一、利用低温电镜术和像重构方法研究兔出血症病毒的三维结构（论文文献综述）
周丽军[1]（2019）在《RHDV抗体检测胶体金与量子点标记试纸条的试制》文中提出兔病毒性出血症病毒（rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV）主要引起兔的一种急性、烈性、高度传染性和高度死亡性的疾病,由于感染该病毒后会导致患兔多器官的出血充血,而将该病称为兔病毒性出血症（rabbit hemorrhagic disease,RHD）。本试验对RHDV VP60截段基因进行原核表达,基于重组蛋白对胶体金及量子点免疫层析试纸条进行初步探索研究。1.RHDV VP60截段基因的原核表达根据Gen Bank RHDV基因序列,通过RT-PCR扩增VP60基因（901bp-1740bp）,连接至p MD19-T克隆载体,经测序鉴定后,酶切、连接构建重组表达质粒p Cold TF-VP60-2,转化到大肠杆菌BL21（DE3）,经PCR、酶切以及测序鉴定后的阳性菌扩大培养,用IPTG（1 mmol/L）进行诱导表达,进行SDS-PAGE分析、Western-blotting鉴定以及亲和层析法纯化蛋白ELISA检测。结果显示重组质粒构建成功,表达的重组蛋白为82.8 k Da,并优化确定了37℃、0.2 mmol/L、诱导6 h为最佳诱导表达条件,经亲和层析法可获得5.16mg/m L纯化重组蛋白,包被重组蛋白的间接ELISA结果表明表达的重组蛋白能与兔抗RHDV抗体特异性结合,具有良好的反应原性。2.RHDV抗体检测胶体金免疫层析试纸条的试制制备兔抗重组蛋白抗体,胶体金标记重组蛋白点样金标垫,兔抗重组蛋白多克隆抗体标记C线,羊抗兔IgG标记T线,设计RHDV抗体检测试纸条,通过T线和C线抗体用量的优化,特异性和敏感性试验,初步试制了RHDV抗体检测的免疫胶体金试纸条,对5份试验免疫血清样品、5份未免疫抗体阴性血清以及临床采样154份免疫过的血清进行试验。结果显示研制的胶体金试纸条具有良好的灵敏性和特异性,其免疫血清灵敏度可达到1:16,特异性检测在兔抗RHDV血清时T线出现了红色条带,兔产气荚膜梭菌A型血清及兔巴氏杆菌等血清在T线未见显色条带,5份阳性样品全部为阳性,5份未免疫血清均为阴性,用设计的RHDV抗体试纸条检测临床采样的154份样品,结果显示150份为阳性,4份为阴性,为RHDV抗体水平监测提供一种可用的免疫试纸条。3.RHDV抗体检测的量子点免疫层析试纸条的试制量子点标记重组蛋白为金标垫,兔抗重组蛋白多克隆抗体标记C线,羊抗兔IgG标记T线,设计RHDV抗体检测试纸条,通过T线和C线抗体用量的优化,特异性和敏感性试验及样品检测应用,初步试制了可用于RHDV抗体检测的量子点免疫层析试纸条。结果显示试制的量子点免疫层析试纸条具有良好的灵敏性和特异性,其免疫血清灵敏度可达到1:32,特异性检测在兔抗RHDV血清时T线出现了荧光条带,阴性血清及兔巴氏杆菌等血清在T线未见显色条带,5份阳性样品全部为阳性,5份未免疫血清均为阴性,用设计的RHDV抗体量子点试纸条检测临床采样的154份样品,结果显示150份为阳性,4份为阴性,与胶体金免疫层析试纸条检测结果相符合,同时为量子点免疫层析试纸条进一步研制奠定了基础。
赵希仑[2]（2016）在《兔出血症病毒（RHDV）与兔出血症病毒2型（RHDV2）的RT-PCR检测方法研究》文中研究指明兔病毒性出血症（rabbit hemorrhagic disease, RHD）,俗称兔瘟,是由兔出血症病毒（rabbit hemorrhagic disease virus, RHDV）引起的兔的一种急性、高度致死性传染病。RHD以呼吸系统出血,实质器官淤血、肿大、出血和肝脏坏死为主要病变特征,主要危害2月龄以上的养殖和野生的多个穴兔品种,死亡率达80%-100%。RHD于1984年被我国首次报道后,在世界很多国家出现发病和流行的报道,严重威胁着世界养兔业的健康发展,被国际动物卫生组织列为法定通过动物疫病。2010年在法国出现了由RHDV新种即兔出血症病毒2型（rabbit hemorrhagic disease virus 2, RHDV2）引起的能感染致死30日龄以内的兔r和传统RHDV毒株灭活苗的免疫过的兔子的新型兔病毒性出血症（new rabbit hemorrhagic disease, nRHD）,也称为兔病毒性出血症2型（rabbit hemorrhagic disease type 2, RHD2）近年来RHD2已扩散至意大利、西班牙、德国、葡萄牙、英国、挪威等多数西欧国家和亚速尔群岛等国。我国目前尚无该病发生及其相关的研究报道,为此本研究在对RHDV2和RHDV基因序列分析基础上对其RT-PCR检测技术进行了初步研究,具体如下：为建立用于兔出血症病毒2型（RHDV2）的快速检测方法。根据GenBank已公布的RHDV和RHDV2 VP60基因,设计合成2对特异性引物和10条搭桥引物,通过搭桥PCR人工合成RHDV2 VP60基因中保守区片段,构建重组质粒,并以其为模板,经过反应条件优化、敏感性试验、特异性试验和35份样品检测应用,初步建立RHDV2 RT-PCR检测方法。结果表明成功合成RHDV2 VP60基因的435 bp保守片段和构建了pMD-19T-RHDV2重组质粒以及pMD-19T-RHDV441,初步建立的RHDV2 RT-PCR方法具有良好的特异性和敏感性,RHDV2的检测限度可达到230个拷贝的靶基因片段,检测RHDV、pGM-T-EBHSV（已构建）、兔源巴氏杆菌、兔源大肠杆菌和兔源沙门氏菌均无特异性扩增。样品检测结果显示样品中RHDV2核酸阴性。为建立用于兔出血症病毒（RHDV）与兔出血症病毒2型（RHDV2）鉴别诊断的检测方法,根据GenBank已公布的RHDV和RHDV2的VP60基因,在上面研究的基础上又设计合成1对特异性引物,采用RT-PCR和搭桥PCR技术分别获取RHDV和RHDV2的VP60基因中保守区片段,构建重组质粒pMD-19T-RHDV2、 pMD-19T-RHDV441（上面已构建）和pMD-19T-RHDV294,并以其为模板,经过反应条件优化、敏感性试验、特异性试验,以及人工感染RHDV样品和临床样品的应用,对RHDV与RHDV2的复合RT-PCR检测方法进行了初步研究。结果显示建立的RHDV与RHDV2复合RT-PCR方法具有良好的特异性和敏感性,可分别扩增山RHDV和RHDV2的VP60保守区基因片段大小为294 bp和435 bp, RHDV与RHDV2的检测限度分别为160和230个拷贝的靶基因片段,而pGM-T-EBHSV（已构建）、兔源巴氏杆菌、兔源大肠杆菌和兔源沙门氏菌等病原的检测结果均为阴性。样品检测结果显示人工感染样品的RHDV检出率为100%（5/5）,30份临床检样RHDV和RHDV2检测结果均为阴性。本研究为我国进行RHDV2的防控提供了一种技术储备和奠定了基础,同时为RHDV和RHDV2的鉴别与流行病学调查提供了科学方法和科学参考。
邱立[3]（2012）在《兔病毒性出血症病毒遗传变异及口服疫苗的研究》文中指出兔病毒性出血症病毒（rabbit hemorrhagic disease virus，RHDV）属于嵌杯病毒科，基因组为单股正链RNA，基因组长7.5kb。自1984年首次在我国报道兔病毒性出血症（rabbit hemorrhagic disease，RHD）后，该病毒迅速在全球蔓延，给家兔及野生兔带来了巨大威胁。由于缺少有效的病毒培养细胞系，直到今天，RHD的控制仍然使用组织灭活疫苗，但是组织灭活疫苗存在较大的生物安全问题、且不符合动物福利的要求，并且对变异株已不能完全保护。2009年秋天到2010年春天陕西数家养兔场暴发疑似RHD的疾病，由于这些养殖场都曾进行RHDV免疫，因此怀疑出现了RHDV变异毒株，导致了RHD在这些养殖场的流行，为揭示造成该现象出现的原因及寻找新的更加有效的防制RHD的方法，本论文进行了系统而深入的研究，具体内容和结果分为以下五个部分：1.兔病毒性出血症病毒遗传进化分析为研究近期内陕西省境内免疫家兔暴发RHD的原因，分析RHDV国内分离株的遗传变异规律及新的变异情况，从临床发病兔场发病兔肝脏、脾脏等病料，分离病毒，扩增RHDV VP60基因，并进行测序，利用DNAstar及MEGA4软件，对获得的VP60序列及GenBank上传序列的同源性进行分析、比较、并构建系统进化树。结果显示：已报道的16株RHDV VP60序列与2006年2010年间收集的5株RHDV VP60序列同源性在92%99.3%间，系统进化分析可将21株国内分离株分成4个群，分别命名为CH1CH4，CH1仅包含1个分离株——WX/China/1984，该分离株是世界上首例兔病毒性出血症的分离病原，但CH1没有在中国广泛流行，CH2CH4与CH1在进化树上距离较远，各自成群，代表了不同年代间国内RHDV的流行毒株，CH4是由近几年分离的RHDV构成的一个群，该群内的毒株与CH2及CH3群毒株差异较大，反应了RHDV近几年发生了变异。2.兔病毒性出血症病毒的抗原变异分析为进一步证实RHDV变异是导致免疫失败的原因，本文选择了与疫苗株NJ/China/1985同属一个群的YL-2006株及不属于同一群的新分离株XA/China/2010毒株对免疫兔进行攻毒试验。共选择24只家兔，其中12只兔30日龄进行免疫，另外12只不进行免疫。在家兔60日龄时分别用YL株和XA/China/2010毒株进行攻毒，每种病毒分别接种免疫家兔和非免疫家兔各6只。结果显示：YL-2006株和XA/China/2010毒株引起非免疫家兔全部死亡，临床症状及病理变化情况相似，以口鼻流血、气管内有粘液，气管及肺脏出血、肝和脾坏死为特征，而免疫组差异较大，免疫组能够完全保护YL-2006株的攻毒，而只为XA/China/2010株提供约50%的免疫保护，说明XA/China/2010抗原表位可能出现了变化，序列比较发现，XA/China/2010与疫苗株存在16个氨基酸的差异，而YL-2006株只有5个氨基酸差异。较多位点的变异可能是导致XA/China/2010攻毒保护效果较差的原因。3.减毒沙门氏菌载体的口服兔病毒性出血症疫苗研究为研究减毒沙门氏菌作为载体的兔病毒性出血症病毒重组活载体疫苗的免疫效果，构建了表达RHDV主要保护性抗原VP60的真核表达载体pcDNA3-VP60，然后将其电转化到减毒沙门氏菌SL7207菌株中，重组细菌被命名为SL/pcDNA3-VP60；免疫兔子后，检测兔子小肠上皮细胞内VP60基因转录情况，并用ELISA方法、淋巴细胞转化试验及细胞因子测定检测兔子免疫效果，然后用RHDV毒株XA/China/2010进行攻毒。结果显示：减毒沙门氏菌能够有效转导兔腹腔巨噬细胞，重组菌株SL/pcDNA3-VP60能够有效的在兔子体内诱导VP60特异性免疫反应，并且可以为攻毒提供约67%的免疫保护，我们首次证实了重组减毒沙门氏菌作为兔病毒性出血症病毒口服疫苗的可能。4.腺病毒基础的兔病毒性出血症口服疫苗的研究为进一步改善兔病毒性出血症病毒的口服疫苗的免疫效果，选用复制缺陷性人腺病毒5型腺病毒作为口服疫苗载体，构建了表达VP60的重组腺病毒rAd-VP60，用Westernblot方法检测了目的抗原的表达，然后通过注射、口服和饵料投服的方法免疫了18只兔子，三种免疫方法都成功诱导了RHDV特异的细胞免疫和体液免疫，免疫组的兔子能够完全抵抗RHDV的攻击。腺病毒表达系统成功为兔子提供了免疫保护，尤其饵料免疫方案可以为野兔免疫提供有效的免疫方法。5.兔病毒性出血症ELISA检测方法的建立为评价兔病毒性出血症疫苗免疫效果，建立了检测兔病毒性出血症病毒抗体间接ELISA方法。对RHDV VP60的主要抗原区域进行表达，经SDS-PAGE和Western blot对表达产物大小及抗原性进行分析，将表达正确、抗原性良好的VP60抗原经纯化后作为ELISA检测抗原，经逐步优化反应条件，建立了兔病毒性出血症病毒ELISA检测方法。VP60抗原基因在大肠杆菌中表达产物大小约为42.34ku，具有良好的反应原性，当以浓度为2.3μg/mL，37℃2h后4℃过夜包被，1%BSA37℃2h封闭，待检血清37℃孵育1h，酶标抗体1:10000稀释，37℃作用1h，底物37℃显色5min的反应条件进行反应时检测效果最好。临界值为0.356；建立的ELISA方法特异性、重复性、敏感性较好；临床检测180份样品，与血凝抑制试验的符合率为74.1%，与商品化试剂盒检测结果符合率为94.8%，该方法可用于临床样品的检测。综上所述，本研究系统分析了RHDV自出现以来在我国的流行情况，揭示RHDV新的变异株的出现，证实了传统疫苗对变异株只能诱导部分的保护效率；构建了以减毒沙门氏菌为载体的口服疫苗，并成功诱导了抗原特异性免疫反应，攻毒保护效率达66.7%；进一步选用腺病毒为载体，构建了腺病毒基础的疫苗，构建的重组腺病毒能够表达靶蛋白，通过注射和口服都能够诱导RHDV特异性的免疫反应，并且可以对免疫兔实现100%的免疫保护。该研究为揭示RHDV流行规律及推进RHDV新一代疫苗研究奠定了基础。
盛蓉[4]（2011）在《携带口蹄疫病毒B细胞表位的兔出血症病毒样颗粒的表达及其免疫原性研究》文中研究表明兔出血症（Rabbit Hemorrhagic Disease, RHD）是由兔出血症病毒（RHDV）引起的兔的传染性疾病,病程短、死亡率高,是家兔烈性传染病。VP60蛋白是RHDV主要的结构蛋白,在动物体内可诱导产生中和抗体,与免疫反应直接相关,是病毒免疫保护性抗原。研究发现在没有其他任何成分存在的条件下,VP60衣壳蛋白在体外可自然聚合成不包裹核酸的、与天然RHDV病毒粒子在物理形态上类似的病毒样颗粒（virus-like particles, VLPs）。这种病毒样颗粒具有很好的免疫原性,本身就可作为免疫佐剂,可以以胞吞或胞饮途径进入抗原提呈细胞,分别诱导体液免疫应答和细胞免疫应答。研究表明,这种病毒样颗粒也可嵌合表达外源基因,并作为疫苗载体。口蹄疫（foot-and-mouth disease virus, FMD）是由口蹄疫病毒（FMDV）引起的一种急性、热性、高度接触性传染病。研究表明O型FMDV至少有5个B细胞表位,其中最重要的一个表位由VP1的141-160位（G-H环）和C端200-213位氨基酸残基线性表位组成,为最重要的B细胞表位,是FMDV最重要的抗原位点。且VP1的第141-160位氨基酸残基中也含有至少一种T细胞表位,能诱导FMDV专一性的T细胞应答。本研究在RHDV衣壳蛋白的C-端（在外）、N-端（在内）和306-307位分别插入单个外源B细胞表位（FMDV VP1B细胞表位200-213aa）和双串联B细胞表位（FMDV VP1141～160aa-GS-（200～213aa））,构建6种重组转移载体并在Sf9细胞中进行表达,通过电镜观察和动物实验,研究加入这些外源片段对VLPs的组装及其免疫原性的影响。主要试验和结果如下：1、本试验根据GenBank数据库RHDV皖阜株衣壳蛋白VP60的基因序列设计针对VP60基因的特异性引物,PCR扩增出相应的核苷酸片段,将PCR扩增产物克隆入载体pMD19-T,经酶切鉴定正确后,连接至真核表达载体,经酶切鉴定正确后与经退火磷酸化的FMDVB细胞表位连接,进行PCR鉴定、DNA测序。获得的重组质粒转化DH10Bac,蓝白斑筛选后进行PCR鉴定即获得重组转移载体。试验结果显示：本试验成功构建6种重组穿梭载体,分别命名为CF.306F、NF、CFB、306FB和NFB。2、用重组穿梭载体转染Sf9细胞。转染后观察细胞病变,当出现明显的细胞病变时,收获病毒。提取细胞内重组杆状病毒RNA进行RT-PCR鉴定,阳性的作为重组杆状病毒原液进行扩增和表达,并通过间接免疫荧光（IFA）、血凝试验、蛋白质电泳（SDS-PAGE）和免疫印迹（Western-blot）等试验进行鉴定。试验结果显示：RT-PCR结果显示获得6种重组杆状病毒；IFA结果显示6种重组杆状病毒在Sf9细胞内表达；SDS-PAGE电泳分析6种嵌合蛋白均在Sf9细胞内表达,且大小约为65kDa; Western-blot显示6种嵌合蛋白（CF,306F、NF、CFB、306FB和NFB）均能被RHDV单抗A3C和牛O型FMDV多抗血清特异性识别,证明6种嵌合蛋白的载体和表位均具有良好的反应原性；本试验中表达的6种嵌合蛋白,仅NF和NFB有血凝性。3、6种嵌合蛋白经初步纯化后电镜观察。取表达的六种嵌合蛋白分别与弗氏佐剂1：1混合乳化,免疫ICR小鼠,并以RHDV灭活亚单位疫苗和O型FMDV合成肽疫苗作阳性对照,无菌PBS做阴性对照。免疫过程中对免疫小鼠进行尾静脉断尾采血,用间接ELISA测定0d、7d、14d、21d、28d、35d和42d血清内抗载体VP60和抗表位FMDV VP1ELISA抗体水平。结果显示：6种嵌合蛋白均能形成病毒样粒子（VLPs）,大小和形态与天然RHDV相似。6种嵌合蛋白通过皮下免疫的途径可诱导产生强烈抗载体VP60和中等强度抗FMDV VP1B细胞表位的体液免疫应答,其中嵌合蛋白NF针对载体和表位特异性抗体水平均最高；当插入外源片段长达126bp其表位抗体水平也保持较高水平,说明RHDV VLPs至少可以容纳126bp长度的基因；本研究中有无佐剂并不影响抗体水平；同时两种蛋白剂量大小（50ug/只和25ug/只）不影响表位抗体水平。本研究在分析了RHDV VLPs作为展示载体展示B细胞表位的可能性的基础上,在RHDV结构蛋白VP60的C-端、N-端和306～307aa处分别插入两种O型FMDV VP1蛋白的B细胞表位,成功构建6种重组穿梭载体,并在Sf9细胞中得到表达；免疫印迹显示其均具有良好的反应原性；电镜观察6种嵌合蛋白均可形成VLPs;动物实验显示RHDV-VLPs在小鼠体内能诱导强烈抗VP60和中等强度抗表位的体液免疫应答；RHDV-VLPs可以容纳长达126bp的外源片段也不影响其免疫原性。本研究为以RHDV VLPs为载体的多价疫苗研究提供理论基础,为后期评价RHDV VLPs展示系统奠定了基础。
杨廷亚[5]（2011）在《应用噬菌体展示技术筛选兔出血症病毒抗原模拟表位及其ELISA抗体检测方法的建立》文中研究说明兔出血症（Rabbit Hemorrhagic Disease, RHD）是由兔出血症病毒（Rabbit hemorrhagic disease virus, RHDV）引起的家兔的一种高度接触性、致死性传染病,以肝细胞坏死、实质脏器出现淤血及出血性变化、死亡率高等为特点,给养兔业造成巨大的经济损失。噬菌体展示技术通过模拟配体-受体间的特异性结合作用而达到从噬菌体多肽文库中筛选特异性配体的目的。该技术被广泛应用在抗原表位筛选、疾病检测、疫苗研究以及多肽药物筛选等方面。在抗原表位的研究中,主要使用亲和筛选的方法,通过三到四轮亲和筛选,有效富集特异性噬菌体克隆,获得抗原模拟表位。本研究为获得抗原RHDV的抗原表位,使用实验室构建的抗RHDV单抗A3c作为固相筛选分子,用噬菌体展示技术进行亲和筛选。为获得新型RHDV检测方法,在亲和筛选的基础上,用筛选得到的噬菌体克隆作为模拟抗原,建立了检测兔血清中RHDV抗体的间接ELISA方法。抗原表位的研究为RHDV分子生物学的进一步研究和新型疫苗的探索提供基础,而间接ELISA方法的建立为兔场免疫效果的评价和流行病学调查提供了有利工具。具体试验内容和结果如下：1. RHDV抗原模拟表位的筛选。复苏实验室保存的RHDV单抗A3c杂交瘤细胞系,并制备腹水型单抗。单抗纯化后测定其纯度、浓度、效价及亲和常数。用高活性、高纯度的单抗作为固相筛选分子,应用噬菌体展示技术进行亲和筛选,对筛选的噬菌体克隆进行鉴定并测序,获得与抗原高度同源的序列,即抗原的表位。结果表明,制备的单抗经纯化后纯度高于80%,ELISA效价为1：81920,亲和常数为3.5×107,具有较高的纯度和活性,可以用作固相亲和筛选。经过三轮亲和筛选,有效富集了特异性噬菌体克隆。用夹心ELISA方法鉴定,结果表明25个噬菌体克隆中19个为阳性克隆。竞争ELISA方法进一步验证了这些克隆与单抗的结合具有特异性。接下来对阳性噬菌体克隆进行测序,结果表明,获得了与抗原高度同源的序列GTDDMDPGTTAA,即抗原的模拟表位。其中,氨基酸基序DXXDP为表位中的核心氨基酸。2.应用亲和筛选得到的阳性噬菌体克隆K1作为模拟抗原,建立检测兔出血症病毒抗体的间接ELISA方法。本研究对ELISA的各个反应条件进行优化,测定该方法的特异性、灵敏性、重复性以及包被的酶标板的保存期,并用该方法检测了100份兔血清中抗体水平。实验结果表明,该方法中噬菌体的最佳包被浓度为1.56×107pfu/ml,血清的最佳稀释度为1：200,5%BSA为最适封闭液,酶标二抗的最佳稀释度为1：5000,封闭液的封闭时间、抗原抗体作用时间、酶标二抗作用时间以及底物的显色时间分别为90min、30min、30min和10min。应用该方法检测100份兔血清中的RHDV抗体水平,其中阳性样品数为86（86%）,而用实验室建立的RHDV VP60蛋白间接ELISA方法检测,阳性样品数为73（73%）。比较两种检测方法,符合率为85%。因此,该ELISA方法特异性好、灵敏度高、重复性好、操作简便,适用于临床推广。
李晶,赵海燕,李鲲鹏[6]（2011）在《生物大分子电子断层三维重建与分子模拟技术》文中认为本文提出了生物大分子电子断层三维重建与分子模拟技术,阐述了该技术的立论依据和需要研究的内容。对该技术的深入研究有利于预测蛋白质的空间结构,为蛋白质三维形态分析提供新的技术方法。
穆亚芳[7]（2011）在《兔出血症病毒VP60蛋白与膜突蛋白相互作用的鉴定》文中研究说明兔出血症（Rabbit hemorrhagic disease, RHD）是由兔出血症病毒（Rabbit hemorrhagic disease virus, RHDV）引起的危害3月龄以上青年兔和成年兔的一种急性、烈性、高度接触性传染病。该病于1984年在中国首次报道后,在世界各地相继发生。迄今,RHD已成为兔的一种毁灭性传染病,给养兔业带来了巨大的经济损失。从1984年RHD首次报道至今,关于RHDV的研究已经取得了很大的发展,但国内外的研究学者至今仍未发现一株能进行RHDV稳定繁殖的细胞系,故而就缺少一个可以从分子水平研究病毒的技术平台,这严重阻滞了对RHDV的研究,因此,RHDV致病的分子机理至今仍不十分清楚。在RHD的发生发展过程中,肝脏是病毒增殖的主要器官。临床病理解剖中肝脏的病理变化最为严重,并且在RHDV大量制备纯化的方案中,病死兔的肝脏往往是病毒的重要来源,研究者直接取肝脏匀浆后提取病毒,所以从肝脏细胞出发,寻找与RHDV相互作用的细胞表面蛋白具有重要意义,现已有研究证实RHDV可感染原代兔肝脏细胞。VP60是RHDV的主要衣壳蛋白,研究表明VP60蛋白与RHDV的致病性和免疫原性有着密切关系,故研究能与VP60蛋白相互作用的兔肝细胞表面蛋白,对了解RHDV致病的分子机制以及RHD的防控具有重要意义。本研究拟采用SMART技术,将兔肝脏cDNA定向克隆到pEXP-Lib载体中,构建兔肝脏细胞的真核表达文库。采用表达克隆法筛选文库,以纯化的VP60为诱饵蛋白,从真核表达文库中筛选能与VP60蛋白发生相互作用的蛋白。通过免疫共沉淀试验、血凝抑制试验,体外验证蛋白之间的相互作用;借助激光共聚焦试验技术证明蛋白在细胞内的共定位。实验结果表明,兔肝脏细胞真核表达文库的鉴定结果显示插入片段分布在0.3 kb 2.0kb之间,重组率约为86%,表明获得了高质量的兔肝脏细胞真核表达文库。筛选结果显示有26个EST片段与兔功能基因有较高的同源性,序列分析以及对蛋白的功能性分析,膜突蛋白（Moesin）可与VP60发生相互作用,故对Moesin进行进一步的相互作用验证以及功能性研究。以兔肝脏cDNA为模板,扩增Moesin部分片段基因688nt2157nt,分别连接到载体pET-30a和pEGFP-N1上,构建Moesin的原核表达载体pET-30a-Msn和真核表达载体pEGFP-N1-Msn。将pET-30a-Msn重组表达载体转化E.coli感受态细胞,诱导表达并纯化获得可溶性Moesin蛋白,通过免疫共沉淀试验和血凝抑制试验验证Moesin与VP60的相互作用。同时,将pEGFP-N1-Msn与pcDNA3.1-VP60重组表达载体共转染HEK293T细胞,采用激光共聚焦试验技术对Moesin与VP60在细胞内的共定位进行分析,证明了Moesin与VP60在哺乳动物细胞内能够通过相互作用达到共定位。本研究通过表达克隆法从兔肝细胞真核表达文库中筛选到Moesin基因,并在体外成功表达了Moesin部分片段基因,证明了其与RHDV VP60蛋白之间存在相互作用,为RHDV致病机理的研究奠定了基础。
张祎[8]（2010）在《表达兔出血症病毒VP60蛋白重组干酪乳杆菌的构建及其免疫学初步分析》文中指出兔病毒性出血症（Rabbit hemorrhagic disease, RHD）是由兔出血症病毒（Rabbit hemorrhagic disease virus, RHDV）所致的兔的一种急性、高度传染性致死性传染病,以全身实质脏器水肿、淤血及呼吸系统出血等变化为主要病变特征。该病是危害我国和世界养兔业发展的重要传染病之一。到目前为止,还未建立该病毒体外繁殖敏感的细胞系,采用RHDV感染的组织脏器经灭活制备的组织灭活苗是目前普遍使用的疫苗制品,该苗虽在预防本病起到积极作用,但其生物安全隐患一直是人们所关注的。因此,寻求安全无毒,易于大量扩增免疫保护性抗原,并开发研制具有免疫保护作用的新型疫苗具有重要的现实意义。基于此,本项研究利用乳酸菌作为载体系统,表达RHDV免疫保护性抗原VP60蛋白,利用乳酸菌黏附定植功能,黏膜佐剂作用达到有效刺激机体的黏膜免疫系统,进而引起系统免疫应答。首先应用RT-PCR技术,从山东省某发病兔场疑似兔瘟病料中扩增出预期大小为1.7kb的衣壳蛋白基因,将扩增产物纯化后克隆入pMD18-T载体,经转化、筛选和鉴定后,获得该株病毒衣壳蛋白基因的克隆T-VP60,测序结果显示VP60全长1740bp,编码579个氨基酸（该基因序列已在GenBank中注册,登录号为GU564448）,与GenBank中44个RHDV序列的生物信息学分析,并构建系统进化树和氨基酸同源性比较,世界不同地区RHDV分离株氨基酸保守性较高,可达94.1%—99.7%, EBHSV与RHDV氨基酸同源性约为75%,而RCV与RHDV的同源性在90%以上。结果显示,该毒株属于抗原变异的RHDVa群。利用干酪乳杆菌Lactobacillus casei 393作为递呈抗原的活菌载体,以RHDV免疫保护性抗原基因VP60主要中和位点为靶基因,定向插入到干酪乳杆菌表面表达和分泌型表达载体pPG-1与pPG-2,构建了pPG-1-VP60/L.casei 393和pPG-2-VP60/L.casei 393重组乳酸杆菌系统。细胞表面表达型重组干酪乳杆菌诱导后经免疫荧光和SDS-PAGE检测结果表明,有约80kD的融合蛋白得到了表达,表达蛋白的大小与理论值相符。分泌表达型重组干酪乳杆菌经诱导后,对诱导表达的菌体及培养上清液进行SDS-PAGE检测表明,有约70kD蛋白得到了表达,Western blot结果分析这两种载体所表达的蛋白具有与天然病毒蛋白一样的抗原特异性。以此活菌作为口服制剂,进行了兔体免疫试验,测定了体液免疫、局部黏膜免疫和对强毒攻击的免疫保护试验。将家兔共分为4组共21只。分别免疫5ml浓度为1010CFU/ml pPG-1-VP60/L.casei 393、pPG-2-VP60/L.casei 393、L.casei 393菌液和灭菌PBS。免疫程序分四次进行,时间间隔2w,每次连续免疫3d,一天口服接种一次。口服接种后不同时间分别测定了血清中IgG抗体和实验兔粪便、鼻洗液中抗VP60的slgA抗体。免疫兔血清HI效价可达24-26。从ELISA检测结果来看,粪便和鼻洗液所产生的sIgA抗体水平不同,其中粪便中的值较高,最高平均值可达0.746,而鼻洗液中最高平均值达到0.658,其中免疫组pPG-1-VP60/L.casei 393和pPG-2-VP60/L.casei 393与对照组L.casei 393及PBS组相比,经过SPSS16.0统计软件分析,差异极显着（P<0.01）,并且分泌性重组干酪乳杆菌免疫效果优于细胞表面表达型重组干酪乳杆菌,充分说明构建的重组干酪乳杆菌表达系统既可刺激机体产生系统的体液免疫应答,又可诱导局部黏膜免疫应答。经口服途径免疫本体动物,获得了良好的免疫效果。经1m1强毒攻击,对照组全部死亡,实验组除了一只特例,其余获得了完全的保护。
禹思宇[9]（2010）在《RNA聚合酶Ⅱ介导的FCV反向遗传操作系统的建立及RHDV VP60基因的表达》文中指出应用反向遗传系统实现RNA病毒的拯救,从而在DNA水平上对RNA病毒进行遗传操作,为深入研究RNA病毒的分子生物学及病毒与宿主的相互作用提供了新的手段。绝大多数杯状病毒不能够在体外培养,严重阻碍了这类病毒的研究,猫杯状病毒为杯状病毒科中少数能在体外培养的病毒之一,本研究选择猫杯状病毒CH-GD分离株,克隆其全基因组cDNA,尝试建立RNA聚合酶Ⅱ介导的FCV反向遗传系统,拯救含遗传标记的FCV。1.FCV CH-GD株全长cDNA分子克隆设计并合成了覆盖FCV CH-GD株基因组的]对引物,以本实验室保存的含有FCV CH-GD株全长基因组的pUC-FCV质粒为模板,采用PCR方法扩增FCV全长基因组。通过沉默突变引入一分子标记（MluⅠ识别位点）以便于区分野毒株和拯救毒。改造pCDNA载体,并在其3端引入核酶（pCDNA-HDVRZ）。（?）（?）CH-GD株全基因组插入载体,构建CH-GD株基因组的全长cDNA克隆（pCDNA-HDVRZ-FCV）,并以PCR、限制性内切酶酶切和基因组测序等方法对pCDNA-HDVRZ-FCV进行鉴定,结果表明已成功构建了FCV CH-GD株的全长cDNA分子克隆。该克隆不仅含有CH-GD株的全基因组序列,还含有核酶序列和一个分子标记（MluⅠ识别位点）。2.拯救病毒的鉴定以pCDNA-HDVRZ-FCV为模板,用脂质体转染法（LipofectamineTM 2000）将FCV基因组全长cDNA分子克隆导入F81细胞,利用聚合酶Ⅱ系统进行体内转录。盲传三代后可观察到典型的FCV致细胞病变效应。使用RT-PCR方法进行鉴定,结果表明拯救病毒成功,获得了感染性cDNA分子克隆。通过对感染性分子克隆分子标志的鉴定,排除了自然毒株的污染。3. RHDV VP60在F81细胞上的表达用KpnⅠ和NotⅠ分别将本实验室构建的两个转移载体和pUC-FCV进行双酶切,采用粘端连接将RHDV VP60基因带入FCV全基因组中不同位点。成功构建了将RHDV VP60插入FCV全基因组中的质粒（LC之后和VP1之后）。采用脂质体转染法将质粒导入F81细胞,转染48h后,应用间接免疫荧光法能够检测到RHDV VP60的表达,继续传代,发现荧光变弱,至第七代检测不到荧光,RT-PCR结果也为阴性。试验结果表明,重组病毒可以在F81细胞中表达VP60,但是不能形成稳定的可感染的重组病毒。总之,FCV反向遗传研究系统的建立将为深入研究其功能基因组学以及致病和变异的分子机制奠定基础,同时还具有将FCV开发成载体用于基因治疗或研发新型疫苗的潜在应用前景。
陈柳,云涛,刘光清,倪征,余斌,宋毅[10]（2010）在《兔出血症病毒衣壳蛋白VP60在杆状病毒表达系统中的表达及细胞内定位》文中研究指明为了探讨兔出血症病毒（RHDV）衣壳蛋白的细胞内定位,利用杆状病毒表达系统构建了表达RHDV结构蛋白（VP60）的重组杆状病毒。间接免疫荧光（IFA）和Western blot检测以及电子显微镜观察结果表明,VP60不仅能在昆虫细胞中正确表达,而且能自组装形成病毒样颗粒（VLPs）。进一步对表达蛋白进行细胞内定位观察发现,表达蛋白定位于Sf9细胞的细胞膜上。
二、利用低温电镜术和像重构方法研究兔出血症病毒的三维结构（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、利用低温电镜术和像重构方法研究兔出血症病毒的三维结构（论文提纲范文）
（1）RHDV抗体检测胶体金与量子点标记试纸条的试制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 兔瘟简介 |
| 1.1 兔瘟基本概况 |
| 1.1.1 病原学 |
| 1.1.2 理化特性 |
| 1.1.3 病毒结构及功能 |
| 1.1.4 流行病学 |
| 1.1.5 临诊症状 |
| 1.1.6 病理变化 |
| 1.1.7 实验室检验 |
| 2 免疫层析技术简介 |
| 2.1 胶体金 |
| 2.1.1 胶体金的结构 |
| 2.1.2 胶体金的制备 |
| 2.1.3 胶体金的鉴定 |
| 2.1.4 免疫胶体金的标记 |
| 2.1.5 免疫胶体金快速检测技术在兽医领域的应用 |
| 2.2 量子点 |
| 2.2.1 量子点免疫层析技术 |
| 2.2.2 量子点标记方法 |
| 2.2.3 免疫层析量子点标记快速检测技术在兽医领域的应用 |
| 3 研究目的与意义 |
| 第二章 RHDV VP60 截段基因的克隆表达及鉴定分析 |
| 1 材料与试剂 |
| 1.1 主要试验材料 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 溶液配制 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 pMD19-T-VP60-2 构建与鉴定 |
| 2.1.1 引物设计 |
| 2.1.2 RNA提取 |
| 2.1.3 RNA反转录 |
| 2.1.4 VP60 截段基因扩增 |
| 2.1.5 pMD19-T-VP60-2 重组克隆载体的构建 |
| 2.2 重组表达质粒构建与鉴定 |
| 2.2.1 pMD19-T-VP60-2及pCold TF质粒的提取、酶切与回收 |
| 2.2.2 pCold TF酶切片段与VP60 截段基因片段的连接 |
| 2.2.3 重组表达菌株的构建及转化菌落的鉴定 |
| 2.3 重组蛋白诱导表达及诱导条件优化 |
| 2.3.1 重组蛋白的诱导表达 |
| 2.3.2 重组表达蛋白存在形式的鉴定 |
| 2.3.3 重组蛋白表达条件的优化 |
| 2.3.4 重组蛋白的Western-Blotting检测 |
| 2.3.5 重组蛋白的纯化 |
| 2.3.6 重组蛋白的浓度测定 |
| 2.3.7 兔抗RHDV抗体的制备及效价测定 |
| 2.3.8 重组蛋白的反应原性检测 |
| 3 试验结果 |
| 3.1 pMD19-T-VP60-2 克隆质粒构建 |
| 3.2 pCold TF-VP60-2 重组表达载体构建 |
| 3.3 重组菌表达条件的优化 |
| 3.3.1 重组蛋白的诱导表达 |
| 3.3.2 重组蛋白性质鉴定 |
| 3.3.3 重组蛋白最优表达条件筛选 |
| 3.4 蛋白免疫印迹分析 |
| 3.5 重组蛋白的纯化及浓度测定 |
| 3.6 兔抗RHDV抗体的效价测定 |
| 3.7 重组蛋白的反应原性检测 |
| 4 讨论 |
| 第三章 胶体金标记重组蛋白免疫层析试纸条的初步研制 |
| 1 材料 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 溶液配制 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 兔抗重组蛋白抗体制备及效价测定 |
| 2.2 胶体金的制备 |
| 2.2.1 器皿的清洁 |
| 2.2.2 制备胶体金 |
| 2.3 材料的处理 |
| 2.3.1 硝酸纤维素(NC)膜的处理 |
| 2.3.2 金标垫(玻璃纤维)的处理 |
| 2.4 金标蛋白的制备条件筛选 |
| 2.4.1 胶体金标记最适pH的筛选 |
| 2.4.2 标记胶体金最适蛋白含量的确定 |
| 2.5 金标重组蛋白的制备 |
| 2.5.1 重组蛋白金标记 |
| 2.5.2 金标蛋白颗粒质量的鉴定 |
| 2.6 金标试纸条的试制 |
| 2.7 试纸条的组装及检测 |
| 2.7.1 检测试纸条的标记 |
| 2.7.2 检测试纸条的组装与测试 |
| 2.8 胶体金试纸条T线和C线条件确定 |
| 2.8.1 T线二抗浓度的优化 |
| 2.8.2 C线多克隆抗体浓度的优化 |
| 2.9 胶体金试纸条的灵敏性和特异性试验 |
| 2.10 临床样品检测 |
| 3 试验结果 |
| 3.1 兔抗重组蛋白抗体的效价测定 |
| 3.2 胶体金的制备及初步鉴定 |
| 3.3 免疫胶体金最适pH的测定 |
| 3.4 胶体金标记蛋白的最适量 |
| 3.5 试纸条检测结果 |
| 3.5.1 硝酸纤维膜上T线二抗浓度的确定 |
| 3.5.2 硝酸纤维膜C线多克隆抗体浓度的确定 |
| 3.6 胶体金试纸的灵敏度试验 |
| 3.7 胶体金试纸的特异性试验 |
| 3.8 临床样品检测 |
| 4 讨论 |
| 第四章 量子点标记重组蛋白免疫层析试纸条的初步研制 |
| 1 材料 |
| 1.1 主要材料 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 试验所需溶液配制 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 量子点标记重组蛋白的制备 |
| 2.2 量子点标记重组蛋白条件的优化 |
| 2.2.1 量子点标记重组蛋白最佳pH值的优化 |
| 2.2.2 量子点标记重组蛋白最佳蛋白量的优化 |
| 2.2.3 量子点标记重组蛋白最佳活化剂量的优化 |
| 2.3 量子点标记重组蛋白的鉴定 |
| 2.4 量子点标记重组蛋白免疫层析试纸条最佳条件的优化 |
| 2.4.1 二抗稀释倍数的优化 |
| 2.4.2 多克隆抗体稀释倍数的优化 |
| 2.5 量子点标记重组蛋白免疫层析试纸条检测限的确定 |
| 2.6 量子点标记重组蛋白免疫层析试纸条的特异性 |
| 2.7 量子点标记重组蛋白免疫层析试纸条检测临床样品 |
| 3 试验结果 |
| 3.1 量子点标记重组蛋白的制备 |
| 3.2 量子点标记重组蛋白最适pH值的确定 |
| 3.3 量子点标记重组蛋白的最适蛋白量 |
| 3.4 量子点标记重组蛋白最佳活化剂量的确定 |
| 3.5 量子点标记重组蛋白免疫层析试纸条最佳条件的优化 |
| 3.5.1 检测线(T线)稀释倍数的优化 |
| 3.5.2 多克隆抗体稀释倍数的优化 |
| 3.6 量子点标记重组蛋白免疫层析试纸条的灵敏性检测 |
| 3.7 量子点标记重组蛋白免疫层析试纸条的特异性 |
| 3.8 临床样品检测 |
| 4 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（2）兔出血症病毒（RHDV）与兔出血症病毒2型（RHDV2）的RT-PCR检测方法研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| 英文摘要 |
| 综述部分 |
| 第一章 兔出血症病毒及其检测技术 |
| 1.1 兔瘟病毒(RHDV) |
| 1.1.1 结构特征 |
| 1.1.1.1 病毒形态结构 |
| 1.1.1.2 基因组结构特征与病毒蛋白 |
| 1.1.2 理化特征与培养特性 |
| 1.1.3 分类地位与分型 |
| 1.1.3.1 分类地位 |
| 1.1.3.2 毒株分型 |
| 1.1.4 病毒的起源 |
| 1.2 RHDV检测诊断技术 |
| 1.2.1 初诊 |
| 1.2.2 实验室检测诊断技术 |
| 1.2.2.1 电镜技术 |
| 1.2.2.2 血凝-血凝抑制试验(HA-HIA) |
| 1.2.2.3 酶联免疫吸附试验(ELISA) |
| 1.2.2.4 分子生物学技术 |
| 1.3 本研究的目的意义 |
| 试验研究 |
| 第二章 兔出血症病毒2型VP60基因保守区人工合成及RT-PCR检测方法初探 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 试剂与样品 |
| 2.1.2 引物设计 |
| 2.1.3 RHDV2 VP60基因靶片段的人工合成 |
| 2.1.3.1 搭桥PCR |
| 2.1.3.2 目的基因重组质粒的构建 |
| 2.1.4 RHDV VP60基因靶片段的克隆鉴定 |
| 2.1.5 反应条件的优化 |
| 2.1.6 RHDV2 RT-PCR敏感性试验 |
| 2.1.7 RHDV2 RT-PCR特异性试验 |
| 2.1.8 初步应用试验 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 RHDV2和RHDV靶基因片段的克隆鉴定 |
| 2.2.2 反应条件的优化 |
| 2.2.3 RHDV2 RT-PCR的敏感性和特异性 |
| 2.2.4 样品检测 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 兔出血症病毒与兔出血症病毒2型复合RT-PCR检测方法的初步研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 试剂与样品 |
| 3.1.2 引物设计 |
| 3.1.3 RHDV与RHDV2靶基因片段的克隆鉴定 |
| 3.1.3.1 RHDV2 VP60靶基因片段的人工合成 |
| 3.1.3.2 RHDV VP60基因靶片段的扩增 |
| 3.1.3.3 RHDV2与RHDV靶基因片段的克隆鉴定 |
| 3.1.4 反应条件的优化 |
| 3.1.5 复合RT-PCR敏感性试验 |
| 3.1.6 复合RT-PCR特异性试验 |
| 3.1.7 初步应用试验 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 RHDV2和RHDV靶基因片段的克隆鉴定 |
| 3.2.2 反应条件的确立 |
| 3.2.3 复合RT-PCR的敏感性和特异性 |
| 3.2.4 样品检测 |
| 3.3 讨论 |
| 结论部分 |
| 第四章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（3）兔病毒性出血症病毒遗传变异及口服疫苗的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 兔病毒性出血症病毒研究进展 |
| 1.1 兔病毒性出血症病毒的概述 |
| 1.2 兔病毒性出血症病毒的分类 |
| 1.3 兔病毒性出血症病毒的生物学特征 |
| 1.3.1 病原特征 |
| 1.3.2 兔病毒性出血症病毒的基因组 |
| 1.3.3 兔病毒性出血症病毒的亚基因组 |
| 1.3.4 兔病毒性出血症病毒的结构蛋白 |
| 1.3.5 兔病毒性出血症病毒的非结构蛋白 |
| 1.4 兔病毒性出血症的临床症状与病理变化 |
| 1.4.1 流行病学 |
| 1.4.2 临床症状 |
| 1.4.3 病理变化 |
| 1.5 兔病毒性出血症病毒的诊断与检测 |
| 1.5.1 电镜检查 |
| 1.5.2 间接血凝试验 |
| 1.5.3 酶联免疫吸附试验 |
| 1.5.4 核酸检测 |
| 1.6 兔病毒性出血症病毒疫苗研究进展 |
| 1.6.1 兔病毒性出血症病毒组织灭活苗 |
| 1.6.2 兔病毒性出血症病毒基因工程苗 |
| 1.7 小结 |
| 第二章 黏膜免疫的机理及口服活载体疫苗研究进展 |
| 2.1 黏膜免疫疫苗的研究 |
| 2.2 减毒沙门氏菌载体概述 |
| 2.2.1 减毒沙门菌通过黏膜上皮 M 细胞进入机体的免疫机制 |
| 2.2.2 减毒沙门氏菌被树突状细胞直接摄取进入机体的免疫机制 |
| 2.2.3 减毒沙门氏菌载体 DNA 疫苗诱导机体的免疫应答 |
| 2.2.4 减毒沙门氏菌载体疫苗的应用 |
| 2.3 腺病毒载体概述 |
| 2.3.1 腺病毒的基因组结构及感染机制 |
| 2.3.2 腺病毒载体的构建及发展 |
| 2.3.3 腺病毒载体应用 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 兔病毒性出血症病毒遗传进化及抗原变异分析 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 兔病毒性出血症临床情况调查 |
| 3.2.2 病毒分离鉴定的结果 |
| 3.2.3 RHDV VP60 基因的扩增 |
| 3.2.4 重组质粒鉴定 |
| 3.2.5 VP60 编码氨基酸序列的比较 |
| 3.2.6 系统发育分析 |
| 3.2.7 攻毒前兔子 HI 滴度的测定 |
| 3.2.8 攻毒试验结果 |
| 3.2.9 肝脏带毒检测 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 减毒沙门氏菌载体的口服兔病毒性出血症疫苗研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 重组载体 pcDNA3-VP60 的鉴定 |
| 4.2.2 SL7207/pcDNA3-VP60 的酶切鉴定 |
| 4.2.3 减毒沙门氏菌对兔子腹腔巨噬细胞的转导效果 |
| 4.2.4 VP60 的体内转录 |
| 4.2.5 口服 DNA 疫苗的免疫效果 |
| 4.2.6 T 淋巴细胞转化 |
| 4.2.7 细胞因子 |
| 4.2.8 攻毒保护 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 腺病毒基础的兔病毒性出血症口服疫苗的研究 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 材料 |
| 5.1.2 方法 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 VP60 基因的扩增 |
| 5.2.2 pAdTrack-VP60 的酶切鉴定 |
| 5.2.3 rhAd-VP60 的酶切鉴定 |
| 5.2.4 重组病毒鉴定 |
| 5.2.5 Western blot 鉴定 VP60 的表达 |
| 5.2.6 体液免疫 |
| 5.2.7 RHDV 特异性 T 细胞增殖检验 |
| 5.2.8 细胞因子检测 |
| 5.2.9 攻毒保护 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 第六章 兔病毒性出血症 ELISA 检测方法的建立 |
| 6.1 材料 |
| 6.1.1 菌株和质粒 |
| 6.1.2 主要工具酶与试剂 |
| 6.1.3 酶标抗体及血清 |
| 6.1.4 常用缓冲液的配制 |
| 6.1.5 主要仪器设备和工具 |
| 6.2 方法 |
| 6.2.1 原核表达载体 pET32a-RHDV E 的构建 |
| 6.2.2 重组质粒 pET32a-RHDV E 的诱导表达 |
| 6.2.3 表达产物的检测 |
| 6.2.4 重组蛋白的制备纯化 |
| 6.2.5 间接 ELISA 检测方法的建立 |
| 6.2.6 临界值的确定 |
| 6.2.7 间接 ELISA 检测方法性能评价 |
| 6.2.8 临床样品的检测 |
| 6.3 结果 |
| 6.3.1 原核表达载体 pET32a-RHDV E 的构建 |
| 6.3.2 重组质粒 pET32a-RHDV E 的诱导表达 |
| 6.3.3 Western blot 检测结果 |
| 6.3.4 重组蛋白的纯化结果 |
| 6.3.5 间接 ELISA 方法的建立 |
| 6.3.6 间接 ELISA 方法阴阳性临界值的确定 |
| 6.3.7 间接 ELISA 检测方法性能评价的结果 |
| 6.3.8 临床样品检测 |
| 6.4 讨论 |
| 6.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 缩略词表 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（4）携带口蹄疫病毒B细胞表位的兔出血症病毒样颗粒的表达及其免疫原性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 文献综述 兔病毒性出血症病毒(RHDV)研究进展 |
| 1 RHDV的分类 |
| 2 RHDV的生物学特性 |
| 2.1 RHDV的形态特征 |
| 2.2 RHDV的理化特性 |
| 2.3 RHDV的血凝特性 |
| 2.4 RHDV血清型及进化特点 |
| 2.5 RHDV的抗原性 |
| 2.6 RHDV的致病性 |
| 2.7 RHDV的培养 |
| 2.8 RHDV的诊断 |
| 3 RHDV的分子生物学研究进展 |
| 3.1 RHDV的结构 |
| 3.2 RHDV的结构蛋白 |
| 3.3 RHDV的非结构蛋白 |
| 3.4 亚基因组 |
| 4 病毒样颗粒(VLPs)的研究进展 |
| 4.1 VLPs的形成 |
| 4.2 VLPs的来源 |
| 4.3 VLPs的免疫原性 |
| 5 RHDV VP60研究新进展 |
| 6 FMDV表位研究动态 |
| 参考文献 |
| 第一章 6种携带口蹄疫病毒B细胞表位的重组转移载体的构建 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| ABSTRACT |
| 第二章 6种嵌合蛋白的表达及鉴定 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| ABSTRACT |
| 第三章 6种嵌合蛋白的空间构象和免疫原性研究 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| ABSTRACT |
| 全文总结 |
| 附录 |
| 致谢 |
（5）应用噬菌体展示技术筛选兔出血症病毒抗原模拟表位及其ELISA抗体检测方法的建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表(Abbreviation) |
| 第一部分 文献综述 |
| 1 兔出血症 |
| 1.1 兔出血症的流行病学、临床症状及病理变化 |
| 1.2 病原分子生物学 |
| 1.3 疫苗的研究现状 |
| 2 噬菌体展示及随机肽库技术 |
| 2.1 噬菌体展示技术的原理 |
| 2.2 噬菌体展示系统分类 |
| 2.3 噬菌体随机肽库 |
| 2.4 噬菌体展示技术的应用 |
| 参考文献 |
| 第二部分 实验部分 |
| 第一章 应用噬菌体展示技术筛选RHDV抗原模拟表位 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 生物材料及试剂盒 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.1.3 主要仪器 |
| 1.1.4 实验动物 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 兔出血症病毒单克隆抗体的制备与纯化 |
| 1.2.2 噬菌体展示肽库的亲和筛选 |
| 2 结果 |
| 2.1 兔出血症病毒单克隆抗体的制备与纯化 |
| 2.1.1 单抗A3c的制备 |
| 2.1.2 单抗A3C亚型的鉴定 |
| 2.1.3 纯化后单抗A3C的纯度的鉴定 |
| 2.1.4 纯化后单抗A3C浓度的测定 |
| 2.1.5 单抗A3C效价的测定 |
| 2.1.6 单抗A3C亲和常数的测定 |
| 2.2 噬菌体展示肽库的亲和筛选 |
| 2.2.1 亲和筛选结果 |
| 2.2.2 三轮洗脱液中噬菌体与靶分子单抗A3c亲和活力 |
| 2.2.3 噬菌体单克隆ELISA鉴定 |
| 2.2.4 噬菌体单链DNA序列分析 |
| 2.2.5 噬菌体克隆的特异性研究 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 应用噬菌体克隆建立检测兔出血症病毒抗体的间接ELISA方法 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 试剂和血清 |
| 1.1.2 仪器 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 应用噬菌体克隆建立ELISA方法的可行性 |
| 1.2.2 间接ELISA最佳反应条件的确定 |
| 1.2.3 间接ELISA操作程序的确定和结果判定 |
| 1.2.4 阻断试验 |
| 1.2.5 敏感性试验 |
| 1.2.6 保存期试验 |
| 1.2.7 重复性试验 |
| 1.2.8 临床应用 |
| 2 结果 |
| 2.1 应用噬菌体克隆建立ELISA方法的可行性 |
| 2.2 间接ELISA最佳反应条件的确定 |
| 2.3 间接ELISA操作程序的确定和结果判定 |
| 2.4 阻断试验 |
| 2.5 敏感性试验 |
| 2.6 保存期试验 |
| 2.7 重复性试验 |
| 2.8 临床应用 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 附录：主要试剂的配制 |
| 致谢 |
（6）生物大分子电子断层三维重建与分子模拟技术（论文提纲范文）
| 1 生物大分子结构的测定方法 |
| 2 国内外电子显微学研究进展 |
| 3 研究项目介绍 |
（7）兔出血症病毒VP60蛋白与膜突蛋白相互作用的鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 引言 |
| 1.1 概况 |
| 1.2 病原学 |
| 1.2.1 病毒学分类与结构特性 |
| 1.2.2 理化特性 |
| 1.2.3 基因组结构 |
| 1.2.4 基因编码蛋白及功能研究 |
| 1.3 临床症状与病理变化 |
| 1.3.1 临床症状 |
| 1.3.2 病理变化 |
| 1.4 流行病学特性 |
| 1.5 诊断方法 |
| 1.5.1 电镜观察法 |
| 1.5.2 血凝和血凝抑制试验 |
| 1.5.3 酶联免疫吸附试验 |
| 1.5.4 反转录-聚合酶链式反应 |
| 1.6 防控 |
| 1.7 蛋白与蛋白相互作用研究的相关技术 |
| 1.7.1 酵母双杂交系统 |
| 1.7.2 免疫共沉淀技术 |
| 1.7.3 噬菌体展示技术 |
| 1.7.4 串联亲和纯化技术 |
| 1.8 膜突蛋白的研究进展 |
| 1.9 兔出血症病毒相互作用蛋白的研究进展 |
| 1.10 本研究的目的及意义 |
| 第二章 兔肝脏CDNA 文库中VP60 相互作用蛋白的筛选 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.1.1 菌株与细胞 |
| 2.1.2 实验动物 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 主要试剂 |
| 2.1.5 兔肝脏总RNA 的提取 |
| 2.1.6 兔肝脏cDNA 真核表达文库的构建 |
| 2.1.7 兔肝脏cDNA 真核表达文库的质量鉴定 |
| 2.1.8 转染用cDNA 文库重组质粒的制备 |
| 2.1.9 SP2/0 细胞的嘌呤霉素MLD 的测定 |
| 2.1.10 兔肝脏cDNA 文库重组质粒转染细胞试验 |
| 2.1.11 细胞筛选试验 |
| 2.1.12 重组质粒特异表达序列的鉴定 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 兔肝脏总RNA 的含量及纯度 |
| 2.2.2 ds cDNA 的鉴定 |
| 2.2.3 文库质量的鉴定 |
| 2.2.4 SP2/0 细胞的嘌呤霉素最小致死浓度的测定 |
| 2.2.5 筛选的阳性SP2/0 细胞中重组表达质粒的PCR 鉴定 |
| 2.2.6 重组表达质粒的序列分析 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 兔肝脏cDNA 真核表达文库的构建 |
| 2.3.2 兔肝脏cDNA 真核表达文库的筛选 |
| 第三章 VP60 与膜突蛋白相互作用的验证 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 病毒、菌株、质粒、抗体、细胞 |
| 3.1.2 试剂与药品 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.1.4 Moesin 部分片段基因的克隆与表达 |
| 3.1.5 RHDV 的纯化 |
| 3.1.6 VP60 与Moesin 相互作用的免疫共沉淀验证 |
| 3.1.7 VP60 与Moesin 相互作用的血凝抑制试验验证 |
| 3.1.8 VP60 与Moesin 相互作用的细胞内共定位验证 |
| 3.1.9 Moesin 介导RHDV 进入细胞的初步探索 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 Moesin 部分片段基因的克隆 |
| 3.2.2 Moesin 部分片段基因的表达与纯化 |
| 3.2.3 RHDV 的纯化 |
| 3.2.4 VP60 与Moesin 相互作用的免疫共沉淀验证结果 |
| 3.2.5 VP60 与Moesin 相互作用的血凝抑制试验验证结果 |
| 3.2.6 Moesin 真核表达载体的构建 |
| 3.2.7 VP60 真核表达载体的构建 |
| 3.2.8 VP60 在 HEK293T 细胞内表达的 IFA 分析结果 |
| 3.2.9 VP60 在 HEK293T 细胞内表达 Western blot 分析结果 |
| 3.2.10 激光共聚焦显微镜观察 VP60 与 Moesin 的细胞内共定位结果 |
| 3.2.11 Moesin 介导 RHDV 进入细胞的初步探索结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 Moesin 部分片段基因的克隆与表达 |
| 3.3.2 VP60 与 Moesin 相互作用的验证 |
| 第四章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 Ⅰ |
| 附录 Ⅱ |
| 附录 Ⅲ |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（8）表达兔出血症病毒VP60蛋白重组干酪乳杆菌的构建及其免疫学初步分析（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 引言 |
| 1.1 兔病毒性出血症的流行现状 |
| 1.2 兔病毒出血症病原学分类及主要生物学特征 |
| 1.3 病毒基因组结构与功能 |
| 1.4 RHDV的结构蛋白与非结构蛋白 |
| 1.4.1 结构蛋白 |
| 1.4.2 非结构蛋白 |
| 1.5 兔病毒性出血症疫苗研究进展 |
| 1.5.1 兔病毒性出血症灭活疫苗研究进展 |
| 1.5.2 不同载体表达兔出血症病毒VP60蛋白研究进展 |
| 1.6 乳酸菌概述 |
| 1.6.1 乳酸菌的益生作用 |
| 1.6.2 乳酸菌的抑菌作用 |
| 1.6.3 乳酸菌的表达系统 |
| 1.6.4 乳酸菌与黏膜免疫 |
| 1.6.5 乳酸菌作为口服疫苗载体研究进展 |
| 1.7 本研究的目的及意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 病料、菌株 |
| 2.1.2 抗体与检测制剂 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 试验动物 |
| 2.1.5 培养基及溶液的配制 |
| 2.1.6 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)主要试剂 |
| 2.1.7 间接ELISA检测抗体主要试剂 |
| 2.1.8 免疫印迹(Western-blot)主要试剂 |
| 2.1.9 主要实验仪器与设备 |
| 2.1.10 引物合成 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 病料的处理及动物感染 |
| 2.2.2 VP60基因的克隆及序列测定 |
| 2.2.3 目的基因VP60的亚克隆与鉴定 |
| 2.2.4 重组干酪乳杆菌的构建 |
| 2.2.5 重组干酪乳杆菌的诱导及表达蛋白的鉴定 |
| 2.2.6 口服重组干酪乳杆菌免疫学指标的测定 |
| 2.2.7 免疫兔攻RHDV保护性试验 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 RHDV的鉴定 |
| 3.1.1 敏感兔接种试验 |
| 3.1.2 HA和HI试验 |
| 3.2 病毒VP60基因的RT-PCR |
| 3.3 VP60基因的序列测定及生物信息学分析 |
| 3.4 重组质粒pMD18-T-VP60的鉴定结果 |
| 3.5 重组乳酸菌表达载体的鉴定 |
| 3.5.1 表面表达型重组载体pPG-1-VP60的鉴定结果 |
| 3.5.2 分泌表达型重组载体pPG-2-VP60的鉴定结果 |
| 3.6 重组干酪乳杆菌的诱导及表达蛋白的鉴定 |
| 3.6.1 细胞表面表达型重组干酪乳杆菌的诱导表达鉴定结果 |
| 3.6.2 分泌表达型重组干酪乳杆菌的诱导表达鉴定结果 |
| 3.7 重组乳酸菌口服免疫兔免疫学指标的测定 |
| 3.7.1 ELISA方法检测免疫兔血清中抗RHDV-VP60特异性抗体IgG测定 |
| 3.7.2 应用血凝抑制试验检测免疫兔的血清效价 |
| 3.7.3 家兔粪便中抗RHDV-VP60特异性sIgA检测结果 |
| 3.7.4 家兔鼻洗液中抗RHDV-VP60特异性sIgA检测结果 |
| 3.7.5 免疫兔攻RHDV保护性试验 |
| 4 讨论 |
| 4.1 兔病毒性出血症病毒09-SD株衣壳蛋白的遗传变异分析 |
| 4.2 口服重组干酪乳杆菌诱导的体液免疫应答 |
| 4.3 口服重组干酪乳杆菌诱导的免疫保护作用 |
| 4.4 表面表达和分泌表达诱导免疫应答的差异分析 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
（9）RNA聚合酶Ⅱ介导的FCV反向遗传操作系统的建立及RHDV VP60基因的表达（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 FCV反向遗传学的研究进展 |
| 1 猫杯状病毒分子生物学研究进展 |
| 1.1 FCV的形态 |
| 1.2 基因组结构 |
| 1.3 RNA |
| 1.4 结构蛋白 |
| 1.5 非结构蛋白 |
| 1.6 ORF3 |
| 1.7 病毒的繁殖与复制 |
| 2 动物RNA病毒的反向遗传学 |
| 2.1 概念与原理 |
| 2.2 正链RNA病毒反向遗传学发展历程 |
| 2.3 反向遗传学研究系统构建的策略 |
| 2.4 反向遗传操作技术的应用与展望 |
| 2.5 杯状病毒反向遗传学的应用 |
| 3 小结 |
| 参考文献 |
| 第二章 RHDV及VP60基因工程疫苗研究进展 |
| 1 兔出血症的基本特性 |
| 2 病毒基因组及重要结构和功能蛋白的特性 |
| 2.1 RHDV基因组结构及其功能 |
| 2.2 亚基因组 |
| 2.3 结构蛋白 |
| 2.4 非结构蛋白 |
| 3 VP60基因工程疫苗研究进展 |
| 3.1 肠杆菌表达的亚单位疫苗 |
| 3.2 杆状病毒-昆虫细胞系统表达的亚单位疫苗 |
| 3.3 酵母重组亚单位疫苗 |
| 3.4 转基因植物表达的亚单位疫苗 |
| 3.5 重组病毒活载体疫苗 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 第二篇 试验研究 |
| 第一章 RNA聚合酶Ⅱ介导的FCV反向遗传操作系统的建立 |
| 1 材料 |
| 1.1 细胞及培养基 |
| 1.2 载体与质粒 |
| 1.3 酶和试剂 |
| 1.4 仪器设备 |
| 2 方法 |
| 2.1 FCV全长的扩增及遗传标记的引入 |
| 2.2 PCR |
| 2.3 pcDNA3载体的改造 |
| 2.4 PCR产物的连接、转化与阳性克隆质粒的鉴定 |
| 2.5 连接产物的转化 |
| 2.6 全基因组真核表达载体的构建 |
| 2.7 病毒的拯救 |
| 2.8 感染性克隆的鉴定 |
| 3 结果 |
| 3.1 FCV全长的扩增 |
| 3.2 pcDNA3载体的改造 |
| 3.3 核酶的引入 |
| 3.4 全基因组感染性克隆的构建 |
| 3.5 转染敏感细胞 |
| 3.6 RT-PCR鉴定 |
| 3.7 拯救毒与亲本毒的区别鉴定 |
| 3.8 拯救毒与亲本毒复制动力学比较 |
| 4 讨论 |
| 4.1 RNA聚合酶Ⅱ(PolⅡ)介导的拯救系统 |
| 4.2 影响病毒转录体感染性的主要因素 |
| 4.3 体内转染时各参数的影响 |
| 5 小结 |
| 参考文献 |
| 第二章 RHDV VP60在F81细胞中的表达 |
| 1 材料 |
| 1.1 细胞及培养条件 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 主要仪器设备 |
| 1.4 仪器设备 |
| 2 方法 |
| 2.1 嵌合体病毒载体的构建 |
| 2.2 阳性克隆的筛选 |
| 2.3 转染敏感细胞 |
| 2.4 VP60的表达 |
| 2.5 表达产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) |
| 3 结果 |
| 3.1 重组质粒的鉴定 |
| 3.2 嵌合体病毒VP60的表达 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 附录 实验所需试剂配制 |
| 致谢 |
四、利用低温电镜术和像重构方法研究兔出血症病毒的三维结构（论文参考文献）
- [1]RHDV抗体检测胶体金与量子点标记试纸条的试制[D]. 周丽军. 四川农业大学, 2019(01)
- [2]兔出血症病毒（RHDV）与兔出血症病毒2型（RHDV2）的RT-PCR检测方法研究[D]. 赵希仑. 四川农业大学, 2016(04)
- [3]兔病毒性出血症病毒遗传变异及口服疫苗的研究[D]. 邱立. 西北农林科技大学, 2012(06)
- [4]携带口蹄疫病毒B细胞表位的兔出血症病毒样颗粒的表达及其免疫原性研究[D]. 盛蓉. 南京农业大学, 2011(04)
- [5]应用噬菌体展示技术筛选兔出血症病毒抗原模拟表位及其ELISA抗体检测方法的建立[D]. 杨廷亚. 南京农业大学, 2011(01)
- [6]生物大分子电子断层三维重建与分子模拟技术[J]. 李晶,赵海燕,李鲲鹏. 中国医疗设备, 2011(08)
- [7]兔出血症病毒VP60蛋白与膜突蛋白相互作用的鉴定[D]. 穆亚芳. 中国农业科学院, 2011(10)
- [8]表达兔出血症病毒VP60蛋白重组干酪乳杆菌的构建及其免疫学初步分析[D]. 张祎. 东北农业大学, 2010(05)
- [9]RNA聚合酶Ⅱ介导的FCV反向遗传操作系统的建立及RHDV VP60基因的表达[D]. 禹思宇. 南京农业大学, 2010(06)
- [10]兔出血症病毒衣壳蛋白VP60在杆状病毒表达系统中的表达及细胞内定位[J]. 陈柳,云涛,刘光清,倪征,余斌,宋毅. 浙江农业学报, 2010(02)