一、幽门螺杆菌细胞空泡毒素基因毒性片段的克隆与表达（论文文献综述）
张馨玮[1]（2020）在《毛螺梭菌促进结直肠癌转移的机制研究》文中研究指明近年来,关于肠道微生物群对结直肠癌（Colorectal Cancer,CRC）发生发展及转移影响的研究急剧增加。结直肠癌作为全世界范围内最常见的恶性肿瘤之一,具有高发病率、高死亡率、患者预后较差,容易出现复发和转移以及药物抗性等特点。随着宏基因组技术的飞速发展和分子生物学的广泛应用,越来越多的研究结果显示肠道微生物在结直肠癌的发生发展和转移中发挥重要作用。本研究通过收集结直肠癌患者的新鲜粪便及基本信息,采用16S r DNA高通量测序和生物信息学分析发现了结直肠癌转移患者粪便中丰度显着增加的毛螺梭菌科（Lachnospiraceae）,并在人群样本中进行验证;构建Lachnospiraceae与结直肠癌细胞共培养模型和BALB/C-nude裸鼠肝转移模型,进一步研究Lachnospiraceae对结直肠癌细胞生物学行为、结直肠癌体内肝转移的影响。此外,我们对共培养的细胞采用RNA-seq高通量测序技术及KEGG Pathway通路富集分析,发现显着富集的糖酵解/糖异生通路;蛋白互作网络分析表明PGK1为该通路中7个蛋白的关键节点;利用qRT-PCR和WB实验验证通路中关键分子的表达,发现PGK1的表达显着上调;进一步体内、外实验探讨PGK1在Lachnospiraceae促进结直肠癌转移中的作用及机制,以期为结直肠癌的预防或治疗策略的制定提供理论依据。一、结直肠癌患者粪便肠道菌群特征分析1.临床样本收集及基本人口学特征分析:收集131例江苏省肿瘤医院行结直肠癌根治术患者的新鲜粪便。根据病人的一般情况及恶性肿瘤的TNM分期对结直肠癌患者信息进行基本人口学特征分析。所有样本均符合相应的排除和纳入标准,并经江苏省肿瘤医院及东南大学伦理委员会批准。2.采用Fast DNA Spin Kit for Feces（MP）试剂盒提取粪便样本细菌的总DNA;采用1%的琼脂糖凝胶电泳对总DNA样本进行鉴定,并测定其浓度;利用特异性引物对抽提的总DNA进行PCR扩增,用2%的琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物。采用Tru Seq?DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建库试剂盒构建文库,并对PCR扩增产物的16S r DNA的V4可变区进行测序;采用OTUs聚类分析、Alpha多样性分析、Beta多样性分析和LEf Se分析等方法对结直肠癌转移与非转移患者粪便微生物种类进行多样性和分类学分析及比较,发现结直肠癌转移患者粪便中丰度显着增加的Lachnospiraceae,并将其作为研究对象。二、毛螺梭菌对结直肠癌肝转移的影响研究1.采用qPCR实验检测结直肠癌转移与非转移患者粪便样本中Lachnospiraceae的表达情况,结果显示,与非转移组相比,结直肠癌转移患者粪便中Lachnospiraceae的丰度显着增加（P<0.01）。2.将Lachnospiraceae与SW480细胞共培养,分别采用CCK8实验、Ed U实验和Transwell实验检测结直肠癌细胞活力、增殖、迁移和侵袭等能力,研究Lachnospiraceae对结直肠癌细胞生物学行为的影响。细胞表型实验结果显示,Lachnospiraceae可显着增加SW480细胞的活力、增殖、迁移和侵袭能力（P<0.001,P<0.001,P<0.001,P<0.001）。3.构建BALB/C-nude裸鼠肝转移模型探讨Lachnospiraceae对结直肠癌转移的影响。采用活体成像技术检测小鼠结直肠癌转移情况,结果显示,单侧脾下注射SW480细胞合并灌胃Lachnospiraceae溶液组小鼠的肝脏荧光强度较其他各组均显着升高（P<0.001,P<0.001,P<0.001）,小鼠肝脏出现多发性肿瘤;进一步采用苏木精-伊红染色法（Hematoxylin-eosin,H&E）对转移肝组织进行病理学诊断,发现相对于其他各组,单侧脾下注射SW480细胞合并Lachnospiraceae灌胃组小鼠肝脏出现明显的结直肠癌肿瘤细胞定植;采用免疫组化染色法（immunohistochemistry,IHC）检测小鼠肝组织中肠癌特异性标志物细胞角蛋白（Cytokeratin 20,CK20）的表达水平,结果显示单侧脾下注射SW480细胞合并Lachnospiraceae灌胃组小鼠肝脏组织中CK20蛋白的表达水平高于其他各组。以上结果表明,Lachnospiraceae可显着增强结直肠癌的肝脏转移能力。三、毛螺梭菌促进结直肠癌肝转移的分子机制研究1.采用RNA-seq高通量测序技术检测Lachnospiraceae与SW480共培养细胞的m RNA表达谱,通过差异m RNA的KEGG Pathway分析发现上调的m RNA显着富集糖酵解/糖异生通路,蛋白互作网络分析结果显示PGK1为该通路中7个蛋白的关键节点。2.采用qRT-PCR实验对糖酵解/糖异生通路的关键分子PGK1在Lachnospiraceae与SW480、RKO共培养细胞中的表达水平进行验证,实验结果显示,与对照组相比,Lachnospiraceae可显着上调两种结直肠癌细胞中PGK1的表达水平（P<0.01,P<0.01）。进一步采用Western Blot实验从蛋白水平验证Lachnospiraceae对SW480、RKO中PGK1表达水平的影响,结果显示,与对照组相比,Lachnospiraceae可显着上调两种结直肠癌细胞中PGK1的蛋白表达水平（SW480:P<0.01;RKO:P<0.01）。3.通过对结直肠癌细胞进行候选关键分子si RNA转染实验,在此基础上采用qRTPCR实验检测PGK1敲减效率,采用CCK8、Ed U和Transwell实验分别检测SW480、RKO细胞活力、增殖、迁移和侵袭等能力,探索PGK1对结直肠癌细胞生物学行为的影响。实验结果表明,与对照组相比,敲减PGK1可显着降低SW480、RKO细胞的活力、增殖、迁移和侵袭等能力（SW480:P<0.05,P<0.01,P<0.05,P<0.01;RKO:P<0.05,P<0.01,P<0.05,P<0.05）。4.构建小鼠肝转移模型,采用免疫组化染色实验观察Lachnospiraceae对PGK1表达的影响。实验结果显示,Lachnospiraceae可显着促进小鼠肝脏肿瘤组织中PGK1的表达。综上所述,我们发现Lachnospiraceae在结直肠癌转移患者粪便中丰度显着增加,且Lachnospiraceae丰度的改变可影响结直肠癌细胞生物学行为及小鼠肝脏转移能力;敲减PGK1可显着降低结直肠癌细胞活力、增殖、迁移和侵袭能力。提示Lachnospiraceae可通过调控PGK1的表达参与糖酵解通路,从而参与调节结直肠癌转移过程。因此本研究认为,Lachnospiraceae可以作为结直肠癌肝转移的关键分子标志物,为结直肠癌肝转移的早期发现及干预提供新的研究方向。
毛刚[2]（2020）在《改良镶嵌疗法治疗幽门螺杆菌的临床疗效研究》文中指出目的:研究改良镶嵌疗法作为一线根治幽门螺杆菌（HP）方案的临床疗效研究和安全性评价。方法:选取2017年1月至2018年4月成都中医药大学附属医院脾胃病科门诊确诊为幽门螺杆菌感染的患者共120例,随机分为A、B两组,A组62例,B组58例。A组给予改良镶嵌疗法（埃索美拉唑镁肠溶片40mg+阿莫西林1.0g,2次/天,疗程7天,埃索美拉唑镁肠溶片40mg+阿莫西林1.0g+呋喃唑酮0.1g+厚朴水煎剂50ml 2次/天,疗程7天）;B组给与铋剂四联疗法（埃索美拉唑镁肠溶片40mg+胶体果胶铋200mg+阿莫西林1.0g+呋喃唑酮0.1g 2次/天,疗程14天）。治疗期间每周随访一次,了解患者的依从性、临床症状变化及不良反应情况;治疗结束1周内复查电子胃镜、胃蛋白酶原检测,观察内镜下胃炎改善情况、胃蛋白酶原变化情况;疗程结束4周后行13碳呼气试验,观察幽门螺杆菌根治情况;试验开始、结束均行常规试验室检查。结果:所有患者均完成了试验研究。（1）根治率情况治疗后A组HP根除率为95.16%,B组HP根除率为91.38%,A组的根除有效率较B组升高,但差异无统计学意义,P>0.05。（2）临床症状改善情况两组各临床症状积分均较治疗前下降,差异有统计学意义,P<0.05;治疗后两组各临床症状积分比较:两组间治疗后各临床症状积分比较:A组的腹痛、腹胀、纳差等临床症状积分较B组显着下降,差异具有统计学意义,P<0.05;两组治疗后总临床症状积分之间相比较,差异无统计学意义P>0.05。（3）内镜疗效两组内镜积分治疗前后比较:两组患者治疗后内镜下积分均较本组治疗前下降,差异具有统计学意义P<0.05;治疗后两组间各内镜下积分比较:A组治疗后的黏膜肿胀内镜下积分较B组治疗后下降,差异具有统计学意义,P<0.05;两组治疗后总内镜下积分之间相比较,差异无统计学意义,P>0.05。（4）早癌相关指标两组胃蛋白酶原（PGA、PGC）治疗前后比较:两组患者治疗后PGA均较本组治疗前下降,差异具有统计学意义,P<0.05,A组治疗后PGC较本组治疗前下降,差异具有统计学意义,P<0.05,B组治疗后PGC较治疗前下降,但无统计学意义,P>0.05;两组间治疗后PGA、PGC相比较,差异无统计学意义,P>0.05。（5）A组出现不良反应9例,发生率为14.5%,B组出现不良反应17例,发生率为29.3%,A组出现不良反应率较低,两组间比较差异有统计学意义,P<0.05,处理后没有患者出现因不良反应终止研究。结论:改良镶嵌疗法根治幽门螺杆菌具有良好的疗效,且安全性高、耐受性好,能取得更好的临床症状缓解、内镜下炎症缓解,不良反应发生率更低,在临床上作为一种理想的根治方案,值得推广。
杨丽萍[3]（2020）在《幽门螺杆菌CagA蛋白对胃癌细胞能量代谢的影响》文中进行了进一步梳理目的:探究幽门螺杆菌（Helicobacter pylori,H.pylori）的细胞毒素相关基因A蛋白（Cytotoxin associated gene A,Cag A）对胃癌细胞能量代谢的影响,构建Cag A诱导的胃癌细胞能量代谢网络,从能量代谢角度探讨Cag A促进胃癌发展的分子机制。方法:（1）建立过表达cag A的胃癌细胞模型。构建过表达cag A重组腺病毒载体p Adeno-cag A并鉴定,用腺病毒感染原代胃癌细胞WZK、YHD胃癌细胞,观察细胞的形态变化;用蛋白质免疫印迹（Western blot,WB）和免疫荧光（Immunofluorescence,IF）检测Cag A蛋白的表达及细胞定位。（2）过表达Cag A对细胞糖酵解代谢酶和GLUT1的影响。（1）利用腺病毒感染WZK、YHD原代胃癌细胞,WB检测已糖激酶2（Hexokinase 2,HK2）、烯醇化酶-α（Enolase 1,ENO1）、丙酮酸激酶1/2（Pyruvate kinase 1/2,PKM1/2）、乳酸脱氢酶A（Lactate dehydrogenase A,LDHA）糖酵解代谢酶和葡萄糖转运蛋白1（Glucose transporter 1,GLUT1）的蛋白表达。（2）用Lipofectamine 2000分别将过表达glut1质粒p CDH-glut1和空载质粒转染胃癌细胞,嘌呤霉素筛选,WB、IF验证BGC823/glut1和AGS/glut1稳转细胞株。IF检测GLUT1与Cag A的细胞共定位。（3）过表达Cag A对细胞能量代谢相关指标的影响。腺病毒感染AGS、YHD、BGC-823/glut1和AGS/glut1胃癌细胞,实验分为空白组（Mock）、空载腺病毒组（NC）和Cag A腺病毒组（Cag A）。（1）多功能酶标仪检测细胞ATP、葡萄糖摄取和葡萄糖消耗能力。（2）Seahorse能量代谢仪检测AGS、YHD的ATP速率和线粒体功能。（4）代谢组学研究。（1）相对定量能量代谢组:收集腺病毒感染YHD 72 h的细胞样本,分为NC组和Cag A组,每组5个生物学重复,利用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析方法,靶向29个能量代谢物进行相对定量分析。（2）基于13C标记的葡萄糖代谢流分析:用腺病毒感染AGS 30 h后替换成含13C标记的葡萄糖的DMEM高糖培养基,分为NC组和Cag A组,每组5个生物学重复,用LC-MS/MS方法分析含同位素的能量代谢产物。（3）氨基酸绝对定量代谢组学:收集腺病毒感染AGS 48 h的细胞样本,进行细胞计数,分为NC组和Cag A组,每组5个生物学重复,利用气相色谱法–质谱法联用（GC-MS）技术进行靶向20种氨基酸的绝对定量代谢组学分析。（5）过表达Cag A对胃癌细胞DNA损伤的影响。IF检测磷酸化组蛋白（Histone H2AX phosphorylation,γH2AX）表达,流式细胞术检测过表达Cag A的胃癌细胞SGC-7901、AGS、WZK、YHD的细胞周期分布、细胞凋亡。结果:（1）成功构建了cag A重组腺病毒载体,包装的p Adeno-cag A腺病毒感染原代胃癌细胞后,细胞形态发生明显的“蜂鸟状”改变。（2）（1）WB结果显示,与NC组比较,过表达Cag A的WZK、YHD细胞中糖酵解代谢酶HK2、ENO1和GLUT1的表达下调;在YHD细胞中PKM1/2表达上调、LDHA表达下调。差异均有统计学意义（P<0.05）。（2）成功建立过表达glut1的稳转细胞株AGS/glut1和BGC-823/glut1,免疫荧光结果显示Cag A在细胞膜和胞质中均有表达,与Glut1在细胞膜上共定位,引起Glut1的表达降低并形成碎片。（3）（1）p Adeno-cag A腺病毒感染48 h的AGS、YHD细胞中ATP水平、葡萄糖消耗水平、葡萄糖摄取水平均显着增加（P<0.05）,BGC-823/glut1和AGS/glut1细胞中ATP水平也显着增加（P<0.05）。（2）ATP速率结果显示,与NC组比较,过表达Cag A组细胞中糖酵解ATP生成速率增加、原代细胞YHD中线粒体ATP生成速率降低（P<0.05）。线粒体功能检测显示,过表达Cag A的YHD细胞中线粒体基础呼吸（Basal respiration）、呼吸储备能力（Spare respiratory capacity）及ATP生成均显着下降（P<0.0001）,AGS细胞中线粒体ATP生成降低（P<0.05）。（4）靶向能量代谢组及代谢流分析结果均显示大多数三羧酸循环代谢产物显着降低,糖酵解中部分代谢物水平上调或不变;氨基酸绝对定量代谢组学中,20种氨基酸显着上调。（5）IF显示p Adeno-cag A腺病毒感染的AGS、YHD细胞γH2AX的表达增强。与NC组比较,SGC-7901、AGS、YHD、WZK细胞G2/M期细胞百分比及凋亡细胞百分数显着增加（P<0.05）。结论:（1）过表达Cag A下调胃癌细胞中糖酵解代谢酶HK2、ENO1和GLUT1的表达。（2）H.pylori-Cag A主要靶向线粒体,引起线粒体的能量代谢障碍,降低线粒体的储备能力,使有氧氧化的产能降低,糖酵解代谢和氨基酸代谢增加,诱导细胞代谢重塑。（3）Cag A具有基因毒性,能诱导细胞DNA双链断裂,促进细胞凋亡,可能与胃癌组织中基因不稳定有关。
孙大林[4]（2019）在《幽门螺杆菌可塑区virB2和virB11基因生物学功能研究》文中研究指明目的:幽门螺杆菌（Helicobacter pylori,H.pylori）是已知与人类胃及十二指肠疾病相关最重要的细菌,virB2和virB11为幽门螺杆菌可塑性区IV型分泌系统tfs3a基因簇结构基因,它们的生物学功能特性在目前可获得的文献中很少报道。为此,本论文以以H.pylori临床分离株H.pylori WH-21可塑性区virB2和virB11基因及其蛋白作为研究对象,通过分子生物学、免疫学和生物信息学进一步研究virB2和virB11基因及其编码产物,为进一步研究H.pylori致病机制及诊断和治疗等奠定基础。方法:1.Karmali培养基微需氧环境中培养H.pylori WH-21菌株。2.PCR法构建virB11基因的原核表达载体,IPTG法诱导宿主表达,Ni2+-NTA法纯化融合蛋白,利用尿素梯度透析复性蛋白免疫家兔制备抗重组VirB11蛋白多克隆抗血清。3.Western blotting法检测VirB11蛋白的亚细胞定位,免疫共沉淀实验和质谱分析方法进行VirB11蛋白的互作蛋白分析。4.将不同浓度的纯化的VirB11蛋白与人正常胃上皮细胞GES-1共培养,并测定共培养后上清液中的IL-8含量。5.合成VirB2蛋白,与正常胃上皮细胞GES-1共培养进行MTT实验,用小鼠制备多克隆抗体,测定抗体效价。6.使用生物信息学软件分析virB2和virB11基因编码蛋白的理化性质、细胞定位、信号肽及空间结构等。结果:1.使用H.pylori WH-21菌株为模板,成功获得了长度为940bp的virB11基因的全长片段。2.通过构建virB11基因的原核表达载体pET28a-virB11,诱导纯化获得VirB11蛋白,免疫雄兔,获得了效价为1:16000的兔抗-VirB11多克隆抗体。3.测定了VirB11蛋白和GES-1共培养的上清液IL-8浓度,结果表明VirB11蛋白的细胞毒性有浓度依赖性,在一定程度上说明宿主炎症的产生与VirB11蛋白的存在有一定的关系。4.通过免疫印迹法、质谱等分析方法,利用免疫雄兔制备的VirB11蛋白的多克隆抗体对VirB11蛋白进行研究的结果表明,VirB11定位于细胞内膜,与ATP合酶β亚基（ATP syntheses subunit beta）、异柠檬酸脱氢酶（isocitrate dehydrogenate）、胞液氨基肽酶（cytosol aminopeptidase）和F0F1ATP合酶α亚基（F0F1 ATP syntheses subunit alpha）和苹果酸:醌氧化还原酶（malate:quinone oxidoreductase）等存在相互作用。5.利用合成的VirB2蛋白获得了鼠抗-VirB2多克隆抗体,明确了VirB2蛋白是一种有浓度依赖性细胞毒作用的蛋白。6.生物学软件分析显示,virB11基因编码的蛋白质VirB11蛋白的等电点为8.46,VirB11蛋白由313个氨基组成,它的分子量为36kDa,属于亲水性稳定蛋白,空间结构呈六聚体通道状,进一步证实VirB11蛋白参与ATP代谢的功能。virB2基因编码的蛋白质VirB2蛋白的等电点为9.56,VirB2蛋白由313个氨基组成,它的分子量为11kDa,但是它同VirB11蛋白不一样,属于疏水性稳定蛋白。结论:1.通过生物学软件分析,明确了VirB2蛋白是疏水性的稳定蛋白而VirB11蛋白则是一种亲水性的稳定性蛋白。2.明确了VirB11定位于细胞内膜,与ATP合酶β亚基（ATP syntheses subunit beta）、异柠檬酸脱氢酶（isocitrate dehydrogenase）、胞液氨基肽酶（cytosol aminopeptidase）和F0F1ATP合酶α亚基（F0F1 ATP syntheses subunit alpha）和苹果酸:醌氧化还原酶（malate:quinone oxidoreductase）等存在相互作用。进一步证实了VirB11蛋白的ATP代谢相关性。3.明显提示VirB11蛋白与细胞分泌IL-8及组织炎症的发生有关。4.明确了VirB2蛋白的抗原性以及浓度依赖细胞毒的作用。
邱涛涛[5]（2018）在《卵黄抗体对黄曲霉毒素B1的降毒效应及机制研究》文中提出黄曲霉毒素（Aflatoxins,AFs）是一类由真菌寄生曲霉菌、黄曲霉菌等产毒菌株产生的次生代谢产物,广泛存在食品和饲料中。其中,以黄曲霉毒素B1（Aflatoxin B1,AFB1）的肝毒性、基因毒性和免疫毒性最强。卵黄免疫球蛋白（Egg Yolk Immunoglobulin,IgY）又称卵黄抗体,存在于经特定抗原免疫禽类的蛋黄中,与哺乳动物血清IgG具有相同特性,能与抗原特异性识别结合。已应用于婴幼儿食品和畜禽饲料中,抵抗病毒和细菌性疾病的侵害。另对IgY研究发现,IgY还可以有效识别大分子蛋白毒素如蛇毒、细菌外毒素等,起到降低毒素毒性的作用。目前,卵黄抗体对小分子毒素的降毒效应缺少基础研究。本研究首次探讨IgY对小分子毒素的降毒效应和其机制。以小分子真菌毒素AFB1为研究对象,小分子真菌毒素ZEN设为对照,合成半抗原后偶联成人工全抗原,免疫蛋鸡制备得到高纯度和特异性IgY。建立细胞染毒模型探讨抗AFB1-IgY对AFB1诱导细胞毒性、功能紊乱和基因毒性的抑制作用;以及在其它细胞系中对AFB1诱导细胞毒性的抑制作用;同时建立体内AFB1诱导肝损伤模型和代谢实验,探讨抗AFB1-IgY降低AFB1诱发肝基因毒性和氧化损伤效应机制。本论文的主要研究成果及结论总结如下:⑴制备出高纯度和特异性抗AFB1-IgY采用加成法AFB1与乙醇酸（GA）合成半抗原AFB1-GA,ZEN与羧甲氧基胺半盐酸盐（CMO）反应合成半抗原ZEN-CMO,再通过活泼酯法将AFB1-GA和ZEN-CMO半抗原与载体蛋白（BSA和OVA）偶联制备AFB1-GA-BSA和ZEN-CMO-BSA人工抗原,免疫蛋鸡,收集鸡蛋。采用酸性条件下水稀释法和微孔过滤提取蛋黄水溶液,结合盐析法和大分子沉淀法纯化IgY,获得高纯度IgY,纯度为94%。实验发现抗原不同,蛋黄中抗体活性随免疫时间的变化情况也不尽相同,用AFB1-GA-BSA和ZEN-CMO-BSA免疫蛋鸡,均能产生IgY,但产生的活性和时间不同,AFB1-GA-BSA免疫蛋鸡产生IgY的抑制率较高,获得高活性IgY的时间相对较短。本实验中制备的抗AFB1-IgY对抗原AFB1的灵敏度较高,最低检测限LOD为0.06ng/mL,IC50为2.4ng/mL,检测线性范围为0.1332.8ng/mL,对AFB2、交叉反应率均低于5%,而AFG1和AFG2交叉反应率均低于0.1%,反应出抗AFB1-IgY对AFB1有很好的特异性、识别和结合能力。制备的抗ZEN-IgY对抗原ZEN的灵敏度表现相对较低,最低检测限LOD为9.27ng/mL,IC50为83.76ng/mL,检测线性范围为13.78508.85ng/mL,对玉米赤霉酮、α-玉米赤霉醇和β-玉米赤霉醇的交叉反应分别小于:85%,20%和20%;而对AFB1和赭曲霉毒素的交叉反应小于2%,反应出ZEN-IgY对ZEN有一定的识别和结合能力,但特异性较差。⑵体外抗AFB1-IgY对AFB1诱导细胞毒性、功能紊乱和基因毒性的抑制作用建立人正常肝细胞L-02体外染毒模型,研究抗AFB1-IgY对AFB1诱导细胞毒,功能紊乱(活性氧化产物和线粒体膜电位和基因毒性的抑制作用。结果显示分别添加0.125μM、0.25μM和0.5μM抗AFB1-IgY与100μM AFB1于培养基中与L-02细胞孵育48h后,细胞的存活率明显升高、凋亡数量下降、周期阻滞和线粒体膜电位变化得到缓解、活性氧化产物降低、DNA损伤改善。并且随着抗AFB1-IgY浓度的增加,相对AFB1处理组抑制凋亡蛋白BCL2和survivin的表达水平随之增加,而促凋亡蛋白caspase-3和BAX的表达水平随之降低,实验结果显示抗AFB1-IgY本身对细胞凋亡蛋白并没有调节作用,细胞的抗氧化蛋白CAT和SOD1的表达水平亦没有随着抗AFB1-IgY的增加活性增加。AFB1进入细胞终产物AFB1-DNA的浓度检测发现随着抗AFB1-IgY的添加,形成的AFB1-DNA加合物浓度逐步降低。综合以上实验结果:随着抗AFB1-IgY的添加,抗AFB1-IgY与AFB1的特异性识别结合后形成蛋白大分子复合物,此复合物不能被细胞所吸收,AFB1进入细胞量减少,随之降低AFB1诱导的细胞毒性、功能紊乱和基因毒性。⑶其它细胞系中抗AFB1-IgY对AFB1诱导细胞毒性的抑制作用基于AFB1主要靶器官肝脏、肠道和生殖系统,选取人肝癌细胞HepG2、人结肠癌细胞HTC-8和人孕早期滋养层细胞Swan 71作为研究对象,建立三种细胞AFB1的染毒模型,进一步补充、丰富抗AFB1-IgY对AFB1诱导细胞毒性的抑制作用数据。结果显示抗AFB1-IgY能降低AFB1对三种细胞存活率的抑制,及AFB1诱导HTC-8细胞的凋亡,存在明显的剂量效应关系;通过transwell实验发现抗AFB1-IgY能降低AFB1抑制Swan 71细胞的侵袭和迁移功能。以上结果表明,在其它细胞系中抗AFB1-IgY同样具备对AFB1诱导细胞毒性抑制能力,推测机体同时摄入抗AFB1-IgY和AFB1后,能降低AFB1对机体的肝毒性、生殖毒性及肠道损伤。⑷抗AFB1-IgY对AFB1诱导大鼠肝基因毒性和氧化损伤的预防作用为探讨抗AFB1-IgY对AFB1诱导大鼠肝基因毒性和氧化损伤抑制作用及机制。通过体外实验确定抗AFB1-IgY和AFB1体外结合比例,建立AFB1诱发大鼠肝损伤模型和AFB1代谢实验。实验结果显示抗AFB1-IgY是一种有效的营养保护剂,可以抑制AFB1诱发早期肝脏损伤生化标志物变化,但IgY并不是通过增加抗凋亡蛋白表达和抗氧化酶活性来实现对肝的保护。进一步AFB1在血液、尿液、肝脏和粪便的代谢产物研究发现中高剂量抗AFB1-IgY与AFB1共同处理大鼠后,AFB1-DNA加合物分别减少了43.3%和52.9%;AFB1-alb分别减少了10.5%和21.1%;AFB1-N7-gua分别减少了19.6%和34.4%,粪便中AFB1增加了约2倍,AFB1-DNA、AFB1-alb和FB1-N7-gua是AFB1诱导机体基因毒性的标志产物,结果证实抗AFB1-IgY是通过抑制AFB1的吸收起到基因毒性预防作用。实验结果证实抗AFB1-IgY能够识别并结合小分子毒素AFB1,形成非共价复合物,减少机体对AFB1吸收,降低小分子毒素AFB1对肝脏组织的基因毒性和氧化损伤。本研究首次为口服IgY抑制动物体内小分子毒素的摄取提供了实验依据。综上所述,抗AFB1-IgY对AFB1具有潜在的降毒作用。在体外实验中抗AFB1-IgY通过与AFB1的结合,减少了AFB1进入细胞所诱发的细胞毒性、细胞功能紊乱和基因毒性。在体内实验中抗AFB1-IgY通过与AFB1形成的非共价复合物,减少胃肠道对AFB1的吸收,降低AFB1诱发肝基因毒性和氧化损伤。本研究增加了抗体新的应用途径,为脱除小分子毒素提供了一种新的思路。
孟楠[6]（2017）在《TIPE3与HP感染相关胃十二指肠疾病关系的研究》文中研究表明目的:本研究旨在探讨TIPE3在幽门螺杆菌引起的胃十二指肠疾病中的表达情况及TIPE3与幽门螺杆菌（Helicobacter pylori,Hp）毒力蛋白CagA在胃十二指肠相关疾病中相关关系的研究。方法:本研究病例来自2016年1月至2017年1月期间在泰安市中心医院就诊的经胃镜确诊的患者,同时经14C呼气实验证实为Hp阳性的患者90例,包括胃十二指肠炎症组45例和胃癌45例;其中,男性62名和女性28名,年龄为38-76岁,平均年龄为59.2±14.2岁,收集患者病历资料及病理标本。分别采用免疫组织化学法,Real-TimePCR方法和Western-Blot法对45例胃癌组织和45例胃十二指肠炎症组织中的TIPE3与CagA进行检测,分析两者的表达特点,探讨两者在Hp感染相关胃十二指肠炎症与胃癌发生与发展中的作用。结果:1.TIPE3在胃癌组织和胃十二指肠炎症组织中的阳性表达率分别为82.22%和48.89%,表达的差异性具有统计学意义。2.CagA在胃癌组织和胃十二指肠炎症组织中的阳性表达率分别为77.78%和33.33%,表达的差异性具有统计学意义。3.胃癌组织中TIPE3mRNA和CagAmRNA的表达量高于胃十二指肠炎症组织,表达的差异性具有统计学意义。4.胃癌组织中TIPE3蛋白和CagA蛋白的表达高于胃十二指肠炎症组织的表达。结论:在Hp感染相关疾病中,胃癌组织中TIPE3和CagA的表达水平高于胃十二指肠炎症组织中的表达水平。TIPE3和幽门螺杆菌毒力蛋白CagA协同作用,可能在Hp感染相关的胃癌和胃十二指肠炎症的发生与发展中发挥重要作用。
陈建国[7]（2013）在《幽门螺杆菌CagA/UreB口服减毒沙门氏菌活载体疫苗的研究》文中进行了进一步梳理幽门螺杆菌（Helicobacter pylori, H. pylori, Hp）广泛存在于人类的胃中,是导致慢性胃炎、胃肠溃疡、胃腺癌等胃肠疾病的主要病原菌,已严重影响着人们的身体健康。尽管国内外采用抗生素三联、四联疗法在治疗H. pylori引起相关的胃炎和胃溃疡等胃肠疾病方面取得了较大成果,但临床发现广谱抗生素的治疗导致幽门螺杆菌耐药菌株不断出现和治愈后复发率居高不下,临床上将很快进入“感染-治愈-复发-再治疗-耐药”的恶性循环,不能彻底解决问题。因此希望通过疫苗免疫奶牛使在牛奶中产生高水平的抗幽门螺杆菌抗体,通过口服该抗体,来预防和治疗H. pylori引起的慢性胃炎、胃肠溃疡等胃肠疾病。因此希望使用安全、高效、使用方便的疫苗来免疫动物产生高浓度抗体或用该疫苗免疫动物使之对幽门螺杆菌产生有效的抵抗力。本研究首先选取生产后10天健康、无乳腺疾病和生殖器官疾病、体温正常的奶牛14头,随机分为两组：PBS对照组和幽门螺杆菌全菌蛋白免疫注射组,每组7头。用浓度为2×1010cfu/mL的幽门螺杆菌（H. polyri）NCTC11637全菌经超声破碎后与等剂量的完全（不完全）弗氏佐剂充分乳化后分别于0、14、28天三次多点肌肉注射全菌蛋白疫苗,每次4mL,免疫产后泌乳的健康奶牛,对照组每次注射PBS与弗氏佐剂乳化物4mL。每周采血和收集牛奶各一次,离心收集血清,以酶联免疫吸附试验测定血清、乳汁的IgG抗体,同时测量体温,观察发情和采食泌乳等健康情况。研究结果显示经肌注幽门螺杆菌全菌蛋白免疫奶牛后可在血清和乳汁中产生特异性抗体,抗体浓度显着高于对照组（P<0.05）,但免疫结束后不久逐渐下降。免疫奶牛的体温、发情和采食泌乳等情况正常。但全菌蛋白疫苗费用高,制作麻烦,注射时阻力大、奶牛反应强烈,且需要多次多点注射。结果表明肌肉注射幽门螺杆菌全菌蛋白疫苗是一个安全、有效的免疫途径。但全菌蛋白疫苗制作麻烦,费用高,注射时奶牛反应大。因此希望构建更加安全、高效和使用更为方便的疫苗代替幽门螺杆菌全菌蛋白疫苗。考虑到幽门螺杆菌是肠道菌群,通过口服引起胃肠道粘膜免疫是一种可行途径。但口服的蛋白疫苗的制作复杂,提纯麻烦,且时间较长,同时需加相应的免疫佐剂提高免疫原性,在口服过程中蛋白疫苗还容易被胃酸及胃蛋白酶破坏而丧失免疫功能。因此考虑用大肠杆菌或减毒沙门氏菌来作为载体。本实验室多次采用减毒猪霍乱沙门氏菌C500作为载体,安全且免疫效果好,希望构建幽门螺杆菌的减毒猪霍乱沙门菌C500口服活载体疫苗。本实验选取幽门螺杆菌中已证实具有免疫原性的两个基因：尿素酶B（urease B, UreB）和细胞毒素相关抗原（cytotoxin-associated antigen, CagA）。先采用PCR技术从幽门螺杆菌标准株SS1扩增Hp-UreB和Hp-CagA基因,将其连接至原核表达质粒pYA3493中,使之构建为pYA3493-UreB-CagA重组质粒,经PCR及酶切鉴定后测定其基因序列,并与GenBank中已发表的相关序列的进行同源性分析。重组质粒pYA3493-UreB-CagA电击转入减毒猪霍乱沙门菌C500,培养后筛选阳性菌落,抽提质粒进行PCR及酶切鉴定。表达的UreB-CagA蛋白用SDS-PAGE和Western Blotting进行鉴定。然后将无特定病原菌昆明小鼠分成5组,每组10只,分别为肌肉注射幽门螺杆菌全菌蛋白疫苗和灌胃分别给予含质粒pYA3493-UreB-CagA的减毒沙门氏菌C500（0.2mL,1×1010CFUmL-1）、含空质粒pYA3493的减毒沙门氏菌C500（0.2mL,1×1010CFUmL-1）、减毒沙门氏菌C500（0.2mL,1×1010CFUmL-1）以及PBS （0.2mL）。每周免疫一次,连续五次。第六周后再用活H. pylori SS1（0.2mL,1×1010CFUmL-1）灌胃攻击,每天一次,连续三天。第九周采血后处死实验小鼠,取一半胃粘膜和十二指肠研磨进行细菌培养检查H. pylori在胃肠定植情况,另一半用于组织切片和免疫组化观察胃肠损伤情况和免疫蛋白分泌的情况,同时对重要脏器肝、脾、肺进行组织切片观察损伤情况。实验前和实验后每隔一周或二周采血一次,连续8次,离心分离血清,采用ELISA检测小鼠血清中的抗体水平。检验pYA3493-UreB-CagA减毒猪霍乱沙门菌C500口服疫苗对小鼠的免疫效果和口服疫苗的安全性评价。结果：核苷酸序列测定及同源性分析证实,克隆的Hp-CagA和Hp-UreB基因与GenBank中相关序列的同源性分别为98%和100%（472／480和1134／1134）。重组质粒PYA3493-UreB-CagA转染减毒猪霍乱沙门菌C500,可表达约59kD的UreB-CagA蛋白。全菌蛋白注射组和含质粒pYA3493-UreB-CagA的减毒沙门氏菌C500组的血清中幽门螺杆菌特异抗体滴度显着高于含质粒pYA3493的减毒沙门氏菌C500组、减毒沙门氏菌C500组以及PBS组（P<0.01）。但均未完全保护月=pylori SS1对胃的攻击,五组中胃和十二指肠均有H. pylori SS1的定植。但全菌蛋白注射组和含质粒pYA3493-UreB-CagA的减毒沙门氏菌C500组小鼠胃肠内的菌落数量显着低于含质粒pYA3493的减毒沙门氏菌C500组、减毒沙门氏菌C500组以及PBS组（P<0.01）。免疫组化表明全菌注射组和口服疫苗中胃和十二指肠有明显的抗体存在,且所有组胃、十二指肠、肝、脾以及肺均无明显损伤,也无小鼠死亡。结果表明建立了同时表达Hp-CagA和Hp-UreB基因的减毒猪霍乱沙门菌疫苗株,该口服减毒沙门氏菌载体疫苗有明显的免疫预防效果,而且比较安全,但不能完全抑制幽门螺杆菌在胃和十二指肠中定植。以上是UreB-CagA双价口服活载体疫苗在小鼠体内的免疫效果,安全有效。体外实验希望通过构建H. pylori的CagA和UreB基因重组真核表达质粒用电击法转染到胃粘膜上皮细胞GES-1后,用幽门螺杆菌SSl攻击转染成功的胃上皮细胞(（?）ES-1,观察对细胞凋亡及细胞形态的影响,探讨细胞凋亡机制。采用PCR技术从幽门螺杆菌标准株SS1中获取CagA部分基因和UreB全长基因与真核表达载体pEGFP-N1相连,构建幽门螺杆菌CagA/UreB真核荧光表达载体pEGFP-N1-CagA-UreB,并用脂质体的方法将质粒pEGFP-N1-UreB-CagA和空质粒pEGFP-N1分别转染到胃粘膜上皮细胞GES-1中,用(3418筛选阳性细胞,用幽门螺杆菌SSl分别处理转染pEGFP-N1-CagA-UreB的细胞、转染pEGFP-N1的细胞以及没转染质粒的细胞。用Annexin V-APC和7-AAD染色后,流式细胞术检测胃上皮细胞GES-1凋亡和死亡的情况,同时透射电镜观察胃上皮细胞GES-1的形态变化。结果发现用脂质体转染质粒到细胞GES-1,转染效率可高达60%以上,500μg G418可对转染细胞进行筛选,筛选后的阳性细胞用幽门螺杆菌处理后,凋亡率要小于空质粒转染的细胞和未转染质粒的细胞,但长时间处理后GES-1细胞均死亡,电镜结果显示细胞凋亡和坏死。结果表明质粒pEGFP-N1-UreB-CagA可转染到胃上皮细胞GES-1在培养细胞内的表达可抵抗幽门螺杆菌SSl对细胞GES-1的破坏,减少细胞凋亡。但用幽门螺杆菌长时间、大剂量处理也会导致细胞凋亡和坏死。这说明尿素酶B和CagA可导致细胞凋亡,但同时也有其他途径参与凋亡过程。
谢立苹[8]（2012）在《幽门螺杆菌CagM、CagI蛋白的生物信息学分析》文中研究指明幽门螺杆菌（Helicobacter pylori, H. pylori）是目前发现唯一能够在人胃内定植、生存的微需氧革兰氏阴性杆菌。是世界性分布的病原菌,也是目前人类发生率最高的慢性细菌感染之一,全世界范围内感染率超过50%。来自世界各地的流行病学研究证实,H. pylori感染是消化性溃疡和慢性胃炎的重要病因,并与胃癌和胃黏膜相关淋巴样组织（MALT）淋巴瘤的发病密切相关,1994年世界卫生组织已将其列为Ⅰ类致癌原。cag致病岛编码的Ⅳ型分泌系统是幽门螺杆菌的一个重要致病因素,通过此分泌系统cag致病岛可将其唯一效应分子CagA转运至宿主细胞并发挥其毒性作用。目前,cag致病岛编码基因的生物学功能及其参与H. pylori致病的机制尚未明确,因此,本文以cag致病岛中的cagM、cagI基因为研究对象,通过分子生物学、微生物学及生物信息学等技术探讨H. pylori cagM、cagl基因的结构和功能,以指导以后的实验研究,为更深入研究cag致病岛的致病机理奠定理论基础。方法：1.根据GenBank中已报道的H. pylori22695的全基因组序列,利用生物信息学软件Primer5.0自行设计cagM、cagI基因引物,获得H. pylori cagM、cagI基因。2. cagM、cagI基因T-A克隆后构建pGEM-T-cagM, pMD18-T-cagI载体,并进行序列测定。3. cagM、cagI基因测序结果提交GenBank,获得基因库登录号。4.运用DNAstar V7.1软件和ANTHEPROT5.0软件分析CagM、CagI蛋白基本性质,包括：氨基酸组成、分子量、等电点、疏水性、亲水性、抗原性等。5.利用生物信息学软件分析H. pylori cagM、cagI基因核苷酸序列及蛋白序列同源性。6.运用ANTHEPROT5.0软件和网络数据库等分析预测其结构,用PROSITE SCAN和Fingerprint分析推测其潜在的功能,包括蛋白的跨膜区、信号肽和剪切位点、二级结构、三级结构、功能位点、亚细胞定位、蛋白家族、蛋白质指纹图谱等。结果：1.应用PCR技术成功克隆了H. pylori cagM、cagI基因。2. cagM、cagI基因T-A克隆后测序,基因测序结果表明：H. pylori NCTC11637cagM基因全长1149bp （GenBank基因库登录号为：GU269568）,与设计序列大小完全一致,编码376个氨基酸；H. pylori NCTC11637cagI基因全长1086bp （GenBank基因库登录号为：HM126476）,与设计序列大小完全一致,编码361个氨基酸。3. CagM、CagI基本性质分析：CagM蛋白有376个氨基酸,分子量为43.76kD,理论等电点为9.3,有多个疏水区域和亲水区域,有多个抗原决定簇；CagI蛋白有361个氨基酸,分子量为39.37kD,理论等电点为5.56,疏水性不是很强,接近两亲性,亲疏水区域间隔分布,有多个明显的具有抗原活性的结构域。4. H. pylori cagM、cagI基因核苷酸序列及蛋白序列同源性比对分析发现：H.pylori cagM、cagI核苷酸序列与GenBank中已知的其他H. pylori菌株cagM、cagI的核苷酸序列同源性分别为96～99%和95～99%；将核苷酸序列按标准密码子翻译成蛋白质后,其氨基酸序列与其他H. pylori菌株氨基酸序列同源性分别为98～99%和96～99%。5. CagM、CagI结构预测分析：CagM蛋白N端20个氨基酸为信号肽,有一段跨膜区,剪切位点在第20个和第21个氨基酸之间,二级结构和三级结构中螺旋结构为主体,CagM蛋白定位于细菌周质空间；CagI蛋白N端20个氨基酸亦为信号肽,有三段跨膜区,剪切位点亦在第20个和第21个氨基酸之间,二级结构和三级结构中螺旋结构亦为主体,CagI蛋白是定位于外膜。6. CagM、CagI功能预测分析：CagM属于蛋白水解酶家族,有多个磷酸化位点,是多种激酶的底物,有糖基化位点和豆蔻化位点,通过翻译后剪切修饰,形成有功能的蛋白,在细菌周质空间行使信号传递和集装Ⅳ型分泌系统中其他蛋白的功能；CagI为稳定的疏水蛋白,保守性很强,有N-糖基化作用位点、蛋白激酶C磷酸化位点、酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点和豆蔻酰化作用位点,有膜蛋白、菌毛蛋白、转运蛋白、水解酶、ATP/GTP酶、微管蛋白、转录调节因子、锚蛋白、分泌系统蛋白等多个蛋白标签。结论：1.成功克隆了H. pylori cag致病岛中的cagM、cagI基因。2.获得了CagM、CagI蛋白的大部分理化特征数据,包括：氨基酸组成、分子量、等电点、疏水性、亲水性、抗原性等。3. H. pylori cagM、cagI核苷酸序列及蛋白序列同源性比对分析发现cagM、cagI基因作为H. pylori cag致病岛编码的Ⅳ型分泌系统结构基因之一,其核苷酸序列及氨基酸序列相对保守,说明二者在幽门螺杆菌致病过程中具有重要作用。4.应用生物数据库和多种生物学软件对H. pylori CagM、CagI蛋白进行全方位的信息学分析,为分析其结构和功能提供了依据。5.预测分析获得：CagM、CagI作为cag致病岛中两个重要蛋白,CagM蛋白定位于周质空间,功能可能是帮助cag致病岛中其他蛋白的集合组装以及协助转运CagA毒素蛋白；CagI蛋白是定位于外膜,在信号转导和物质转运过程中充当信使或载体,可能具有水解酶活性,ATP/GTP酶活性。
王国富,高峰,吴利先[9]（2012）在《幽门螺杆菌重组Bb-hpaA-vacA疫苗的构建》文中研究表明目的构建幽门螺杆菌（Hp）重组双歧杆菌（Bb）Bb-hpaA-vacA疫苗。方法通过PCR分别扩增hpaA和va-cA抗原编码基因,然后采用基因拼接法（gene SOEing）剪接hpaA和vacA,得到hpaA-vacA融合基因;将该融合基因定向克隆到大肠埃希菌-双歧杆菌穿梭表达载体pGEX-1λT,构建重组质粒pGEX-hpaA-vacA,电穿孔法将该质粒导入Bb,构建幽门螺杆菌重组hpaA-vacA疫苗,然后用SDS-PAGE和Western blotting鉴定表达的重组蛋白。结果 PCR成功扩增出分子量约为1 500bp的hpaA-vacA融合基因,双酶切证实hpaA-vacA融合基因成功插入pGEX-1λT中,并成功转化入双歧杆菌,而且重组蛋白能在双岐杆菌中得到正确表达,Western blotting显示重组蛋白具有免疫原性。结论成功构建螺杆菌rBb-hpaA-vacA疫苗,为该疫苗的进一步研究奠定了基础。
高峰[10]（2011）在《幽门螺杆菌重组Bb-vacA-hpaA候选疫苗的构建》文中提出目的构建幽门螺杆菌vacA-hpaA融合基因；构建大肠杆菌-双歧杆菌穿梭表达质粒pGEX-vacA-hpaA;分析重组质粒pGEX-vacA-hpaA在大肠杆菌BL21中的表达;电穿孔转化两歧双歧杆菌（Bb）,构建幽门螺杆菌重组Bb-vacA-hpaA候选疫苗。方法以质粒pQE-vacA、pET-hpaA为模板,PCR扩增获得vacA和hpaA编码基因序列；依次构建重组质粒pQE-hpaA, pQE-vacA-hpaA,以重组质粒pQE-vacA-hpaA为模板,PCR扩增构建融合基因vacA-hpaA。将融合基因vacA-hpaA定向连接至大肠杆菌-双歧杆菌穿梭表达载体pGEX-1λT,构建重组质粒pGEX-vacA-hpaA。电穿孔将pGEX-vacA-hpaA导入BL21, SDS-PAGE分析pGEX-vacA-hpaA在大肠杆菌BL21中的表达；Western blot鉴定表达蛋白的抗原性。最后将pGEX-vacA-hpaA电转化导入Bb,构建幽门螺杆菌重组Bb-vacA-hpaA候选疫苗。结果琼脂糖凝胶电泳证实vacA-hpaA融合基因全长1500bp左右,测序结果显示其与预期结果一致。双酶切证实vacA-hpaA融合基因成功插入pGEX-1λT质粒,成功构建重组质粒pGEX-vacA-hpaA并成功转入大肠杆菌BL21。SDS-PAGE结果显示重组质粒在大肠杆菌BL21中经IPTG诱导4h表达了约85KDa的目的蛋白,Western blot分析显示该蛋白能分别与兔抗VacA和兔抗HpaA免疫血清发生特异性结合。最后PCR及双酶切鉴定证实重组质粒pGEX-vacA-hpaA成功转入两歧双歧杆菌Bb,成功获得rBb-vacA-hpaA候选疫苗。结论1.成功构建vacA-hpaA融合基因。2.成功构建幽门螺杆菌穿梭表达载体pGEX-vacA-hpaA。3.幽门螺杆菌穿梭表达质粒pGEX-vacA-hpaA能在大肠杆菌BL21中经IPTG诱导表达,而且所表达的重组蛋白同时具有VacA和HpaA蛋白单独的抗原性。4.成功构建幽门螺杆菌rBb-vacA-hpaA候选疫苗。
二、幽门螺杆菌细胞空泡毒素基因毒性片段的克隆与表达（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、幽门螺杆菌细胞空泡毒素基因毒性片段的克隆与表达（论文提纲范文）
（1）毛螺梭菌促进结直肠癌转移的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 技术路线 |
| 第一章 结直肠癌转移相关的肠道细菌筛选 |
| 第一节 基本人口学特征分析 |
| 1 材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 第二节 16S rDNA测序筛选差异肠道细菌 |
| 1 材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 讨论 |
| 第二章 毛螺梭菌对结直肠癌肝转移的影响研究 |
| 第一节 毛螺梭菌在结直肠癌患者粪便中的丰度验证 |
| 1 材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 第二节 毛螺梭菌对结直肠癌细胞生物学行为的影响 |
| 1 材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 第三节 毛螺梭菌对结直肠癌肝转移的影响 |
| 1 材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 讨论 |
| 第三章 毛螺梭菌促进结直肠癌肝转移的分子机制研究 |
| 第一节 毛螺梭菌促进结直肠癌肝转移的关键分子识别 |
| 1 材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 第二节 毛螺梭菌促进结直肠癌肝转移的关键分子鉴定 |
| 1 材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 第三节 PGK1对结直肠癌细胞生物学行为的影响 |
| 1 材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 第四节 体内实验探讨毛螺梭菌对PGK1表达的影响研究 |
| 1 材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 讨论 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 综述 肠道菌群与消化道恶性肿瘤发生发展关系的研究进展 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（2）改良镶嵌疗法治疗幽门螺杆菌的临床疗效研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附件 |
| 常用治疗方案附录 |
| 参考文献 |
| 英文缩略词对照表 |
| 幽门螺杆菌主要治疗方案的临床进展研究(综述) |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表论文情况 |
| 致谢 |
（3）幽门螺杆菌CagA蛋白对胃癌细胞能量代谢的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 略缩词表 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述:幽门螺旋杆菌 CagA 蛋白与胃癌细胞能量代谢的研究进展 |
| 参考文献 |
| 作者简历 |
| 致谢 |
| 学位论文数据集 |
（4）幽门螺杆菌可塑区virB2和virB11基因生物学功能研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 H.pylori virB11 基因功能研究 |
| (一)材料和方法 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验菌株和载体 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要溶液的配制 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 H.pylori的培养与鉴定 |
| 2.2 H.pylori DNA的提取 |
| 2.3 设计合成virB11 基因的引物 |
| 2.4 PCR克隆virB11 基因 |
| 2.5 PCR产物的胶回收 |
| 2.6 制备E.coli DH5α感受态 |
| 2.7 virB11 基因的T-A连接反应 |
| 2.8 连接产物转化E.coli DH5α感受态细菌 |
| 2.9 virB11 重组质粒的筛选和提取 |
| 2.10 构建、鉴定virB11 重组原核表达的质粒 |
| 2.11 VirB11 融合蛋白的诱导表达和纯化 |
| 2.12 制备VirB11 蛋白的多克隆抗体 |
| 2.13 重组VirB11 蛋白的多克隆抗体效价测定 |
| 2.14 H.pylori分离组分和亚细胞定位 |
| 2.15 VirB11 蛋白的互作蛋白分析 |
| 2.16 virB11 基因推导编码产物的获得及生物信息学分析 |
| 2.17 免疫共沉淀中VirB11 蛋白及互作蛋白的验证 |
| 2.18 VirB11 蛋白与GES-1 细胞共培养上清液的IL-8 检测 |
| (二)结果 |
| 1.1 H.pylori WH-21 菌株的分离培养与鉴定鉴定 |
| 1.2 H.pylori virB11 基因片段的PCR扩增 |
| 1.3 virB11 基因的克隆与鉴定 |
| 1.4 构建并分析virB11 基因重组表达质粒 |
| 1.5 VirB11 重组蛋白的诱导表达及鉴定 |
| 1.6 纯化VirB11 重组蛋白与测定抗体效价 |
| 1.7 定位VirB11 蛋白在细胞内的位置 |
| 1.8 分析VirB11 蛋白的互作蛋白 |
| 1.9 分析VirB11 蛋白的理化特性 |
| 1.10 预测VirB11 蛋白信号肽和跨膜区 |
| 1.11 预测VirB11 蛋白二级结构 |
| 1.12 VirB11 蛋白卷曲螺旋的预测分析 |
| 1.13 VirB11 蛋白三维结构预测 |
| 1.14 检测共培养上清液中IL-8的浓度 |
| (三)讨论 |
| (四)结论 |
| (五)参考文献 |
| 第二部分 H.pylori virB2 基因功能的研究 |
| (一)材料和方法 |
| 1 材料 |
| 1.1 合成VirB2 蛋白 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要溶液配制 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 VirB2 蛋白的生物信息学分析 |
| 2.2 VirB2 蛋白与GES-1 细胞共培养及MTT实验 |
| 2.3 VirB2 蛋白的多克隆抗体制备 |
| 2.4 VirB2 蛋白的多克隆抗体效价测定 |
| (二)结果 |
| 1.1 VirB2 蛋白的理化特性分析 |
| 1.2 VirB11 蛋白信号肽和跨膜区的预测 |
| 1.3 VirB11 蛋白二级结构的预测 |
| 1.4 VirB11 蛋白卷曲螺旋的预测分析 |
| 1.5 VirB11 蛋白三维结构预测 |
| 1.6 VirB2 蛋白与GES-1 细胞共培养及MTT实验分析 |
| 1.7 VirB2 蛋白的多克隆抗体效价测定 |
| (三)讨论 |
| (四)结论 |
| (五)参考文献 |
| 综述 幽门螺杆菌毒力因子的相关研究 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表文章情况 |
| 致谢 |
（5）卵黄抗体对黄曲霉毒素B1的降毒效应及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 主要英文缩略对照表（Abbreviations） |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 AFB_1毒性机理及危害 |
| 1.1.1 AFB_1污染情况及限量标准 |
| 1.1.2 AFB_1毒性机理 |
| 1.1.3 AFB_1对动物危害 |
| 1.2 AFB_1脱除法 |
| 1.2.1 物理脱除法 |
| 1.2.2 化学脱除法 |
| 1.2.3 生物方法脱除法 |
| 1.3 卵黄抗体中和毒素研究 |
| 1.3.1 IgY的形成和结构 |
| 1.3.2 IgY提取与纯化 |
| 1.3.3 IgY生物学优势 |
| 1.3.4 IgY体内代谢活性 |
| 1.3.5 IgY中和蛋白毒素研究 |
| 1.4 口服卵黄抗体的应用 |
| 1.4.1 促生长发育应用 |
| 1.4.2 动物疾病控制应用 |
| 1.5 主要研究内容 |
| 1.5.1 研究目的与研究内容 |
| 1.5.2 研究方法 |
| 1.6 主要技术路线图 |
| 第2章 抗AFB_1和ZEN卵黄抗体的制备及鉴定 |
| 2.1 实验材料与方法 |
| 2.1.1 主要实验试剂及用品 |
| 2.1.2 常用试剂配制 |
| 2.1.3 实验仪器 |
| 2.1.4 实验动物 |
| 2.1.5 饲料配方 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 AFB_1半抗原的衍生 |
| 2.2.2 ZEN半抗原的衍生 |
| 2.2.3 AFB_1人工抗原的制备与鉴定 |
| 2.2.4 ZEN人工抗原的制备与鉴定 |
| 2.2.5 免疫蛋鸡 |
| 2.2.6 卵黄抗体的初步纯化 |
| 2.2.7 冷冻干燥制备卵黄抗体粉 |
| 2.2.8 卵黄抗体纯度鉴定 |
| 2.2.9 间接竞争酶联免疫分析方法 |
| 2.2.10 建立标准曲线 |
| 2.2.11 不同免疫期IgY结合抗原能力 |
| 2.2.12 特异性检测 |
| 2.2.13 数据处理与分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 半抗原的鉴定 |
| 2.3.2 人工抗原的制备与鉴定 |
| 2.3.3 抗体纯度鉴定 |
| 2.3.4 ELISA标准曲线的建立 |
| 2.3.5 不同免疫时期IgY抑制率 |
| 2.3.6 特异性 |
| 2.4 本章小结 |
| 第3章 抗AFB_1-IgY对AFB_1诱导细胞毒性、功能紊乱和基因毒性的抑制作用 |
| 3.1 实验材料与方法 |
| 3.1.1 主要实验试剂及用品 |
| 3.1.2 常用试剂配制 |
| 3.1.3 实验仪器 |
| 3.1.4 细胞株 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 L-02细胞培养 |
| 3.2.2 MTT法检测AFB_1或抗AFB_1-IgY对L-02细胞的毒性 |
| 3.2.3 抗AFB_1-IgY对AFB_1抑制L-02细胞存活影响检测 |
| 3.2.4 细胞凋亡检测 |
| 3.2.5 细胞内活性氧含量的测定 |
| 3.2.6 细胞线粒体膜电位变化检测 |
| 3.2.7 细胞周期检测 |
| 3.2.8 Hoechst染色检测细胞核形态变化 |
| 3.2.9 细胞DNA损伤检测 |
| 3.2.10 AFB_1-DNA加合物测定 |
| 3.2.11 Western blot测定氧化蛋白和凋亡蛋白表达水平 |
| 3.2.12 数据处理与分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 抗AFB_1-IgY或AFB_1对L-02细胞的毒性作用 |
| 3.3.2 抗AFB_1-IgY对AFB_1诱导细胞毒性影响 |
| 3.3.3 抗AFB_1-IgY对AFB_1诱导细胞功能紊乱影响 |
| 3.3.4 抗AFB_1-IgY对AFB_1诱导细胞基因毒性影响 |
| 3.4 本章小结 |
| 第4章 其它细胞模型抗AFB_1-IgY对AFB_1诱导细胞毒性的抑制作用 |
| 4.1 实验材料与方法 |
| 4.1.1 主要实验试剂及用品 |
| 4.1.2 常用试剂配制 |
| 4.1.3 实验仪器 |
| 4.1.4 细胞株 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 HepG2人肝癌细胞培养 |
| 4.2.2 HTC-8人结肠癌细胞培养 |
| 4.2.3 Swan71人滋养层细胞培养 |
| 4.2.4 MTT法检测抗AFB_1-IgY或AFB_1对三种细胞的毒性 |
| 4.2.5 抗AFB_1-IgY对AFB_1抑制HepG2、HTC-8和Swan71细胞存活影响 |
| 4.2.6 HTC-8细胞凋亡检测 |
| 4.2.7 Transwell实验检测Swan71细胞侵袭和迁移能力 |
| 4.2.8 数据处理与分析 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 抗AFB_1-IgY或AFB_1对HepG2细胞毒性 |
| 4.3.2 抗AFB_1-IgY或AFB_1对HTC-8细胞毒性 |
| 4.3.3 抗AFB_1-IgY或AFB_1对Swan71细胞毒性 |
| 4.3.4 抗AFB_1-IgY对AFB_1抑制HepG2细胞存活率影响 |
| 4.3.5 抗AFB_1-IgY对AFB_1抑制HTC-8细胞存活率影响 |
| 4.3.6 抗AFB_1-IgY对AFB_1抑制Swan71细胞存活率影响 |
| 4.3.7 抗AFB_1-IgY对AFB_1诱导HTC-8细胞凋亡影响 |
| 4.3.8 抗AFB_1-IgY对AFB_1诱导Swan71细胞侵袭和迁移能力降低的影响 |
| 4.4 本章小结 |
| 第5章 抗AFB_1-IgY对AFB_1诱导大鼠肝基因毒性和氧化损伤抑制作用 |
| 5.1 实验材料与方法 |
| 5.1.1 主要实验试剂及用品 |
| 5.1.2 常用试剂配制 |
| 5.1.3 实验仪器 |
| 5.1.4 实验动物 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 卵黄抗体制备 |
| 5.2.2 抗AFB_1-IgY与AFB_1体外结合反应 |
| 5.2.3 肝损伤干预实验动物分组及处理 |
| 5.2.4 肝组织病理学检验 |
| 5.2.5 血清肝功能指标的测定 |
| 5.2.6 肝组织一氧化氮的测定 |
| 5.2.7 肝组织脂质过氧化产物丙二醛的测定 |
| 5.2.8 Western blot测定抗氧化蛋白和凋亡相关蛋白表达水平 |
| 5.2.9 抗AFB_1-IgY干预AFB_1代谢实验动物分组及处理 |
| 5.2.10 粪便中AFB_1的定量测定 |
| 5.2.11 AFB_1-N7-Gua,AFB_1-DNA和AFB_1-alb的定量测定 |
| 5.2.12 数据处理与分析 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 体外抗AFB_1-IgY与AFB_1结合作用 |
| 5.3.2 大鼠存活及体重变化状况 |
| 5.3.3 抗AFB_1-IgY对AFB_1诱导大鼠血清肝功能异常影响 |
| 5.3.4 抗AFB_1-IgY对AFB_1诱发大鼠肝脂质氧化影响 |
| 5.3.5 抗AFB_1-IgY对AFB_1诱发大鼠肝组织病理学变化影响 |
| 5.3.6 抗AFB_1-IgY抑制AFB_1诱导大鼠肝细胞凋亡和抗氧化蛋白变化 |
| 5.3.7 抗AFB_1-IgY共同处理对大鼠粪便中AFB_1含量影响 |
| 5.3.8 抗AFB_1-IgY共同处理对大鼠尿液中AFB_1代谢物含量影响 |
| 5.3.9 抗AFB_1-IgY共同处理对大鼠血液中AFB_1-alb含量影响 |
| 5.3.10 抗AFB_1-IgY共同处理对肝组织中AFB_1-DNA含量影响 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 本章小结 |
| 第6章 结论与展望 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 创新性 |
| 6.3 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录A：AFB_1和ZEN半抗原鉴定图谱 |
| 附录B：攻读博士学位期间发表论文 |
（6）TIPE3与HP感染相关胃十二指肠疾病关系的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
（7）幽门螺杆菌CagA/UreB口服减毒沙门氏菌活载体疫苗的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一部分 幽门螺杆菌疫苗的研究进展 |
| 1 幽门螺杆菌的病理损伤机制 |
| 1.1 幽门螺杆菌的生物学特性 |
| 1.2 幽门螺杆菌的感染途径 |
| 1.3 幽门螺杆菌的毒力基因 |
| 1.3.1 幽门螺杆菌尿素酶(urease) |
| 1.3.2 细胞毒素相关抗原(CagA) |
| 1.3.3 空泡毒素基因(VacA) |
| 1.3.4 iceA基因 |
| 2 幽门螺杆菌的治疗 |
| 2.1 幽门螺杆菌的化学药物治疗 |
| 2.2 免疫抗体治疗幽门螺杆菌 |
| 2.3 影响幽门螺杆菌治疗的因素 |
| 3 幽门螺杆菌感染动物模型 |
| 3.1 H. pylori类似菌的自然感染情况 |
| 3.2 H. pylori感染的动物模型 |
| 3.3 动物模型的应用 |
| 3.3.1 动物模型在抗H. pylori治疗方法和疗效研究进展 |
| 3.3.2 动物模型在研究H. pylori致病机理方面的应用 |
| 3.3.3 动物模型在研究H. pylori疫苗中的应用 |
| 4 幽门螺杆菌疫苗免疫机制及其研究进展 |
| 4.1 幽门螺杆菌自然感染的免疫反应 |
| 4.2 幽门螺杆菌疫苗类型的研究进展 |
| 4.2.1 全菌蛋白疫苗 |
| 4.2.2 基因工程疫苗 |
| 4.2.3 载体疫苗 |
| 4.3 国内外幽门螺杆菌疫苗研究的现状 |
| 5 研究目的和意义 |
| 5.1 本研究的目的 |
| 5.2 本研究的意义 |
| 第二部分 实验研究 |
| 实验研究一 幽门螺杆菌全菌蛋白疫苗免疫奶牛 |
| 引言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 菌株 |
| 1.1.2 试剂 |
| 1.1.3 试验动物 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 疫苗准备 |
| 1.2.2 免疫、采样 |
| 1.2.3 血清/乳汁中IgG检测 |
| 2 数据分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 奶牛的血清中和牛奶中幽门螺杆菌抗体的动态变化规律 |
| 3.2 免疫后奶牛身体状况 |
| 4 讨论 |
| 4.1 疫苗的免疫途径 |
| 4.2 免疫乳的应用 |
| 实验研究二 幽门螺杆菌UreB/CagA双价口服减毒沙门氏菌活载体疫苗的构建 |
| 引言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 菌株与质粒 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.1.3 主要仪器 |
| 1.1.4 主要培养基 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 幽门螺杆菌的培养 |
| 1.2.2 感受态细菌的制备 |
| 1.2.3 引物设计及PCR反应体系 |
| 1.2.4 目的基因CagA和UreB分别与T载体(pMD-18T)的连接、转化 |
| 1.2.5 转化的质粒提取鉴定 |
| 1.2.6 pYA3493质粒提取,酶切 |
| 1.2.7 表达Hp-UreB和Hp-CagA的重组减毒猪霍乱沙门菌疫苗的建立 |
| 1.2.8 重组蛋白的表达及鉴定 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 Hp-UreB和Hp-CagA基因片段的扩增 |
| 2.2 酶切鉴定和和PCR鉴定 |
| 2.3 重组蛋白的表达及鉴定 |
| 3 讨论 |
| 3.1 基因的选择 |
| 3.2 口服疫苗载体的选择 |
| 实验研究三 幽门螺杆菌CagA/UreB沙门氏菌活载体疫苗免疫小鼠的研究 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 实验动物 |
| 1.1.2 菌株 |
| 1.1.3 主要试剂 |
| 1.1.4 主要仪器 |
| 1.1.5 各种培养基 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 疫苗准备 |
| 1.2.2 免疫、采样 |
| 1.2.3 幽门螺杆菌特异抗体IgG检测(ELISA) |
| 1.2.4 组织切片和免疫组化 |
| 2 数据分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 血清中抗体分析 |
| 3.2 组织切片和免疫组化 |
| 3.3 不同组织中幽门螺杆菌SS1菌落数 |
| 4 讨论 |
| 实验四 幽门螺杆菌CagA/UreB真核荧光载体的构建及胃黏膜上皮细胞GES-1转染的研究 |
| 引言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 菌株与质粒 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.1.3 主要仪器 |
| 1.1.4 各种培养基 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 幽门螺杆菌的培养 |
| 1.2.2 引物设计及PCR反应体系 |
| 1.2.3 目的基因CagA和UreB分别与T载体(pMD-18T)的连接、转化 |
| 1.2.4 转化的质粒提取鉴定 |
| 1.2.5 质粒pEGFP-N1提取、酶切 |
| 1.2.6 表达Hp-UreB和Hp-CagA的重组质粒的构建 |
| 1.2.7 质粒大量提取 |
| 1.2.8 提纯质粒转染GES-1细胞 |
| 1.2.9 细胞凋亡的检测 |
| 1.2.10 电镜观察 |
| 2 数据分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 Hp-UreB和Hp-CagA基因片段的扩增 |
| 3.2 UreB与pEGFP-N1连接以及酶切结果 |
| 3.3 细胞转染 |
| 3.4 细胞凋亡的检测 |
| 3.5 透射电镜观察 |
| 4 讨论 |
| 第三部分 参考文献 |
| 第四部分 全文结论和创新点 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 附录Ⅰ 在读期间发表的学术论文 |
| 附录II 参加的学术活动 |
| 致谢 |
（8）幽门螺杆菌CagM、CagI蛋白的生物信息学分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.1.1 幽门螺杆菌感染现状 |
| 1.1.2 幽门螺杆菌cag致病岛 |
| 1.1.3 幽门螺杆菌的致病因子 |
| 1.1.4 幽门螺杆菌Ⅳ型分泌系统(type Ⅳ secretion system,T4SS) |
| 1.1.5 Ⅳ型分泌系统伴侣蛋白(Type Ⅳ secretion system chaperone) |
| 1.2 本研究的目的、内容及技术路线 |
| 1.2.1 研究目的 |
| 1.2.2 研究内容及方案 |
| 1.2.3 技术路线 |
| 第二章 幽门螺杆菌cagM、cagI基因的克隆与测序 |
| 前言 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 菌株和质粒 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要溶液配制 |
| 2.1.4 主要仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 H.pylori培养与鉴定 |
| 2.2.2 H.pylori基因组DNA的提取 |
| 2.2.3 PCR引物的设计 |
| 2.2.4 PCR扩增H.pylori的cagM、cagI基因 |
| 2.2.5 目的DNA片段的回收 |
| 2.2.6 制备感受态细胞 |
| 2.2.7 载体和目的片段的连接 |
| 2.2.8 转化与筛选 |
| 2.2.9 重组质粒的鉴定 |
| 2.2.10 H.pylori NCTC11637 cagM、cagI基因序列的检测 |
| 2.2.11 H.pylori NCTC11637 cagM、cagI基因序列提交NCBI核酸数据库GenBank |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 H.pylori的分离培养与鉴定 |
| 2.3.2 PCR法扩增H.pylori cagM、cagI基因片段 |
| 2.3.3 T-A克隆与鉴定 |
| 2.3.4 H.pylori NCTC11637菌株cagM、cagI基因的测序结果 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 CagM、CagI蛋白的生物信息学分析 |
| 前言 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 主要软件 |
| 3.1.2 主要网站 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 序列组成和基本性质分析 |
| 3.2.2 同源性分析 |
| 3.2.3 跨膜区预测分析 |
| 3.2.4 信号肽和剪切位点预测分析 |
| 3.2.5 二级结构预测分析 |
| 3.2.6 三级结构预测分析 |
| 3.2.7 功能位点分析 |
| 3.2.8 卷曲螺旋的预测分析 |
| 3.2.9 细胞定位的预测分析 |
| 3.2.10 蛋白家族保守区域分析 |
| 3.2.11 蛋白质指纹图谱分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 序列组成和基本性质分析 |
| 3.3.2 同源性分析 |
| 3.3.3 跨膜区预测 |
| 3.3.4 信号肽和剪切位点预测 |
| 3.3.5 二级结构预测分析 |
| 3.3.6 三级结构预测分析 |
| 3.3.7 功能位点分析 |
| 3.3.8 卷曲螺旋的预测分析 |
| 3.3.9 细胞定位的预测分析 |
| 3.3.10 蛋白家族保守区域分析 |
| 3.3.11 蛋白指纹图谱分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 基本性质 |
| 3.4.2 同源性 |
| 3.4.3 结构预测 |
| 3.4.4 功能分析 |
| 第四章 结论和展望 |
| 4.1 结论 |
| 4.2 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 读博期间发表的论文和参加的课题 |
（9）幽门螺杆菌重组Bb-hpaA-vacA疫苗的构建（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 菌种与质粒 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 hpaA-vacA融合基因的扩增 |
| 1.4 重组质粒pGEX-hpaA-vacA的构建和鉴定 |
| 1.5 幽门螺杆菌重组Bb-vacA-hpaA疫苗的构建和鉴定 |
| 1.5.1 Bb电转化感受态细胞的制备[8] |
| 1.5.2 重组质粒pGEX-hpaA-vacA的电转化 |
| 1.5.3 重组Bb疫苗的鉴定 |
| 1.5.4 pGEX-hpaA-vacA在双歧杆菌中的表达及Western blot分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 hpaA和vacA抗原编码基因以及hpaA-vacA融合基因的扩增 |
| 2.2 重组质粒pGEX-hpaA-vacA的鉴定和融合基因的测序 |
| 2.3 rBb-vacA-hpaA疫苗的鉴定 |
| 2.4 pGEX-hpaA-vacA在双歧杆菌中的表达和Western blotting分析 |
| 3 讨论 |
（10）幽门螺杆菌重组Bb-vacA-hpaA候选疫苗的构建（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 重组质粒pQE-vacA-hpaA的构建及幽门螺杆菌vacA-hpaA融合基因的扩增 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 2.1 PCR扩增vacA基因及hpaA基因 |
| 2.2 构建重组质粒pQE-hpaA |
| 2.3 构建重组质粒pQE-vacA-hpaA |
| 2.4 PCR扩增vacA-hpaA融合基因 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 结论 |
| 第二部分 幽门螺杆菌重组质粒pGEX-vacA-hpaA的构建与表达以及融合蛋白的抗原性鉴定 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 2.1 提取大肠杆菌-双歧杆菌穿梭表达质粒pGEX-1λT |
| 2.2 构建重组质粒pGEX-vacA-hpaA |
| 2.3 重组质粒pGEX-vacA-hpaA的鉴定 |
| 2.4 重组质粒pGEX-vacA-hpaA在大肠杆菌BL21中的诱导表达 |
| 2.5 SDS-PAGE电泳 |
| 2.6 SDS-PAGE凝胶的考马斯亮蓝染色 |
| 2.7 表达蛋白的抗原性鉴定(Western-blot) |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 结论 |
| 第三部分 幽门螺杆菌重组Bb-vacA-hpaA候选疫苗的构建 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 2.1 提取幽门螺杆菌重组质粒pGEX-vacA-hpaA |
| 2.2 Bb的培养及转化 |
| 2.3 重组Bb-vacA-hpaA候选疫苗的鉴定 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 结论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
四、幽门螺杆菌细胞空泡毒素基因毒性片段的克隆与表达（论文参考文献）
- [1]毛螺梭菌促进结直肠癌转移的机制研究[D]. 张馨玮. 东南大学, 2020
- [2]改良镶嵌疗法治疗幽门螺杆菌的临床疗效研究[D]. 毛刚. 西南医科大学, 2020(02)
- [3]幽门螺杆菌CagA蛋白对胃癌细胞能量代谢的影响[D]. 杨丽萍. 贵州医科大学, 2020(04)
- [4]幽门螺杆菌可塑区virB2和virB11基因生物学功能研究[D]. 孙大林. 大连医科大学, 2019(04)
- [5]卵黄抗体对黄曲霉毒素B1的降毒效应及机制研究[D]. 邱涛涛. 华南农业大学, 2018(08)
- [6]TIPE3与HP感染相关胃十二指肠疾病关系的研究[D]. 孟楠. 泰山医学院, 2017(06)
- [7]幽门螺杆菌CagA/UreB口服减毒沙门氏菌活载体疫苗的研究[D]. 陈建国. 华中农业大学, 2013(10)
- [8]幽门螺杆菌CagM、CagI蛋白的生物信息学分析[D]. 谢立苹. 江苏大学, 2012(09)
- [9]幽门螺杆菌重组Bb-hpaA-vacA疫苗的构建[J]. 王国富,高峰,吴利先. 中国人兽共患病学报, 2012(02)
- [10]幽门螺杆菌重组Bb-vacA-hpaA候选疫苗的构建[D]. 高峰. 大理学院, 2011(01)