ScFv。将该重组病毒感染Sf9细胞, SDS-PAGE和Weatern blot分析表明:抗人CD28 ScFv在昆虫细胞中获得高效表达,分子量约36 kDa。细胞裂解及产物可溶性分析表明:该单链抗体基因在Sf9细胞中超高量表达并以不溶性集聚体形式存在,表达产物可达细胞总蛋白的25.7%。经变性溶解集聚体、Ni-NTA亲和层析,获得纯化抗人CD28 ScFv表达产物。流式细胞分析,当CD28 SvFc结合了T-28细胞表面抗原结合表位后,单克隆抗体2F5与T-28细胞的结合率从86.9%下降至18.1%,表明抗人CD28 ScFv可有效地与CD28单克隆抗体竞争性结合CD28细胞表面抗原。HyNPV是BmNPV和AcNPV通过基因重组后得到的一个具有BmNPV和AcNPV双重优点的新型杂交病毒,本研究还利用家蚕-HyNPV表达系统,研究了其在家蚕中的表达。本研究在成功拼接抗人CD28单链抗体基因的基础上,应用二种Bac-to-Bac BEVS系统构建并获得了抗人CD28-ScFv的转移载体和重组病毒,并在Sf9细胞和家蚕中表达了CD28-ScFv,首次对Sf9细胞中表达的外源蛋白抗CD28 ScFv的可溶性问题进行了研究,获得了具有免疫学活性的高纯度的抗人CD28单链抗体。为抗CD28 ScFv的抗肿瘤药物的开发奠定了基础。
岳万福[8]（2009）在《基于家蚕杆状病毒表达系统表达外源基因研究》文中提出家蚕杆状病毒表达系统作为一种真核表达系统,表达的蛋白具有折叠和糖基化,近于真实构相,表达量较大,而且能够可溶性地表达一些原核系统难以表达的大分子量蛋白。我们首先使用家蚕杆状病毒表达系统表达了Mn-SOD基因,并通过低温冷冻真空干燥,以SOD全蚕粉的形式,保持了SOD的活性。对SOD全蚕粉进行了以《保健食品检验与评价技术规范》为标准的安全性和功能性检验。经对小鼠进行人体推荐量360倍的急性毒性检验、90天的长期性毒性检验,小鼠生长正常,各器官无异常现象发生；SOD全蚕粉对ConA刺激导致的淋巴细胞转化,在体外法实验中,显示能明显增加淋巴细胞转化率,提示SOD全蚕粉具有免疫调节作用；经口给予小鼠不同剂量的SOD全蚕粉30天,能提高小鼠迟发型变态反应能力,在高剂量组达到显着水平,但与阳性对照（黄芪组）有较明显的差距。SOD全蚕粉促进小鼠的体重增长,对脾脏生长无影响,但明显增加小鼠的胸腺／体重比值；用SRBC免疫小鼠后,产生抗SRBC抗体,SOD全蚕粉对血凝素也有明显的作用,表明SOD全蚕粉对正常机体的体液免疫功能均有增强作用；经对小鼠巨噬细胞的功能实验,SOD全蚕粉提高了小鼠巨噬细胞吞噬鸡红细胞的能力。在家蚕体内表达SOD基因后,经冷冻干燥制得SOD全蚕粉,设三个剂量组和阴性、阳性对照组给小鼠灌胃；经口给予小鼠不同剂量的SOD全蚕粉30天,能增加小鼠血和肝脏中的超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶的活性,降低小鼠肝脏中丙二醛含量。在家蚕体内表达SOD基因后,经冷冻干燥制得SOD全蚕粉,小鼠灌胃45天,小鼠尾静脉注稀释的印度墨汁,以吞噬指数表示小鼠碳廓清的能力,碳廓清能力提高,说明加速碳粒的清除,显着提高自然杀伤细胞抗瘤活性,增强机体的非特异性细胞免疫功能。以NIH小鼠为研究模型,观察SOD全蚕粉对NK细胞活性的影响,证实了SOD全蚕粉有明显的能增强NK细胞的活性,从而增强机体的免疫机能。在此基础上,进行抑制肿瘤实验,结果表明提高小鼠抗肿瘤能力,SOD全蚕粉提高S180肿瘤荷瘤小鼠的淋巴细胞转化率、NK细胞活性,抑制小鼠的肿瘤生长；SOD全蚕粉组对肝癌H22的平均抑瘤率为40.3,表现出较强的抗肿瘤活性,能促进T淋巴细胞转化,提高NK细胞活性。经四氧嘧啶造模成功后小鼠,对其灌胃SOD全蚕粉30天（SOD全蚕粉为家蚕体内表达SOD基因后,经冷冻干燥制得）,结果显示SOD全蚕粉能增加小鼠的糖耐量水平,对小鼠的空腹血糖值有降低趋势,达到显着水平。家蚕杆状病毒表达系统是一个功能强大,可利用范围较广的真核表达系统,然而,由于感染需要节间注射,限制了家蚕杆状病毒表达系统的应用,因此,我们对家蚕杆状病毒表达系统进行了几项攻进。采用荧光增白剂喷洒桑叶,增加家蚕经口对杆状病毒表达系统中携带外源基因病毒的易感性。构建了双表达载体系统,在表达Mn-SOD目的蛋白的同时,恢复表达了多角体基因；多角体基因和Mn-SOD基因被分别插在多角体启动子和P10启动子之下,实现了经口感染。摸索出重组杆状病毒DNA与转染剂混合比例和转染条件,在家蚕体内实现从DNA到病毒的转化,经口感染家蚕幼虫,大大简化外源基因表达的操作手续。表达的目的蛋白在感染后期常被降解,甚至在感染后期家蚕等昆虫组织器官也受到降解,给目的蛋白的纯化等处理带来许多麻烦,这已成为该表达系统,特别是在产业化开发时遇到的一个严重的问题。为了解决表达蛋白的稳定性。引进和采用了缺少半胱氨酸蛋白酶基因的Bacmid质粒载体（CPD）,缺少半胱氨酸蛋白酶和几丁质酶基因的Bacmid质粒载体（CPPD）,用这些改进后的Bacmid质粒载体表达外源基因,并在人胰岛素的表达中进行了对比；在猪蓝耳病病毒膜蛋白GP5和M基因表达实验中采用了缺少半胱氨酸蛋白酶基因的Bacmid质粒载体（CPD）。在家蚕体内表达出人胰岛素,开发出除大肠杆菌、酵母表达系统外,人胰岛素表达的第三条途径。在家蚕体内表达出猪繁殖与呼吸综合征（蓝耳病）表面抗原蛋白,经ELISA检验有抗原原性,开辟了用家蚕生产DNA等基因工程疫苗的新途径奠定了基础。
李成伟,贾孟,张怡,周庆峰,张红绪[9]（2008）在《几种外源基因真核表达体系研究进展》文中研究指明随着分子生物学的飞速发展,进入到后基因组时代后,人们对蛋白质的结构和功能研究越加深入,对蛋白质表达载体的研究也逐渐丰富.本文主要综述了几种常见的真核表达载体以及影响外源基因在这些载体中表达效率的一些因素,旨在对研究者有所启发.
田飞焱[10]（2008）在《鱼类神经坏死病病毒衣壳蛋白基因分析及其真核表达》文中研究表明鱼类病毒性神经坏死病（virus nervous necrosis,VNN）的病原为鱼类神经坏死病毒,它属于诺达病毒科（Nodaviridae）中的β-诺达病毒属。自80年代报道以来,目前该病毒引起的疾病在除非洲以外的世界其它地方迅速蔓延开来,给各国海水养殖业造成了巨大的损失。神经坏死病毒基因组包括两条正义的、非聚腺苷酸化的RNA单链（RNA1和RNA2）。RNA1的大小约为3.0 kb-3.2 kb,主要编码非结构A蛋白,是一种依赖RNA的RNA聚合酶;RNA2的大小约为1.3 kb-1.4 kb,其开放阅读框编码一个病毒衣壳蛋白。近年来我国沿海大规模网箱养殖的石斑鱼,由于受神经坏死病毒的感染,给育苗生产带来极大的损失。从本室分离到的6株NNV提取病毒基因组RNA。根据已报道的RNA2片断全序列设计引物,用RT-PCR方法特异性扩增出6株病毒的衣壳蛋白基因片段,分别连接到PMD18-T载体中,并进行序列测定和分析。结果发现,6个NNV分离株的RNA2片断核苷酸序列的同源性在97.3%以上;推导的氨基酸序列同源性在79.6%-99.1%之间。根据RNA2片断核苷酸序列绘制的分子进化树表明,6个NNV分离株在进化树同一分枝上,属于RGNNV基因型,与已报道的点带石斑鱼神经坏死病病毒（ECNNV）、巨石斑鱼神经坏死病病毒（ETNNV）及玛拉巴石斑鱼神经坏死病病毒（MGNNV）亲缘关系较近。试验结果表明,我国沿海养殖场发生的鱼类病毒性神经坏死病均由同一来源的病毒引起的,该基因型的鱼类神经坏死病毒在我国沿海养殖的石斑鱼中传播流行。利用RT-PCR技术获得病毒性神经坏死病毒0603株的衣壳蛋白基因,将其插入到杆状病毒Bac-To-Bac表达系统的pFastBacⅠ质粒中,构建了pFastBac-cp质粒,转化DH10Bac大肠杆菌后获得重组穿梭载体Bacmid-cp,脂质体介导转染Sf9细胞产生有感染力的重组杆状病毒AcNPV-cp。SDS-PAGE,ELISA和Western-blotting分析可见大小约为37kD的特异性蛋白带,其可以与病毒性神经坏死病毒阳性血清反应,表明AcNPV-cp在Sf9细胞中成功地表达了病毒性神经坏死病毒的衣壳蛋白。电镜观察发现,cp蛋白可自行装配成病毒样粒子,其大小形态类似全病毒,并呈晶格状排列在细胞质中。
二、一种新颖的棉铃虫单粒包埋核多角体病毒表达系统（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、一种新颖的棉铃虫单粒包埋核多角体病毒表达系统（论文提纲范文）
（1）暗黑鳃金龟几丁质酶基因hpChi的克隆、表达及活性分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 暗黑鳃金龟简介 |
| 1.2 几丁质酶 |
| 1.2.1 昆虫几丁质酶及其基本结构 |
| 1.2.2 昆虫几丁质酶分类 |
| 1.3 昆虫几丁质酶基因的筛选 |
| 1.4 昆虫几丁质酶在生物防治中的应用 |
| 1.5 昆虫杆状病毒表达系统 |
| 1.5.1 昆虫杆状病毒表达系统简介 |
| 1.5.2 Bac-to-Bac杆状病毒表达系统 |
| 1.6 实验目的及意义 |
| 第二章 暗黑鳃金龟几丁质酶基因的分离鉴定 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 文库、抗体 |
| 2.1.2 宿主菌、试剂盒和主要工具酶 |
| 2.1.3 主要试剂及溶液 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 大肠杆菌XL1-Blue的感受态细胞制备 |
| 2.2.2 暗黑鳃金龟中肠cDNA表达文库的免疫筛选 |
| 2.2.3 阳性克隆的鉴定 |
| 2.2.4 暗黑鳃金龟几丁质酶基因HpChi的生物信息学分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 暗黑鳃金龟几丁质酶基因的筛选 |
| 2.3.2 阳性克隆的鉴定 |
| 2.3.3 核苷酸和氨基酸的一级序列分析 |
| 2.3.4 HpChi蛋白的二、三级结构预测 |
| 2.3.5 暗黑鳃金龟幼虫几丁质酶HpChi的聚类分析 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 暗黑鳃金龟几丁质酶hpChi的原核表达分析 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 hpChi目的基因的获取 |
| 3.2.2 hpChi的回收纯化 |
| 3.2.3 hpChi与载体DNA的相应酶切、纯化 |
| 3.2.4 hpChi及载体DNA的连接 |
| 3.2.5 氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞 |
| 3.2.6 pET30a-hpChi的转化与鉴定 |
| 3.2.7 重组质粒的筛选与鉴定 |
| 3.2.8 融合蛋白的诱导表达及SDS-PAGE检测 |
| 3.2.9 融合蛋白的Western blot鉴定 |
| 3.2.10 几丁质酶HpChi的纯化 |
| 3.2.11 制备多克隆抗体 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 pET30a-hpChi重组表达载体的鉴定 |
| 3.3.2 hpChi在E.coli BL21中的表达 |
| 3.3.3 融合蛋白的纯化 |
| 3.3.4 制备多克隆抗体 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 暗黑鳃金龟几丁质酶基因hpChi的酵母表达 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 hpChi目的基因的获取 |
| 4.2.2 CTAB法提取质粒DNA |
| 4.2.3 hpChi和pPICK9K的相应酶切、纯化 |
| 4.2.4 hpChi和pPICK9K的连接 |
| 4.2.5 pPICK9K-hpChi的转化与鉴定 |
| 4.2.6 重组质粒pPIC9K-hpChi的线性化 |
| 4.2.7 缺陷型毕赤酵母菌株GS115的筛选 |
| 4.2.8 毕赤酵母GS115电激感受态细胞的制备 |
| 4.2.9 重组质粒pPIC9K-hpChi电激转化GS115感受态细胞 |
| 4.2.10 重组酵母菌株的初步筛选 |
| 4.2.11 重组酵母菌株的抗性筛选 |
| 4.2.12 重组酵母菌株的表型鉴定 |
| 4.2.13 重组酵母菌株基因组DNA的提取与PCR鉴定 |
| 4.2.14 重组酵母菌株的诱导表达 |
| 4.2.15 目的蛋白表达的检测 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 重组质粒pPICK9K-hpChi的鉴定 |
| 4.3.2 重组毕赤酵母菌株的表型鉴定 |
| 4.3.3 重组毕赤酵母菌株的PCR鉴定 |
| 4.3.4 pPIC9K-hpChi的表达检测 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 暗黑鳃金龟几丁质酶hpChi的昆虫细胞表达 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 昆虫细胞系 |
| 5.1.2 菌株和质粒 |
| 5.1.3 培养基与实验试剂 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 hpChi目的基因的获取 |
| 5.2.2 pFast-hpChi重组转座载体的构建 |
| 5.2.3 Bacmid-hpChi的构建 |
| 5.2.4 重组Bacmid的鉴定 |
| 5.2.5 昆虫细胞的培养 |
| 5.2.6 重组Bacmid DNA转染昆虫细胞 |
| 5.2.7 杆状病毒的扩增 |
| 5.2.8 重组蛋白Western blot分析 |
| 5.2.9 HpChi几丁质酶活性检测 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 Bacmid-hpChi重组载体的鉴定 |
| 5.3.2 HpChi在昆虫细胞中的表达 |
| 5.3.3 几丁质酶的活性分析 |
| 5.4 小结 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 缩略词 |
| 硕士期间发表的论文 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（2）含冰核基因重组杆状病毒构建及其应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1 冰核细菌概述 |
| 1.1 冰核蛋白结构 |
| 1.2 冰核蛋白成冰核机制 |
| 1.3 其他组分对冰核活性影响 |
| 1.4 冰核蛋白糖脂复合物组装 |
| 1.5 冰核细菌的应用 |
| 2 杆状病毒表达系统 |
| 2.1 杆状病毒基本结构 |
| 2.2 杆状病毒的生活史 |
| 2.3 杆状病毒基因的表达 |
| 2.4 Bac-to-Bac杆状病毒表达系统 |
| 第二章 一般材料与方法 |
| 1 材料 |
| 1.1 菌种和载体 |
| 1.2 昆虫和病毒 |
| 1.3 工具酶 |
| 1.4 抗生素和试剂盒 |
| 1.5 其他试剂 |
| 1.6 常用培养基和缓冲液 |
| 2 方法 |
| 2.1 细菌DNA提取 |
| 2.2 质粒DNA提取 |
| 2.3 感受态制备 |
| 2.4 琼脂糖凝胶切胶回收DNA目的片段 |
| 2.5 SDS-PAGE胶配制 |
| 2.6 SDS-PAGE电泳 |
| 第三章 冰核细菌Erwinia ananas 110冰核基因iceA的原核表达及冰核活性分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 冰核细菌基因组提取 |
| 1.2 冰核基因iceA的PCR扩增 |
| 1.3 重组克隆载体pMD19-T-ice构建 |
| 1.4 重组表达载体pET-23a(+)-ice构建 |
| 1.5 pET-23a(+)-ice、pET-23a(+)转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS |
| 1.6 蛋白表达和SDS-PAGE分析 |
| 1.7 冰核活性测定 |
| 2. 结果与分析 |
| 2.1 冰核基因iceA基因扩增和重组克隆载体pMD19-T-ice鉴定 |
| 2.2 重组克隆载体pET-23a(+)-ice鉴定 |
| 2.3 蛋白表达与SDS-PAGE分析 |
| 2.4 表达蛋白冰核活性分析 |
| 3 讨论 |
| 第四章 含冰核基因iceA重组杆状病毒AcV/polh-ice构建 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 polyhedrin基因合成 |
| 1.2 iceA基因扩增 |
| 1.3 重组转移质粒pFASTBac~(TM)Dual-polh构建 |
| 1.4 重组转移质粒pFASTBac~(TM)Dual-polh-ice构建 |
| 1.5 重组穿梭载体Bacmid构建 |
| 1.6 Bacmid/polh-ice转染sf9细胞 |
| 1.7 病毒株扩增 |
| 1.8 表达蛋白检测 |
| 1.9 AcV/polh-ice对甜菜夜蛾影响 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 重组转移质粒pFASTBac~(TM)Dual-polh的鉴定 |
| 2.2 重组转移质粒pFASTBac~(TM)Dual-polh-ice的鉴定 |
| 2.3 重组穿梭载体Bacmid/polh-ice鉴定 |
| 2.4 感染sf9细胞与收获病毒株 |
| 2.5 表达蛋白分析 |
| 2.6 甜菜夜蛾感染 |
| 3 讨论 |
| 第五章 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 附录A：Erwinia ananas 110冰核蛋白序列 |
| 附录B：polh基因合成序列 |
| 附录C：氨基酸符号 |
| 附录D：缩略语 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（3）水稻条纹病毒NSvc2-N与NSvc2-C蛋白互作的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 水稻条纹病毒的研究背景 |
| 1.1.1 水稻条纹病的发生及其危害 |
| 1.1.2 水稻条纹病的传播 |
| 1.1.3 RSV的病毒粒子 |
| 1.1.4 RSV的基因组结构 |
| 1.1.5 RSV编码蛋白的功能 |
| 1.2 酵母双杂交系统及其应用 |
| 1.2.1 酵母双杂交系统的简介 |
| 1.2.2 酵母双杂交系统的原理 |
| 1.2.3 酵母双杂交系统优缺点 |
| 1.2.4 酵母双杂交系统研究RSV与寄主的互作情况 |
| 1.3 荧光共振能量转移 |
| 1.3.1 荧光共振能量转移原理 |
| 1.3.2 荧光共振能量转移(FRET)的优缺点 |
| 1.3.3 受体漂白荧光共振能量转移 |
| 1.3.4 荧光共振能量转移-荧光寿命成像(FRET-FLIM)技术 |
| 1.3.5 荧光共振能量转移(FRET)技术的注意事项 |
| 1.4 杆状病毒AcMNPV作为人类干细胞基因治疗载体的研究 |
| 1.4.1 杆状病毒简介 |
| 1.4.2 杆状病毒的分类 |
| 1.4.3 杆状病毒的形态结构 |
| 1.4.4 杆状病毒的基因组结构及基因表达调控 |
| 1.4.5 杆状病毒表达载体系统 |
| 1.4.6 杆状病毒AcMNPV用作人类干细胞基因治疗载体 |
| 1.4.7 大肠杆菌--杆状病毒穿梭载体(Bac to Bac系统) |
| 1.5 本论文的研究目的和意义 |
| 第二章 酵母双杂交分析NSvc2-N与NSvc2-C蛋白间的互作 |
| 2.1 仪器 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 菌株 |
| 2.2.2 质粒 |
| 2.2.3 主要试剂 |
| 2.2.4 培养基 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 水稻叶片总RNA的提取 |
| 2.3.2 RT-PCR扩增目的基因片段 |
| 2.3.3 PCR产物的回收与连接 |
| 2.3.4 制备大肠杆菌DH5a感受态细胞 |
| 2.3.5 转化大肠杆菌DH5a |
| 2.3.6 大肠杆菌中质粒的提取方法 |
| 2.3.7 酶切鉴定 |
| 2.3.8 载体的构建 |
| 2.3.9 酵母感受态细胞的制备 |
| 2.3.10 诱饵载体的自激活鉴定 |
| 2.3.11 阳性克隆的筛选 |
| 2.4 结果分析与讨论 |
| 2.4.1 NSvc2-N和NSvc2-C的RT-PCR扩增产物 |
| 2.4.2 NSvc2-C和NSvc2-N诱饵和捕获载体的构建 |
| 2.4.3 NSvc2-C和NSvc2-N蛋白的相互作用检验 |
| 2.4.4 分析和讨论 |
| 第三章 FRET法验证NSvc2-N与NSvc2-C间的互作 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验用的菌株 |
| 3.1.2 质粒 |
| 3.1.3 试剂 |
| 3.1.4 培养基 |
| 3.1.5 引物 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 RT-PCR扩增目的基因片段 |
| 3.2.2 PCR产物的回收与连接 |
| 3.2.3 转化大肠杆菌DH5α |
| 3.2.4 大肠杆菌中质粒的提取及酶切鉴定 |
| 3.2.5 质粒构建 |
| 3.2.6 重组Bacmid的构建 |
| 3.2.7 重组Bacmid DNA转染-感染昆虫Sf9细胞 |
| 3.2.8 荧光显微镜观察FRET结果 |
| 3.3 结果分析与讨论 |
| 3.3.1 含NSvc2-N和NSvc2-C重组质粒的构建 |
| 3.3.2 重组病毒的产生 |
| 第四章 AcMNPV作为人类干细胞基因治疗载体的研究 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 菌株和质粒 |
| 4.1.2 试剂 |
| 4.1.3 培养基和细胞 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 目的基因片段的PCR扩增 |
| 4.2.2 PCR产物的回收与连接 |
| 4.2.3 转化大肠杆菌DH5α、提取质粒、酶切鉴定 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 目的基因的扩增 |
| 4.3.2 目的基因的克隆及鉴定 |
| 4.3.3 目的基因片段连接pTRE-tight |
| 4.3.4 pTet-on Advanced用XhoⅠ和HindⅢ酶切后连接pFastBac1 |
| 4.3.5 目的片段与pFast-Tet的连接 |
| 4.3.6 重组质粒转化DH10B构建重组Bacmid |
| 4.3.7 鉴定正确的Bacmid转染昆虫细胞Sf9 |
| 4.4 结果分析与讨论 |
| 第五章 总结与讨论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（4）鸭甲肝病毒1型一个保守的中和性线性B细胞表位的确定（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 鸭甲肝病毒的研究概述 |
| 1.1.1 DHAV-1病原学研究 |
| 1.1.2 流行病学研究 |
| 1.1.3 DHAV分子生物学的研究 |
| 1.1.4 临床症状和病理剖检 |
| 1.1.5 DHAV的诊断方法 |
| 1.1.6 DHAV的预防与治疗 |
| 1.2 昆虫杆状病毒表达系统 |
| 1.2.1 杆状病毒基因组的结构及功能的研究 |
| 1.2.2 杆状病毒表达系统的特点 |
| 1.2.3 杆状病毒载体的重组与筛选 |
| 1.2.4 影响外源基因表达的因素 |
| 1.2.5 杆状病毒载体及其表达系统进展 |
| 1.2.6 昆虫细胞系及培养基 |
| 1.2.7 杆状病毒表达的最新应用及展望 |
| 1.3 原核表达系统 |
| 1.4 抗原表位的研究 |
| 1.4.1 T细胞表位的研究方法 |
| 1.4.2 B细胞表位的研究方法 |
| 1.4.3 抗原表位的应用及展望 |
| 1.5 本研究的目的和意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 菌(毒)株 |
| 2.1.2 实验动物和细胞株 |
| 2.1.3 酶和相关试剂 |
| 2.1.4 主要仪器 |
| 2.1.5 实验所用的溶液及其配制 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 试验一 单克隆抗体的制备 |
| 2.2.2 试验二 杆状病毒表达系统对单克隆抗体的抗原表位进行初步分析 |
| 2.2.3 试验三 用原核表达系统采用设计引物交叉重叠法分段表达VP1蛋白确定出抗原表位 |
| 2.2.4 试验四 杆状病毒表达系统IFA分析验证抗原表位 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 单克隆抗体的制备 |
| 3.1.1 细胞株分泌抗体稳定性检测 |
| 3.1.2 腹水效价的测定 |
| 3.2 Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达BVP1蛋白同5株单抗的抗原表位初步分析结果 |
| 3.2.1 pFastBac~(TM) HTB-VP1重组质粒的双酶切鉴定 |
| 3.2.2 重组转移载体的克隆测序 |
| 3.2.3 重组杆粒的鉴定 |
| 3.2.4 重组病毒感染sf9细胞后的细胞病变 |
| 3.2.5 重组蛋白在sf9中的表达及IFA分析 |
| 3.2.6 Weatern blot分析结果 |
| 3.3 第一次VP1蛋白分7段交叉表达 |
| 3.3.1 PCR扩增结果 |
| 3.3.2 DHAV-VP1分7段基因重组质粒双酶切鉴定 |
| 3.3.3 SDS-PAGE凝胶分析 |
| 3.3.4 Western blot分析结果 |
| 3.4 第二次VP1蛋白分6段交叉重叠表达 |
| 3.4.1 PCR扩增图 |
| 3.4.2 DHAV-1VP1分6段基因重组质粒双酶切鉴定 |
| 3.4.3 重组质粒的克隆测序 |
| 3.4.4 重组蛋白诱导表达SDS-PAGE鉴定 |
| 3.4.5 重组蛋白的Western blot鉴定 |
| 3.4.6 单克隆抗体4F8抗原表位的Wertern blot鉴定 |
| 3.5 单克隆抗体4F8识别抗原表位的IFA验证 |
| 4 讨论 |
| 4.1 DHAV-1抗原表位的研究现状 |
| 4.2 DHAV-1蛋白的真核表达及5株单抗识别抗原的初步定位 |
| 4.3 单抗4F8识别抗原表位的精确定位 |
| 5 结论 |
| 6 参考文献 |
| 7 致谢 |
| 8 攻读硕士期间发表论文情况 |
（5）华北大黑鳃金龟中肠cDNA文库的构建及其围食膜靶标蛋白的分离与鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 引言 |
| 1.1 围食膜的分类、形成及组分 |
| 1.1.1 围食膜的种类 |
| 1.1.2 围食膜的形成机制 |
| 1.1.3 围食膜的组分 |
| 1.2 围食膜的结构及功能 |
| 1.2.1 围食膜的结构模型 |
| 1.2.2 围食膜的功能 |
| 1.3 围食膜内潜在的害虫防治靶标位点 |
| 1.4 昆虫杆状病毒表达系统 |
| 1.4.1 昆虫杆状病毒表达系统的特点 |
| 1.4.2 昆虫杆状病毒表达系统的应用 |
| 1.4.3 影响杆状病毒表达系统表达外源蛋白的因素 |
| 1.4.4 Bac-to-Bac 杆状病毒表达系统 |
| 1.5 选题依据及目的意义 |
| 第2章 华北大黑鳃金龟幼虫中肠cDNA 表达文库的构建 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 供试昆虫 |
| 2.1.2 供试菌株及试剂盒 |
| 2.1.3 培养基 |
| 2.1.4 试剂及溶液 |
| 2.1.5 仪器设备 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 华北大黑鳃金龟中肠组织的收集 |
| 2.2.2 总 RNA 的提取 |
| 2.2.3 mRNA 分离纯化 |
| 2.2.4 cDNA 的合成 |
| 2.2.5 cDNA 的分级、纯化及定量 |
| 2.2.6 cDNA 与载体λZAP 的连接与包装 |
| 2.2.7 cDNA 文库重组率、库容量检测 |
| 2.2.8 cDNA 文库的扩增 |
| 2.2.9 cDNA 文库质量鉴定 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 总RNA 的提取 |
| 2.3.2 mRNA 的分离纯化 |
| 2.3.3 cDNA 第一链和第二链的合成 |
| 2.3.4 cDNA 分级分离及定量 |
| 2.3.5 cDNA 文库的滴度及重组率检测 |
| 2.3.6 cDNA 文库插入片断大小的PCR 鉴定 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 cDNA 文库的构建方法 |
| 2.4.2 影响cDNA 文库构建质量的因素 |
| 2.4.3 cDNA 文库的应用 |
| 2.5 小结 |
| 第3章 华北大黑鳃金龟cDNA 表达文库的免疫筛选 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 文库、抗体及宿主菌 |
| 3.1.2 主要工具酶及试剂 |
| 3.1.3 主要仪器设备 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 XL1-Blue 大肠杆菌感受态的制备 |
| 3.2.2 cDNA 文库单克隆的制备 |
| 3.2.3 转膜 |
| 3.2.4 免疫和显色反应 |
| 3.2.5 阳性克隆的第二轮筛选 |
| 3.2.6 阳性克隆的鉴定 |
| 3.2.7 cDNA 的序列分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 阳性克隆的筛选 |
| 3.3.2 阳性克隆的鉴定 |
| 3.3.3 阳性克隆基因的序列分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 cDNA 文库的免疫筛选 |
| 3.4.2 影响免疫筛选的因素 |
| 3.5 小结 |
| 第4章 华北大黑鳃金龟围食膜几丁质结合蛋白 HoCBP2 及HoCBP76 的克隆、表达及功能分析 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 菌株、细胞及载体 |
| 4.1.2 试剂 |
| 4.1.3 CBP 基因的克隆与测序分析 |
| 4.1.4 CBP 基因的原核表达 |
| 4.1.5 CBP 基因的真核表达 |
| 4.1.6 CBP 蛋白功能检测 |
| 4.1.7 CBP 蛋白在H.oblita 幼虫组织中的免疫定位 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 HoCBP2 及HoCBP76 的序列分析 |
| 4.2.2 HoCBP2 及HoCBP76 的原核表达 |
| 4.2.3 HoCBP2 和HoCBP76 在Bac-to-Bac 系统中的表达 |
| 4.2.4 HoCBP2 和HoCBP76 重组蛋白的几丁质活性检测 |
| 4.2.5 CBP 蛋白在H.oblita 幼虫组织中的免疫定位 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第5章 华北大黑鳃金龟几丁质酶HoChi 的分离鉴定 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 菌株、细胞及载体 |
| 5.1.2 主要试剂及工具酶 |
| 5.1.2 几丁质酶HoChi 基因的鉴定与测序分析 |
| 5.1.3 几丁质酶HoChi 基因的原核表达 |
| 5.1.4 几丁质酶HoChi 基因的真核表达 |
| 5.1.5 重组杆状病毒DNA 的提取及PCR 鉴定 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 HoChi 基因的序列分析 |
| 5.2.2 华北大黑鳃金龟HoChi 与几种其他昆虫几丁质酶氨基酸序列的比较分析 |
| 5.2.3 华北大黑鳃金龟HoChi 重组载体的构建和表达 |
| 5.2.4 几丁质酶HoChi 基因的真核表达 |
| 5.3 讨论 |
| 5.3.1 HoChi 基因属于典型的昆虫18 家族Ⅰ亚族几丁质酶 |
| 5.3.2 HoChi 基因序列保守性分析 |
| 5.3.3 华北大黑鳃金龟幼虫中肠HoChi 基因的应用前景 |
| 5.4 小结 |
| 第6章 华北大黑鳃金龟丝氨酸羧肽酶HoSCP 的分离鉴定 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 材料 |
| 6.1.2 H.oblita 中肠cDNA 文库的筛选及序列分析 |
| 6.1.3 HoSCP 基因的原核表达 |
| 6.1.4 HoSCP 基因的真核表达 |
| 6.2 结果与分析 |
| 6.2.1 HoSCP 基因序列分析 |
| 6.2.2 丝氨酸羧肽酶的原核表达 |
| 6.2.3 丝氨酸羧肽酶的真核表达 |
| 6.3 讨论 |
| 6.4 小结 |
| 第7章 华北大黑鳃金龟围食膜肠粘蛋白HoIIM 的分离鉴定 |
| 7.1 材料与方法 |
| 7.1.1 供试昆虫及试剂 |
| 7.1.2 H.oblita 幼虫围食膜的提取 |
| 7.1.3 PAS 染色所需试剂的配制 |
| 7.1.4 H.oblita 幼虫围食膜蛋白组分分析 |
| 7.1.5 病毒增效蛋白Enhancin 对H.oblita 幼虫围食膜的影响 |
| 7.1.6 H.oblita 中肠cDNA 表达文库的筛选及HoIIM 的测序分析 |
| 7.2 结果与分析 |
| 7.2.1 H.oblita 幼虫围食膜蛋白组分分析 |
| 7.2.2 Enhancin 对H.oblita 幼虫围食膜的影响 |
| 7.2.3 HoIIM 基因的序列分析 |
| 7.3 讨论 |
| 7.3.1 颗粒体病毒增效蛋白对昆虫围食膜的影响 |
| 7.3.2 IIM 的结构特征 |
| 7.4 小结 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在读期间发表的学术论文 |
| 作者简历 |
| 致谢 |
（6）家蚕膜蛋白Baxinhibitor-1与多角体蛋白融合在家蚕杆状病毒表达系统中的表达及鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语 |
| 第一部分 文献综述与实验设计 |
| 第一章 背景综述 |
| 第一节 膜蛋白研究的困难 |
| 第二节 昆虫杆状病毒表达载体系统的研究进展 |
| 1 杆状病毒的形态和结构 |
| 2 杆状病毒表达系统 |
| 2.1 杆状病毒表达系统与大肠杆菌、酵母、哺乳动物细胞三种表达系统比较 |
| 2.2 家蚕/BmNPV表达系统相对于Sf细胞/AcMNPV表达系统的优势 |
| 2.3 大肠杆菌一昆虫细胞穿梭载体系统(Bac-to-Bac) |
| 2.4 杆状病毒表达系统的进展及展望 |
| 3 多角体蛋白 |
| 第三节 Bax inhibitor-1的研究进展 |
| 1 BI-1基因的发现及分子结构 |
| 2 BI-1的表达与分布及进化保守性 |
| 3 BI-1的功能 |
| 3.1 BI-1的抗凋亡功能 |
| 3.2 BI-1的离子通道功能 |
| 3.3 BI-1在植物中的作用 |
| 3.4 BI-1与发育 |
| 4 BI-1基因与肿瘤 |
| 5 展望 |
| 第二章 实验方案设计 |
| 1 实验目的和意义 |
| 2 研究内容 |
| 3 实验流程图 |
| 第二部分 研究论文 |
| 第一章 天然Polh的纯化及多克隆抗体的制备 |
| 1 材料与试剂 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 试剂配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 细胞培养与冻存、复苏 |
| 2.2 病毒的扩增培养 |
| 2.3 病毒滴度测定(终点稀释法) |
| 2.4 天然Polh的纯化 |
| 2.5 SDS-PAGE电泳分析 |
| 2.6 Polh多克隆抗体的制备 |
| 2.7 Western blotting检测 |
| 3 结果 |
| 3.1 天然Polh的粗纯结果 |
| 3.2 过RESOUCE Q进一步纯化 |
| 3.3 过HiPrep26/10脱盐柱交换缓冲液 |
| 3.4 质谱分析 |
| 3.5 Western blotting检测 |
| 4 讨论 |
| 第二章 快速高效的纯化与Polh融合的目标蛋白方法的建立 |
| 1 材料和试剂 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 主要试剂的配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 克隆实验设计 |
| 2.2 Polh基因的克隆 |
| 2.3 EGFP基因的克隆 |
| 2.4 序列测定 |
| 2.5 重组质粒的转化及鉴定 |
| 2.6 重组质粒在大肠杆菌中表达 |
| 2.7 SDS-PAGE电泳分析 |
| 2.8 融合蛋白的纯化 |
| 2.9 TEV酶酶切纯化后的融合蛋白 |
| 2.10 TEV酶酶切后EGFP的纯化 |
| 2.11 Western blotting分析酶切后各组份 |
| 3 结果 |
| 3.1 Polh基因的克隆结果 |
| 3.2 EGFP基因的克隆结果 |
| 3.3 序列测定 |
| 3.4 Polh-EGFP的诱导表达 |
| 3.5 Polh-EGFP的纯化 |
| 3.6 融合蛋白的TEV酶酶切 |
| 3.7 TEV酶酶切后EGFP的纯化 |
| 3.8 Western blotting分析酶切后各蛋白 |
| 4 讨论 |
| 第三章 家蚕Bax inhibitor-1基因的生物信息学分析 |
| 1 序列与工具 |
| 1.1 序列 |
| 1.2 工具和软件 |
| 2 方法 |
| 2.1 BmBI-1基因的获得 |
| 2.2 BmBI-1基因的序列分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 BmBI-1基因的序列 |
| 3.2 疏水性分析 |
| 3.3 跨膜区和信号肽分析 |
| 3.4 二级结构的预测 |
| 3.5 BmBI-1蛋白高级结构的预测 |
| 3.6 功能位点分析 |
| 3.7 BmBI-1氨基酸序列同源性分析 |
| 4 讨论 |
| 第四章 家蚕Bax inhibitor-1基因融合Polh基因在家蚕杆状病毒表达系统中的表达 |
| 1 材料与试剂 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 试剂配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 重组质粒pFastBac HTb-Polh的构建 |
| 2.2 重组供体质粒pFastBac HTb-Polh-BmBI-1与pFastBac HTb-BmBI-1的构建及鉴定 |
| 2.3 重组病毒基因组Bacmid-Polh-BmBI-1与Bacmid-BmBI-1的构建 |
| 2.4 细胞培养与冻存、复苏 |
| 2.5 重组病毒vBmPolh-BmBI-1与vBmBmBI-1的构建 |
| 2.6 目的蛋白Polh-BmBI-1和BmBI-1在家蚕BmN细胞中的表达和鉴定 |
| 2.7 融合蛋白Polh-BmBI-1在重组病毒感染的细胞中的表达时相 |
| 2.8 融合蛋白Polh-BmBI-1在家蚕五龄幼虫及蚕蛹中的表达和鉴定 |
| 3 结果 |
| 3.1 重组供体质粒pFastBac HTb-Polh-BmBI-1与pFastBac HTb-BmBI-1的 |
| 3.2 重组Bacmid PCR鉴定 |
| 3.3 重组病毒vBmPolh-BmBI-1与vBmBmBl-1的PCR鉴定 |
| 3.4 PT-PCR及Western blotting鉴定Polh-BmBI-1和BmBI-1蛋白在家蚕细胞中的表达情况 |
| 3.5 融合蛋白Polh-BmBI-1在重组病毒感染的细胞中的表达时相 |
| 3.6 Western blotting鉴定融合蛋白Polh-BmBI-1在家蚕幼虫及蚕蛹中的表达 |
| 4 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（7）抗人CD28单链抗体基因在Sf9细胞及家蚕中的表达研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一部分 文献综述 |
| 第一章 昆虫杆状病毒表达载体系统的研究进展 |
| 第二章 单链抗体研究进展 |
| 第二部分 研究内容 |
| 第三章 抗人CD28-ScFv 转移载体的构建及重组病毒的制备 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 讨论 |
| 4 参考文献 |
| 第四章 抗人CD28 单链抗体基因在Sf9 细胞中的表达、纯化 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 讨论 |
| 4 参考文献 |
| 第五章 抗人CD28 单链抗体的生物学活性测定 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 讨论 |
| 4 参考文献 |
| 第六章 利用杂交病毒HyNPV在家蚕中表达鼠抗人CD28单链抗体 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 讨论 |
| 4 参考文献 |
| 总结与展望 |
| 在读期间公开发表的研究论文 |
| 致谢 |
（8）基于家蚕杆状病毒表达系统表达外源基因研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Summary |
| 第一章 文献综述 |
| 第一节 杆状病毒表达系统 |
| 1.杆状病毒的生物学特性 |
| 2.杆状病毒表达系统的产生 |
| 3.杆状病毒表达系统特点 |
| 4.杆状病毒表达系统的应用 |
| 5.影响杆状病毒表达系统外源基因表达的因素 |
| 6.杆状病毒的不足 |
| 7.展望 |
| 参考文献 |
| 第二节 Bac-to-Bac昆虫细胞-杆状病毒表达系统 |
| 1.Bac-to-Bac系统的原理 |
| 2.Bac-to-Bac系统的诞生及其优点 |
| 3.Bac-to-Bac系统的发展 |
| 4.Bac-to-Bac在家蚕中的应用 |
| 5.近几年Bac-to-Bac在家蚕中的应用实例 |
| 参考文献 |
| 第三节 SOD的研究概况 |
| 1.SOD研究的基本概况 |
| 2.SOD的来源 |
| 3.SOD克隆和表达的研究近况 |
| 参考文献 |
| 第四节 胰岛素的研究概述 |
| 1.胰岛素与糖尿病 |
| 2.胰岛素的应用 |
| 3.基因工程合成胰岛素 |
| 参考文献 |
| 第五节 猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗研究现状 |
| 1.猪繁殖与呼吸综合征病毒概况 |
| 2.猪繁殖与呼吸综合征疫苗研究 |
| 3.猪繁殖与呼吸综合征疫苗研究的展望 |
| 参考文献 |
| 第二章 SOD基因的克隆和表达 |
| 第一节 SOD基因的获得 |
| 1.材料与方法 |
| 2.结果 |
| 第二节 重组载体和重组病毒构建 |
| 1.材料与方法 |
| 2.结果 |
| 第三节 Mn-SOD基因在家蚕体内表达 |
| 1.材料与方法 |
| 2.结果 |
| 第四节 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 SOD功能研究 |
| 第一节 SOD全蚕粉制作 |
| 1.材料与方法 |
| 2.结果 |
| 第二节 SOD全蚕粉的毒性实验 |
| 1.方法和材料 |
| 2.实验结果 |
| 3.小结 |
| 第三节 Con诱导的小鼠脾淋巴细胞转化实验 |
| 1.材料与方法 |
| 2.结果 |
| 3.小结 |
| 第四节 SOD全蚕粉对小鼠迟发型变态反应的影响 |
| 1.材料和方法 |
| 2.结果 |
| 3.小结 |
| 第五节 SOD全蚕粉增强免疫力实验脏器/体重比值测定 |
| 1.材料与方法 |
| 2.结果 |
| 3.小结 |
| 第六节 SOD全蚕粉增强免疫功能的小鼠血清溶血素测定 |
| 1.材料和方法 |
| 2.结果 |
| 3.小结 |
| 第七节 SOD全蚕粉的小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验 |
| 1.材料与方法 |
| 2.结果 |
| 3.小结 |
| 第八节 SOD全蚕粉的抗氧化功能检验 |
| 一、造模 |
| 1.材料和方法 |
| 2.结果 |
| 二、小鼠血中和肝匀浆中MDA(丙二醛)含量测定 |
| 1.材料和方法 |
| 2.结果 |
| 3.小结 |
| 三、SOD全蚕粉灌胃后小鼠血/组织中抗氧化酶SOD活力测定 |
| 1.材料和方法 |
| 2.结果 |
| 3.小结 |
| 四、SOD全蚕粉灌胃后小鼠的血/组织中谷脱甘肤过氧化物酶活力测定 |
| 1.材料和方法 |
| 2.结果 |
| 3.小结 |
| 第九节 SOD全蚕粉增强免疫功能的小鼠碳廓清实验 |
| 1.材料 |
| 2.方法和步骤 |
| 3.结果 |
| 4.小结 |
| 第十节 SOD全蚕粉对小鼠NK细胞活性影响的实验研究 |
| 1.实验材料 |
| 2.实验方法 |
| 3.结果 |
| 4.小结 |
| 第十一节 SOD全蚕粉辅助降血糖功能检验 |
| 1.材料和方法 |
| 2.结果 |
| 3.小结 |
| 第十二节 SOD全蚕粉对S180荷瘤小鼠免疫调节作用的研究 |
| 1.材料和方法 |
| 2.结果 |
| 3.小结 |
| 第十三节 SOD全蚕粉抗肝癌(H22)的作用及其机制实验 |
| 1.材料与方法 |
| 2.结果 |
| 3.小结 |
| 第十四节 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 家蚕杆状病毒表达系统的改进 |
| 第一节 荧光增白剂增强对家蚕NPV病毒经口感染能力实验 |
| 1.材料和方法 |
| 2.结果 |
| 3.小结 |
| 第二节 双启动子重组病毒构建与经口感染效率 |
| 1.材料和方法 |
| 2.结果 |
| 3.小结 |
| 第三节 重组病毒DNA注射感染 |
| 1.材料和方法 |
| 2.结果 |
| 3.小结 |
| 第四节 讨论 |
| 1.杆状病毒表达系统发展 |
| 2.多角体去除后的得失 |
| 3.我国应用杆状病毒表达系统的国情与优势 |
| 4.有益的改进 |
| 5.减少表达蛋白降解的改进 |
| 参考文献 |
| 第五章 人胰岛素在家蚕体内的表达 |
| 1.材料和方法 |
| 2.结果 |
| 3.讨论 |
| 参考文献 |
| 第六章 猪蓝耳病E、M基因在家蚕中的融合表达 |
| 1.材料和方法 |
| 2.结果 |
| 3.讨论 |
| 参考文献 |
| 第七章 结论、创新点、及后续研究 |
| 致谢 |
| 附件:作者简历 |
| 发表论文 |
| 发明专利申请公布说明书 |
（9）几种外源基因真核表达体系研究进展（论文提纲范文）
| 1 酵母表达系统 |
| 1.1 巴氏德毕赤酵母表达系统的构成 |
| 1.2 影响外源基因表达的因素 |
| 2 杆状病毒表达系统 |
| 2.1 杆状病毒表达系统的种类 |
| 2.2 影响外源基因表达的因素 |
| 3 哺乳动物细胞表达系统 |
| 4 转基因植物表达系统 |
| 5 杜氏盐藻生物反应器 |
| 6 结 语 |
（10）鱼类神经坏死病病毒衣壳蛋白基因分析及其真核表达（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 VNN的国内外研究现状 |
| 1.1.1 VNN的发现及危害 |
| 1.1.2 VNN的病理学变化 |
| 1.1.3 NNV的种类和地理分布 |
| 1.1.4 易感水生动物 |
| 1.1.5 传播途径 |
| 1.1.6 NNV的理化特性 |
| 1.1.7 NNV的分子生物学 |
| 1.1.8 检测NNV感染的诊断方法 |
| 1.1.9 VNN的免疫预防研究 |
| 1.2 杆状病毒表达系统 |
| 1.2.1 杆状病毒的生物学特性 |
| 1.2.3 杆状病毒表达体系的应用 |
| 1.3 研究目的和意义 |
| 第二章 6株鱼类神经坏死病病毒(NNV)CP基因的分子特征和遗传发生分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 病毒、载体和细胞 |
| 2.1.2 主要试剂与溶液配制 |
| 2.1.3 质粒抽提溶液配制 |
| 2.1.4 引物 |
| 2.1.5 病毒RNA的提取 |
| 2.1.6 NNV cp基因的RT-PCR扩增 |
| 2.1.7 RT-PCR扩增产物的回收 |
| 2.1.8 连接反应 |
| 2.1.9 大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备 |
| 2.1.10 大肠杆菌DH5α感受态细胞的转化 |
| 2.1.11 pMD18-cp质粒小量提取 |
| 2.1.12 酶切鉴定 |
| 2.1.13 序列测定和分析 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 RT-PCR扩增结果 |
| 2.2.2 pMD18-cp克隆载体的酶切鉴定 |
| 2.2.3 cp基因的核苷酸序列及与推导的氨基酸序列比较 |
| 2.2.4 NNV衣壳蛋白cp基因限制性内切酶位点分析 |
| 2.2.5 6株NNV分离株cp基因序列与国内外毒株RNA2序列比较分析 |
| 2.2.6 NNV分离株推导的氨基酸序列分析 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 鱼类神经坏死病病毒衣壳蛋白在昆虫细胞中的表达及其特性研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 质粒、载体和细胞 |
| 3.1.2 主要试剂与溶液配制 |
| 3.1.3 穿梭载体Bacmid的提取液 |
| 3.1.4 空斑试验试剂配制 |
| 3.1.5 SDS-PAGE,Western-blotting的相关试剂 |
| 3.1.6 ELISA的相关试剂 |
| 3.1.7 主要仪器 |
| 3.1.8 构建重组杆状病毒操作流程示意图 |
| 3.1.9 大肠杆菌DH10Bac感受态细胞的制备 |
| 3.1.10 供体质粒pFastBac-cp的构建 |
| 3.1.11 重组穿梭载体Bacmid-cp的构建 |
| 3.1.12 重组Bacmid-cp的提取 |
| 3.1.13 Sf9的细胞活化与冻存 |
| 3.1.14 脂质体介导转染Sf9细胞 |
| 3.1.15 重组杆状病毒AcNPV-cp的感染 |
| 3.1.16 空斑实验 |
| 3.1.17 表达产物的SDS-聚丙烯酰胺电泳 |
| 3.1.18 表达产物的Western-blotting检测 |
| 3.1.19 体外表达cp蛋白的粗纯化 |
| 3.1.20 间接ELISA检测AcNPV-cp表达的外源蛋白 |
| 3.1.21 NNV cp蛋白负染与电镜观察 |
| 3.1.22 感染AcNPV-cp的Sf9细胞切片 |
| 3.2 结果和分析 |
| 3.2.1 供体质粒pFastBac-cp的构建 |
| 3.2.2 穿梭载体Bacmid-cp的构建 |
| 3.2.3 重组杆状病毒AcNPV-cp的获得 |
| 3.2.4 重组病毒滴度测定 |
| 3.2.5 体外表达蛋白SDS-PAGE分析 |
| 3.2.6 体外表达蛋白的Western blotting鉴定 |
| 3.2.7 酶联免疫吸附试验(ELISA) |
| 3.2.8 NNV cp蛋白负染与电镜观察 |
| 3.2.9 感染AcNPV-cp的Sf9细胞切片 |
| 3.3 讨论 |
| 参考文献 |
| 硕士期间研究成果 |
| 致谢 |
四、一种新颖的棉铃虫单粒包埋核多角体病毒表达系统（论文参考文献）
- [1]暗黑鳃金龟几丁质酶基因hpChi的克隆、表达及活性分析[D]. 邹爽. 河北农业大学, 2014(04)
- [2]含冰核基因重组杆状病毒构建及其应用[D]. 姚润贤. 湖南农业大学, 2013(07)
- [3]水稻条纹病毒NSvc2-N与NSvc2-C蛋白互作的研究[D]. 侯艳玲. 扬州大学, 2013(04)
- [4]鸭甲肝病毒1型一个保守的中和性线性B细胞表位的确定[D]. 周国梅. 山东农业大学, 2012(07)
- [5]华北大黑鳃金龟中肠cDNA文库的构建及其围食膜靶标蛋白的分离与鉴定[D]. 刘小民. 河北农业大学, 2011(07)
- [6]家蚕膜蛋白Baxinhibitor-1与多角体蛋白融合在家蚕杆状病毒表达系统中的表达及鉴定[D]. 白书婉. 浙江理工大学, 2011(08)
- [7]抗人CD28单链抗体基因在Sf9细胞及家蚕中的表达研究[D]. 黄光镁. 苏州大学, 2009(09)
- [8]基于家蚕杆状病毒表达系统表达外源基因研究[D]. 岳万福. 浙江大学, 2009(05)
- [9]几种外源基因真核表达体系研究进展[J]. 李成伟,贾孟,张怡,周庆峰,张红绪. 商丘师范学院学报, 2008(09)
- [10]鱼类神经坏死病病毒衣壳蛋白基因分析及其真核表达[D]. 田飞焱. 华中农业大学, 2008(02)