一、新疆出血热病毒的实验室诊断方法（论文文献综述）
闫芳域[1]（2018）在《出血热相关病毒核酸检测技术研究》文中研究表明病毒性出血热（Viral hemorrhagic fevers,VHFs）是一组病毒性疾病,主要以出血、突起发热和休克为特征。出血热相关的病毒性疾病起病急,随着全球经济一体化及现代交通运输方式的快速发展,传染病跨境传播的风险不断加大,对相应病毒性传染病的组合检测技术提出了更高的要求。目前,实验室主要是通过病毒分离,检测病毒核酸、抗原以及特异性抗体等方法进行实验室诊断。病毒分离被认为是诊断病毒感染的金标准,但是由于耗费时间长,需要标本量大,无法进行多元的检测。本科室已建立了按照症候群和科属分组的多重实时荧光定量RT-PCR检测方法,在分地区组合的检测方法上还有待完善。本实验的主要内容是针对按地区分组的出血热及其相关病毒病分组的核酸检测方法,包括实时荧光定量PCR法和液相芯片法。实时荧光定量PCR技术是一种定量分析的方法,这种方法在PCR反应体系中加入荧光基团,并同时利用荧光积累,实时监测整个PCR进程,最后通过绘制标准曲线对未知模板进行定量分析。实时荧光定量PCR技术的灵敏度高且特异性强,特点是省时、便利和快捷,并可以进行绝对或相对定量分析,是实验室常用的检测方法。液相芯片技术是1995年美国Lutminex公司开发的一种高通量检测平台,它可以定性或定量的在一个反应体系中检测100种不同分析物,其优点是节省时间、节省标本,高通量。目前较多应用于蛋白质和核酸的检测研究,如细胞因子的活动水平检测、肿瘤标记物、激素水平和PCR产物的检测等。为了满足出血热相关病毒性疾病跨境传播检出的需要,本研究拟建立按照地区分组的病毒核酸检测方法。首先将纳入病毒按照高发地区进行分组后,分别设计病毒的引物和探针。针对实时荧光定量PCR方法使用的探针为TaqMan探针,针对液相芯片技术的探针5’端添加12C连接臂后进行氨基修饰。使用体外转录得到的各个病毒RNA参考品对两种方法进行灵敏度的评价。1.利用RNA参考品进行分组的多重实时荧光定量RT-PCR检测,建立标准曲线,评价各个检测的灵敏度,检出限在101～103拷贝/μl。利用50份未感染人血清和所有纳入病毒的模拟标本进行特异性评价,未见有扩增,表明此方法具有良好的特异性。最后通过重复性实验验证各组检测方法的稳定性,显示组内变异系数小于6.84%,组间变异系数小于8.33%。2.将探针偶联到羧基荧光微球后对RNA参考品分组进行的Tem-PCR扩增产物进行检测,评价检测方法的灵敏度和稳定性。利用50份健康人血清标本和30份未感染纳入疾病的病人血清进行特异度检测。结果显示所建立的基于荧光微球的核酸检测方法可特异性检出相应病原体核酸,检测限可达102～106拷贝/μl,特异性为100%,组内变异系数均在18%以下,组间变异系数在25%以下,稳定性尚可。本研究建立了出血热及其相关病毒病的快速组合核酸检测技术,并对其进行了初步评价,对纳入病毒病的出入境检测和临床诊断具有积极意义。
刘东晓[2]（2017）在《内蒙古西部地区蜱传克里米亚刚果出血热病毒基因组和分子流行病学研究》文中研究说明蜱虫作为一种重要的媒介生物,其种类繁多、分布广泛,目前已发现了 83种蜱传病毒,其中不乏严重威胁公共卫生的蜱传脑炎病毒、科罗拉多蜱传热病毒等。尤其是2007年蜱媒非洲猪瘟暴发和国内2009年发现蜱媒“新型布尼亚病毒”致人死亡事件发生以来,蜱传病毒的研究引起了国内外专家和国家疾病防控部门的高度重视。内蒙古是畜牧业集中地带,伴随而来该地区有大量的蜱虫寄生,以动物为中介,蜱很容易将病毒传播给人类和其它动物,使得该地区是蜱传病毒病的潜在高危地区。因此,为了充分保障该地区牧民生命安全和畜牧业的健康发展,填补我国内蒙地区蜱虫携带病毒的本底数据的空白,调查是否具有重要人兽共患病相关的病毒并进行深入研究,本研究采集内蒙古左旗和右旗地区的动物寄生蜱虫,利用病毒宏基因组学相关技术对蜱传病毒进行研究,通过实验,获得以下结果:（1）样品采集:本实验样品采集工作于2015-2016年间完成。2015年5月,于内蒙古自治区的阿拉善盟左旗和阿拉善盟左旗与右旗交界2个采样点采集骆驼、绵羊体表寄生的亚洲璃眼蜱共计643只;2016年4月,从内蒙左右旗交界的骆驼,嘉镇乌兰呼都格嘎查采集的绵羊及骆驼血清,共计112份。（2）样品核酸检测:利用病毒宏基因组学技术对从所采集的样品进行病毒组学研究,共获得了644692条Reads,拼接出2484条Contig。通过核酸序列注释发现,其8.2%（203/2484）的contig为病毒序列,并注释到4个病毒科和4个病毒属;其中一条720bp的contig注释到克里米亚刚果出血热病毒（CCHFV）,根据这条contig设计特异性检测引物,对样品进行检测,共计从60个蜱虫样本中检测到有4个样本携带有克里米亚刚果出血热病毒基因,四株病毒分别命名为N5株,H1株,NM-18株和NM-24株,其中H1株的宿主为绵羊,其余三株的宿主为骆驼,阳性率为6.7% （4/60）。（3）克里米亚刚果出血热病毒全基因组研究:本研究通过NCBI Blast比对选择参考株对其中一株病毒（NM-18株）的全序列进行了分段扩增,共设计了 18对简并引物,并扩增出病毒的全基因组序列,其中包括S片段1672bp, ORF为1449bp,编码482个氨基酸,Gc含量为45.25%;M片段5368bp,ORF为5070bp,编码1689个氨基酸,Gc含量为43.60%; L片段12155bp,ORF为11838bp,编码3945个氨基酸,Gc含量为41.37%。与已知的克里米亚刚果出血热病毒进行系统进化分析发现,NM-18株与其他克里米亚刚果出血热病毒相比,S片段的全基因组序列同源性与同样分离自我国蜱虫的HY-13株最高,可以达到95.2%; M片段的全基因组核苷酸同源性则与分离自南非的SPU415/85株最高,可以达到91.2%; L片段的全基因组核苷酸同源性与同样分离自我国蜱虫的YL04057株同源性最高,可以达到93.7%。（4）样品血清学检测:本实验利用本实验扩增出的NM-18株克里米亚刚果出血热病毒的S片段,使用原核表达将病毒的N蛋白成功表达,大小为54kD,并成功纯化,又利用纯化成功的克里米亚刚果出血热病毒的N蛋白对来自内蒙地区共计2个采样点,2种蜱虫宿主共112份血清进行了Western blot检测,在采集的全部112份血清中,克里米亚刚果出血热病毒阳性血清共有49份,阳性率可以达到43.75%。综上所述,本研究通过病毒宏基因学技术次对内蒙古地区的蜱虫病毒组的研究,发现了蜱传重要人兽共患病病原克里米亚刚果出血热病毒的存在,成功的扩增出一株克里米亚刚果出血热病毒的全基因组序列,分析了宿主动物对该病毒的感染阳性率。为进一步建立西北地区蜱虫携带病毒的本底数据信息库奠定了基础,也为蜱媒人兽共患病毒的防控提供了理论参考。
寇春[3]（2016）在《新疆准噶尔盆地周边地区蜱与鼠类携带虫媒病毒的调查研究》文中研究指明新疆维吾尔自治区位于我国西北边陲,亚欧大陆腹地,与俄罗斯、蒙古、巴基斯坦等8家接壤,陆上对外口岸较多,与周边国家经济交往频繁。新疆地理生态环境多样,物种分布广与内地有着明显的不同,适合蜱的生长繁殖,其分布广泛,种类较多,可传播多种虫媒病毒。新疆地区时有人、畜不明原因发热和脑炎散发或流行,疑似虫媒病毒引起,但是由于种种原因,目前还没有进行过系统而深入的调查,急需加强研究。我国已知流行的4种虫媒病毒病中新疆出血热和蜱传脑炎在新疆都有发现,在新疆既往进行的虫媒病毒调查中,已经从新疆地区的全沟硬蜱、森林革蜱、亚洲璃眼蜱、边缘革蜱和草原革蜱中分别分离到蜱传脑炎病毒,东方马脑炎病毒,新疆出血热病毒、新环状病毒。从按蚊、库蚊、伊蚊中分别分离到辛德毕斯病毒,西方马脑炎病毒,辽宁病毒,Tahyna病毒等。但尚缺乏对新疆准噶尔盆地周边地区虫媒病毒的深入调查研究。为了解新疆准噶尔盆地周边地区蜱及啮齿动物（鼠）携带虫媒病毒情况,应用RT-PCR、细胞培养及生物信息学等方法对该地区蜱及啮齿动物（鼠）感染虫媒病毒情况进行了调查研究。本项研究结果对丰富新疆乃至国内虫媒病毒资源和进行新疆地区虫媒病毒病预防控制具有重要意义。主要内容包括以下方面:1.新疆啮齿动物（鼠）样本采集及携带虫媒病毒的初步检测2014-2015年在新疆准噶尔盆地周边地区乌苏、阜康、奇台、吉木萨尔和石河子149团等地区采集了1054只啮齿动物,其中2014年,2015年分别为684只和370只,主要种类有长尾黄鼠（Spermophilus undulatus）、子午沙鼠（Meriones meridianus Pallas）、大沙鼠（Rhombomys opimus）和三趾跳鼠（Dipus sagitta）。2014年鼠样本根据采集地、属种与脏器的不同分成193组。通过RT-PCR的方法对鼠中发热伴血小板减少综合征病毒（SFTSV）、新疆出血热病毒（XHFV）、荆门病毒（JMTV）以及古尔图病毒（Guertu virus）的感染情况进行了检测。结果发现总样本中Guertu virus的S片段阳性率为9.3%,SFTSV的S片段阳性率为6.2%。Guertu virus与SFTSV主要集中在乌苏地区,主要宿主为长尾黄鼠。提示长尾黄鼠为Guertu virus与SFTSV新的宿主。2015年样本同样方法分组成136组,除检测以上4种病毒外还检测了汉坦病毒（HTV）,蜱传脑炎病毒（TBEV）与黄病毒属病毒（Flavivirus）。结果显示总样本中XHFV的阳性率为11%,SFTSV阳性率为7.4%,Guertu virus阳性率为21.3%。阳性样本主要集中在乌苏地区。根据2014-2015年对准噶尔盆地周边地区鼠样本的检测结果,提示新疆乌苏地区可能存在XHFV、SFTSV与Guertu virus的自然疫源地。2.新疆蜱中新病毒的发现、分离及在蜱中分子流行病学调查2014年在新疆乌苏地区共采集了13662只草原革蜱（Dermacentor nuttalli）。根据采集地与蜱种类不同按每组约200只左右分成68组,选取8组有代表样性的样本,经武汉中科院病毒研究所的454高通量测序,有7组样本中存在黄病毒科病毒的重叠群（Contig）。对获得的Contig利用NCBI中的BLISA工具搜索,发现所有Contig都与荆门蜱病毒（Jingmen tick virus,JMTV）的核酸序列相似性最高,在65%-84%之间。暂将该新病毒命名为新疆蜱病毒（Xinjiang tick virus,XJTV）。选取454高通量测序的3组阳性样本,利用Vero细胞对XJTV进行病毒培养和分离,细胞传至第7代后,仅在第一代培养细胞的上清中检测到有XJTV的核酸片段,同时对第一代细胞的上清及细胞制备切片进行电镜观察,发现在细胞与上清中存在90nm左右的病毒粒子。通过RT-PCR对XJTV在乌苏地区蜱中的流行情况进行检测。结果表明,2014年乌苏地区的68组草原革蜱中,检测到XJTV阳性组数54组,其阳性率达79.4%。说明草原革蜱为XJTV的媒介之一,该病毒可能在乌苏地区的蜱中广泛分布。3.新疆蜱携带XJTV基因组序列信息分析与克隆454高通量测序的Contig与JMTV基因序列比对后发现只有部分S1与S3的信息,利用获得的基因序列设计引物进行RT-PCR得到了该病毒的S1与S3全序列信息。对采自新疆羊沟地区的一份阳性样本经RNA-Seq技术（上海伯豪公司）分析获得了S2与S4的部分序列信息,通过设计特异性引物用RT-PCR的方法获得了该病毒的S2与S4全序列信息。利用RT-PCR和重叠RT-PCR的方法分别将结构蛋白S1,S2,S3与S4全基因序列克隆到p GEM-Teasy载体中,这为更好地保存病毒的基因组信息,以及对该病毒分子特性和相关基因功能等性质的研究提供了基础。4.XJTV非结构蛋白和结构蛋白的生物信息学分析利用相关生物学软件Signa IP 4.1、TMHMM、Net NGlyc1.0 Serve、Phrye、MEGA5与DNAStar等对XJTV编码的非结构蛋白（NSP1与NSP2）和结构蛋白（VP1、VP2和VP3）进行了分析。在二级结构中XJTV与黄病毒科的代表株在非结构蛋白的功能区域的motif保守性较高。利用已经解析蛋白晶体结构的登革热病毒（DENV-4）和日本脑炎病毒（JEV）作为模板模拟出XJTV的S1与S3编码蛋白的三维结构。结果发现XJTV基于二级结构保守的motif在空间位置上也与模板蛋白的motif一一对应,提示这些保守结构在病毒的生命周期中可能行使着相同的生物学功能。对结构蛋白VP1、VP2与VP3的跨膜区域、信号肽与糖基化位点进行分析预测,结果表明结构蛋白VP1、VP2与VP3分别具有病毒的包膜蛋白、衣壳蛋白和膜蛋白的功能。基于XJTV的S1与S3编码的非结构蛋白构建的系统发育进化树分析结果显示,与选择的黄病毒科的部分代表毒株相比,XJTV不属于黄病毒科已有的三个属,而与JMTV和MGTV位于进化树单独的分支中。提示XJTV可能是黄病毒科一个新的属中的毒株。5.XJTV衣壳蛋白重组表达质粒的构建及其兔多克隆抗体的制备将XJTV与JMTV编码结构蛋白的基因序列进行比较后,选取相对保守的衣壳蛋白（Capsid protein）ORF片段序列,将其构建到原核表达载体p ET28a与p ET32a中,同时构建至真核表达载体pc DNA3.1中,通过序列测定,结果表明成功获得了三种表达质粒p ET28a-CP,p ET32a-CP和pc DNA3.1-CP。将p ET28a-CP质粒转染大肠杆菌中表达纯化获得重组蛋白,用纯化的重组蛋白免疫新西兰白兔制备抗体,经检测所获得的抗体效价达1:100000以上,通过western blot检测证实了该抗体与抗原有很好的结合亲和性。构建的原核表达质粒及制备的抗体可为后续开展病毒血清学检测及XJTV的免疫学特性研究工作提供了条件。将构建的真核表达载体p CDNA3.1-CP转染入293T细胞,经IFA检测,表明VP2基因编码的衣壳蛋白在该细胞中成功表达,这为后续病毒的包装以及对哺乳动物的侵染机制研究提供了基础。
吕恒,钟璟浩,张锦海,王平,王长军[4]（2016）在《新型布尼亚病毒环介导等温扩增可视化检测方法的建立》文中进行了进一步梳理目的应用环介导等温扩增（LAMP）技术建立新型布尼亚病毒（SFTSV）可视化快速检测方法。方法针对新型布尼亚病毒的S片段基因设计LAMP引物建立LAMP方法。反应体系内加入染料羟基萘酚蓝（HNB）作为反应扩增指示剂,根据LAMP浊度仪扩增结果优化反应条件,根据HNB颜色变化进行结果判定,评估LAMP方法的特异性和灵敏性。结果建立的LAMP方法最低检出限为10拷贝/反应管;方法的特异性高,仅SFTSV反应管颜色由紫罗兰变为天蓝色,而汉坦病毒、新疆出血热、Q热、马尔堡、埃博拉病毒及阴性对照反应管均未发生变色反应;LAMP反应的最佳温度为63℃,其扩增效率高于常规PCR,试验过程仅需30min。结论建立的可视化SFTSV LAMP检测方法具有特异性强,灵敏性高,实验设备要求简单等优点,可用于SFTSV的快速检测。
曹佳媛,田明尧,崔卓栋,柴丹,范园园,赵飞,张艳芳,金宁一[5]（2016）在《三种出血热病毒的荧光基因芯片检测方法的建立》文中认为为建立可同时检测新疆出血热病毒（CCHFV）、裂谷热病毒（RVFV）、拉沙病毒（LSV）的荧光基因芯片,分别针对CCHFV和RVFV的S基因、LSV的NP基因,应用生物学软件设计了3对引物与6条探针。运用多重PCR扩增和标记目的片段,将其与基因芯片杂交,最后扫描分析结果。分别对杂交温度与杂交时间进行条件优化,最后对基因芯片的特异性、敏感性和重复性进行评估。结果显示,设计的所有探针都可以与目的片段特异性杂交,探针1a与1b可检测到CCHFV,探针2a与2b可检测到RVFV,探针3a与3b可检测到LSV。相比多重PCR,荧光基因芯片检测CCHFV的灵敏度提高了10倍,检测RVFV的灵敏度提高了100倍,检测LSV的灵敏度提高了100倍。结果表明,本试验建立的同时检测3种出血热病毒的荧光基因芯片检测方法特异性高、敏感性强,可用于这3种病毒的快速检测与甄别。
俞欢,汪梅芳,张渝疆,彭倩,寇春,达尔肯·托肯,李阳,李轶杰,孙素荣[6]（2015）在《新疆出血热病毒截短糖蛋白的原核表达及抗体制备》文中认为目的原核表达纯化新疆出血热病毒79121毒株糖蛋白截短片段（Gn、Gc1和Gc2）并分别制备其多克隆抗体。方法采用反转录PCR的方法克隆79121毒株Gn、Gc1及Gc2基因片段,并将其构建到原核表达载体pET-28a（+）中,转化到E.coli BL21（DE3）中进行诱导表达,经镍柱亲和层析法纯化Gn-His、Gc1-His及Gc2-His融合蛋白,SDS-PAGE分析蛋白相对分子质量（Mr）。用纯化蛋白免疫新西兰白兔制备抗血清,ELISA和Western blot法检测血清效价和特异性。结果双酶切鉴定和测序证实构建的pET-28a-Gn、pET-28a-Gc1和pET-28a-Gc2重组表达载体正确,表达的融合蛋白Gn-His、Gc1-His和Gc2-His其Mr分别约为25×103、33×103和34×103。ELISA法检测抗体效价分别为1:25 600、1:6400及1:25 600。Western blot结果表明兔多克隆抗体均能特异性识别相应的重组蛋白。结论新疆出血热病毒截短糖蛋白的表达纯化和效价高、特异性好的兔抗血清的制备,为新疆出血热病毒的检测和糖蛋白生物学功能的深入研究提供资料。
孙素荣,郝建梅,雒涛,王启果,张渝疆[7]（2014）在《塔里木河流域新疆出血热自然疫源地生态系统多样性与出血热流行相关性分析（Ⅱ）》文中研究表明目的了解并掌握塔里木河流域新疆出血热自然疫源地生态系统主要宿主和媒介的群落构成,及其与新疆出血热流行的相关性。方法根据塔里木河流域地理环境特征,在上、中、下游3个区段设立调查研究样方,采集家畜、啮齿动物和蜱类样本,采用生态学方法分析不同生态景观下宿主和媒介的群落结构组成和特征,检测蜱类样本的新疆出血热病毒携带率和家畜抗体携带率,统计分析流行病学的相关性。结果塔里木河流域新疆出血热自然疫源地啮齿动物和蜱类群落组成简单,啮齿动物7种,以子午沙鼠为主,占73.6%,蜱类3种,以亚洲璃眼蜱为主,占98.4%以上;不同地理生态景观上,干旱、半干旱的沙质盐碱地是亚洲璃眼蜱和啮齿动物分布的最优生态景观;空间分布上,亚洲璃眼蜱在优生景观中的数量由上游至下游逐步增加的变化趋势一致,游离蜱指数分别为37.0、44.7和64.7;塔里木河流域上、中、下游3个区段羊血清抗新疆出血热病毒抗体阳性率由13.2%增加至43.1%,自然界中亚洲璃眼蜱病毒分离率由零增加至6.9%,亚洲璃眼蜱指数和羊血清CCHFV（克里米亚-刚果出血热病毒）阳性率呈正相关（r=0.992）。结论塔里木河流域新疆出血热自然疫源地呈现丰富的多样性,其自然界新疆出血热流行强度与疫源地宿主媒介及植被构成的丰富度密切相关,可因自然界中亚洲璃眼蜱指数的不同分为不同的流行区。
王晓宏[8]（2012）在《脑炎/脑膜炎及出血热病原体多重PCR-Mass ARRAY检测技术的建立》文中认为人类文明的进步并未阻止传染病的肆虐,进入二十一世纪,传染病的防治仍是人类必须面对的巨大挑战。对传染病病原学的研究始终是一项具有重大意义的任务。近年来,生物学技术的迅速发展也使得传染病病原体的检测与鉴定技术得到飞速发展,每一项技术的革新对生命科学领域来说都是一次跨越。目前,众多分子生物学方法已成功应用于病原体检测中,如PCR技术、基因芯片技术、分子杂交技术等。相对于传统检测技术而言,新一代分子生物学技术具有操作简单、耗时短、检测效率高等特点,但是也存在相应的不足,如何避免这些不足并开发新技术已成为目前科研工作者的首要任务。在本研究中,我们将最初用于基因分型、突变位点检测、耐药位点分析等方面的多重PCR-Mass ARRAY技术应用于传染病病原体的高通量检测中,以15种可引起脑炎/脑膜炎症状的病原体以及16种可引起病毒性出血热的病毒为研究对象,建立脑炎/脑膜炎以及出血热病毒的多重PCR-Mass ARRAY检测技术,实现此类病原体的多重、高通量、高特异性以及高灵敏度检测,服务于流行病学调查研究以及传染病病原体大规模筛查与鉴定。实验方法：针对拟检测病原体,使用生物信息学方法对待检病原体的基因组序列进行分析,确定各病原体的保守序列；以保守序列为参考序列,设计PCR-Mass ARRAY的扩增引物组合和延伸引物组合（每种病原体包括一对扩增引物和一条延伸引物）；使用无菌双蒸水、正常人基因组DNA以及人工重组质粒对引物体系的特异性以及可重复性进行验证；使用梯度稀释的质粒对该体系的灵敏度进行测定。在优化并建立了脑炎/脑膜炎以及出血热病毒的多重PCR-Mass ARRAY检测技术体系之后,使用6种脑炎培养病毒以及14份脑炎症状的临床标本对该体系的实际检测效果进行评价。同时,使用实时荧光定量PCR技术、Sanger测序法对同批样本进行平行检测,以评价多重PCR-Mass ARRAY技术的灵敏度以及准确性。结果与结论：（1）建立的脑炎/脑膜炎病原体多重PCR-Mass ARRAY检测技术具有很高的特异性,最终确定的检测体系不出现假阳性和非特异延伸；对梯度稀释后的重组质粒进行多重PCR-Mass ARRAY检测,确定各质粒的检测灵敏度,脑炎/脑膜炎病原体质粒的灵敏度范围为100copies/μl—10000copies/μl,且只有两种病原体的灵敏度为10000copies/μl;6种脑炎纯病毒的检测结果显示各病毒cDNA均可检出,没有假阳性,Sanger测序结果与多重PCR-Mass ARRAY的检测结果一致；对14份脑炎症状的临床样本多重PCR-Mass ARRAY检测结果显示,有3份样本检测到流行性乙型脑炎（JEV）,其余样本各种病原体检测均为阴性。使用荧光定量PCR法对同批样本进行平行检测,检出两份JEV,这两份样本的PCR-Mass ARRAY结果也为JEV阳性,应用Sanger测序法对3份阳性样本进行鉴定,证实3份样本均为JEV阳性,证明PCR-Mass ARRAY技术的灵敏度高于荧光定量PCR技术。（2）建立的16种出血热病毒多重PCR-Mass ARRAY检测技术同样具有很好的特异性与可重复性；分别使用梯度稀释的出血热病毒重组质粒对该技术的灵敏度进行测试,测试结果显示质粒的灵敏度范围为10copies/μl—100copies/μl,大部分质粒灵敏度为100copies/μl,证明所建立的出血热病毒多重PCR-Mass ARRAY技术具有很高的灵敏度。上述实验结果表明：多重PCR-Mass ARRAY在脑炎／脑膜炎病原体以及出血热病毒的检测中具有良好的特异性与可重复性,并具有比较高的灵敏度与准确度。因此,该技术适合应用于流行病学调查研究与传染病病原体的大规模筛查中。
苏锦坤,师永霞,郑夔,李小波,黄吉城,相大鹏,幸芦琴,郭波旋[9]（2012）在《新疆出血热病毒的实时荧光RT-PCR检测方法研究》文中研究表明目的:建立新疆出血热病毒的实时荧光RT-PCR检测方法。方法:分析新疆出血热病毒核酸S片段序列的保守性,设计新疆出血热病毒实时荧光RT-PCR引物和探针。以体外转录后的RNA作为阳性对照模板,摸索出实时荧光RT-PCR检测的最佳引物浓度、探针浓度和反应体系条件,并进行灵敏度和特异性分析。结果:建立的新疆出血热病毒的实时荧光RT-PCR检测方法最佳反应体系为:正向引物CCHFV-FP终浓度250 nM,反向引物CCHFV-RP终浓度500 nM,探针CCHFV-Probe终浓度500 nM;扩增程序为:50℃10 min,95℃10 min;95℃5 s,57℃20 s 45次循环。该方法最低检测限约为2 copies病毒/反应,与森林脑炎病毒和汉坦病毒无交叉反应。结论:该方法灵敏度高、特异性强,适用于新疆出血热病毒的快速检测。
李冰,木合塔,王启果,王信惠,阿布力克木,孟卫卫,戴翔,张渝疆[10]（2011）在《药物驱蜱对新疆出血热流行抑制作用的现场实验研究》文中进行了进一步梳理目的探讨药物驱蜱对新疆出血热（XHF）在家畜中流行的抑制效果。方法采用药物驱蜱方式对塔里木盆地疫区内的羊群进行对比实验研究。结果实验组羔羊在服用驱蜱药物阿维菌素后,羔羊体外寄生蜱的染蜱率为55.0%,蜱指数为1.0,而未服用阿维菌素的对照组感染率为100%,蜱指数为11.2,实验组羔羊体外寄生蜱的感染率和蜱指数分别较对照组低45%和10.2;实验6个月后,实验组克里米亚-刚果出血热病毒（CCHFV）抗体阳性率为22.4%,显着低于对照组（45.9%）,与实验组在实验前的CCHFV抗体阳性率（23.7%）基本一致。结论 XHF流行地区羔羊服用驱蜱药物阿维菌素可阻碍蜱类对羔羊的侵袭,抑制XHF在羔羊中的流行。
二、新疆出血热病毒的实验室诊断方法（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、新疆出血热病毒的实验室诊断方法（论文提纲范文）
（1）出血热相关病毒核酸检测技术研究（论文提纲范文）
| 英文缩略词表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 1. 引言 |
| 1.1 登革病毒 |
| 1.2 基孔肯雅病毒 |
| 1.3 寨卡病毒 |
| 1.4 黄热病毒 |
| 1.5 汉坦病毒 |
| 1.6 发热伴血小板减少综合征病毒 |
| 1.7 沙粒病毒 |
| 1.8 克里米亚刚果出血热病毒 |
| 1.9 裂谷热病毒 |
| 1.10 马尔堡病毒 |
| 1.11 埃博拉病毒 |
| 1.12 鄂木斯克出血热病毒和科萨努尔森林病病毒 |
| 1.13 中东呼吸道综合征冠状病毒 |
| 1.14 蜱传脑炎病毒 |
| 2. 实验材料 |
| 2.1 病毒基因 |
| 2.2 主要试剂与耗材 |
| 2.3 主要仪器设备 |
| 2.4 缓冲液配方 |
| 3. 实验方法 |
| 3.1 技术路线 |
| 3.2 引物探针的设计 |
| 3.3 标准品的制备和稀释 |
| 3.4 荧光定量RT-PCR实验及标准曲线的绘制 |
| 3.5 Tem-PCR |
| 3.6 微球与捕获探针的偶联 |
| 3.7 Luminex TM 200仪器的校准 |
| 3.8 Tem-PCR产物的检测 |
| 4. 结果 |
| 4.1 按地区分组实时荧光定量PCR结果 |
| 4.2 按地区分组液相芯片方法检测结果 |
| 5. 讨论 |
| 5.1 实时荧光定量PCR |
| 5.2 液相芯片检测技术 |
| 6. 小结 |
| 参考文献 |
| 附录1: DENV-CHIKV病毒样颗粒的制备及免疫原性研究 |
| 1. 引言 |
| 2. 实验材料 |
| 2.1 实验动物 |
| 2.2 病毒毒株、细胞株 |
| 2.3. 抗体和抗原 |
| 2.4. 主要试剂及耗材 |
| 2.5. 溶液配方 |
| 2.6 实验仪器 |
| 3. 实验方法 |
| 3.1 重组杆状病毒适宜扩增条件的选取及扩增 |
| 3.2. 病毒样颗粒的制备 |
| 3.3. 抗原的鉴定 |
| 3.4 动物实验 |
| 3.5 免疫实验及滴度的确定 |
| 4. 结果 |
| 4.1 DENV-CHIK VLPs重组杆状病毒的制备与核酸鉴定 |
| 4.2 DENV-CHIK VLPs重组杆状病毒制备条件与鉴定 |
| 4.3 DENV-CHIK VLPs的制备与鉴定 |
| 4.4 IgG抗体水平 |
| 5. 讨论 |
| 6. 小结 |
| 参考文献 |
| 附录2: 建立检测方法的检测限和特异性汇总 |
| 结论 |
| 致谢 |
（2）内蒙古西部地区蜱传克里米亚刚果出血热病毒基因组和分子流行病学研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词 |
| 第一章 克里米亚刚果出血热病毒分子生物学的研究进展 |
| 1.1 克里米亚刚果出血热的简介 |
| 1.2 流行病学和生态学 |
| 1.3 克里米亚刚果出血热病毒的分子生物学研究 |
| 1.4 病毒的传播媒介 |
| 1.5 病毒的理化性质 |
| 1.6 克里米亚刚果出血热病毒的亲缘关系与地理分布 |
| 1.7 诊断、治疗和疫苗 |
| 1.8 国内的研究进展及本研究的意义 |
| 第二章 内蒙古西部地区蜱虫病毒宏基因组学研究 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 克里米亚刚果出血热病毒全基因组研究 |
| 3.1 材料 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 克里米亚刚果出血热病毒血清学研究 |
| 4.1 材料 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附表 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（3）新疆准噶尔盆地周边地区蜱与鼠类携带虫媒病毒的调查研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1 新疆地区虫媒病毒调查研究状况 |
| 1.1 新疆主要虫媒病毒 |
| 1.2 新疆虫媒病毒研究的发展与展望 |
| 2 黄病毒研究进展 |
| 2.1 基因组及复制周期 |
| 2.2 黄病毒的检测方法 |
| 2.3 黄病毒属主要诊断抗原的研究进展 |
| 2.4 黄病毒的流行情况 |
| 3 研究的目的及意义 |
| 参考文献 |
| 第二章 新疆地区啮齿动物（鼠）携带虫媒病毒的分子生物学初步检测及分离 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 采集时间与采集地点 |
| 1.2.2 采集方法 |
| 1.2.3 样品研磨 |
| 1.2.4 RNA的提取 |
| 1.2.5 cDNA的制备 |
| 1.2.6 引物设计与合成 |
| 1.2.7 PCR |
| 1.2.8 病毒的分离与检测 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 新疆蜱中新病毒的发现、分离及蜱中分子流行病学调查 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 采集时间与采集地点 |
| 1.2.3 样本研磨 |
| 1.2.4 RNA的提取 |
| 1.2.5 cDNA的合成 |
| 1.2.6 454高通量测序检测样本的准备 |
| 1.2.7 PCR检测 |
| 1.2.8 组织细胞培养法分离病毒 |
| 1.2.9 电镜观察 |
| 2 结果 |
| 2.1 捕蜱数量及种类 |
| 2.2 454高通测序结果 |
| 2.3 蜱样本分毒结果 |
| 2.4 电镜观察实验 |
| 2.5 蜱样本中XJTV的流行病学调查 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 新疆蜱携带XJTV基因组序列信息分析与克隆 |
| 前言 |
| 1 材料及方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 454高通量测序序列分析与拼接 |
| 1.2.2 RNA-seq高通测序序列分析与拼接 |
| 1.2.3 XJTV序列的 5'与 3'两端序列信息的获取 |
| 1.2.4 XJTV每节段中的片段克隆到pGEM-Teasy |
| 1.2.5 XJTV每节段全长克隆至pGEM-Teasy载体中 |
| 1.2.6 序列的拼接及分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 454高通量测序结果分析 |
| 2.2 RNA-seq高通量测序结果分析 |
| 2.3 XJTV全序列信息的克隆 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第五章 XJTV序列的生物信息学分析 |
| 前言 |
| 1 方法 |
| 1.1 基因序列选取 |
| 1.2 二级结构预测 |
| 1.3 三级结构预测 |
| 1.4 系统发育进化分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 XJTV二级结构分析结果 |
| 2.1.1 糖基化位点分析 |
| 2.1.2 信号肽分析 |
| 2.1.3 跨膜区域 |
| 2.1.4 黄病毒科保守的模体分析 |
| 2.2 非结构蛋白三级结构预测 |
| 2.3 NS3与NS5的进化分析 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第六章 XJTV的CP蛋白基因原核与真核载体构建及抗体制备 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 CP蛋白基因引物的设计、合成与PCR反应 |
| 1.2.2 重组表达载体的构建 |
| 1.2.3 CP蛋白的原核表达 |
| 1.2.4 真核质粒转染实验 |
| 1.2.5 重组CP蛋白的大量诱导及纯化 |
| 1.2.6 重组CP蛋白兔多克隆抗体的制备 |
| 1.2.7 Western Blotting分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 CP蛋白基因原核与真核质粒构建结果 |
| 2.2 重组CP蛋白基因原核表达结果 |
| 2.3 重组CP基因在真核细胞中表达结果 |
| 2.4 Western Blotting检测抗重组CP蛋白的兔多克隆抗体 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 结论与展望 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（4）新型布尼亚病毒环介导等温扩增可视化检测方法的建立（论文提纲范文）
| 材料与方法 |
| 1 材料 |
| 1.1 试剂和仪器 |
| 1.2 菌毒株 |
| 2 方法 |
| 2.1 引物设计与合成 |
| 2.2 模板制备 |
| 2.3 LAMP优化反条件 |
| 2.3.1 HNB浓度选择 |
| 2.3.2 反应体系配制与温度优化 |
| 2.4 方法的特异性验证 |
| 2.5 方法灵敏性验证 |
| 结果 |
| 1显色指示剂HNB最佳浓度的确定 |
| 2最佳反应温度 |
| 3 试验的特异性 |
| 4 试验的灵敏性 |
| 讨论 |
（5）三种出血热病毒的荧光基因芯片检测方法的建立（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 质粒、病毒和主要试剂 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 引物、探针的设计与合成 |
| 1.4 基因芯片的制备 |
| 1.5 多重PCR体系的建立 |
| 1.6 基因芯片的杂交与结果扫描 |
| 1.7 基因芯片检测方法的优化 |
| 1.7.1最佳杂交时间的筛选 |
| 1.7.2最佳杂交温度的筛选 |
| 1.8 基因芯片特异性检测 |
| 1.9 基因芯片敏感性检测 |
| 1.10 基因芯片重复性检测 |
| 2 结果 |
| 2.1 三种病毒的多重PCR扩增 |
| 2.2 三种质粒与基因芯片杂交的扫描 |
| 2.3 杂交时间与杂交温度的优化 |
| 2.3.1杂交时间的优化 |
| 2.3.2杂交温度的优化 |
| 2.4 基因芯片特异性检测 |
| 2.5 基因芯片灵敏性检测 |
| 2.6 基因芯片重复性检测 |
| 3 讨论 |
（7）塔里木河流域新疆出血热自然疫源地生态系统多样性与出血热流行相关性分析（Ⅱ）（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 研究区域 |
| 1.2 数据采集和处理 |
| 2 结果 |
| 2.1 蜱类和啮齿动物群落组成 |
| 2.2 不同区域XHF流行的差异性 |
| 2.3 出血热流行强度与地理环境和蜱指数关系 |
| 3 讨论 |
（8）脑炎/脑膜炎及出血热病原体多重PCR-Mass ARRAY检测技术的建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1. 引言 |
| 1.1 脑炎/脑膜炎病原体简介 |
| 1.1.1 虫媒性脑炎/脑膜炎病毒 |
| 1.1.2 脑炎/脑膜炎细菌 |
| 1.2 病毒性出血热病原体简介 |
| 1.2.1 拉沙热病毒(lassa fever virus.Lassa) |
| 1.2.2 胡宁病毒(junin virus.Junin) |
| 1.2.3 马秋波病毒(machupo virus.Machupo) |
| 1.2.4 汉坦病毒(hanta virus.Hanta) |
| 1.2.5 新疆出血热病毒(crimeancongo hemorrhagic fever virus.CCHFV) |
| 1.2.6 马尔堡病毒(marburg virus.Marburg) |
| 1.2.7 埃博拉病毒(ebola virus.Ebola) |
| 1.2.8 登革病毒(dengue virus.DENV) |
| 1.2.9 裂谷热病毒(rift valley fever virus.RVFV) |
| 1.2.10 肺综合征出血热病毒(sin nombre virus.SNV) |
| 1.2.11 黄热病毒(yellow fever virus.YFV) |
| 1.3 病原体检测技术 |
| 1.3.1 传统生物学技术 |
| 1.3.2 现代分子生物学技术 |
| 1.4 多重PCR-Mass ARRAY简介 |
| 1.4.1 MALDI TOF MS |
| 1.4.2 Mass ARRAY |
| 1.4.3 iPLEX基因型分析法的工作原理 |
| 1.4.4 多重PCR-Mass ARRAY的优势及应用 |
| 1.5 研究内容与意义 |
| 2. 膜炎/脑膜炎病原体多重PCR-Mass ARRAY检测技术的建立 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 样本 |
| 2.1.2 试剂 |
| 2.1.3 设备与耗材 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 脑膜炎病原体保守序列分析与筛选 |
| 2.2.2 内参基因的选择 |
| 2.2.3 引物的设计、配制与测试 |
| 2.2.4 质粒构建及验证 |
| 2.2.5 病毒培养液的预处理 |
| 2.2.6 临床标本的预处理 |
| 2.3 多重PCR-Mass ARRAY检测技术的建立 |
| 2.3.1 前PCR扩增 |
| 2.3.2 SAP消化 |
| 2.3.3 iPLEX延伸反应 |
| 2.3.4 树脂纯化 |
| 2.3.5 质谱检测 |
| 2.4 多重PCR-Mass ARRAY检测技术的特异性与灵敏度 |
| 2.4.1 峰图判读分析 |
| 2.4.2 特异性结果分析 |
| 2.4.3 灵敏度结果分析 |
| 2.4.4 重复性结果分析 |
| 2.5 病毒培养物的检测步骤与结果分析 |
| 2.5.1 纯病毒标本多重PCR-Mass ARRAY实验标准流程 |
| 2.5.2 纯病毒标本多重PCR-Mass ARRAY实验结果分析 |
| 2.6 临床标本检测步骤与结果分析 |
| 2.6.1 脑炎临床标本cDNA多重PCR-Mass ARRAY实验标准流程 |
| 2.6.2 临床标本多重PCR-Mass ARRAY实验结果分析 |
| 2.7 小结 |
| 2.7.1 特异性 |
| 2.7.2 灵敏度 |
| 2.7.3 实用性 |
| 3. 出血热病原体多重PCR-Mass ARRAY检测技术的建立 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 出血热病毒质粒标准品 |
| 3.1.2 试剂 |
| 3.1.3 设备与耗材 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 出血热病毒保守序列分析、筛选以及内参基因的选择 |
| 3.2.2 引物设计及测试 |
| 3.2.3 构建重组质粒 |
| 3.2.4 方法特异性、灵敏度及重复性验证 |
| 3.3 出血热病毒多重PCR-Mass ARRAY检测技术的建立 |
| 3.3.1 前PCR扩增 |
| 3.3.2 SAP消化 |
| 3.3.3 iPLEX延伸反应 |
| 3.3.4 树脂纯化 |
| 3.3.5 质谱检测 |
| 3.4 实验结果分析 |
| 3.4.1 特异性结果分析 |
| 3.4.2 出血热病毒重组质粒灵敏度结果分析 |
| 3.4.3 体系重复性结果分析 |
| 3.5 小结 |
| 3.5.1 特异性 |
| 3.5.2 灵敏度 |
| 3.5.3 可重复性 |
| 4. 讨论与结论 |
| 4.1 讨论 |
| 4.1.1 病原体保守序列选择的关键点 |
| 4.1.2 引物设计的关键点 |
| 4.1.3 实验结果的判定 |
| 4.2 结论 |
| 4.2.1 脑炎/脑膜炎病原体多重PCR-Mass ARRAY检测 |
| 4.2.2 出血热病原体多重PCR-Mass ARRAY检测 |
| 4.2.3 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间科研成果 |
（9）新疆出血热病毒的实时荧光RT-PCR检测方法研究（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试剂与仪器 |
| 1.2 引物、探针的设计与合成 |
| 1.3 阳性对照RNA模板拷贝数 |
| 1.4 扩增条件的建立 |
| 1.5 最佳引物浓度的确定 |
| 1.6 最佳探针浓度的确定 |
| 1.7 检测灵敏度试验 |
| 1.8 重复性试验 |
| 1.9 特异性试验 |
| 2 结果 |
| 2.1 检测条件优化结果 |
| 2.1.1 最佳扩增程序的确定 |
| 2.1.2 最佳引物浓度的确定 |
| 2.1.3 最佳探针浓度的确定 |
| 2.2 检测灵敏度试验 |
| 2.3 重复性试验 |
| 2.4 特异性试验 |
| 3 讨论 |
（10）药物驱蜱对新疆出血热流行抑制作用的现场实验研究（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 现场实验地区和对象 |
| 1.2 驱蜱药物 |
| 1.4 XHF抗体检测 |
| 1.5 数据处理 |
| 2 结果 |
| 2.1 山羊体表寄生蜱 |
| 2.2 山羊XHF感染 |
| 3 讨论 |
四、新疆出血热病毒的实验室诊断方法（论文参考文献）
- [1]出血热相关病毒核酸检测技术研究[D]. 闫芳域. 中国疾病预防控制中心, 2018(05)
- [2]内蒙古西部地区蜱传克里米亚刚果出血热病毒基因组和分子流行病学研究[D]. 刘东晓. 宁夏大学, 2017(02)
- [3]新疆准噶尔盆地周边地区蜱与鼠类携带虫媒病毒的调查研究[D]. 寇春. 新疆大学, 2016(06)
- [4]新型布尼亚病毒环介导等温扩增可视化检测方法的建立[J]. 吕恒,钟璟浩,张锦海,王平,王长军. 中国病原生物学杂志, 2016(03)
- [5]三种出血热病毒的荧光基因芯片检测方法的建立[J]. 曹佳媛,田明尧,崔卓栋,柴丹,范园园,赵飞,张艳芳,金宁一. 中国兽医科学, 2016(01)
- [6]新疆出血热病毒截短糖蛋白的原核表达及抗体制备[J]. 俞欢,汪梅芳,张渝疆,彭倩,寇春,达尔肯·托肯,李阳,李轶杰,孙素荣. 中华微生物学和免疫学杂志, 2015(05)
- [7]塔里木河流域新疆出血热自然疫源地生态系统多样性与出血热流行相关性分析（Ⅱ）[J]. 孙素荣,郝建梅,雒涛,王启果,张渝疆. 疾病预防控制通报, 2014(02)
- [8]脑炎/脑膜炎及出血热病原体多重PCR-Mass ARRAY检测技术的建立[D]. 王晓宏. 陕西师范大学, 2012(02)
- [9]新疆出血热病毒的实时荧光RT-PCR检测方法研究[J]. 苏锦坤,师永霞,郑夔,李小波,黄吉城,相大鹏,幸芦琴,郭波旋. 中国卫生检验杂志, 2012(05)
- [10]药物驱蜱对新疆出血热流行抑制作用的现场实验研究[J]. 李冰,木合塔,王启果,王信惠,阿布力克木,孟卫卫,戴翔,张渝疆. 中国媒介生物学及控制杂志, 2011(01)