一、EB病毒基因BARF1在鼻咽癌中的表达及其意义（论文文献综述）
蔡曌[1]（2021）在《1、DNA拷贝数异常改变作为膀胱癌预后判断相关分子标志物的研究 2、EB病毒相关上皮性恶性肿瘤中病毒miRNA与宿主相互作用的分子机制及其意义》文中认为这一博士学位课题由相对独立的两部分研究工作构成。第一章DNA拷贝数异常改变作为膀胱癌预后判断相关分子标志物的研究膀胱癌的高复发率为患者带来了长期的身体和经济负担。目前对于膀胱癌的诊断已有多种基于不同技术平台的生物标志物,然而,对于患者复发风险的评估和预测还较少有相关标志物的报道。尽管在膀胱癌肿瘤的发生发展过程中存在大量基因组序列的改变,但目前对于膀胱癌肿瘤预后风险评估还尚未有获得广泛认可的生物标志物可供临床使用。本项研究旨在膀胱癌组织和尿液中探索与膀胱癌患者预后相关的分子标志物,评估其在患者预后评估中的临床应用价值。本实验室前期工作中对65例膀胱癌肿瘤组织DNA进行了基于芯片的比较基因组杂交实验,发现并通过real-time PCR验证了在膀胱癌组织中高频出现的5个高频拷贝数变异的基因CEP63、FOSL2、GHR、PAQR6、ZFAND3。本项研究对候选的5个拷贝数高频变异的基因在219例于中国医学科学院肿瘤医院初治的膀胱癌患者手术切除的新鲜肿瘤组织样本和123例初治膀胱癌患者术前尿沉渣脱落细胞样本中的拷贝数变异与患者临床特征的相关性进行了进一步分析。为分析候选拷贝数变异与患者预后的相关性,研究中对所有入组患者均开展了术后随访,获得其无瘤生存期。研究应用Kaplan-Meier生存曲线、Cox风险比例回归、Logestic线性回归分析候选拷贝数变异与患者肿瘤复发风险的关系,并分别对非肌层浸润性和肌层浸润性膀胱癌构建了预后预测模型。为提高在尿液中检测拷贝数变异的准确性,研究中采用了高灵敏的3D数字PCR技术,并运用受试者工作特征曲线（receiver operating characteristic curve,ROC 曲线）比较了 real-time PCR 与 3D 数字PCR在尿沉渣脱落细胞中对拷贝数变异基因的检测效能,建立了尿样本中膀胱癌的诊断模型。在5个候选拷贝数变异的基因中,CEP63（p<0.01）、FOSL2（p<0.01）、PAQR6（p<0.01）在219例肿瘤组织中相比于健康人外周血白细胞中的基因拷贝数显着增加。CEP63（p<0.01）和FOSL2（p<0.01）的拷贝数在肌层浸润性膀胱癌肿瘤组织中显着高于非肌层浸润性膀胱癌肿瘤组织。CEP63（p<0.01）和FOSL2（p=0.047）的拷贝数在高级别肿瘤中显着高于低级别肿瘤。在发生淋巴结转移患者的肿瘤组织中CEP63的拷贝数显着增加（p<0.01）。研究中对所有病例进行了随访,随访时间为3个月至188个月,中位随访时间为61个月。所有入组患者的5年无瘤生存率为48.3%;10年无瘤生存率为22.7%。基于219例肿瘤组织中CEP63、FOSL2、PAQR6的拷贝数变异,分别对非肌层浸润性膀胱癌患者和肌层浸润性膀胱癌患者进行生存分析,发现CEP63和FOSL2的拷贝数增加是非肌层浸润性膀胱癌的独立预后因素（p<0.05）。FOSL2和PAQR6的拷贝数增加是肌层浸润性膀胱癌的独立预后因素（p<0.05）。基于CEP63、FOSL2的拷贝数变异构建非肌层浸润性膀胱癌的肿瘤复发预测模型计算预后指数（Prognostic Index,PI）,预测模型为PI=1.5095×CEP63+1.47123×FOSL2,结果显示,预后指数高的非肌层浸润性膀胱癌患者肿瘤复发风险是预后指数低的患者的3.434倍（p=0.0003）。基于FOSL2和PAQR6拷贝数变异,构建肌层浸润性膀胱癌的肿瘤复发预测模型计算预后指数,预测模型为PI=2.0440×FOSL2+2.2079×PAQR6,结果显示预后指数高的肌层浸润性膀胱癌患者发生肿瘤复发的风险是预后指数低的患者的5.443倍（p=0.0001）。对于基于传统危险分层中的高风险非肌层浸润性膀胱癌患者,生存分析结果显示,预后指数高的患者无瘤生存期更短（p=0.00056）。在膀胱癌患者尿沉渣脱落细胞中CEP63（p=0.036）与FOSL2（p<0.01）的拷贝数相比于正常对照尿沉渣脱落细胞样本显着增加。应用3D数字PCR检测,发现肌层浸润性膀胱癌尿沉渣脱落细胞样本中CEP63（p<0.01）与FOSL2（p=0.046）的拷贝数显着高于非肌层浸润性膀胱癌样本,CEP63的拷贝数在发生淋巴结转移的膀胱癌患者中显着增加（p=0.042）。生存分析结果显示非肌层浸润性膀胱癌患者尿沉渣脱落细胞中CEP63的拷贝数增加（p<0.01）或FOSL2的拷贝数增加（p=0.018）预示着更大的肿瘤复发风险。基于尿样本中CEP63、FOSL2的拷贝数变异在训练集（n=41）中构建非肌层浸润性膀胱癌12个月内发生肿瘤复发的预测模型并在验证集（n=41）中进行验证,预测模型为PIL=-2.679+2.083×CEP63+1.827×FOSL2,结果显示,预后指数高的非肌层浸润性膀胱癌患者12个月内发生肿瘤复发的风险是预后指数低的患者的6.612倍（p=0.002）。ROC曲线分析结果显示3D数字PCR检测尿沉渣脱落细胞样本中CEP63和FOSL2拷贝数变异的曲线下面积分别为0.848和0.803,灵敏度分别为0.750和0.650,阴性预测值分别为0.786和0.708。而real-time PCR检测CEP63和FOSL2拷贝数变异的曲线下面积分别为0.601和0.685,灵敏度分别为0.475和0.425,阴性预测值分别为0.644和0.646。进一步基于3D数字PCR联合尿样本中CEP63与 FOSL2 的拷贝数变异构建膀胱癌患者诊断型:L=-1.817+2.267×CEP63+2.695×FOSL2,该模型的 ROC 曲线下面积为 0.858,灵敏度为85.0%,阴性预测值为83.8%。本项研究发现CEP63、FOSL2、PAQR6在膀胱癌中拷贝数增加,前两者与膀胱癌肿瘤的分期和病理分级显着相关。CEP63、FOSL2的拷贝数变异能够对非肌层浸润性膀胱癌患者的肿瘤复发风险进行评估和预测,FOSL2、PAQR6的拷贝数变异可应用于肌层浸润性膀胱癌患者肿瘤复发的预测。在膀胱癌患者尿样本中CEP63、FOSL2的拷贝数显着增加,并与肿瘤分期相关。尿样本中CEP63和FOSL2拷贝数增加的非肌层浸润性膀胱癌患者1年内发生肿瘤复发风险更高。研究中应用的3D数字PCR相比于real-time PCR检测效能更高,基于3D数字PCR的尿样本诊断模型能够较好的区分膀胱癌与正常人,为未来膀胱癌尿液检测提供了新途径。第二章EB病毒相关上皮性恶性肿瘤中病毒miRNA与宿主相互作用的分子机制及其意义EB病毒（Epstein-Barr virus,EBV）属于疱疹病毒科γ亚科,是双链DNA病毒。EB病毒是人类普遍且长期感染的病毒。在世界人口中大约有95%存在终生的无症状感染。EB病毒参与了人类多种恶性肿瘤的形成,包括Burkitt’s淋巴瘤、鼻咽癌、霍奇金氏淋巴瘤、NK/T细胞淋巴瘤、胃癌等。EB病毒的发现距今已有50余年,但病毒的致癌机制目前仍然尚未清楚。miRNA是基因表达转录后调控的重要因子,在多种复杂的细胞生物学进程,例如细胞发育和分化中扮演着十分重要的作用。越来越多的研究发现某些特定miRNA的负调控作用能够引起多种器官的癌变发生。EB病毒是第一个发现的能够编码miRNA的病毒,已有研究发现部分EB病毒编码的miRNA能够调控宿主基因的表达。但对于其他EB病毒编码的miRNA在癌变过程中的作用机制目前还尚未完全了解。本项研究旨在通过miRNA表达谱芯片和转录组测序分析,构建EB病毒相关上皮性恶性肿瘤即EB病毒相关胃癌和鼻咽癌中病毒miRNA的表达谱,分析病毒miRNA在宿主细胞中对宿主基因表达的调控作用,进而探索病毒miRNA对宿主细胞生物学功能的影响,以及在癌变发生和发展过程中所起到的作用。EB病毒相关胃癌在亚洲胃癌患者中约占6%,需要通过EBER原位杂交检测证实肿瘤组织中存在EB病毒的感染,由于EBER原位杂交尚未作为胃癌患者的常规病理检测项目,受到样本收集难度的限制,以及RNA较容易降解的特性,目前国内还尚未有基于EB病毒相关胃癌新鲜组织的转录组测序分析研究。在本项研究中,我们对8例EB病毒相关胃癌新鲜冻存组织、2株EB病毒相关胃癌细胞系SNU719、YCCEL1和2株EB病毒阴性胃癌细胞系AGS、HGC27进行了miRNA表达谱芯片和转录组测序分析宿主基因、宿主miRNA和EB病毒miRNA的表达情况。通过生物信息学分析,联合公共数据库中38例EB病毒相关胃癌的基因表达数据,探索EB病毒miRNA与宿主miRNA以及宿主基因的关系。为验证数据分析结果,进一步对筛选出的病毒miRNA进行体外细胞功能实验,探索其对胃癌细胞增殖能力、细胞周期以及细胞迁移能力的影响。为了解筛选出的在EB病毒相关胃癌中能够显着影响细胞生物学功能的病毒miRNA在另一种EB病毒相关上皮性恶性肿瘤即鼻咽癌中的作用。我们对33例鼻咽癌新鲜冻存组织进行了转录组测序。并通过体外细胞功能实验探索候选病毒miRNA在鼻咽癌细胞中对细胞增殖能力、细胞周期以及细胞迁移能力的调控作用。在本项研究中,我们通过对miRNA表达谱芯片和转录组测序数据分析获得了 EB病毒相关胃癌中病毒miRNA的表达谱,筛选出在肿瘤组织和EB病毒相关胃癌细胞系中均高表达的4个病毒miRNA。对其进行靶基因预测,我们发现在EB病毒相关胃癌中高表达的4个病毒miRNA靶基因主要富集于细胞迁移、细胞周期调控、细胞间信号转导和DNA复制等重要生物学功能上。而对于肿瘤组织和EB病毒相关胃癌细胞系中宿主miRNA的差异表达分析水平的分析发现,4个宿主miRNA在肿瘤组织与细胞系中的表达水平与EB病毒miRNA的表达成正相关关系,相关系数大于等于0.9。进一步分析这4个宿主miRNA与EB病毒miRNA的序列,发现 EB 病毒 miRNA miR-BARTl-3p 与宿主 miRNA hsa-miR-29a-3p 具有相同的5’端种子区序列;而miR-BART7-3p则与宿主miRNA hsa-miR-154-3p具有相同的5’端种子区序列。由此推测上述病毒miRNA与宿主miRNA的调控功能具有一定的相似性。为进一步探索“EB病毒miRNA-宿主miRNA”关系对中的病毒miRNA与宿主miRNA是否协同作用共同参与调控细胞生物学功能。首先联合TCGA（The Cancer Genome Atlas）数据库中转录组数据和 GEO（Gene Expression Omnibus）数据库中表达谱芯片数据,以及本项研究中的转录组测序数据,分析共计46例EB病毒相关胃癌中肿瘤与癌旁组织的差异宿主基因,结合在EB病毒相关胃癌相比于EB病毒阴性胃癌细胞中差异的宿主基因,以此对“EB病毒miRNA-宿主miRNA”关系对中的病毒miRNA与宿主miRNA的交集靶基因进行筛选,结果显示,在EB病毒相关胃癌肿瘤组织中差异表达,并与EB病毒感染相关的宿主靶基因,其信号通路主要富集于涉及细胞生长、迁移、分化等重要功能的2个信号通路。说明候选的病毒miRNA可能与其相关的宿主miRNA共同参与到对细胞生长、迁移等重要功能的调控中。进一步的体外细胞功能实验也表明了miR-BART1-3p和miR-BART7-3p能够抑制胃癌细胞的增殖和迁移,对细胞的生长起负向调控作用。此外,在另一种EB病毒相关上皮性恶性肿瘤,鼻咽癌中,我们也构建了 EB病毒miRNA的表达谱,与EB病毒相关胃癌不同的是,miR-BART1-3p在鼻咽癌中的表达水平较低而miR-BART7-3p在鼻咽癌中的表达水平也仅处于中等。但通过体外细胞功能实验,我们发现miR-BART7-3p在鼻咽癌细胞中,仍具有对细胞增殖和迁移功能的抑制作用。在上述研究中,我们构建了 EB病毒相关胃癌和鼻咽癌中病毒miRNA的表达谱。通过生物信息学分析获得了具有相同种子区序列的病毒和宿主miRNA,两者共同参与了涉及细胞增殖、迁移、分化等重要生物学功能的信号通路调控。体外细胞实验结果表明了病毒miRNA对于胃癌和鼻咽癌细胞在增殖、细胞周期和细胞迁移能力的抑制作用。本项研究对病毒miRNA miR-BART1-3p和miR-BART7-3p在胃癌细胞中的作用及其可能的机制进行探索,发现了miR-BART7-3p在两种EB病毒相关恶性肿瘤中具有相似的生物学功能,研究从新的视角提供了 EB病毒影响肿瘤进展的可能机制,有助于促进对于上皮性恶性肿瘤中EB病毒感染在癌变中作用的理解。
赵爽[2]（2021）在《基于转录组测序分析的鼻咽癌相关EB病毒变异亚型及预后模型的研究》文中指出背景:EB病毒（Epstein-Barrvirus,EBV）广泛感染人类,引发多种疾病包括恶性肿瘤,其中与鼻咽癌发病密切相关——在约98%的鼻咽癌患者的肿瘤组织中,可以检测到EBV的核酸。目前,已有多种EBV毒株的基因序列发表,不同肿瘤来源的EBV毒株携带不同的基因变异。EBV的变异可能在其致瘤过程中发挥作用,从而影响特定类型肿瘤的生物学行为。然而,对与鼻咽癌相关的EBV基因变异尚缺乏系统性研究。鼻咽癌是一种具有高度侵袭性和转移性的恶性肿瘤,目前,TNM分期系统是鼻咽癌治疗决策和预后评估的主要依据。然而,该系统对于评估鼻咽癌预后的价值有限,已经不能完全满足临床需求。目的:这一博士学位课题的研究工作基于转录组测序数据分析,目的有二,①发现、鉴定与鼻咽癌相关的EBV基因变异,解析不同EBV亚型与鼻咽癌临床特征的关系,初步揭示鼻咽癌相关EBV基因变异的生物学功能。②筛选、构建鼻咽癌预后分子模型。方法:本项研究共纳入两组鼻咽癌患者;第一组67个病例,主要参加转录组测序及相关分析;第二组32个病例,主要参加EBV基因变异的验证分析。此两组鼻咽癌病例互为独立样本。针对第一组67例鼻咽癌患者的肿瘤和癌旁组织进行转录组测序。对测序数据进行生物信息学分析,从中发现鼻咽癌相关EBV的基因变异。采用RNA原位杂交技术BaseScope联合免疫组化共染色的方法,在第二组32例鼻咽癌组织样本中对测序发现的EBV基因变异进行验证。将上述在鼻咽癌中发现、鉴定的EBV变异位点,与公共数据中非鼻咽癌来源的EBV序列进行聚类分析;从中找出鼻咽癌相关的EBV亚型,并分析不同病毒亚型与鼻咽癌患者临床特征及预后的关系。另外,采用常规细胞分子生物学方法,建立稳定表达上述EBV变异基因的鼻咽癌细胞株,通过体外实验探索鼻咽癌相关EBV变异基因的基本生物学功能。构建鼻咽癌预后分子模型的工作,从第一组参加转录组测序的67例鼻咽癌患者之中选择随访信息完善的60例入组,分为“复发转移组”和“非复发转移组”两组。通过对测序数据的分析,采用随机森林和极限梯度提升的机器学习方法,筛选出宿主的与鼻咽癌预后相关的特征基因。基于这一组特征基因,进一步采用Cox 比例风险回归模型构建鼻咽癌预后模型。继而采用GSEA和相关性分析,评价该模型的医学生物学功能。结果:①转录组测序结果显示,入组的鼻咽癌组织中存在EBV基因变异。其中,EBER2和LMP2基因具有最高的变异频率,分别在65/66和64/66例鼻咽癌组织中被检测到。②采用BaseScope和免疫组化共染技术,在独立样本32个鼻咽癌病例中以单细胞原位的方式验证了测序检出的EBER2的变异;并且证明携带病毒变异的细胞为肿瘤（上皮）细胞,而不是肿瘤组织中的浸润免疫细胞,由此明确了 EBV变异活跃转录的组织细胞来源。③根据EBER2的变异位点,将测序获得的EBV序列与已发表的EBV序列进行聚类分析,可将EBV分为两种亚型:EB-1和EB-2。其中,根据EBER2 7123位点,可进一步将EB-2细分为A>T和A>G两种亚型。EB-1基因型EBV显着富集于鼻咽癌（卡方检验,p<0.0001）;而EB-2亚型富集于中国北方鼻咽癌患者,且与肿瘤T分期相关（卡方检验,p<0.05）。生存分析显示,相较于EB-1亚型和EB-2-A>G,感染EB-2-A>T亚型EBV的患者预后最差（Log-rank,p=0.026）。④结合宿主mRNA表达谱数据进行差异表达基因分析和富集分析发现,EB-1和EB-2亚型参与影响宿主细胞不同的生物学过程。其中,EB-1亚型主要激活“Epithelial mesenchymal transition”,而 EB-2 亚型则主要激活“MYC targets v1”等。⑤针对另一个发生高频率变异的病毒基因LMP2变异的体外实验分析发现,相较于对照组,变异的LMP2B有显着促进鼻咽癌细胞增殖、迁移,抑制凋亡的作用。构建鼻咽癌预后分子模型的工作,对于转录组测序数据重点关注宿主的基因表达。⑥采用机器学习方法筛选出“复发转移组”和“非复发转移组”之间的特征基因,共 13 个:CES4A、GIMAP1.GIMAP5、GLB1L、LGR5、LOC730098、MLF1、MTHFD1L、MYLPF、NUP160、SIRPB1、TCN2、TMEM265、U2AF1L5。⑦基于这些特征基因构建Cox风险比例模型,得到一个4-mRNA signature,包括U2AF1L5、TMEM265、GLB1L和MLF1基因。根据这一模型计算每个患者的风险评分,并将患者分为高风险组和低风险组。⑧Kapan-Meier生存曲线和ROC曲线分析显示,这一预后模型能较好地评估鼻咽癌患者的预后,高风险组患者预后显着差于低风险组（Log-Rank,总生存:p=0.00126,无病生存:p=0.000059）。这一 4-mRNA signature在评估患者总生存以及无病生存的效果（AUC分别为0.893和0.86,）优于T分期（AUC为0.619和0.538）及N分期（AUC:0.582和0.622）。⑨多因素Cox分析结果显示,风险评分是鼻咽癌的独立预后因素（总生存,HR=14.501,p=0.012,无病生存:HR=13.752,p<0.001）。⑩GSEA 富集分析发现 4-mRNA signature 与细胞增殖和宿主免疫应答密切相关。结论:鼻咽癌组织中存在EBV基因变异。其中EBER2和LMP2基因具有最高的变异频率。鼻咽癌组织内发生基因变异的EBV存在于肿瘤细胞而非浸润免疫细胞中。根据EBER2的变异模式,可将EBV分为两种亚型:EB-1和EB-2;它们与鼻咽癌患者的临床特征、预后相关,并可能与宿主发生不同的相互作用。通过对转录组数据的分析挖掘,构建了包含4个基因的4-mRNA signature模型,可用于鼻咽癌预后评估。
李睿[3]（2018）在《基于EB病毒潜伏期膜蛋白的鼻咽癌诊治用单克隆抗体的筛选研究》文中提出鼻咽癌是我国的高发恶性肿瘤之一,发病率居耳鼻咽喉部位恶性肿瘤之首。因发病部位解剖结构复杂,鼻咽癌一般不适合手术,而是首选放射治疗。目前放射治疗对早期鼻咽癌患者的治愈率己高达90%以上,但由于早期筛查方法的局限性,大部分鼻咽癌确诊患者已发展到临床中晚期,常伴发远端转移;另外,部分鼻咽癌患者在放射治疗后容易复发。总之,此类临床晚期、转移性或复发性的鼻咽癌严重拉低患者的五年生存率。因此,探索更高效特异的鼻咽癌诊治用的生物靶标日渐成为重要的鼻咽癌研究方向。鼻咽癌与EBV关系密切,在鼻咽癌患者中EBV以II型潜伏态存在,表达一种核心蛋白EBNA1和两种重要的膜蛋白LMP1和LMP2。其中,LMP1和LMP2作为主要的癌蛋白,被认为与鼻咽癌的发生发展密切相关。自90年代起,许多研究人员己提出LMP1和LMP2可作为重要的鼻咽癌诊治用靶标蛋白,但至今未能在临床中获得有效应用。本研究拟以LMP1和LMP2作为研究对象,通过免疫原制备探索和特异性单克隆抗体的筛选鉴定,以期获得适合鼻咽癌诊治用的特异性抗体,为LMPs作为鼻咽癌诊治靶标的探索提供科学依据。本论文的第一部分旨在利用小鼠单克隆抗体筛选平台,从免疫原制备方式比较、免疫佐剂和免疫方案组合比较、抗体筛选方法比较以及抗体性能评价等方面探索LMPs相关鼻咽癌特异性诊治抗体的筛选策略。首先,通过LMPs的氨基酸序列分析确定出LMP1和LMP2各胞外区的氨基酸序列组成,采用多肽化学合成、多肽串联原核表达、全序列昆虫细胞真核表达、全序列哺乳动物细胞表达等不同方式制备出一系列LMPs免疫原,发现LMPs胞外区序列的疏水性严重影响合成肽的合成质量和重组抗原的活性。其次,利用上述制备的LMPs抗原,结合弗氏佐剂、铝佐剂、CpG佐剂以及多糖类、小分子激动剂等免疫佐剂,设计了多种免疫方案进行小鼠免疫,通过常规ELISA和条带Western Blot评价不同免疫方案下的LMPs特异性抗体应答效果,发现合成肽SPL1-3偶联组和有目的抗原表达的全细胞免疫组能诱导出LMPs特异性抗体应答,但不同免疫佐剂的免疫应答比较未见显着差异。再次,比较了全细胞裂解液和膜蛋白包被ELISA与细胞ELISA、ELISPOT以及基于多肽的流式分选等不同筛选方法,发现基于多肽的B细胞分选特异性较差,而细胞ELISA检测灵敏度高且操作方便,是适合细胞膜抗原高通量抗体筛选的最佳筛选策略。最后,对筛选到的98株LMPs抗体进行性质鉴定和应用探索,发现4株LMP1胞内区特异性单抗具有良好的天然抗原结合能力,其识别表位为首次报道;组织学分析显示anti-LMP1单抗9F2和anti-LMP2单抗3A7在免疫组化检测中有良好的灵敏度和特异性,有望成为鼻咽癌临床组织学诊断新工具;另外,发现单抗9F2转染入胞后能显着降低LMP1阳性细胞内NF-κB水平,对细胞的生长具有一定的抑制作用,显示出潜在的治疗价值。据报道,兔单抗与小鼠单抗相比,其识别的表位更加丰富,对于多肽或小分子等低免疫原性的抗原具有更好的识别能力。鉴于LMPs抗原在小鼠中的免疫原性较弱,本研究的第二部分工作旨在建立一个高效的兔单抗筛选平台,探索LMPs在实验兔中的抗体应答情况,为筛选更好的LMPs特异性单抗奠定基础。首先,确定了兔B细胞群的流式细胞分选方案。第二,构建了兔B细胞的单细胞PCR方法,抗体的轻重链基因扩增成功率为60-100%。第三,建立了兔B细胞体外刺激培养方法和最佳的兔B细胞体外培养条件,在该条件下兔B细胞体外培养阳性率（OD值>0.5）平均为38.75%。第四,构建了兔单抗体外重组表达载体pRVRCH/pRVRCL,可满足兔抗体基因在HEK293表达系统中的高效表达。第五,基于此技术平台,分别制备了特异识别戊肝病毒和轮状病毒的两种兔单克隆抗体,验证了兔单抗筛选平台的可行性,并发现实验兔较实验鼠表现出免疫应答速度更快、滴度更高,倾向于产生更高的亲和力的抗体的优越性。最后,本研究利用兔单抗筛选平台对LMPs特异性抗体应答进行了初步探索,结果显示细胞抗原和LMP2A的N端重组抗原能够在实验兔中产生明显的抗体应答,尤其是重组抗原在实验兔中的抗体应答滴度较其在实验鼠中的应答滴度提升10-100倍,为进一步筛选LMPs兔单抗奠定坚实基础。综上所述,本论文针对EB病毒潜伏期膜蛋白LMP1和LMP2的胞内和胞外区特异性抗体的筛选策略进行了全面的探索,成功获得了具有应用潜力的胞内区抗体,证实LMPs特定的合成肽和有目的抗原表达的全细胞抗原可以在小鼠体内诱导出针对LMPs膜外区的抗体应答,建立了高效的兔单克隆抗体筛选和表达平台,为LMPs相关鼻咽癌特异性诊治抗体的开发奠定了基础。
王红[4]（2018）在《鼻咽癌患者来源EB病毒感染树鼩动物模型的构建》文中研究表明作为一种致瘤病毒,EB病毒（Epstein-Barr virus,EBV）与多种肿瘤的发生密切相关,如:伯基特淋巴瘤、鼻咽癌、肺癌、胃癌等。然而,EBV参与鼻咽癌发生发展的机制研究尚未明确,其因在于缺乏有效的细胞和动物模型。虽然目前已利用新世界猴、SCID小鼠、转基因动物和兔子、豚鼠等动物构建EBV相关动物模型,但因受限于感染率或动物机体的非自然免疫状态,仍未探明EBV参与NPC发生发展的机制。因此,急需寻找一种高感染率的具有正常机体免疫力的动物构建EBV感染的动物模型。在本课题组前期研究中,已证实机体免疫正常的树鼩可用于构建B95-8细胞系来源的EBV感染的动物模型,感染率可达80%,证实树鼩具有构建EBV感染的动物模型的潜力。因此,本实验希望能利用树鼩构建鼻咽癌患者来源的EBV感染的动物模型。首先,利用鼻咽癌患者来源EBV感染树鼩,拟构建EBV感染的树鼩动物模型,旨在探究人源性EBV感染树鼩的可能性。然后,通过摸索接种剂量,构建长期感染的动物模型,探讨EBV在树鼩内形成感染的时间及感染阶段分类等。再者,通过对BARF1基因片段进行测序和分析,以期阐明EBV分株与亚型。最后,应用环磷酰胺叠加EBV感染因素探索是否可诱导树鼩体内形成肿瘤。总之,本课题希望能通过一系列基础研究为后续开发抗EBV感染的药物和疫苗、研究EBV感染和致瘤机制、深入研究EBV与鼻咽癌发生发展的关系等提供依据。方法:1、鼻咽癌患者来源的EBV状况探索:收集10例血清EBVCA-IgA和EBNA-IgA为阳性的鼻咽癌患者的鼻咽部组织、抗凝外周血和不抗凝外周血,分别用于提取组织悬液、单个核细胞（PBMC）和血清。提取DNA后,利用qPCR方法检测各样品中的EBV DNA拷贝数。同时,使用透射电镜观察3类生物样本中是否有EBV病毒颗粒,再用免疫电镜技术验证。2、树鼩感染EBV需要的EBV DNA拷贝数探究:根据方法1的结果,将获取的鼻咽癌组织悬液按照EBV DNA拷贝数稀释成2×106 copies/μl、2×104 copies/μl、2×102 copies/μl、2×100 copies/μl。设置A-D四个实验组,每组5只树鼩,E组为对照组,含2只树鼩。实验组树鼩通过喷鼻的方式各接种100μl EBV混悬液,对照组给予同等剂量生理盐水喷鼻。每周为各组树鼩抽血,检测其感染程度。在连续观察2个月后,使用免疫抑制剂—环磷酰胺,按照20mg/Kg进行腹腔注射,连续观察3周评估感染效果。3、长期EBV感染树鼩模型的构建和观察:设置实验组树鼩10只,对照组3只。将鼻咽癌患者来源的含EBV病毒混悬液通过喷鼻方式感染实验组树鼩,对照组喷鼻同等体积的生理盐水,定期用qPCR、RT-PCR、ELISA的方法监测所有树鼩外周血PBMC中EBV DNA拷贝数变化、EBV相关基因片段的表达、血清EBVCA-IgG水平。通过对死亡树鼩的器官组织行免疫组织、Western blot和原位杂交检测,了解EBV相关蛋白和EBERs的表达情况。4、BARF1基因测序:采用RT-PCR和cDNA扩增产物基因测序等方法,对BARF1基因进行检测,并参照已发表的文献中人类疱疹病毒4型（HHV-4）、鼻咽癌EBV病毒株（HNNPC1-9）、淋巴瘤病毒株（B95-8）、胃癌病毒株（Akata-GC1）等序列,对所得序列结果进行比对分析,以寻找树鼩被感染的病毒基因型。5、应用环磷酰胺叠加EBV感染探索体内成瘤方法:通过对实验组树鼩连续应用环磷酰胺1周后,饲养3月处死动物。经石蜡包埋和病理切片后,HE染色观察实验组和对照组树鼩的鼻咽部和器官是否有肿瘤形成;免疫组化染色和原位杂交等方法,检测EBV相关蛋白和EBERs在树鼩组织中的表达。结果:1、NPC组织中EBV DNA拷贝数含量最高,可观察到EBV颗粒。通过鼻咽癌组织、外周血单个核细胞和血清三类生物样本的PCR检测,三者的EBV DNA拷贝数分别是（14.3±5.41）×107、（1.58±1.04）×104、（11.6±2.96）×102 copies/DNA,可知鼻咽癌组织中EBV DNA拷贝数的含量最高;透射电镜可观察到疱疹病毒样颗粒存在在7份NPC患者的生物样本中,免疫电镜可观察到8例患者的生物样本中EBV颗粒存在。2、本次实验中获得的树鼩感染EBV需要的EBV DNA拷贝数临界值为2×102 copies。通过对A-D四组树鼩外周血中BamHI-W、BZLF1、BARF1、BHRF1、LMP1、EBNA1等EBV相关基因片段的RT-PCR技术检测和分析可知,A组和B组中的10只树鼩均获得EBV感染,且出现感染的时间早,表达的目的指标强。虽然C组中2只树鼩被EBV感染,但是它们外周血中早期EBV相关指标表达不明显,仅在第2个月末对该组所有存活树鼩行免疫抑制后,逐渐出现BamHI-W片段的表达,第9周达到最强。同样地,在使用环磷酰胺后,A组和B组均可检测到多个EBV相关片段的表达,而D组和对照组始终未见表达。EBVCA-IgG的表达变化情况与体内EBV相关基因片段的表达情况密切相关。因此,可以知道树鼩被EBV感染需要的EBV DNA拷贝数临界值为2×102 copies;而通过2×104 copies接种的B组树鼩表现出较好的感染效果;环磷酰胺的使用可以促使EBV从潜伏感染状态转变为裂解感染。3、树鼩可被鼻咽癌患者组织、PBMC和血清来源的EBV长期感染,并且最终可形成树鼩体内的裂解感染和潜伏感染同时存在的状态。通过10个月的长期观察和监测,取树鼩外周血DNA和RNA分别进行qPCR和RT-PCR检测结果进行分析,可知该组树鼩均被EBV感染,在不同时期伴随EBV相关基因片段BARF1、BHRF1、LMP1和EBNA1的表达。随着树鼩体内EBV DNA拷贝数的变化,EBVCA-IgG的水平也随之发生明显改变。有趣的是,根据RT-PCR结果对EBV感染阶段进行分析可知,可在树鼩体内检测到裂解基因（BARF1和BHRF1）和潜伏基因（LMP1和EBNA1）的表达,可判断在这些树鼩体内同时存在潜伏感染和裂解感染。免疫组化检测EBNA1、EBNA2和LMP1可在树鼩鼻咽部组织表达;Western Blot可检测到EBNA1和EBNA2蛋白在脾脏和/或肝脏组织中表达。原位杂交可在脾、肝、肺和胃组织中检测到EBERs。4、基因测序结果:通过对第三章长期感染树鼩的RT-PCR结果进行深入分析,明确EB病毒早期基因BARF1在整个观察群体和观察周期中表达最佳,比EBNA1、LMP1和BHRF1基因能更好地代表EB病毒在树鼩体内的感染状态。因此选择BARF1进行下一步测序工作。基因测序结果显示送检的BARF1基因序列可与EB病毒的亚型毒株比对,间接证实树鼩被EB病毒感染。另外,通过基因系统进化树分析可知B1、B3、B6和B8号树鼩感染的EB病毒更接近于HHV-4代表的EB病毒亚型,B5、B7和B9号树鼩则更倾向于标准亚型序列之外的EB病毒亚型,B2和B10两组接近于HNNPC1亚型。5、EBV感染叠加环磷酰胺因素诱导树鼩动物模型体内成瘤方法初探:通过环磷酰胺的应用,在实验组8只树鼩的鼻咽部HE染色切片中,有6例发现存在炎性改变,出现淋巴细胞、浆细胞浸润,但是尚未观察到鼻咽部上皮细胞的异型增生或恶变。环磷酰胺的应用可对脾和肝中的EBERs表达有促进作用,对肺和胃组织中的EBERs表达无明显作用。另外,尚未发现树鼩鼻咽部上皮下淋巴滤泡中有EBERs阳性信号表达。通过免疫组化检测,可观察到EBNA1、LMP1、EA和BZLF1在实验组和对照组的鼻咽部、脾脏、肝脏、肺部和胃部出现不同程度的表达,证实不论是否应用环磷酰胺,EBV感染的树鼩体内均可同时表达EB病毒潜伏感染和裂解感染的相关蛋白,说明机体一旦感染EB病毒,可能会同时存在潜伏感染和裂解感染两种状态,这为进一步探究EB病毒在机体内的存在状态提出新的观点。结论:根据透射电镜和免疫电镜结果提示在鼻咽癌患者体内存在完整EBV颗粒。树鼩可被鼻咽癌患者来源的EBV感染,间接证实鼻咽癌患者组织中含有具有EBV颗粒。树鼩接受EBV感染的最小EBV DNA拷贝数为2×102copies,而当树鼩接受EBV DNA拷贝数为2×104 copies的EBV液喷鼻感染时,可以达到较好的感染效果。鼻咽癌患者的肿瘤组织、外周血单核细胞和血清来源的EBV均具有感染树鼩的能力,通过长达10个月的观察,树鼩机体对EBV产生的各项证据均体现出我们成功构建鼻咽癌患者来源的EB病毒感染的树鼩动物模型,为后续研究抗病毒感染的疫苗、药物、深入探索EBV与鼻咽癌发生发展的关系与机制提供依据。通过对BARF1基因片段测序,对BARF1基因片段序列进行分析,为深入研究广西鼻咽癌中EBV亚型的探索打下基础。通过对EBV感染叠加环磷酰胺因素诱发树鼩体内成瘤的方法探索,虽然在未观察到组织结构异型或细胞核异型等恶变现象,但是实验结果证实了通过叠加应用环磷酰胺可促进EBV在树鼩脾脏的潜藏,受EBV感染的B细胞可随血流迁移到肝脏,可到达鼻咽部、肺部和胃部引起炎症性病变。这些发现可为后期深入研究EBV的感染特性、EBV的致瘤机理等提供了依据。
刘勤[5]（2017）在《鼻咽癌石蜡标本探索miR-19b的分子通路》文中提出背景:鼻咽癌是一种与EB病毒感染有关、多基因参与、遗传与环境因素协同作用的恶性肿瘤,在我国两广、福建发病率较高,其发病具有性别差异,男性发病是女性的两倍以上。EB病毒是人类IV型疱疹病毒,全世界有90%以上的人群感染过EB病毒,几乎所有的未分化和低分化鼻咽癌都与EB病毒潜伏性感染有关。EB病毒潜伏性感染是鼻咽癌发生发展的环境因素之一。EB病毒在鼻咽癌细胞中以一种特殊的潜在感染方式出现,即Ⅱ期潜伏感染（latencyⅡ）,仅表达少量的EB病毒基因,如:EBERs,EBNA1,LMP1,LMP2,BARF1,以及几个Bam HⅠA转录本在鼻咽癌细胞中表达。EBV潜伏膜蛋白1（latent membrane protein 1,LMP1）具有癌基因的功能,能转化上皮细胞,改变癌细胞的功能特性而促进肿瘤演进及侵袭。mi RNA是最近几年在病毒和多种真核细胞中发现的一类长度为21～25nt的短序列,来源内源性染色体上的非编码单链RNA,在进化上具有高度的保守性,能够通过与靶m RNA特异性的碱基互补配对,抑制其翻译引或者起靶m RNA降解,从而对基因进行转录后的表达调控。虽然多种mi RNA的功能尚不清楚,但是研究已经表明mi RNA在整个生命过程中扮演了及其重要的角色,包括细胞的增殖、分化、凋亡,乃至于炎症改变、免疫系统改变、以及肿瘤的发生等。据报道,mi RNA与多种肿瘤的发生、发展密切相关。2002年,人们发现有些mi RNA表达缺失能导致白血病,这是最早能证明mi RNA与肿瘤有关的例子。在那之后,有大量的文章记载mi RNA与肿瘤的关系,例如,乳腺癌患者的血清mi R-21较正常人明显升高,mi R-183在非小细胞肺,mi R-16、mi R-196a在胰腺癌患者中表达明显升高。如今,mi RNA表达调控异常可以导致肿瘤的发生发展和转移已经成为不可争论的事实。众所周知,EB病毒与鼻咽癌发病密切相关,它不但是第一个被发现编码mi RNA的病毒,而且,它可以编码多种mi RNA基因,包括ebv-mi R-BHRF1-1-3和ebv-mi R-BART1-22,它们分别位于病毒基因组中BHRF和BART两个区域。这些mi RNA不仅通过作用于病毒本身的靶基因,调节病毒从裂解期到潜伏期的转化,以便于病毒的感染和潜伏,而且还作用于宿主靶基因,这将更加有利于病毒逃避宿主细胞的免疫反应。Iizasa等人研究发现,mi R-BART6-5p RNAs通过抑制病毒癌基因EBNA2的表达,进而抑制其免疫状态由低反应性向高反应性的转变,这种转变,更加有利于EB病毒的感染和潜伏,上述表明,EB病毒编码的mi RNA在鼻咽癌的发生、发展过程中都发挥着至关重要的作用。而本课题组前期研究也发现,LMP1阳性表达的鼻咽癌细胞株中mi R-19b表达升高10倍以上。目前,关于mi RNA-19b靶基因的预测有多种,但其在鼻咽癌中的具体的分子作用机制仍需探索。目的:检测鼻咽癌与鼻咽部粘膜慢性炎石蜡标本mi R-19b的差异表达,从而探讨mi R-19b与鼻咽癌的发病相关性。检测鼻咽癌和鼻咽部粘膜慢性炎石蜡标本中mi R-19b靶基因产物SOCS-1的差异表达,从而对mi R-19b的分子通路进行科学研究。方法:（1）取鼻咽部粘膜慢性炎石蜡标本10例,鼻咽癌石蜡标本60块。接着总RNA抽提、逆转录、mi R-19b的q PCR,独立样本t检验分析在鼻咽部粘膜慢性炎病人、鼻咽癌病人石蜡标本之间的mi R-19b表达差异。（2）取鼻咽部粘膜慢性炎石蜡标本10例,鼻咽癌石蜡标本60块,通过免疫组化检SOCS-1的差异表达,并与石蜡标本中mi R-19b的差异表达进行相关性分析,探索mi R-19b在鼻咽癌致癌机制中的分子通路。结果:（1）对鼻咽癌石蜡标本mi R-19b的表达进q PCR检测发现,与鼻咽粘膜部慢性炎石蜡标本相比,mi R-19b表达异常（P<0.05）,且提示mi R-19b过表达。（2）免疫组化检测鼻咽部粘膜慢性炎病人与鼻咽癌病人的石蜡标本表明,在鼻咽癌中SOCS-1均低表达,但在粘膜慢性炎的病人中有9例高表达,与石蜡标本中mi R-19b在q PCR检测具有一致性,说明mi R-19b的差异表达可能与SOCS-1相关,统计表明,SOCS-1与mi R-19b负相关,相关系数为-0.625,P=0.02。结论:（1）对比鼻咽部粘膜慢性炎病人的石蜡标本,mi R-19b在鼻咽癌病人中过表达,有统计学意义（P<0.05）。因此石蜡标本中mi R-19b有希望作为鼻咽癌临床诊断的分子标记物。（2）鼻咽癌与鼻咽部粘膜慢性炎病人中SOCS-1的差异表达表明,SOCS-1有可能作为鼻咽癌临床诊断的潜在分子标记物。（3）mi R-19b可能抑制SOCS-1的表达促进鼻咽癌的发生,发展。
董欣[6]（2017）在《1、鼻咽癌放疗反应相关的医学生物学标志 2、OLC1基因在膀胱癌中异常表达及其医学生物学意义》文中指出第一章鼻咽癌放疗反应相关的医学分子生物学标志鼻咽镜下取活检获得组织病理学诊断是鼻咽癌诊断的金标准。放射治疗是目前原发鼻咽癌首选和最有效的治疗手段,但仍有约四分之一的患者对放射治疗不敏感。如若能够在治疗之前对患者对放疗的反应进行预测评估,则有助于针对不同患者制定个体化治疗方案,改善治疗效果。因此,发现、鉴定鼻咽癌放疗敏感性相关的医学生物学标志,成为这一领域重要的研究课题。本项研究首先归纳分析了 2014-2016年期间中国医学科学院肿瘤医院收治的100例鼻咽癌患者的临床资料,旨在探讨基于窄带成像（narrow band imaging,NBI）技术的鼻咽镜下肿瘤表面微血管显露情况与放疗后肿瘤消退情况的关系。随后采用基因芯片的方法对两组不同放疗反应的鼻咽癌（共20例）的肿瘤组织中差异表达microRNA进行筛选,并预测其靶基因且进行功能分析;进而采用新一代测序技术对10例鼻咽癌肿瘤和癌旁组织进行转录组测序分析,筛选差异表达基因并进行功能分析。结合两种方法分析不同放疗反应组间差异表达分子功能与血管生成的关系。另外,探讨了 EB病毒基因在鼻咽癌肿瘤组织中的表达,且分析其表达情况与鼻咽癌放疗反应的关系。在100例鼻咽癌病例中分析发现,NBI内镜下肿瘤表面微血管显露情况与放疗敏感性呈显着正相关（p=0.006,X2=19.268）,即微血管显露评级越高,肿瘤放疗后消退越快。基于这一发现,采用免疫组织化学的方法检查了 89例鼻咽癌肿瘤组织中VEGF、EGFR和Ki67蛋白的表达,结果显示其表达情况与NBI内镜下肿瘤表面血管显露相关。采用芯片技术分析了放疗敏感和放疗不敏感的鼻咽癌各10例肿瘤和癌旁组织的microRNA表达谱,在肿瘤与癌旁组和放疗高敏感与放疗低敏感组分别筛选得到了 78个和41个差异表达microRNA。使用3个公共数据库miRBase,TargetScan和PicTar进行靶基因预测。对肿瘤和癌旁组,要求在全部3个数据库中预测到其靶基因;对于放疗高敏感和低敏感组,要求至少在两个数据库中预测到其靶基因。进而采用Panther软件分别分析其靶基因的生物学功能,结果显示Angiogenesis通路均处在肿瘤和癌旁组、放疗高敏感和低敏感组靶基因功能富集结果中。这说明不同放疗敏感性的鼻咽癌组织中差异表达的microRNA预测得到的靶基因功能富集主要与血管生成有关。采用新一代测序技术对10例鼻咽癌肿瘤和癌旁组织进行转录组测序,在鼻咽癌癌旁与肿瘤组之间差异表达的基因中,发现上调的基因有3432个,下调的基因有4453个;在肿瘤表面微血管显露与未显露组之间差异表达的基因中,发现上调的有379个,下调的基因有392个;在肿瘤放疗高敏感和放疗低敏感组之间差异表达的基因中,发现上调的有115个,下调的基因有132个。三种不同组合比较共有105个共有的差异基因。信号通路富集分析显示,Jak-STAT通路和VEGF等信号通路与鼻咽癌的放疗反应相关。VEGF通路在肿瘤血管生成过程中扮演重要角色,这与临床观察的肿瘤微血管显露情况相一致。另外,转录组测序数据显示,EB病毒编码基因在鼻咽癌肿瘤组织中特异性的高表达,且EBER1/2在鼻咽癌病例中的表达情况可能与肿瘤放疗反应相关。上述研究资料提示:NBI鼻咽镜下观察到的肿瘤微血管显露情况可预示放疗后肿瘤消退情况;不同放疗反应的鼻咽癌差异表达microRNA谱和转录组差异表达基因其生物学功能与血管生成有关,EB病毒基因也在鼻咽癌放疗后肿瘤消退过程中发挥作用。NBI内镜下鼻咽癌肿瘤表面的微血管显露情况,以及肿瘤组织中宿主和EB病毒的异常表达基因（如VEGF通路和Jak-STAT通路,等）,有可能作为鼻咽癌放疗反应相关的医学、分子生物学标志,在治疗前对放疗后肿瘤消退情况进行预测和评估。第二章OLC1基因在膀胱癌中异常表达及其医学生物学意义本实验室前期工作发现并鉴定的肺癌相关基因OLC1在多种恶性肿瘤中表达异常,但目前尚未见OLC1与膀胱癌的研究报道。本项研究首先分析了 OLC1在膀胱癌中的表达情况,随后分析了 OLC1基因异常表达的临床意义,继而进一步探讨了该基因在膀胱癌细胞中的生物学功能。在mRNA水平,RT-PCR分析结果显示,OLC1基因在膀胱癌患者的肿瘤组织中的表达显着高于正常膀胱黏膜组织（p<0.001）,且在肌层浸润性膀胱癌（41/70）中表达高于非肌层浸润性癌（29/70）（p<0.05）,在吸烟患者（24/70）中表达高于非吸烟患者（46/70）（p<0.01）;在蛋白质水平,免疫组织化学分析显示OLC1在37.7%（43/114）膀胱癌组织中高表达,在55例肌层浸润性癌中,52.7%（29例）呈高表达;而在59例非肌层浸润性癌中,23.7%（14例）呈高表达。分析发现,在膀胱癌肿瘤组织中,OLC1的蛋白表达水平与肿瘤的病理学分期（p<0.001）,以及患者的吸烟史（p=0.022）显着相关。对106例随访资料完整的膀胱癌患者病例信息进行分析,发现39例OLC1高表达的膀胱癌患者无瘤生存（disease free survival,DFS）中位数为49个月,67例OLC1低表达的患者DFS中位数为64个月,统计分析发现肿瘤组织中OLC1蛋白表达的高低与患者5年无瘤生存率无显着相关性（39.5%vs56.7%,p=0.156）;39例OLC1高表达的膀胱癌患者总生存（overall survival,OS）中位数为110个月,67例OLC1低表达的患者OS中位数为95个月。OLC1高表达患者的5年总生存率与OLC1低表达患者的5年总生存率有显着差异（79.5%vs 88.1%,p=0.040）。合并分析OLC1表达和吸烟因素,在吸烟患者中有22例OLC1高表达,34例OLC1低表达,五年总生存率分别为71.4%和85.7%（p=0.032）;吸烟人群中OLC1高表达的患者其五年总生存率显着低于非吸烟切OLC1低表达的患者（p=0.010）。体外实验显示,稳定表达外源性OLC1基因能够增加膀胱癌细胞T24和5637的增殖能力,同时也能够增强其侵袭能力。上述研究资料提示,OLC1基因在膀胱癌中存在异常表达,且能够增加膀胱癌细胞的增殖和侵袭能力,同时其异常表达可能与膀胱癌患者,尤其是在吸烟膀胱癌患者的预后相关。
邓卓霞,司勇锋,陶仲强[7]（2016）在《鼻咽癌病因研究及早期诊断与治疗》文中研究表明鼻咽癌在中国南方是常见的恶性肿瘤, 广西是鼻咽癌高发区, 遗传学及EB病毒相关的研究进展为鼻咽癌早期诊断及治疗提供了更多的选择。为了明确在高发区的发病情况, 本单位自1978年开始在广西省梧州市苍梧县运用EB病毒血清学技术进行鼻咽癌普查, 并对血清学阳性者进行长达20年的追踪观察, 使鼻咽癌早期诊断率及远期生存率均有明显提高。目前EB病毒壳抗体IgA/VCA、早期抗原抗体IgA/EA在中国已经广泛应用于鼻咽癌筛查, 但目前仍存在较多问题, 需要更多更好的筛查技术予以解决。早诊早治在广西是鼻咽癌防治的主要策略, 鼻咽癌普查是应该坚持进行。
韩小磊[8]（2016）在《EB病毒在胸腺瘤中的表达水平初探》文中研究表明目的:目前EB病毒在其他肿瘤及疾病中的发病机制研究颇多,成果丰硕,但在胸腺瘤以及胸腺其他疾病中研究较少。其对胸腺瘤合并自身免疫性疾病是否产生影响也没有确切定论。本研究以EB病毒在胸腺瘤中的表达为研究要点,目的是通过检测胸腺瘤及其他胸腺疾病组织中EB病毒基因的表达情况,来研究胸腺瘤与EB病毒的关联性,并通过检测这些患者中有无血清中EB病毒感染,来进一步研究EB病毒与胸腺瘤的关联性,以及是否与重症肌无力也存在关联性。方法:本实验分为四组:胸腺瘤组,正常胸腺组,胸腺增生组,纵隔其他肿瘤组。统计各组的临床资料,收集患者组织样本并提取基因组DNA,亦收集部分血清样本。应用PCR检测组织中EB病毒基因的表达;ELISA检测所采集血清样本检测有无EB病毒感染;研究其在各分组中的基因表达与病毒感染,分析各分组间的表达与感染差异;以探讨EB病毒与胸腺瘤的感染的关系。结果:（1）PCR检测EB病毒胸腺瘤组与正常组检测结果比较差异具有统计学意义,P<0.05,EB病毒检测阳性率胸腺增生组最高。PCR检测EB病毒各个基因表达情况,EBER-1表达最多,BARF-1阳性次之,EBNA-1最少。（2）PCR胸腺瘤组区分为单纯胸腺瘤组与胸腺瘤合并自身免疫性疾病组,EB病毒检测结果比较差异具有统计学意义,P<0.05,EBV阳性率单纯胸腺瘤组大于胸腺瘤合并自身免疫性疾病组。PCR胸腺瘤组区分为单纯胸腺瘤与胸腺瘤MG组,EB病毒检测结果比较差异具有统计学意义,P<0.05,EBV基因检测阳性率单纯胸腺瘤组大于胸腺瘤MG组。PCR胸腺增生组区分为单纯胸腺增生组和胸腺增生合并自身免疫性疾病组,EB病毒检测结果无明显差异,P>0.05,EBV基因检测阳性率胸腺增生合并自身免疫性疾病组大于胸腺增生组。（3）PCR检测EB病毒阳性率在胸腺瘤组中各病理分型中,A型最高,B型最低,B1型与B2型结果比较差异具有统计学意义,P<0.05,B1型阳性率高于B2型。重症肌无力分型中EB病毒阳性率无明显差异,P>0.05。临床分期中EB病毒阳性率无明显差异,P>0.05。（4）ELISA检测EB病毒阳性率在胸腺瘤组与胸腺增生组结果无明显差异,P>0.05,ELISA检测阳性率胸腺增生组大于胸腺瘤组。单纯胸腺瘤组与胸腺瘤合并自身免疫性疾病组在ELISA检测上无明显差异,P>0.05,ELISA检测阳性率胸腺瘤合并自身免疫性疾病组大于单纯胸腺瘤组。（5）ELISA检测EB病毒阳性率在胸腺瘤组中病理分型,重症肌无力分型,临床分期结果无统计学差异,P>0.05。（6）PCR与ELISA结果比较,在病理分型,重症肌无力分型以及临床分期中,两种检验结果在B型,C型中阳性率不同。结论:证实EB病毒与胸腺瘤存在一定关联,需要进一步深入研究。EB病毒与单纯胸腺瘤的关系更大,与自免病也有一定关系。EB病毒与胸腺增生和自免病也有一定联系,但需扩大样本研究验证。EB病毒与病理分型关系更大,B1型与EB病毒关系比B2型更强,EB病毒与重症肌无力和临床分期无明显关系,但仍需扩大样本验证。ELISA结果差异不明显,需要扩大研究对象以明确有无关联性。恶性程度越高,重症肌无力越重,分期越晚,血清及基因检测结果差异越明显。
任艳鑫[9]（2014）在《病毒IL-10通过“MHC-I类分子抗原加工提呈操纵子”致鼻咽癌免疫逃逸的机制研究》文中进行了进一步梳理[背景和目的]鼻咽癌（Nasopharyngeal carcinoma,NPC）是中国南方及东南亚地区常见的恶性肿瘤之一,其起病隐匿、转移早、治疗后容易复发,五年生存率始终在60%以下。鼻咽癌发病主要与EB病毒（Epstein-Barr virus,EBV）感染、环境（主要为化学致癌物）及遗传等多种因素相关。EBV病毒感染是目前公认的鼻咽癌发生、发展的重要因素之一,其编码蛋白从致瘤、抑制免疫、促进肿瘤转移、抑制肿瘤细胞调亡等方面促进肿瘤的发生。EB病毒的BCRF-1基因片段编码vIL-10与人IL-10有83%的同源性,具有和人IL-10类似的免疫抑制作用,但缺乏免疫调节作用,vIL-10可通过多种途径抑制肿瘤免疫应答,从而促使肿瘤逃逸机体免疫监视。在肿瘤免疫应答过程中,MHC-Ⅰ类分子限制的CD8+细胞毒性T淋巴细胞在阻止肿瘤的发生、发展过程中起关键作用。肿瘤抗原是内源性抗原,首先由低分子量多肽(（low molecular weightpolypeptide,LMP）-2、7消化.加工成一定分子量的抗原肽,然后与抗原处理相关转运体蛋白（Transporter association antigen processing,TAP）-1.2结合转运至内质网。在内质网中,MHC（主要是HLA-Ⅰ）结合抗原肽后将其呈递至细胞表面供CD8+细胞毒性T淋巴细胞（CTLs）识别,从而启动细胞免疫。由于MHC-Ⅰ类基因、TAP基因、LMP基因位置靠近,转录活性同时受干扰素的诱导,能够协调三者基因产物的量,有效提呈抗原,故三者构成的系统被比喻成真核生物MHC-Ⅰ类分子抗原加工和提呈的“操纵子”。在一系列抗原呈递过程中,无论哪个环节出现异常都会影响肿瘤抗原的提呈,抑制机体对肿瘤的免疫杀伤。因此,明确鼻咽癌中vIL-10是否对MHC-Ⅰ类分子抗原加工和提呈的“操纵子”表达具有影响以及导致这种影响的机制可以帮助我们更加进一步理解鼻咽癌患者的免疫状态。本文主要目的：通过石蜡切片了解鼻咽癌组织中“MHC-Ⅰ类分子抗原加工提呈操纵子”（即TAP-1,TAP-2,LMP-2, LMP-7及HLA-Ⅰ）表达的变化及其与临床因素的关系；通过研究鼻咽癌组织中BCRF-1mRNA及vIL-10蛋白质的表达,明确vIL-10对鼻咽癌患者免疫细胞的影响；通过体外实验了解vIL-10对鼻咽癌细胞株“MHC-Ⅰ类分子抗原加工提呈操纵子”表达的影响；阐明vIL-10对NF-κB通路相关蛋白表达影响以及对其下游“MHC-Ⅰ类分子抗原加工提呈操纵子”基因表达的影响。[方法]本研究分四部分：1、鼻咽癌组织“MHC-Ⅰ类分子抗原加工提呈操纵子”表达的研究收集昆明医科大学第三附属医院（云南省肿瘤医院）头颈外科住院患者,病理证实为鼻咽低分化鳞癌,同期因鼻咽部肿块至云南省肿瘤医院头颈外科就诊,并行鼻咽部取材病理证实为鼻咽部非特异性炎症为对照组,免疫组织化学法（IHC）检测鼻咽癌石蜡切片中TAP-1, TAP-2,LMP-2, LMP-7及HLA-Ⅰ的表达,流式细胞仪（FCM）检测鼻咽癌患者及对照组外周血中CD4+T、CD8+T细胞比例,酶联免疫吸附法（ELISA）检测空腹外周静脉血IL-10含量,并对以上结果进行统计分析。2、鼻咽癌组织中BCRF-1基因表达及其对免疫功能影响的研究RT-PCR检测鼻咽癌组织中BCRF-1mRNA, Western Blot检测鼻咽癌组织中vIL-10蛋白质；流式细胞术检测鼻咽癌患者外周血CD4+T、CD8+T细胞的比例。3、vIL-10对鼻咽癌细胞“MHC-Ⅰ类分子抗原加工提呈操纵子”表达影响的研究收集不同时间段vIL-10处理的鼻咽癌细胞,RT-PCR、Western Bolt方法检测vIL-10处理的鼻咽癌细胞中“MHC-Ⅰ类分子抗原加工提呈操纵子”（即TAP-1,TAP-2,LMP-2, LMP-7及HLA-I）表达的变化。4、vIL-10通过NF-κB通路对“MHC-Ⅰ类分子抗原加工提呈操纵子”基因表达影响的研究（1）重组质粒pEGFP-N1-TNFα转染鼻咽癌细胞并检测转染后细胞分泌TNF-α的浓度,不同浓度TNF-a作用鼻咽癌细胞,Western Blot检测不同时间段TNF-a对NF-κB的活性的影响；（2）不同浓度的vIL-10预处理鼻咽癌细胞株2小时后,15ng/mLTNF-α再刺激鼻咽癌细胞,Western Blot检测NF-κB通路各个蛋白的变化；（3）免疫荧光方法观察vIL-10对NF-κBp65核转位活性的影响；（4） EMS A法检测NF-κB p65在细胞核内的DNA结合活性；（5）CHIP法检测vIL-10对NF-κB目的基因（即MHC-Ⅰ类分子抗原加工和提呈“操纵子”）表达的影响。[结果]1、鼻咽癌组织“MHC-Ⅰ类分子抗原加工提呈操纵子”的低表达及其与临床因素的关系：①TAP-1, TAP-2,LMP-2, LMP-7及HLA-Ⅰ在鼻咽癌组织中表达分别为43.1%、46.55%、41.38%、44.83%、50.00%（25/58、27/58、24/58、26/58、29/58）均低于鼻咽非肿瘤组织中的表达90.00%、95.00%、95.00%、95.00%、95.00%（18/20、19/20、19/20、19/20、19/20）（P<0.05）；②鼻咽癌组CD4+T细胞比例明显低于对照组（33.41±10.04%vs40.15±3.56%,P<0.05）,CD8+T细胞比例与对照组比较无统计学差异（25.32±8.29%vs22.89±2.24%,P>0.05）,鼻咽癌组IL-10表达明显高于对照组（13.12±1.23vs3.69±1.03ng/ml,P<0.05）；③鼻咽癌中TAP-1, TAP-2,LMP-2, LMP-7及HLA-Ⅰ表达与年龄、性别无相关性（P>0.05）,与TNM分期、有无淋巴结转移及有无远处转移密切相关（P<0.05）；④CD8+T细胞与TAP-1, TAP-2,LMP-2, LMP-7及HLA-Ⅰ表达成正比,IL-10表达与TAP-1,TAP-2,LMP-2, LMP-7及HLA-Ⅰ表达成反比,CD4+T细胞与TAP-1, TAP-2,LMP-2,LMP-7及HLA-Ⅰ表达无明显相关性；⑤Kaplan-Meier分析提示：临床分期、有无淋巴结转移、有无远处转移、病理分型、TAP-1表达、TAP-2表达、LMP-2表达、LMP-7表达、HLA-Ⅰ表达与鼻咽癌患者预后相关,具有统计学差异（P<0.05）。多因素Cox回归模型分析：有无远处转移及HLA-Ⅰ表达为鼻咽癌患者独立预后因素（P分别为0.041,0.042）。2、鼻咽癌组织vIL-10的高表达及其与免疫细胞的关系：①34例鼻咽癌组织BCRF-1mRNA呈阳性（34/40,85%）,16例鼻咽正常组织BCRF-1mRNA呈阳性（16/20,80%）,两者比较无统计学差异（P>0.05）；②30例鼻咽癌组织vIL-10呈阳性（30/40,75%）,10例鼻咽正常组织vIL-10呈阳性（10/20,50%）,两者比较有统计学差异（P<0.05）；③40例鼻咽癌患者分为vIL-10阳性组和vIL-10阴性组,vIL-10阳性组CD4+T细胞及CD4+T/CD8+T比值明显低于vIL-10阴性组（24.99±3.88%VS35.92±6.31%,0.86VS1.99,P<0.05）,vIL-10阳性组CD8+T细胞也明显低于vIL-10阴性组（20.10±7.68%VS30.61±3.34%,P<0.05）。3、vIL-10抑制鼻咽癌细胞株“MHC-Ⅰ类分子抗原加工提呈操纵子”的表达：（1）mRNA水平上：①CNE-1和CNE-2的TAP-1在不同时间点水平均未表现出显着差异；②vIL-10作用1h、4h、6h、12h时,CNE-1和CNE-2的TAP-2的mRNA均未出现变化,在24h时,TAP-2出现显着下降甚至消失；③LMP-2的mRNA在24h时,CNE-1的LMP-2mRNA出现减弱,CNE-2的LMP-2mRNA甚至消失；④CNE-1细胞在vIL-10作用后1h即出现LMP-7下降,而CNE-2细胞在vIL-10作用后6h出现下降；⑤在24h时CNE-1和CNE-2的HLA-I mRNA水平出现显着下降。（2）蛋白水平上：①CNE-1在vIL-10作用后6h时,TAP-1蛋白水平出现略微下降,12h时并未延续该下降趋势反而有所上升,24h时TAP-1蛋白水平出现显着下降（P<0.05）,CNE-2细胞在vIL-10作用后6h、12h时,TAP-1蛋白水平比1h增高,在24h时蛋白水平显着下降（P<0.05）；②CNE-1和CNE-2细胞在vIL-10作用后1h、6h、12h、24h,TAP-2蛋白水平逐渐下降（P值均<0.05）；③vIL-10作用CNE-1细胞后,LMP-2蛋白水平在12h时出现显着下降。CNE-2细胞中则表现为随时间逐渐下降趋势（P值均<0.05）；④CNE-1细胞的LMP-7蛋白在vIL-10作用后12h时出现显着下降。CNE-2细胞中LMP-7蛋白出现随时间逐渐下降趋势（P值均<0.05）；⑤CNE-1和CNE-2细胞在vIL-10作用后,HLA-Ⅰ出现下降趋势,但是在CNE-1细胞中各时间段变化无统计学差异（P>0.05）,CNE-2细胞在24h出现显着下降,差异有统计学意义（P<0.05）。4、vIL-10通过NF-κB通路对“MHC-Ⅰ类分子抗原加工提呈操纵子”基因表达影响：（1）vIL-10抑制NF-κ,B通路的活性：①纳米材料介导TNF-α转染鼻咽癌细胞,转染后细胞分泌TNF-α增加,但是未达到实验所需浓度；②TNF-α作用后,CNE-1,CNE-2细胞的NF-κB p-p65表达量均增加,并且并且与TNF-α浓度变化成正比；③CNE-2细胞的IKKa、IKKβ在TNF-α诱导后表达增加,而CNE-1细胞未发现此种变化,两种细胞的p-IKK a/β在TNF-a诱导后表达均增加；④CNE-1、CNE-2细胞的IKB a受到TNF-a刺激后表达减少,并且与TNF-a浓度成反比,两种细胞在TNF-α诱导后p-IKB a表达均增加；⑤CNE-1、CNE-2细胞的p-IKK a/β、NF-κB p-p65的表达与vIL-10浓度呈反比,而IKB蛋白表达与vIL-10浓度呈正比；⑥vIL-10作用CNE-1,CNE-2细胞后,胞浆中NF-kB p65核转位活性减弱。⑦vIL-10可以抑制鼻咽癌细胞中NF-κB的DNA结合活性,在CNE-2中抑制作用呈剂量依赖性。（2）vIL-10抑制NF-κB目的基因“MHC-Ⅰ类分子抗原加工提呈操纵子”的表达：ChIP结果显示CNE-2细胞中vIL-10可以通过NF-κB抑制TAP-1,TAP-2,LMP-2,LMP-7及HLA-Ⅰ基因表达。[结论]1、鼻咽癌组织中TAP-1, TAP-2,LMP-2, LMP-7及HLA-Ⅰ低表达,且与患者免疫抑制相关,HLA-Ⅰ低表达预示鼻咽癌患者不良预后。2、鼻咽癌组织中高表达BCRF-1基因及其蛋白产物vIL-10；vIL-10可以使鼻咽癌患者的免疫细胞发生偏移,发挥免疫抑制。3、vIL-10可明显抑制鼻咽癌MHC-Ⅰ类分子抗原加工和提呈的“操纵子”的表达,并且呈一定的时间依赖性。4、vIL-10可以抑制NF-κBp65活化、核转位及细胞核内NF-κB与DNA结合活性,进而抑制NF-κB目的基因TAP-1,TAP-2,LMP-2,LMP-7及HLA-Ⅰ的转录激活,降低鼻咽癌抗原提呈能力。
桂勋[10]（2014）在《鼻咽癌早期诊断和治疗新型标志物的探索研究》文中进行了进一步梳理鼻咽癌是我国南部地区及东南亚常见的恶性肿瘤之一,给人类健康及经济稳定造成了极大的危害。由于鼻咽癌发生部位的解剖结构较复杂,不易于手术治疗,而且对化学药物不敏感,因此,当前鼻咽癌的治疗主要依赖放射治疗。目前的临床放射治疗对早期鼻咽癌治愈效果可达90%以上,但由于缺乏有效的早期诊断方法,大部分鼻咽癌患者被确诊时都接近中、晚期,错过了放射治疗的最佳时机,导致了患者五年生存率的大大降低。因此,寻找适合鼻咽癌早期诊断的血清学诊断标志物已成为目前鼻咽癌临床与基础研究的一个重要研究方向。此外,经初次放射治疗后的鼻咽癌患者,部分容易出现复发,部分容易出现远端转移,且对放射治疗不再敏感,此类复发或转移患者的预后生存率极低,因此,寻找适合易复发或易转移鼻咽癌患者个性化诊断的血清学标志物并探索适合鼻咽癌治疗的生物治疗靶标也日渐成为重要的鼻咽癌研究方向。为此,本研究针对鼻咽癌的早期诊断、个性化诊断以及治疗性抗体药物研发等三部分进行有意义的前期探索。本论文的第一部分旨在寻找高特异性的鼻咽癌诊断标志物,建立鼻咽癌的血清学早期诊断方法及组织学特异性检测工具。鼻咽癌的发生及发展过程与EB病毒的感染密切相关,EB病毒相关标志物已被用于开发鼻咽癌临床诊断试剂,如EBNA1/IgA、VCA/IgA等,此类标志物对鼻咽癌的早期筛查有很好的检测灵敏度,但特异性尚达不到临床检测的要求。鉴于EB病毒主要以II型潜伏态的形式存在于鼻咽癌细胞中,本研究拟以EB病毒II型潜伏态特异性表达蛋白LMP1、LMP2A及BARF1为研究对象,探索此类标志物应用于鼻咽癌早期筛查的可能性。首先,利用原核表达的方式制备了 LMP1、LMP2A不同亲水区基因及BARF1全长基因的重组蛋白,并分别用于检测鼻咽癌患者及健康人血清中针对上述三种抗原的IgA及IgG抗体水平,结果发现,仅鼻咽癌患者血清中抗LMP1第3个胞外区（LMP1-EX3）的IgA抗体和抗LMP2A第5个胞外区（LMP2A-EX5）的IgA抗体水平显着高于健康人,提示LMP1-EX3/IgA和LMP2A-EX5/IgA有望成为鼻咽癌特异诊断的标志物;其次,利用LMP1羧基端重组蛋白（rLMP1-C.ter,aa187-aa386）及LMP2A氨基端重组蛋白（rLMP2A-N.ter,aal-aa119）免疫BALB/c小鼠,分别制备了抗LMP1-C.ter单抗25株和抗LMP2A-N.ter单抗16株,Western blot及免疫荧光的鉴定结果显示,抗LMP1-C.ter单抗14B6和5H8对过表达LMP1的293T细胞有反应,抗LMP2A-N.ter单抗13A12和12A 2对过表达LMP2A的293T细胞有反应,提示这些单抗能识别天然构象的EB病毒表达抗原,有望成为鼻咽癌检测的研究工具;最后,选取抗LMP1-C.ter单抗代表株14B6和抗LMP2A-N.ter单抗代表株13A12,分别测试它们在免疫组化实验中对临床鼻咽癌患者组织切片的检测效果,结果显示,上述两个单抗对鼻咽癌组织切片有良好的免疫组化活性和特异性,有望成为鼻咽癌临床组织学诊断工具。综上,本研究发现EB病毒的潜伏期膜蛋白LMP1和LMP2A是两个重要的鼻咽癌特异性诊断标志物,其一是证明LMP1-EX3/IgA及LMP2A-EX5/IgA可用于建立适合鼻咽癌血清学特异筛查的免疫诊断试剂,其二是证明LMPI单抗14B6及LMP2A单抗13A12可用于建立适合鼻咽癌组织学特异诊断的免疫组化检测试剂,这些发现为研究EB病毒潜伏期膜蛋白在鼻咽癌发生发展中的作用机制和临床诊断意义奠定良好的工作基础。本研究的第二部分旨在寻找适合鼻咽癌个性化诊断的标志物,探索研制易复发或易转移性鼻咽癌的早期诊断试剂的可能性。尽管当前放射治疗对原发性鼻咽癌已取得很好的治疗效果,但仍有15-58%的患者预后容易复发或转移,并产生放疗抗性,此类病人的再次治疗的预后很差,成为鼻咽癌临床治疗中的一个难点。因此,研究适合复发性鼻咽癌早期诊断用的诊断标志物,有助于高度个性化治疗方案的制定,对提高复发性鼻咽癌的治疗效果具有重要意义。文献报道EB病毒II型潜伏态BARTs区的转录产物与鼻咽癌的发生发展密切相关,可能与鼻咽癌预后发展有关。为此,本研究拟以EB病毒II型潜伏态BARTs区的转录产物A73为研究对象,探索其作为鼻咽癌个性化诊断标志物的可能性。首先,利用原核表达方式制备了高纯度的A73重组蛋白rGST-A73-NP9,并用于检测鼻咽癌患者血清中抗A73的IgA及IgG抗体水平,结果发现,A73/IgA的检测值可以将鼻咽癌患者分成两类,提示A73/IgA是一个不同类型鼻咽癌的分类诊断靶标;其次,利用rGST-A73-NP9免疫BALB/c小鼠,制备了抗A73的特异性单抗18株,并采用Western blot及免疫荧光方法证明A73单抗6A2对过表达A73的293T细胞有良好反应,提示A73单抗能识别自然状态下的A73抗原,为利用A73单抗研究A73表达产物提供了有用的研究工具;然后,利用单抗6A2分别对EB病毒感染的淋巴细胞系B95-8及上皮细胞系C666-1进行了 Western blot及免疫荧光的检测,结果显示,在这两种传代细胞系中均未检测到A73蛋白的表达,但在部分鼻咽癌组织中检测到A73蛋白的存在,提示A73蛋白有可能作为一个鼻咽癌分类诊断用的免疫组化检测靶标;最后,通过分离鼻咽癌细胞系C666-1细胞培养上清及鼻咽癌患者血清中的外泌体,用RT-PCR检测方法首次在外泌体中发现了 A73 mRNA的存在,提示鼻咽癌细胞中高表达的A73 mRNA很可能通过外泌体的方式转运至胞外,而此种转运方式和鼻咽癌患者血清中A73 mRNA的水平可能与鼻咽癌的复发和转移有关。综上,可能存在A73高表达和低表达两种鼻咽癌类型,而此两种鼻咽癌的转归结果是否存在差异还需要进一步鉴定。本研究的第三部分是研究LMP1和LMP2A抗体治疗鼻咽癌的效果探索LMP1及LMP2A作为鼻咽癌抗体治疗靶标的可行性。抗体药物由于具有毒副作用小及特异性强等特性,在肿瘤的治疗上表现出了明显的优势。LMP1及LMP2A是EB病毒在鼻咽癌细胞中表达的膜蛋白,具有很强的肿瘤组织表达特异性,而且在肿瘤的发生及发展过程中起重要作用,本研究拟通过实验证明其作为鼻咽癌抗体治疗靶标的潜在可能性。首先,基于鼻咽癌细胞系CNE-2Z构建了同时表达虫荧光素酶的LMP1及LMP2A稳定表达细胞株CNE-2Z-Luc-LMP1及CNE-2Z-Luc-LMP2A;其次,通过以白喉毒素为载体的展示肽免疫BALB/c小鼠,分别制备了抗LMP1-EX3特异性单抗25株及抗LMP2A-EX5特异性单抗6株,并用Western blot及免疫荧光检测方法证明抗LMPI-EX3单抗14H5和12AI与过表达LMP1的293T细胞有反应,抗LMP2A-EX5单抗5E9和7H3与过表达LMP2A的293T细胞有反应,在此基础上鉴定出LMP2A-EX5单抗所识别的线性B细胞表位382SLSSTEFIP390;最后,用肿瘤细胞体外生长抑制实验评估了抗LMP1-EX3单抗及抗LMP2A-EX5单抗对鼻咽癌细胞系CNE-2Z-Luc-LMPI及CNE-2Z-Luc-LMP2A的生长抑制效果,结果显示抗LMP1-EX3单抗2B8、5D4及7G9,抗LMP2A单抗5E9及7H3在体外对鼻咽癌细胞系有很好的生长抑制活性,从而初步证明LMP1-EX3及LMP2A-EX5作为鼻咽癌抗体治疗靶标的可行性。总之,本论文针对EB病毒II型潜伏态的基因转录产物进行鼻咽癌诊断靶标及治疗靶标的的探索研究,发现LMP1-EX3及LMP2A-EX5是很好的鼻咽癌诊断及治疗靶标,还发现A73是一个潜在的鼻咽癌个性化诊断靶标,为研制鼻咽癌特异性早期诊断试剂和鼻咽癌治疗性抗体药物奠定了基础。
二、EB病毒基因BARF1在鼻咽癌中的表达及其意义（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、EB病毒基因BARF1在鼻咽癌中的表达及其意义（论文提纲范文）
（1）1、DNA拷贝数异常改变作为膀胱癌预后判断相关分子标志物的研究 2、EB病毒相关上皮性恶性肿瘤中病毒miRNA与宿主相互作用的分子机制及其意义（论文提纲范文）
| 英语缩略词 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 DNA拷贝数异常改变作为膀胱癌预后判断相关分子标志物的研究 |
| 导论 |
| 1. 膀胱癌概述 |
| 2. 基因拷贝数变异的生物学意义 |
| 3. 基因拷贝数变异与恶性肿瘤的关系 |
| 4. 膀胱癌中的基因拷贝数异常 |
| 5. 问题与展望 |
| 6. 本项研究的目的和基本策略 |
| 结果 |
| 第一节 本研究入组病例及其临床病理特征 |
| 1. 膀胱癌肿瘤组织病例 |
| 1.1 膀胱癌肿瘤组织病例的临床病理特征 |
| 1.2 膀胱癌肿瘤组织病例随访情况 |
| 2. 膀胱癌尿样本 |
| 2.1 膀胱癌尿样本病例的临床病理特征 |
| 2.2 膀胱癌尿样本病例随访情况 |
| 第二节 膀胱癌组织中DNA拷贝数异常改变辅助膀胱癌预后判断 |
| 1. DNA拷贝数异常与临床病理风险因素的相关性分析 |
| 1.1 膀胱癌肿瘤组织中的DNA拷贝数异常 |
| 1.2 膀胱癌肿瘤组织中DNA拷贝数异常与临床病理风险因素的关系 |
| 2. DNA拷贝数异常与患者预后的相关性分析 |
| 2.1 DNA拷贝数异常与非肌层浸润性膀胱癌预后的相关性 |
| 2.2 DNA拷贝数异常与肌层浸润性膀胱癌预后的相关性 |
| 3. 基于临床病理风险因素与DNA拷贝数异常的预后预测模型 |
| 3.1 Cox风险比例回归分析影响膀胱癌患者无瘤生存期的独立预后因素 |
| 3.2 基于膀胱癌独立预后因素构建预后预测模型 |
| 3.2.1 构建非肌层浸润性膀胱癌患者预后预测模型 |
| 3.2.2 构建肌层浸润性膀胱癌患者预后预测模型 |
| 3.2.3 高风险非肌层浸润性膀胱癌患者预后预测 |
| 第三节 基于Real-time PCR方法检测膀胱癌术前尿脱落细胞中DNA拷贝数异常改变辅助膀胱癌预后判断 |
| 1. 膀胱癌患者尿样本中DNA拷贝数异常与临床病理风险因素的相关性分析 |
| 1.1 膀胱癌患者术前尿样本中的DNA拷贝数异常改变 |
| 1.2 术前尿样本中DNA拷贝数异常与临床病理风险因素的关系 |
| 2. 膀胱癌患者术前尿样本中DNA拷贝数异常与预后的相关性分析 |
| 2.1 术前尿样本中DNA拷贝数异常与预后的关系 |
| 2.2 术前尿样本中DNA拷贝数异常与非肌层浸润性膀胱癌短期肿瘤复发的相关性 |
| 2.3 构建非肌层浸润性膀胱癌短期肿瘤复发预测模型 |
| 第四节 基于3D数字PCR方法检测膀胱癌术前尿脱落细胞中DNA拷贝数异常改变辅助膀胱癌预后判断 |
| 1. 膀胱癌患者术前尿样本中DNA拷贝数异常与临床病理风险因素的相关性分析 |
| 1.1 膀胱癌患者术前尿样本中的DNA拷贝数异常改变 |
| 1.2 术前尿样本中DNA拷贝数异常与临床病理风险因素的关系 |
| 2. 3D数字PCR与real-time PCR对尿液中拷贝数变异分子的检测效能比较 |
| 2.1 受试者工作曲线分析比较两者检测效能 |
| 2.2 构建基于3D数字PCR的术前尿样本诊断模型 |
| 3. 膀胱癌患者术前尿样本中DNA拷贝数异常与预后的相关性分析 |
| 3.1 尿样本中DNA拷贝数异常与非肌层浸润性膀胱癌预后的相关性 |
| 3.2 尿样本中DNA拷贝数异常与肌层浸润性膀胱癌预后的相关性 |
| 讨论 |
| 1. 膀胱癌相关分子标志物研究的策略 |
| 2. 组织中膀胱癌预后相关分子标志物 |
| 3. 尿液中膀胱癌预后相关分子标志物 |
| 4. 3D数字PCR在膀胱癌患者尿液检测中的应用 |
| 5. CEP63、FOSL2及PAQR6的异常改变与肿瘤的关系 |
| 6. 本项研究的局限性 |
| 本章小结 |
| 材料与方法 |
| 一、研究病例和实验材料 |
| 1. 膀胱癌患者及其生物学样品 |
| 2. 生物样品收集、制备和鉴定所需试剂 |
| 3. 实时荧光定量PCR |
| 4. 3D数字PCR |
| 5. 引物序列 |
| 6. 主要仪器和设备 |
| 7. 主要分析软件 |
| 二、实验方法 |
| 1. 尿沉渣DNA提取 |
| 2. 实时荧光定量PCR |
| 3. 扩增产物质量检测 |
| 4. 引物扩增标准曲线 |
| 5. 3D数字PCR |
| 6. 统计学方法 |
| 第二章 EB病毒相关上皮性恶性肿瘤中病毒miRNA与宿主相互作用的分子机制及其意义 |
| 导论 |
| 1. EB病毒概述 |
| 2. EB病毒相关的上皮性恶性肿瘤 |
| 3. EB病毒编码基因及其变异与恶性肿瘤的关系 |
| 4. EB病毒编码的小RNA与恶性肿瘤的关系 |
| 5. 本项研究的目的和策略 |
| 结果 |
| 第一节 EB病毒编码的miRNA在胃癌中的表达及其医学生物学意义 |
| 一、研究入组病例及其临床病理特征 |
| 二、EB病毒相关胃癌中病毒及宿主miRNA的表达 |
| 1. EB病毒相关胃癌中病毒miRNA的表达谱 |
| 1.1 miRNA芯片质量控制 |
| 1.2 EB病毒相关胃癌肿瘤组织中病毒miRNA的表达谱 |
| 1.3 EB病毒相关胃癌细胞系中病毒miRNA的表达谱 |
| 1.4 EB病毒相关胃癌中高表达的病毒miRNA |
| 1.5 探索EB病毒相关胃癌中高表达病毒miRNA的靶基因及其功能 |
| 2. EB病毒相关胃癌中宿主miRNA的表达 |
| 2.1 EB病毒相关胃癌组织中宿主miRNA的差异表达分析 |
| 2.2 EB病毒相关胃癌细胞系中宿主miRNA的差异表达分析 |
| 2.3 EB病毒相关胃癌中与病毒有关的宿主miRNA |
| 3. EB病毒编码的miRNA与宿主miRNA的相关性分析 |
| 3.1 探索EB编码的miRNA与宿主细胞miRNA表达的相关性 |
| 3.2 探索与EB病毒miRNA与相关宿主miRNA结构的相关性 |
| 3.3 探索与EB病毒相关的宿主miRNA的靶基因及其功能 |
| 三、EB病毒相关胃癌中病毒miRNA对宿主基因表达的影响 |
| 1. EB病毒相关胃癌中差异表达的宿主基因 |
| 1.1 转录组测序EB病毒相关胃癌组织中宿主基因的差异表达 |
| 1.2 公共数据库中EB病毒相关胃癌组织中宿主基因的差异表达 |
| 1.3 EB病毒相关胃癌与EB病毒阴性胃癌中宿主基因的差异表达 |
| 2. 差异表达的宿主基因与病毒miRNA的相关性 |
| 2.1 从差异表达的宿主基因中筛选病毒与宿主miRNA的共同靶基因 |
| 2.2 病毒与宿主miRNA共同靶基因KEGG信号通路富集 |
| 四、EB病毒相关胃癌中病毒miRNA的功能研究 |
| 1. 瞬时转染后细胞中miR-BART1-3p和miR-BART7-3p的表达变化 |
| 2. EB病毒miRNA对胃癌细胞增殖能力的影响 |
| 2.1 miR-BART1-3p及miR-BART7-3p过表达对细胞增殖能力的影响 |
| 2.2 miR-BART1-3p及miR-BART7-3p敲降对细胞增殖能力的影响 |
| 3. EB病毒miRNA对胃癌细胞周期的影响 |
| 3.1 miR-BART1-3p及miR-BART7-3p过表达对细胞周期的影响 |
| 3.2 miR-BART1-3p及miR-BART7-3p敲降对细胞周期的影响 |
| 4. EB病毒miRNA对胃癌细胞迁移能力的影响 |
| 4.1 miR-BART1-3p及miR-BART7-3p过表达对细胞迁移能力的影响 |
| 4.2 miR-BART1-3p及miR-BART7-3p敲降对细胞迁移能力的影响 |
| 第二节 EB病毒编码的miRNA在鼻咽癌中的表达及其医学生物学意义 |
| 一、研究入组病例及其临床病理特征 |
| 二、鼻咽癌中EB病毒miRNA的表达 |
| 三、鼻咽癌中EB病毒miR-BART7-3p的功能研究 |
| 1. 瞬时转染后细胞中miR-BART7-3p的表达变化 |
| 2. miR-BART7-3p对鼻咽癌细胞增殖能力的影响 |
| 2.1 miR-BART7-3p过表达对鼻咽癌细胞增殖能力的影响 |
| 2.2 miR-BART7-3p敲降对鼻咽癌细胞增殖能力的影响 |
| 3. miR-BART7-3p对鼻咽癌细胞周期的影响 |
| 3.1 miR-BART7-3p过表达对鼻咽癌细胞周期的影响 |
| 3.2 miR-BART7-3p敲降对鼻咽癌细胞周期的影响 |
| 4. miR-BART7-3p对鼻咽癌细胞迁移能力的影响 |
| 4.1 miR-BART7-3p过表达对鼻咽癌细胞迁移能力的影响 |
| 4.2 miR-BART7-3p敲降对鼻咽癌细胞迁移能力的影响 |
| 讨论 |
| 1. 临床相关研究质量控制 |
| 2. EB病毒相关胃癌中病毒miRNA的研究 |
| 3. 本项研究中病毒miRNA在EB病毒相关胃癌中的表达及其意义 |
| 4. 鼻咽癌中病毒miRNA的研究 |
| 5. 本项研究中病毒miRNA在鼻咽癌中的表达及其意义 |
| 本章小结 |
| 材料与方法 |
| 一、实验材料 |
| 1. EB病毒相关胃癌患者及其生物学样品 |
| 2. 鼻咽癌相关患者及其生物学样品 |
| 3. 临床样品收集、制备和鉴定所需试剂 |
| 4. 主要试剂盒 |
| 5. 实时定量荧光PCR试剂 |
| 6. 细胞培养和miRNA转染 |
| 7. 常用试剂配制 |
| 8. 细胞培养用主要器皿 |
| 9. 主要仪器 |
| 10. 主要分析软件 |
| 二、实验方法 |
| 1. 基因表达谱芯片技术 |
| 2. 芯片数据读取 |
| 3. 芯片数据预处理和标准化 |
| 4. 第二代测序 |
| 5. miRNA实时定量荧光PCR |
| 6. 总RNA样品的提取、制备及质量鉴定 |
| 7. 细胞生物学实验方法 |
| 参考文献 |
| 基金资助 |
| 致谢 |
（2）基于转录组测序分析的鼻咽癌相关EB病毒变异亚型及预后模型的研究（论文提纲范文）
| 英语缩略词 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 与鼻咽癌相关的EBV基因变异及其医学生物学功能 |
| 第一节 导论 |
| 1.EBV概述 |
| 1.1 EBV的基本生物学特征 |
| 1.2 EBV潜伏感染 |
| 1.3 EBV潜伏基因 |
| 2 鼻咽癌概述 |
| 3.鼻咽癌中EBV基因的变异 |
| 4.本项研究的目的和基本策略 |
| 第二节 结果 |
| 1.纳入转录组测序分析的鼻咽癌病例入组及其基本特征 |
| 2.入组样品的转录组测序分析 |
| 3.鼻咽癌组织中EBV基因变异的分析 |
| 3.1 鼻咽癌组织中EBER2和LMP2携带高频变异 |
| 3.2 EBER2变异与鼻咽癌 |
| 4.鼻咽癌中EBER2变异亚型及其临床意义 |
| 4.1 EBER2亚型与鼻咽癌患者临床特征的关系 |
| 4.2 EBER2亚型与鼻咽癌患者预后的关系 |
| 5.EBER变异在鼻咽癌独立样本中的实验验证 |
| 5.1 在EBV阳性细胞中验证EBER的变异 |
| 5.2 在鼻咽癌组织中验证EBER的变异 |
| 5.3 独立样本验证中EBER2亚型分布及与临床表型的关系 |
| 6.EBER2亚型对应宿主基因的表达分析 |
| 7.鼻咽癌组织中LMP2B的变异位点 |
| 8.LMP2B-C666和LMP2B-Raji在鼻咽癌细胞中的生物学功能 |
| 8.1 稳定表达外源性LMP2B-C666和LMP2B-Raji的鼻咽癌细胞的构建 |
| 8.2 LMP2B-C666和LMP2B-Raji对鼻咽癌细胞表型的影响 |
| 8.3 LMP2B-C666的蛋白稳定性 |
| 9.LMP2B变异与EBER2亚型的关联 |
| 第三节 讨论 |
| 1.临床相关研究的质量控制 |
| 2.以转录组测序数据分析EBV基因变异 |
| 3.EBER2的变异与鼻咽癌患者预后的关系 |
| 4.EBER变异的独立样本验证与细胞定位 |
| 5.LMP2B在鼻咽癌中的生物学功能 |
| 本章小结 |
| 第二章 鼻咽癌预后评估模型的建立 |
| 第一节 导论 |
| 1.鼻咽癌概述 |
| 2.与鼻咽癌预后相关的分子标志物 |
| 3.免疫微环境与鼻咽癌预后的关系 |
| 3.1 鼻咽癌与免疫治疗 |
| 3.2 浸润免疫细胞与鼻咽癌预后 |
| 4.本项研究的目的和基本策略 |
| 第二节 结果 |
| 1.鼻咽癌“复发转移组”和“非复发转移组”的特征性基因表达谱 |
| 1.1 入组的鼻咽癌病例及其临床信息 |
| 1.2 转录组测序数据的主成分分析(principal component analysis,PCA) |
| 1.3 机器学习方法筛选两组鼻咽癌病例肿瘤组织的特征基因 |
| 1.4 两组鼻咽癌患者肿瘤组织中的差异表达mRNA |
| 2.筛选出的13个特征基因与鼻咽癌预后的关系 |
| 2.1 13个特征基因与鼻咽癌患者无进展生存的关系 |
| 2.2 13个特征基因与鼻咽癌患者总生存的关系 |
| 3.鼻咽癌预后模型的建立 |
| 3.1 13个特征基因分别对于鼻咽癌预后的影响 |
| 3.2 多因素Cox比例风险回归模型 |
| 3.3 4-gene signature预后预测能力的评估 |
| 3.4 基于4-gene signature的风险评分与其预后能力的关联 |
| 3.5 基于4-gene signature的风险评分是否为预后的独立因素 |
| 4.4-gene signature的生物学功能 |
| 5.肿瘤免疫浸润和鼻咽癌预后的关系 |
| 5.1 本组鼻咽癌病例肿瘤组织中浸润免疫细胞与鼻咽癌预后的关系 |
| 5.2 GEO数据中浸润免疫细胞与鼻咽癌预后的关系 |
| 6.4-mRNA signature表达水平与肿瘤浸润免疫细胞的关系 |
| 第三节 讨论 |
| 1.筛选与鼻咽癌预后相关的基因 |
| 2.干扰素在鼻咽癌发生发展中的作用 |
| 3.鼻咽癌4-gene signature预后评估模型及其生物学功能 |
| 4.免疫微环境与鼻咽癌预后的关系 |
| 本章小结 |
| 第三章 材料与方法 |
| 第一节 研究对象和实验材料 |
| 1.鼻咽癌病例及其组织样品 |
| 2.细胞系 |
| 3.菌株和质粒载体 |
| 4.抗体 |
| 5.主要试剂与耗材 |
| 6.细胞培养的器皿 |
| 7.常用试剂的配制 |
| 8.主要仪器 |
| 9.主要分析软件及网站 |
| 第二节 实验方法 |
| 1.分子生物学实验方法 |
| 2.细胞生物学实验方法 |
| 3.生物学信息分析 |
| 4.统计学方法 |
| 参考文献 |
| 基金资助 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（3）基于EB病毒潜伏期膜蛋白的鼻咽癌诊治用单克隆抗体的筛选研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 鼻咽癌概述 |
| 1.1.1 鼻咽癌的流行病学概况 |
| 1.1.2 鼻咽癌的临床特征 |
| 1.1.3 鼻咽癌的致病因子 |
| 1.1.4 鼻咽癌的诊断 |
| 1.1.5 鼻咽癌的治疗 |
| 1.2 EB病毒简介 |
| 1.2.1 EB病毒的发现 |
| 1.2.2 EB病毒的形态和结构特征 |
| 1.2.3 EB病毒的生命周期 |
| 1.2.4 EB病毒与肿瘤 |
| 1.3 EB病毒潜伏膜蛋白研究进展 |
| 1.3.1 潜伏期膜蛋白1(LMP1) |
| 1.3.2 潜伏期膜蛋白2(LMP2) |
| 1.4 肿瘤治疗性抗体药物研究进展 |
| 1.4.1 单克隆抗体制备技术 |
| 1.4.2 抗体药物治疗肿瘤的作用机制 |
| 1.4.3 肿瘤抗体药物的靶点(胞内、胞外) |
| 1.5 本研究的目的、意义及思路 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 主要仪器 |
| 2.2 主要耗材 |
| 2.3 主要试剂 |
| 2.3.1 E.coli菌株 |
| 2.3.2 质粒 |
| 2.3.3 细胞株 |
| 2.3.4 实验动物 |
| 2.3.5 分子及细胞生物学实验用常规试剂 |
| 2.3.6 引物与多肽 |
| 2.3.7 免疫佐剂 |
| 2.3.8 其他常规试剂 |
| 2.3.9 临床标本 |
| 2.4 实验用溶液及培养基配制 |
| 2.4.1 分子生物学实验常规溶液的配制 |
| 2.4.2 细胞培养/转染用溶液的配制 |
| 2.4.3 ELISA检测用溶液 |
| 2.4.4 免疫组化相关液体的配制 |
| 2.5 实验方法 |
| 2.5.1 常规分子克隆实验方法 |
| 2.5.2 细胞生物学实验方法 |
| 2.5.3 小鼠单克隆抗体的制备与纯化 |
| 2.5.4 小鼠淋巴细胞的流式分选与检测 |
| 2.5.5 小鼠杂交瘤细胞的抗体可变区基因钓取 |
| 2.5.6 兔单抗平台相关实验 |
| 2.5.7 免疫学相关试验方法 |
| 2.5.8 其他实验方法 |
| 2.6 数据处理及统计学分析方法 |
| 第三章 结果与分析 |
| 第一部分 基于小鼠单抗筛选平台对LMPs相关抗体筛选的探索 |
| 3.1 LMPs相关的抗原研究 |
| 3.1.1 合成肽及其偶联抗原 |
| 3.1.2 原核重组表达抗原 |
| 3.1.3 真核表达系统的重组抗原 |
| 3.1.4 抗原表达细胞株 |
| 3.1.5 核酸免疫抗原的制备 |
| 3.2 LMPs胞外、胞内区抗体筛选免疫方案的制定 |
| 3.3 LMPs相关免疫效果评价 |
| 3.3.1 合成肽免疫组 |
| 3.3.2 原核表达重组抗原免疫组 |
| 3.3.3 细胞与核酸免疫组 |
| 3.4 Anti-LMPs抗体筛选方案探索 |
| 3.4.1 基于抗原表达细胞的筛选 |
| 3.4.2 基于抗原特异性记忆B细胞的流式分选 |
| 3.5 Anti-LMPs单克隆抗体的鉴定与应用 |
| 3.5.1 Anti-LMPs单克隆抗体的鉴定 |
| 3.5.2 Anti-LMPs抗体在免疫组化方面的应用 |
| 3.5.3 Anti-LMP1抗体在鼻咽癌治疗方面的初步探索 |
| 3.6 第一部分小结 |
| 第二部分 兔单抗筛选平台的建立及LMPs特异性兔单抗筛选的探索 |
| 3.7 基于兔B细胞特异性分选的兔单抗筛选平台的建立 |
| 3.7.1 兔抗原特异性B细胞染色方案制定 |
| 3.7.2 兔B细胞单细胞PCR平台的建立 |
| 3.7.3 兔B细胞体外刺激培养平台 |
| 3.7.4 抗体重组表达载体构建 |
| 3.8 兔单抗筛选平台的应用 |
| 3.9 LMPs特异性兔单克隆抗体筛选探索 |
| 3.10 第二部分小结 |
| 第四章 讨论 |
| 4.1 鼻咽癌特异性诊断治疗性抗体开发的必要性和重要性 |
| 4.2 多次跨膜膜蛋白特异性抗体筛选的挑战 |
| 4.3 LMPs膜内区抗体在鼻咽癌个性化诊断及治疗中的潜力 |
| 4.4 基于流式分选的兔单克隆抗体筛选平台的重要性 |
| 第五章 小结与展望 |
| 参考文献 |
| 在校期间的科研成果 |
| 致谢 |
（4）鼻咽癌患者来源EB病毒感染树鼩动物模型的构建（论文提纲范文）
| 个人简历 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 实验流程图 |
| 第一章 鼻咽癌患者体内EBV现况调查及病毒源获取 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第二章 树鼩感染EBV需要的EBV DNA拷贝数探究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第三章 长期EBV感染树鼩模型的构建和观察 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第四章 树鼩外周血BARF1 基因片段测序分析 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第五章 叠加环磷酰胺因素构建EBV感染树鼩动物模型体内成瘤方法初步探索 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 综述一 |
| Reference |
| 综述二 |
| References |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
（5）鼻咽癌石蜡标本探索miR-19b的分子通路（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 英汉缩略词对照表 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 石蜡 miRNA 在肿瘤中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 致谢 |
（6）1、鼻咽癌放疗反应相关的医学生物学标志 2、OLC1基因在膀胱癌中异常表达及其医学生物学意义（论文提纲范文）
| 英语缩略词 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 鼻咽癌放疗反应相关的医学分子生物学标志 |
| 导论(含文献综述) |
| 1. 鼻咽癌的诊断和治疗 |
| 2. 鼻咽癌内镜下的肿瘤微血管显露 |
| 3. EB病毒与鼻咽癌 |
| 基本研究策略 |
| 结果 |
| 1. 鼻咽镜下肿瘤表面微血管显露与鼻咽癌放疗反应之间的关系 |
| 1.1 鼻咽癌病例入组及其基本特征 |
| 1.2 鼻咽镜下肿瘤表面微血管显露情况与放疗反应联合分析 |
| 1.3 鼻咽癌肿瘤组织中VEGF、EGFR和Ki67的蛋白表达 |
| 2. 鼻咽癌肿瘤组织放疗反应相关差异表达microRNA的筛选分析 |
| 2.1 鼻咽癌病例入组及其基本特征 |
| 2.2 鼻咽癌放疗反应相关的microRNA表达谱 |
| 2.3 鼻咽癌放疗反应相关差异表达microRNA的靶基因预测 |
| 3. 不同放疗反应的鼻咽癌转录组测序分析 |
| 3.1 用于转录组测序的鼻咽癌病例入组及其基本特征 |
| 3.2 鼻咽癌患者肿瘤及其癌旁组织转录组测序 |
| 3.3 鼻咽癌患者肿瘤及其癌旁组织转录组测序数据质量控制 |
| 3.4 鼻咽癌组织转录组测序差异表达基因的筛选 |
| 3.5 鼻咽癌差异表达基因的功能富集分析 |
| 4. EB病毒基因在鼻咽癌患者肿瘤组织中的表达 |
| 讨论 |
| 1. 临床相关研究质量控制 |
| 2. 窄带成像内镜下鼻咽癌肿瘤表面微血管显露情况 |
| 3. 不同放疗反应鼻咽癌患者肿瘤组织中差异microRNA表达谱的筛选和功能富集 |
| 4. 鼻咽癌不同放疗反应及不同血管显露情况的转录组测序分析 |
| 5. EB病毒编码的基因产物在鼻咽癌肿瘤组织中的表达 |
| 本章小结 |
| 材料与方法 |
| 一、实验材料 |
| 1. 鼻咽癌患者及其生物学样品 |
| 1.1 新鲜冻存鼻咽癌组织 |
| 1.2 福尔马林固定石蜡包埋鼻咽癌组织 |
| 2. 细胞系 |
| 3. 临床样品收集和制备所需试剂 |
| 4. Realtime-PCR试剂 |
| 5. 抗体 |
| 6. 主要试剂盒 |
| 7. 细胞培养试剂 |
| 8. 免疫组织化学试剂 |
| 9. 常用试剂的配制 |
| 10. 主要仪器 |
| 11. RNA质量控制、生物信息分析 |
| 二、实验方法 |
| 1. 总RNA样品的提取、制备及质量鉴定 |
| 1.1 提取新鲜冻存鼻咽癌和膀胱癌肿瘤组织标本总RNA |
| 1.2 RNA样品的质量鉴定 |
| 1.3 RNA样品的纯化 |
| 2. 基因芯片检测microRNA表达谱 |
| 2.1 样品去磷酸化 |
| 2.2 变性 |
| 2.3 标记 |
| 2.4 准备杂交盒 |
| 2.5 芯片清洗 |
| 3. 细胞生物学方法 |
| 3.1 细胞复苏 |
| 3.2 细胞冻存 |
| 3.3 细胞传代 |
| 3.4 脂质体介导的细胞转染 |
| 3.5 CCK8检测细胞增殖曲线 |
| 3.6 细胞体外浸润分析 |
| 4. 免疫组织化学分析 |
| 4.1 免疫组织化学染色 |
| 4.2 免疫组织化学染色评分 |
| 5. RNA原位杂交 |
| 6. 统计学分析 |
| 第二章 OLC1基因在膀胱癌中异常表达及其医学生物学意义 |
| 导论(含文献综述) |
| 1. 膀胱癌概述 |
| 2. 膀胱癌分期与预后 |
| 3. 膀胱癌与吸烟 |
| 4. OLC1基因 |
| 5. 本课题的研究目的和研究策略 |
| 基本研究策略 |
| 结果 |
| 1. 膀胱癌病例入组及其基本特征 |
| 用于mRNA分析的膀胱癌病例信息 |
| 用于蛋白免疫组化分析的膀胱癌病例信息 |
| 2. OLC1基因mRNA在膀胱癌患者组织中的表达水平及其意义 |
| 2.1 膀胱癌肿瘤组织与正常黏膜组织中OLC1的mRNA表达水平 |
| 2.2 OLC1基因高表达与膀胱癌分期的关系 |
| 2.3 OLC1基因高表达与膀胱癌患者吸烟的关系 |
| 3. 膀胱癌组织中OLC1蛋白表达情况及其意义 |
| 3.1 OLC1蛋白在非肌层浸润性和肌层浸润性膀胱癌中的表达 |
| 3.2 膀胱癌肿瘤组织中OLC1蛋白表达与膀胱癌患者无瘤生存及总生存的关系 |
| 4. OLC1在膀胱癌中的功能探索 |
| 4.1 OLC1过表达膀胱癌细胞系的建立 |
| 4.2 OLC1过表达对膀胱癌细胞增殖的影响 |
| 4.3 OLC1过表达对膀胱癌细胞侵袭能力的影响 |
| 讨论 |
| 1. OLC1在膀胱癌中的表达 |
| 2. OLC1联合吸烟与膀胱癌分期和预后的关系 |
| 3. OLC1在膀胱癌细胞系中的表达及其功能 |
| 本章小结 |
| 材料与方法 |
| 一、实验材料 |
| 1. 膀胱癌患者及其生物学样品 |
| 1.1 新鲜冻存膀胱癌组织 |
| 1.2 福尔马林固定石蜡包埋膀胱癌组织 |
| 2. 细胞系 |
| 3. 菌株及质粒载体 |
| 4. PCR引物序列 |
| 5. 抗体 |
| 6. 蛋白提取和定量试剂 |
| 二、实验方法 |
| 1. 实时荧光定量PCR分析 |
| 1.1 RNA逆转录为cDNA |
| 1.2 实时荧光定量PCR的反应体系和反应条件 |
| 1.3 绘制标准曲线 |
| 1.4 样本检测 |
| 1.5 统计学分析 |
| 2. 质粒抽提 |
| 2.1 小量提取质粒DNA |
| 2.2 大量提取质粒DNA |
| 3. rTaq酶PCR反应 |
| 4. PCR产物胶回收 |
| 5. 细胞总蛋白提取及免疫印迹 |
| 5.1 裂解细胞收获总蛋白 |
| 5.2 蛋白质浓度的测定 |
| 5.3 聚丙烯凝胶电泳SDS-PAGE |
| 5.4 半干法蛋白转印 |
| 5.5 抗体孵育 |
| 5.6 化学发光显影 |
| 5.7 Western blot二次发光检测 |
| 6. 细胞生物学方法 |
| 6.1 细胞复苏 |
| 6.2 细胞冻存 |
| 6.3 细胞传代 |
| 6.4 脂质体介导的细胞转染 |
| 6.5 CCK8检测细胞增殖曲线 |
| 6.6 细胞体外浸润分析 |
| 7. 免疫组织化学分析 |
| 7.1 免疫组织化学染色 |
| 7.2 免疫组织化学染色评分 |
| 8. 统计学分析 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（8）EB病毒在胸腺瘤中的表达水平初探（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 1 对象和方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 仪器与试剂 |
| 1.2.1 实验仪器设备 |
| 1.2.2 实验试剂（商品化） |
| 1.2.3 实验试剂（自行配制） |
| 1.3 实验步骤与方法 |
| 1.3.1 组织样本基因组DNA的提取 |
| 1.3.2 基因组DNA的浓度测定 |
| 1.3.3 EBV病毒基因的PCR检测 |
| 1.3.4 血液样本的ELISA检测 |
| 1.3.5 统计方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 分组间合并症情况 |
| 2.1.1 PCR各分组间合并症情况 |
| 2.1.2 PCR胸腺瘤组病理分型与MG |
| 2.1.3 ELISA分组间合并症情况 |
| 2.2 PCR检验EB病毒结果 |
| 2.2.1 PCR检测所有分组EB病毒结果比较 |
| 2.2.2 PCR胸腺瘤组与胸腺增生组分组为单纯与合并自免病比较EB病毒检测结果 |
| 2.2.3 PCR检测EB病毒与病理分型 |
| 2.2.4 PCR检测EB病毒与MG分型 |
| 2.2.5 PCR检测EB病毒与临床分期 |
| 2.3 ELISA检测结果比较 |
| 2.3.1 ELISA组所有样本检测结果比较 |
| 2.3.2 ELISA组胸腺瘤与胸腺增生组分组为单纯和合并自免病比较ELISA检测结果 |
| 2.3.3 ELISA检测EB病毒与病理分型 |
| 2.3.4 ELISA检测EB病毒与MG分型 |
| 2.3.5 ELISA检测EB病毒与临床分期 |
| 2.4 PCR与ELISA结果比较 |
| 3 讨论 |
| 3.1 胸腺瘤与自身免疫性疾病 |
| 3.2 胸腺瘤中EB病毒的表达 |
| 3.2.1 PCR检测EB病毒基因与分组 |
| 3.2.2 PCR检测EB病毒基因与分型及分类 |
| 3.2.3 ELISA检测EB病毒与分组 |
| 3.2.4 ELISA检测EB病毒与分型及分类 |
| 3.2.5 PCR与ELISA检测EB病毒结果比较 |
| 3.3 胸腺瘤与EB病毒基因突变 |
| 3.4 本实验的局限性与展望 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 综述 胸腺瘤研究进展 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（9）病毒IL-10通过“MHC-I类分子抗原加工提呈操纵子”致鼻咽癌免疫逃逸的机制研究（论文提纲范文）
| 英文缩略语 |
| 中文摘要 |
| Abstracts |
| 第一部分 鼻咽癌组织“MHC-Ⅰ类分子抗原加工提呈操纵子”表达的实验研究 |
| 第一节 前言 |
| 第二节 材料与方法 |
| 第三节 结果 |
| 第四节 讨论 |
| 第五节 小结 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 第二部分 鼻咽癌组织中BCRF-1基因表达及其对免疫功能影响的实验研究 |
| 第一节 前言 |
| 第二节 材料与方法 |
| 第三节 结果 |
| 第四节 讨论 |
| 第五节 小结 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 第三部分 vIL-10对鼻咽癌细胞株“MHC-Ⅰ类分子抗原加工提呈操纵子”表达影响的研究 |
| 第一节 前言 |
| 第二节 材料与方法 |
| 第三节 结果 |
| 第四节 讨论 |
| 第五节 小结 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 第四部分 vIL-10通过NF-κB通路对“MHC-Ⅰ类分子抗原加工提呈操纵子”基因表达影响的实验研究 |
| 第一节 前言 |
| 第二节 材料与方法 |
| 第三节 结果 |
| 第四节 讨论 |
| 第五节 小结 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 总结 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 在读博士期间发表论文 |
| 在读博士期间参加课题 |
| 致谢 |
（10）鼻咽癌早期诊断和治疗新型标志物的探索研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 鼻咽癌概述 |
| 1.1.1 鼻咽癌的流行病学 |
| 1.1.2 鼻咽癌的致病因子 |
| 1.1.3 鼻咽癌的临床特征 |
| 1.1.4 鼻咽癌的诊断 |
| 1.1.5 鼻咽癌的治疗 |
| 1.2 EB病毒概述 |
| 1.2.1 EB病毒的发现 |
| 1.2.2 EB病毒的分类 |
| 1.2.3 EB病毒的形态学和生物学特征 |
| 1.2.4 EB病毒的生活周期 |
| 1.2.5 EB病毒的流行病学 |
| 1.2.6 EB病毒的治疗 |
| 1.2.7 EB病毒潜伏态的主要转录产物 |
| 1.2.8 EB病毒相关肿瘤 |
| 1.3 本研究的目的、意义及思路 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 主要仪器 |
| 2.2 主要耗材 |
| 2.3 主要试剂及实验动物 |
| 2.3.1 E.coli菌株 |
| 2.3.2 质粒 |
| 2.3.3 细胞株 |
| 2.3.4 实验动物 |
| 2.3.5 分子及细胞生物学实验用常规试剂 |
| 2.3.6 其他常规试剂 |
| 2.3.7 临床标本 |
| 2.4 实验用溶液及培养基配制 |
| 2.4.1 常规分子生物学实验溶液的配制 |
| 2.4.2 细胞培养/转染用溶液的配制 |
| 2.4.3 病毒抗原及抗体检测用溶液的配置 |
| 2.5 实验方法 |
| 2.5.1 常规分子克隆实验方法 |
| 2.5.2 常规细胞生物学实验方法 |
| 2.5.3 稳定细胞株的构建 |
| 2.5.4 单克隆抗体的制备和纯化 |
| 2.5.5 肿瘤细胞的生长抑制实验 |
| 2.5.6 免疫学相关实验方法 |
| 2.5.7 本研究中用到的其他实验方法 |
| 2.6 数据处理及统计学分析 |
| 第三章 结果与分析 |
| 第一部分: 鼻咽癌特异性诊断试剂的研发探索 |
| 3.1 三种鼻咽癌血清诊断试剂的研发探索 |
| 3.1.1 鼻咽癌LMP1/IgA检测试剂雏形的初步建立 |
| 3.1.2 鼻咽癌LMP2A/IgA检测试剂雏形的初步建立 |
| 3.1.3 鼻咽癌BARFI/IgA及BARF1/IgG检测试剂的研发探索 |
| 3.2 鼻咽癌免疫组化检测试剂的建立 |
| 3.2.1 LMP1免疫组化检测试剂的初步建立 |
| 3.2.2 LMP2A免疫组化检测试剂的初步建立 |
| 3.3 第一部分小结 |
| 第二部分: 鼻咽癌个性化诊断靶标的探索 |
| 3.4 A73蛋白的鉴定及其作为鼻咽癌个性化诊断靶标的探索 |
| 3.4.1 血清中抗A73的抗体作为鼻咽癌个性诊断靶标的评估 |
| 3.4.2 细胞或组织中A73蛋白作为鼻咽癌个性诊断靶标的评估 |
| 3.4.3 血清中A73 mRNA作为鼻咽癌个性诊断靶标的探索 |
| 3.5 第二部分小结 |
| 第三部分: 鼻咽癌免疫治疗靶标的探索 |
| 3.6 基于EB病毒蛋白靶标的治疗性抗体探索 |
| 3.6.1 以LMPI为靶标的鼻咽癌治疗性抗体研发探索 |
| 3.6.2 以LMP2A为靶标的鼻咽癌治疗性抗体研发探索 |
| 3.7 第三部分小结 |
| 第四章 讨论 |
| 4.1 鼻咽癌的血清学早期诊断极为重要 |
| 4.2 EB病毒II型潜伏态的基因转录产物为鼻咽癌提供了很好的早期诊断靶标 |
| 4.3 鼻咽癌个性化诊断试剂研发的必要性 |
| 4.4 抗体药物治疗是鼻咽癌治疗的一个重要发展方向 |
| 第五章 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 在校期间的科研成果 |
| 致谢 |
四、EB病毒基因BARF1在鼻咽癌中的表达及其意义（论文参考文献）
- [1]1、DNA拷贝数异常改变作为膀胱癌预后判断相关分子标志物的研究 2、EB病毒相关上皮性恶性肿瘤中病毒miRNA与宿主相互作用的分子机制及其意义[D]. 蔡曌. 北京协和医学院, 2021
- [2]基于转录组测序分析的鼻咽癌相关EB病毒变异亚型及预后模型的研究[D]. 赵爽. 北京协和医学院, 2021
- [3]基于EB病毒潜伏期膜蛋白的鼻咽癌诊治用单克隆抗体的筛选研究[D]. 李睿. 厦门大学, 2018(06)
- [4]鼻咽癌患者来源EB病毒感染树鼩动物模型的构建[D]. 王红. 广西医科大学, 2018(07)
- [5]鼻咽癌石蜡标本探索miR-19b的分子通路[D]. 刘勤. 桂林医学院, 2017(06)
- [6]1、鼻咽癌放疗反应相关的医学生物学标志 2、OLC1基因在膀胱癌中异常表达及其医学生物学意义[D]. 董欣. 北京协和医学院, 2017(11)
- [7]鼻咽癌病因研究及早期诊断与治疗[J]. 邓卓霞,司勇锋,陶仲强. 国际耳鼻咽喉头颈外科杂志, 2016(03)
- [8]EB病毒在胸腺瘤中的表达水平初探[D]. 韩小磊. 天津医科大学, 2016(03)
- [9]病毒IL-10通过“MHC-I类分子抗原加工提呈操纵子”致鼻咽癌免疫逃逸的机制研究[D]. 任艳鑫. 昆明医科大学, 2014(11)
- [10]鼻咽癌早期诊断和治疗新型标志物的探索研究[D]. 桂勋. 厦门大学, 2014(04)