细胞外ATP防治去神经肌萎缩的实验研究

一、细胞外ATP防治失神经肌肉萎缩的实验研究（论文文献综述）

吕桃桃^[1]（2020）在《利用RNA-Seq技术探究三法三穴对坐骨神经损伤大鼠的修复机制》文中认为[目的]通过行为学探究三法三穴对坐骨神经损伤（sciatic nerve injury,SNI）大鼠恢复的疗效,基于形态学观察三法三穴对SNI大鼠超微结构的影响,利用RNA-Seq技术探究三法三穴对SNI大鼠的神经传导通路关键部位即神经损伤点、背根神经节（dorsal root ganglion,DRG）、脊髓背角、脊髓腹角和腓肠肌的基因表达情况,从转录组水平阐明推拿对周围神经损伤的恢复机制。[方法]将SD大鼠随机分为假手术组、模型组和三法三穴组。假手术组暴露大鼠右侧坐骨神经,不做夹持。模型组通过建立右侧坐骨神经钳夹损伤模型,造成大鼠坐骨神经挤压损伤。造模7 d后,每日利用“按摩推拿手法模拟仪”（专利号:ZL 2007 1 0187403.1）对三法三穴组大鼠术侧殷门穴、承山穴、阳陵泉穴依次定量施以点法、拨法、揉法刺激1次,每法、每穴刺激1 min,每只大鼠干预9 min/d（1 min/穴/法×3法×3穴）。治疗10次休息1 d,共治疗20次。具体方法如下:1.行为学通过坐骨神经功能指数（sciatic functionalindex,SFI）评价大鼠后肢精细运动情况;斜板试验评价大鼠后肢肌力变化;累积疼痛评分评价大鼠的痛觉功能改变。探究三法三穴干预对SNI大鼠的感觉与运动功能的影响,阐明推拿促进周围神经损伤恢复的疗效。2.采用透射电镜观察大鼠神经损伤点、脊髓腹角、腓肠肌的超微结构,为三法三穴促进SNI大鼠功能恢复提供形态学依据。3.利用RNA-Seq技术检测三法三穴对SNI大鼠神经传导通路关键部位即神经损伤点、DRG、脊髓背角、脊髓腹角和腓肠肌的基因表达影响,并进行GO功能和KEGG通路等生物信息学分析,阐明推拿促进损伤神经修复的分子机制。4.从初级神经元DRG的测序结果中筛选出参与神经元突触调节、感觉神经元调节的关键差异表达基因Pdzd2、Camk2a、Mdk、C1q13、Klf7,并利用Real Time-PCR进行验证,进一步阐明推拿对周围神经损伤后疼痛功能障碍的调控机制。[结果]1.行为学结果1.1 SFI结果与基线比较,干预0次（术后7 d）模型组和三法三穴组大鼠的SFI数值明显降低;与模型组比较,干预10次后三法三穴组大鼠SFI数值升高（P<0.05）;与模型组比较,干预15次、20次后三法三穴组SFI数值显着升高（P<0.01）。1.2 斜板试验结果与假手术组比较,干预0次（术后7 d）、5次模型组和三法三穴组斜板角度显着降低（P<0.01）,模型组和三法三穴组间无统计学差异。与模型组比较,干预10次三法三穴组斜板角度开始升高（P<0.05）。与模型组比较,干预15次、20次三法三穴组斜板角度明显增加（P<0.01）,但与假手术组相比仍有显着性差异（P<0.01）。1.3 累积疼痛评分结果基线期各组大鼠累计疼痛评分一致且均为0。推拿干预0次,模型组和三法三穴组大鼠累积疼痛评分较假手术组升高（P<0.05）;干预10次和20次后,三法三穴组大鼠累积疼痛评分较模型组明显改善（P<0.05）,但与假手术组相比仍有一定差距（P<0.05）。2.透射电镜结果2.1 神经损伤点电镜结果假手术组髓鞘结构完整,排列整齐且无萎缩;与假手术组相比,模型组髓鞘完整性破坏,崩脱严重甚至形成髓鞘球,伴轴索萎缩及线粒体变性;三法三穴干预可改善神经损伤点超微结构,三法三穴组神经纤维髓鞘保留较完整,轴索无明显肿胀或萎缩,但无空泡状线粒体。2.2 脊髓腹角电镜结果假手术组脊髓腹角神经元超微结构基本正常;与假手术组相比,模型组脊髓腹角运动神经元受损严重,核仁、染色质、线粒体固缩,核膜凹凸不平;与模型组相比,三法三穴组脊髓腹角神经元受损减轻,染色质深染明显减轻,核膜较光滑、完整,线粒体等细胞器较完整,无明显固缩及肿胀。2.3 腓肠肌电镜结果假手术组肌球蛋白丝排列整齐,A带、I带、Z线、M线等典型结构明显;与假手术组相比,模型组肌丝排列紊乱及A带、I带、Z线、M线消失,肌束萎缩严重,卫星细胞坏死、凋亡,线粒体失活;三法三穴组肌丝排列有序,可清晰观察到Z线、M线,卫星细胞坏死数量明显减少,线粒体结构相对完整。3.RNA-Seq 结果将OD260/280值介于1.8-2.2,RIN评分>8的样本建库并测序。测序结果如下:3.1 神经损伤点测序结果模型组与三法三穴组的221个差异表达基因的GO功能富集在多细胞组织过程的调控、病毒防御反应、对外界刺激的反应、免疫系统过程、对生物刺激的反应、防御反应等;KEGG通路分析显示与信号转导通路、免疫系统通路、内分泌系统通路、细胞增长和凋亡通路相关。GO功能富集在横纹肌细胞分化的调控、肌肉细胞分化的调控、成肌细胞分化的调控、肌管分化的调控、横纹肌收缩、肌肉器官发育、收缩纤维部分等,与肌细胞调控相关的生物学过程。3.2 DRG测序结果三组差异表达基因共计369个;差异表达GO功能包括生物调节过程、对刺激的反应、生物过程的积极调节、参与化学突触传递的突触前过程、运动、生长、分子传感器活性等;KEGG通路富集在Wnt信号通路、IL-17信号通路、MAPK信号通路等。3.3 脊髓背角测序结果三法三穴组与模型组比较有61个差异表达基因;差异基因的GO功能富集在信号调节、突触部分、信号转导调控、细胞分化调控等;KEGG通路富集在MAPK信号通路、VEGF信号通路、AMPK信号通路等。3.4 脊髓腹角测序结果三组差异表达基因共217个;差异表达基因的GO功能与细胞过程、对刺激的反应、免疫系统过程、生物过程的负调节等相关;KEGG通路分析与免疫系统、癌症、信号转导等通路密切相关。3.5 腓肠肌测序结果三组差异表达基因的GO功能包括细胞过程单有机体过程、代谢过程、生物调控、对刺激的反应、多细胞组织过程、生物过程的正向调节等;KEGG通路富集在细胞因子-细胞因子-受体相互作用、AMPK信号通路等。4.Real Time-PCR 结果与假手术组比较,模型组DRG中差异表达基因Pdzd2、Camk2a、Mdk、Clq13、Klf7的基因表达量增加,三法三穴干预可使损伤大鼠DRG中这些基因表达降低,表达趋势与RNA-Seq获得的结果一致。[结论]1.推拿可以促进SNI大鼠的精细运动、后肢肌力及疼痛功能的恢复,改善周围神经损伤后的感觉和运动功能障碍。2.推拿可保护SNI大鼠髓鞘完整性、恢复脊髓腹角运动神经元结构以及重建腓肠肌肌丝结构,发挥对损伤神经的形态学恢复作用。3.推拿促进SNI大鼠恢复,是通过调控大鼠神经损伤点、DRG、脊髓背角、脊髓腹角和腓肠肌的基因表达实现的,其过程可涉及多个生物学过程及信号通路。4.推拿对神经损伤大鼠的修复,可能是通过降低DRG中的Pdzd2、Camk2a、Mdk、Clq13、Klf7等基因表达,促进SNI大鼠的轴突再生、感觉和运动功能的恢复。这些基因可能成为推拿促进周围神经损伤修复的重要治疗靶点。

段斐,张华,吴越,姚振威,王静^[2]（2017）在《失神经骨骼肌萎缩的研究现状及进展》文中研究表明当今骨科领域,周围神经损伤一直影响着患者疗效。肌萎缩的发生,细胞凋亡导致骨骼肌萎缩,神经-肌肉接头处营养因子的代谢发生障碍,肌卫星细胞的减少,生长因子以及线粒体和各种酶的变化都是失神经骨骼肌萎缩的机制。电刺激法,保护神经元,生长因子,神经植入提高神经再生速度以及被动活动可以有效治疗患者。失神经骨骼肌萎缩的研究进展也趋于完善。

赵文勇^[3]（2013）在《间充质祖细胞源性神经元样细胞体内移植延缓骨骼肌萎缩的实验研究》文中进行了进一步梳理外周神经损伤后骨骼肌发生严重萎缩抑或损伤神经修复后肌肉功能难以恢复的患者在临床上较为常见,并且治疗相当困难。深入阐明失神经性骨骼肌萎缩的机理，有效地延缓或防治其萎缩，最大程度地维持骨骼肌原有功能，是近年来研究的重点和亟待解决的难题。显微外科技术的广泛应用尽管能提高外周神经损伤的修复水平，但术后骨骼肌功能恢复并不十分理想，其根源在于周围神经损伤后，运动神经再生非常缓慢，当受损神经通过再植或重新长入所支配的靶肌肉时，长时间失神经支配所致的肌肉不可逆变化（如肌肉萎缩、纤维化等）使骨骼肌无法恢复正常功能。为防治失神经性骨骼肌萎缩，国内外学者采取了许多方法，包括功能性电刺激、被动运动、药物疗法、神经元植入、生长因子治疗、基因治疗等，尽管实验研究均取得了一定成功，但临床应用的疗效却有限。干细胞（stem cell，SC）是一类具有自我增殖能力与多向分化潜能的细胞,既能产生基因型与自己完全相同的子代细胞,也能分化为祖细胞，具有再生为各种组织、器官的潜能,故医学界称其为“万用细胞”。研究表明，成体干细胞（adult stem cells，ASCs）在自然条件下通常倾向于分化为所属组织的各种细胞类型，主要用于替换衰老死亡的细胞和维持机体新陈代谢的相对稳定，但在特定的外界诱导条件下，一种组织的成体干细胞可以“横向分化”为其他组织的功能细胞，参与组织的损伤修复。此外，成体干细胞还可取自于患者的自身组织,通过定向诱导分化后重新植入患者体内避免了免疫排斥的问题。正是由于成体干细胞具有可塑性、旺盛的自我增殖能力及多向分化潜能，且疾病或损伤均能刺激成体干细胞的增殖和分化，因此一些学者认为成体干细胞对于各种神经系统损伤将是一种重要的治疗措施，并具有广阔的应用前景。近年来，一些学者将神经干细胞（neural stem cells，NSCs）及间充质干细胞（Mesenchymal stem cells,MSCs）移植于离断的外周神经或直接注入靶肌肉内并有效延缓了失神经性骨骼肌萎缩，动物实验确实获得了成功，但由于足量的神经干细胞获得途径相对有限且扩增困难，体外培养的小鼠间充质干细胞又极易遭受到造血干细胞的污染而使其增殖效果不理想，寻找新的移植细胞尤为迫切。新近研究发现，间充质祖细胞（mesenchymal progenitor cell,MPCs）可体外定向诱导分化为神经元样细胞，同时间充质祖细胞具有易获取、易生长、增殖能力强等特点，且来源于密质骨，体外培养时可避免造血干细胞的污染，故有望成为神经干细胞及间充质干细胞的替代种子细胞。因此，本课题拟培养GFP转基因C57小鼠密质骨碎片来源MPCS，体外定向诱导分化为神经元样细胞后进行神经断离处移植或直接注入靶肌肉内，初步探讨移植细胞体内原位定植存活情况以及延缓骨骼肌萎缩的作用与机制，为进一步探明其分子机制、后期临床应用提供理论指导和实验依据，同时也为法医物证学的个体识别方法、神经损伤后鉴定时限及其损伤程度的把握提供了新的思路。本研究内容主要包括两部分：第一部分：间充质祖细胞源性神经元样细胞肌内移植后自身特性的维持。目的：体外培养绿色荧光蛋白转基因C57小鼠密质骨碎片来源的间充质祖细胞，通过体外定向诱导分化为神经元及神经胶质样细胞后移植于神经断离处及直接注入靶肌肉中，探讨肌内移植后能否定植存活并维持其移植前的特性。方法：取3周龄健康GFP转基因C57小鼠后肢长骨进行MPCs培养，利用流式细胞术及成骨、成脂定向诱导分化检测其纯度及多向分化潜能。选取生长良好的第三代MPCs，神经元原代培养上清液进行神经元及神经胶质样细胞诱导分化后，采用免疫荧光染色检测神经元特异性标志物NSE、NeuN及神经胶质特异性标志物GFAP的表达情况并收集细胞，用生理盐水调整细胞浓度至5×105/μl细胞悬液备用；选取12周龄健康C57小鼠24只，按随机数字表法分为神经断离处+MPC移植组、神经断离处+生理盐水组、肌肉+MPC移植组、肌肉+生理盐水组，其中上述各组小鼠右后肢作为实验侧，左后肢为假手术侧。参照文献操作方法，4组小鼠右后肢均切断坐骨神经建立小鼠失神经腓肠肌萎缩模型，左后肢仅分离坐骨神经但不做切断处理。神经断离处+MPC移植组和肌肉+MPC移植组：右侧坐骨神经切断处、右侧腓肠肌内及左侧对应部位分别注入5μl MPCs悬液；神经断离处+生理盐水组和肌肉+生理盐水组：右侧坐骨神经切断处、右侧腓肠肌内及左侧对应部位均注入5μl生理盐水。术后4周，荧光显微镜下观察肌内移植细胞存活情况，并采用免疫荧光染色检测移植细胞神经元特异性标志物NSE、NeuN及神经胶质特异性标志物GFAP的表达情况。结果：1、通过小鼠密质骨培养获得的MPCs主要表达间质细胞免疫表型CD29、CD44、CD90、CD106，不表达造血干细胞免疫表型CD31和CD45，且在体外能够诱导分化为骨细胞及脂肪细胞，提示通过小鼠密质骨培养获得的MPCs是细胞同源性好、纯度高、排除了造血干细胞干扰且具有多向分化潜能的成体干细胞。2、MPCs经神经元原代培养上清液诱导24h后，大部分细胞阳性表达NSE、NeuN，少数细胞阳性表达GFAP，而对照组未见确切阳性表达细胞，提示MPCs经体外定向诱导分化后具备神经元或神经胶质的某些特性。3、术后4周，荧光显微镜下观察发现移植细胞均匀分布于肌细胞间隙；免疫荧光检测发现，神经断离处+MPC移植组和肌肉+MPC移植组右后肢注射部位周围肌肉组织中大部分移植细胞阳性表达NSE、NeuN，少量细胞阳性表达GFAP，而左侧对应部位肌肉组织以及另外两组均未见明显阳性细胞表达，提示MPCs源性神经元样细胞移植于神经断离处及失神经支配靶肌中能够定植存活并很好地维持其移植前特性。结论：1、成功培养出生长良好、纯度高且具有多向分化潜能的MPCs细胞。2、MPCs体外可定向诱导分化为神经元及神经胶质样细胞。3、MPCs源性神经元样细胞肌内移植后能够在原位定植存活并很好地维持其移植前特性。第二部分：间充质祖细胞源性神经元样细胞体内移植延缓骨骼肌萎缩的研究目的：初步探讨间充质祖细胞源性神经元样细胞移植于神经断离处和靶肌肉中延缓失神经性骨骼肌萎缩作用及其机制。方法：取GFP转基因C57小鼠后肢长骨进行MPCs培养及鉴定，选取生长良好的第三代MPCs，采用神经元原代培养上清液进行神经元及神经胶质样细胞诱导分化后收集细胞，生理盐水调整细胞浓度至5×105/μl细胞悬液备用。选取C57小鼠48只，随机分为对照组、神经断离组、神经断离处移植组、肌肉移植组，每组12只。参照文献操作方法，建立小鼠失神经腓肠肌萎缩模型，其中对照组不做任何处理。神经断离处移植组和肌肉移植组分别于坐骨神经断离处、腓肠肌内注入5μl MPCs悬液，神经断离组于腓肠肌内注入等量生理盐水，对照组不作任何处理。观察小鼠后肢活动能力，术后2和4周测量腓肠肌湿重、肌纤维横截面积维持率及观察超微结构，用Western blot检测α-actin、MHC及RT-PCR检测Myogenin、MyoD的表达情况。结果：1、术后2和4周，神经断离处移植组和肌肉移植组腓肠肌湿重及肌纤维横截面积维持率显着高于神经断离组，提示两种治疗方法均可有效延缓失神经性骨骼肌萎缩，其中神经断离处移植组治疗效果更显着。2、术后4周，神经断离处移植组和肌肉移植组肌细胞核、线粒体、内质网的退变及肌肉纤维化程度明显低于神经断离组，且部分细胞表现出旺盛的增殖活性的特点（细胞核内移，核增大，核仁明显，异染色质发达、线粒体数量增多等），表明两种治疗方法均可有效抑制失神经性骨骼肌纤维化；3、术后4周，Western blot检测发现，神经断离处移植组和肌肉移植组腓肠肌内α-actin及MHC的表达程度均显着高于神经断离组和对照组，表明两种治疗方法既可有效抑制失神经性骨骼肌蛋白质的降解，又能够促进蛋白质的加快合成。4、术后4周，RT-PCR检测发现，神经断离处移植组和肌肉移植组腓肠肌内Myogenin及MyoD的基因表达丰度显着高于神经断离组和对照组，其中以MyoD的高表达更为显着。结论：1、MPCs源性神经元样细胞移植于神经断离处及靶肌肉内均可有效延缓失神经性骨骼肌萎缩及肌肉纤维化的发生，其中以神经断离处细胞移植的疗效更为显着；2、MPCs源性神经元样细胞移植于神经断离处及靶肌肉内均可有效抑制失神经支配靶肌肉蛋白质的降解；3、初步得出MPCs源性神经元样细胞移植于神经断离处及靶肌肉内延缓失神经性骨骼肌萎缩的机制。

彭春辉,梁炳生,王鹏飞,王红兵,任晋华^[4]（2012）在《细胞外三磷腺苷对失神经大鼠腓肠肌细胞中FoxO3 a通路的影响》文中进行了进一步梳理目的探讨细胞外三磷腺苷（ATP）对失神经大鼠腓肠肌细胞中FoxO3a/MAFbx通路的影响。方法雌性成年Wistar大鼠54只随机分为3组:失神经对照组,ATP治疗组,健康对照组。其中失神经对照组和ATP治疗组在右侧梨状肌下缘切断坐骨神经,制作失神经动物模型。术后ATP治疗组于右侧腓肠肌内注射ATP0.1 mg/d,左侧腓肠肌内注射等量生理盐水;失神经对照组双下肢注射等量的生理盐水;健康对照组不做任何处理。在术后0、2、7、14、28 d分别处死一组大鼠,取其两侧腓肠肌,称肌湿重,计算肌失重比（右侧/左侧）,采用实时荧光定量PCR和Western Blot检测大鼠腓肠肌FoxO3a和MAFbx的mRNA和蛋白表达水平以及253位磷酸化的FoxOSa（p-FoxO3a）蛋白表达。结果 ATP治疗组肌湿重比高于失神经对照组,差异有统计学意义（P<0.01）;ATP治疗组FoxO3a的mRNA和蛋白表达略低于失神经对照组,差异无统计学意义（P>0.05）;MAFbx的mRNA和蛋白表达低于失神经对照组,差异有统计学意义（P<0.05）;p-FoxO3a的蛋白表达量较对照组明显增加,不同时段差异均有统计学意义（P<0.05）。结论细胞外ATP可能通过磷酸化FoxO3a进而抑制MAFbx蛋白的表达来延缓大鼠骨骼肌失神经萎缩。

彭春辉^[5]（2012）在《细胞外ATP对失神经大鼠腓肠肌细胞中FoXO3a通路的影响》文中指出目的:探讨细胞外ATP对失神经大鼠腓肠肌细胞中FoXO3a/MAFbX通路的影响。方法：雌性成年Wistar大鼠54只随机分三组，ATP治疗组和失神经对照组在右侧梨状肌下缘切断坐骨神经，制作失神经动物模型。术后ATP治疗组于右侧腓肠肌内注射ATP 0. 1mg/ d，左侧腓肠肌内注射等量生理盐水；失神经对照组双下肢注射等量的生理盐水，正常对照组（0天）不做任何处理。在术后0，2，7，14，28天分别处死一组大鼠取其两侧腓肠肌,称肌湿重,计算肌失重比（右侧∕左侧），采用年实时荧光定量PCR和Western Blotting检测大鼠腓肠肌FoxO3a、MAFbx的mRNA和蛋白表达水平以及253位磷酸化的FoxO3a（p-FoxO3aS253）蛋白表达。结果:ATP治疗组肌湿重比高于失神经对照组，差异具有统计学意义（p＜0.01）。ATP治疗组FoxO3amRNA和蛋白表达略低于失神经照组，差异无统计学意义（p＞0.05）。MAFbxmRNA和蛋白表达低于失神经对照组，差异有统计学意义（p＜0.05）。p-FoxO3a蛋白表达量较对照组明显增加，不同时段差异均具有统计学意义（p＜0.05）。结论：细胞外ATP可能通过磷酸化FoxO3a进而抑制MAFbX蛋白的表达来延缓去神经性大鼠肌萎缩。

庞涛^[6]（2012）在《应用端侧吻合方法防治失神经肌肉萎缩的实验研究》文中进行了进一步梳理目的：探讨应用端侧吻合方法防治失神经肌肉萎缩的作用，为临床治疗提供实验依据。方法：选用SD雌性大鼠作为研究对象，共32只，分为四组，每组8只。A组：将右侧腓总神经切断后，于相邻胫神经干上行外膜“开窗”，将腓总神经远侧断端以端侧吻合的方式吻合于胫神经干上。B组：将一神经移植段的两端分别与正常胫神经干和切断腓总神经远端行外膜“开窗”端侧吻合。C组：将右侧腓总神经切断后，两断端均结扎并翻转吻合于临近肌肉上。D组：正常对照组：大鼠右侧腓总神经不做任何处理。术后12周行神经肌肉形态学检查，胫前肌肌纤维横截面积，肌湿重及神经电生理检测，评价端侧吻合方法对失神经肌肉萎缩的防治作用。结果：①神经肌肉形态学检查：A,B,D三组均可见再生的轴突和髓鞘，并且见正常肌肉形态结构，C组神经远断端纤维化并且肌纤维萎缩变细。②胫前肌肌纤维横截面积：A,B两组间差异无显着性（P>0.05）,C组与A,B,D三组比较，差异有显着意义（P<0.05）③胫前肌肌湿重：A,B两组较D组稍轻，统计学上有显着差异（P<0.01），C组与A,B,D三组比较，差异有显着意义（P<0.01）④神经传导速度比较：C组测不出运动神经传导速度，A,B两组运动神经传导速度慢于D组，A,B两组间运动神经传导速度比较，无统计学意义（P>0.05）,A,B两组与D组比较，差异有统计学意义（P<0.01）.。结论：端侧吻合法为防治肌肉失神经萎缩的有效方法，但其再生神经对肌肉支配功能不足以代替原支配神经。

周岚^[7]（2011）在《补气活血法防治失神经肌萎缩的机理研究》文中进行了进一步梳理目的通过观察补阳还五汤对损伤神经及其靶肌形态与功能的影响,并应用基因芯片技术寻找补阳还五汤防治失神经肌萎缩的分子靶点,探讨补气活血法防治失神经肌萎缩的生物学作用及其机理,为中医药防治失神经肌萎缩提供新的科学资料。方法1补气活血法防治失神经肌萎缩的理论探讨系统地整理古代有关痿证文献及现代中医学家对痿证的研究；探讨失神经肌萎缩的现代医学研究概况及补气活血法的防治机理；并收集近年来有关补阳还五汤的文献资料：包括组方、配伍、及其现代药理研究。2补阳还五汤延缓大鼠胫前肌失神经肌萎缩的实验研究SPF级雄性SD大鼠60只,随机分为6组：BYHWD高、中、低剂量组（剂量分别为25.92、12.96、6.48g生药/kg）、弥可保组（剂量为625μg/kg）、模型组、假手术组。采用大鼠腓总神经5mm夹伤模型,每日灌胃给药。术后18天行足迹实验测定展趾功能；应用电生理学技术测定神经传导速度与复合肌动作电位振幅；应用光电镜技术从形态学上测定再生有髓神经纤维数、髓鞘厚度、胫前肌截面积与湿重比；观察补阳还五汤给药后大鼠腓总神经再生与功能恢复情况及其对胫前肌失神经肌萎缩的防治作用。3补阳还五汤延缓大鼠胫前肌失神经肌萎缩的的分子机制研究SPF级雄性SD大鼠随机分为补阳还五汤高剂量组与模型组,每组10只动物。模型建立与术后给药同上。术后第7、18天取材进行芯片研究。并用实时荧光定量PCR验证部分差异表达基因,以期找出补阳还五汤对失神经肌萎缩起保护作用的可能分子靶点。结果1.失神经肌萎缩属于祖国医学的“痿证”范畴,病性为本虚标实。元气大伤为本,血脉瘀阻为标；元气大伤、血脉瘀阻是失神经肌萎缩发病的主要病理机制；补气活血是其主要治法。补阳还五汤是补气活血法的代表方剂,用以治疗本病,切合病机。2.展趾功能：各组大鼠TSF值均随术后时间的推移逐渐增加,与第3天的展趾功能比较,模型组、中、低剂量组从第15天开始出现显着性差异（P<0.05或P<0.01）,而高剂量组与弥可保组第9天开始就出现显着性差异（P<0.05或P<0.01）。另外,术后12天开始BYHWD高剂量组、弥可保组TSF均显着高于模型组（P<0.05或P<0.01）；术后15天及18天,BYHWD高、中剂量组、弥可保组TSF与模型组比较有显着性差异（P<0.05或P<0.01）。3.大鼠术侧腓总神经近、远侧端CMAP波幅：与假手术组相比,其余各组波幅均明显降低（P<0.01）；而与模型组比较,BYHWD高、中剂量组和弥可保组波幅均显着增高（P<0.01）。4.腓总神经传导速度：与假手术组相比,其余各组神经传导速度均明显降低（P<0.01）；而与模型组相比,BYHWD中、高剂量组和弥可保组均显着增高（P<0.05或P<0.01）。5.胫前肌形态学观察：假手术组胫前肌横切面可见肌纤维截面积较大,形态较规则,且很少见到结缔组织；模型组与假手术组相比截面积明显减少,且表现为大小不一,形态不规则,肌纤维结构紊乱,细胞间隙明显增宽,结缔组织明显增生,肌纤维明显萎缩变性；BYHWD各组和弥可保组与假手术组相比截面积有所减小,细胞间隙增宽,肌纤维轻度萎缩变性,但形态较规则,结构尚清晰、染色较均一,结缔组织增生不明显。6.胫前肌湿重比：与假手术组相比,各组动物术侧胫前肌湿重比皆不同程度的降低（P<0.01）；而与模型组相比,BYHWD中、高剂量组和弥可保组均显着增高（P<0.05或P<0.01）。7.胫前肌横截面积：与假手术组相比,各组动物术侧胫前肌横截面积皆不同程度的减小（P<0.01）；与模型组相比,BYHWD各组和弥可保组明显增加（P<0.01）；弥可保组与BYHWD高剂量组相比差异有显着性（P<0.05）。8.运动终板：术后18天,大鼠胫前肌运动终板乙酰胆碱酯酶染色后观察,可见假手术组运动终板为棕黑色,纵切面上其形状为椭圆形或圆形,着色均匀。弥可保组与BYHWD高剂量组仅表现为运动终板边缘不如假手术组光滑；BYHWD中、低剂量组与模型组的运动终板表现为数量逐渐减少,形态逐渐不规则,边缘逐渐不光滑；终板内部着色也逐渐变浅。9.神经轴突NF免疫荧光组织化学染色观察：假手术组神经轴突排列密集,分布整齐；模型组轴突密度明显低于假手术组,且排列紊乱；而BYHWD组和弥可保组轴突密度较模型组高,分布也较整齐。其中,补阳还五汤高剂量组和弥可保组的再生神经轴突较多,而中、低剂量组的再生神经较少。10.电镜形态学观察：假手术组有髓神经纤维成熟。髓鞘厚。排列致密；BYHWD各组和弥可保组可见较成熟的、排列较致密的有髓纤维,髓鞘较厚；而模型组有髓神经纤维排列稀疏紊乱,髓鞘较薄,成熟度欠佳,尚可见较为明显的退变现象。11.有髓神经纤维计数、髓鞘厚度：与假手术组相比,模型组、BYHWD各组、弥可保组大鼠术侧腓总神经夹伤远端再生有髓神经纤维计数、髓鞘厚度明显降低（P<0.01）；与模型组比较,BYHWD高、中剂量组和弥可保组显着增高（P<0.01）。12.芯片结果：BYHWD作用胫前肌第7天,芯片分析结果表明BYHWD高剂量组与模型组相比,基因表达谱有显着差异,其中4条基因表达上调,3条基因下调。而BYHWD作用胫前肌18天后,差异表达基因中16条基因上调,13条基因下调。差异表达基因中变化最明显的是Angpt14,大约上调15倍,它与血管新生密切相关；其次就是Pik3c2g,它可活化Akt后参与多种信号转导而发挥广泛的生物学效应。这些差异表达基因具有的生物学功能可分为直接和间接延缓肌萎缩两大类。其中促进肌肉蛋白合成,抑制其分解,能直接延缓失神经肌萎缩的功能有：促进蛋白质合成,细胞周期调控,抗凋亡,抑制泛素化途径,促进肌细胞增殖与分化。而通过其他机制间接延缓失神经肌萎缩的功能有：血管重塑,血管新生,改善微循环,神经保护,胶原合成,能量合成增加,抗氧化损伤。以上功能按出现频率由多至少依次排列为：能量合成增加（8次）、血管新生（5次）、抗凋亡（5次）、抗氧化（4次）、神经保护（4次）；其他功能相对较少。另外,还有一些差异表达基因功能不明,或者目前还不能确定是否具有保护失神经肌萎缩的作用,有待进一步的深入研究。13. qRT-PCR检测Angpt14与Pik3c2g基因在补阳还五汤高剂量组与模型组的差异表达,结果与芯片结果一致,说明芯片结果可靠。结论1.补阳还五汤对大鼠胫前肌失神经肌萎缩有较好的直接防治作用；并有利于轴突生长和髓鞘形成,通过促进大鼠夹伤神经再生与功能恢复,间接延缓失神经肌萎缩的发生。2.补阳还五汤对失神经肌萎缩的保护作用与它对多种相关基因的调控有关。其机理可能通过大补元气,活血化瘀促进能量合成与血管新生、抑制细胞凋亡、抗氧化、保护神经等方面来防治失神经肌萎缩的发生,其机制有待进一步的研究。3.补阳还五汤还可能通过大补元气激活PI3K/Akt信号通路促进蛋白质合成、减少蛋白降解、促进血管新生、肌卫星细胞的增殖与分化、细胞周期调控等多种生理功能来延缓失神经肌萎缩的发生。4.补气活血法是是防治失神经肌萎缩的有效方法,它可能是通过调控基因表达来实现其保护作用。

曾维铨^[8]（2010）在《腓总神经卡压的解剖与修复方法的实验研究》文中提出【目的】1.研究腓总神经损伤后应用端侧吻合法是否有防治失神经性肌肉萎缩的作用。2.研究腓总神经的易卡压部位。【方法】1.64只成年健康SD大鼠随机分成两组,失神经组（A组）:单纯剪断腓总神经,造成胫前肌失神经支配的动物模型;神经端侧吻合组（B组）:剪断腓总神经后,将远端与已开窗的胫神经作端侧吻合,即将腓总神经远端吻合到胫神经开窗处,将腓总神经近端吻合到股外侧的肌肉内。术后2、4、6、8周观察后肢运动功能的变化和胫前肌的萎缩情况,并行胫前肌肌肉纤颤电位或再生电位检测,测量胫前肌肌肉湿重及肌纤维截面积和胫前肌的Na+-K+-ATP酶活性。饲养三个月左右观察后肢运动功能的变化和胫前肌的萎缩和神经功能恢复情况,测量肌肉湿重、肌肉截面积以及酶的活性,比较神经吻合后两组的神经功能情况。2.行18例成人尸体的解剖,从腘窝至小腿外侧,经腓骨小头下方做“S”形切口,切开皮肤、皮下组织,小心分离,观察并测量腓骨肌管内腓总神经与骨膜贴合的长度;观测腓骨肌管区腓总神经走行情况、神经分支特点以及与周围结构的关系。观测腓骨长肌纤维弓的性质及进口、出口距腓骨小头的距离;腓总神经在外侧沟起始部与腓骨肌管部的横径;腓浅、腓深神经分叉部位。【结果】1.失神经组随着失神经时间延长,肌肉萎缩程度逐渐加重,足底发生溃疡,趾甲发生脱落,纤颤电位波幅逐渐下降,肌肉湿重、肌纤维截面积和酶的活性均逐渐下降;端侧吻合术组随着神经吻合修复时间的延长,肌肉几乎未发生萎缩,足底未发生溃疡及趾甲的脱落,肌肉湿重、肌纤维截面积、酶活性未发生明显变化,虽不及正常组,但明显高于发生肌肉萎缩的失神经组。2.实验动物手术后三个月,神经端侧吻合术组在肌肉大体形态上或行为学功能恢复均优于失神经组,其电生理、肌肉湿重、肌肉截面积和酶活性等方面都较失神经组佳,有显着性差别。3.腓骨肌管内腓总神经呈弧形并与腓骨骨膜紧密相贴,长度为25.78±2.6mm。腓骨肌管入口为少量腘筋膜与腓骨肌起始部,均为腱性筋膜样组织,距腓骨头尖的距离为13.9±1.9mm。出口为腱性者占13.3%,肌性者占8.5%,混合性者占78.2%,距腓骨头的距离为35.1±2.8mm。拱长/管长（即入口至出口）为27.1±2.3mm。腓骨肌管部腓骨长肌纤维拱的性质,全腱性者占7.6%,混合性者占89.4%,全肌性者占3.0%。前者为4.2±0.8mm,后者为6.4±0.4mm,腓总神经在腓骨肌管处分为腓浅神经与腓深神经,其分叉点与腓骨头尖的距离为2.14±0.30cm,在腓浅、深神经分叉点处横径为6.5±0.4mm。【结论】1.神经端侧吻合法可以尽快恢复骨骼肌的神经营养,有效预防失神经性肌肉的萎缩。2.神经端侧吻合法可以明显提高神经恢复的可能性,促进腓总神经功能恢复。3.混合性或腱性的腓骨长肌拱形结构,形成相对较致密隧道的腓骨肌管与腘窝外侧沟是造成腓总神经卡压、损伤的重要原因。

姜晓琪^[9]（2010）在《人体失神经支配肌肉萎缩程度与临床可修复时限的研究》文中研究指明目的：研究人体骨骼肌失神经支配后,肌萎缩、肌纤维化程度与失神经支配时间的关系,寻找一种安全,无创,准确性高的检测手段,为临床开展晚期神经修复时限的选择提供理论依据。方法：48例不同时限臂丛神经损伤患者的肱二头肌标本按神经损伤时限分为6组：0-3个月（10例）、3-6个月（18例）、6-12个月（8例）、1-2年（8例）、大于2年组（8例）。对照组为正常肱二头肌（8例）。对患者肱二头肌进行EMG,B超, MRI检测,以病理结果为金标准,评价EMG,B超, MRI检测肌萎缩程度的准确性。结果：随着肱二头肌失神经时限的延长,肌纤维逐渐萎缩,肌肉截面积减小,纤维及脂肪组织逐渐增多,随着时间的推移,EMG表现为病理性纤颤波及正尖波的峰值逐渐下降、时程逐渐延长,2年后病理性纤颤波及正尖波的峰值及时程下降更明显,直至呈一直线,B超显示失神经2年后,肱二头肌内可见大量强回声影,但仍可见残存正常肌肉组织回声,肱二头肌截面积为正常对照组的24%,MRI的T1WI、T2WI象及IR——FSE序列显示,失神经3年后仍可见残留肌纤维,但肱二头肌截面积为正常对照组的27%,结果与病例检查结果相符。结论：失神经支配肌肉在在EMG中表现为出现病理性纤颤波及正尖波,但随着时间的推移,如果神经未得到及时修复,其峰值及时程进一步下降,B超和MRI显示：患侧肱二头肌随着失神经支配时间的延长,纤维组织逐渐增多,肌肉横截面积逐渐减少,分别至正常对侧的24%和27%,在病理检查中表现为肌细胞浆丢失及面积减小,胶原纤维的增生。病理检查结果显示,失神经2年内肌细胞截面积和肌肉/胶原截面积比率下降最为明显,提示失神经2年内是肌肉萎缩,纤维化最严重时期,失神经2年以后肌肉萎缩,纤维化明显减缓,但失神经2年后仍残留肌纤维截面积为正常对照组的36%。病理、EMG、B超及MRI,提示失神经2年内进行神经修复可能是阻止肌肉萎缩,纤维化的最佳时期,但失神经2年后作神经修复仍有其肌肉形态学的基础。

刘傲霜^[10]（2008）在《中药熏洗促进大鼠失神经支配骨骼肌损伤修复的实验研究》文中提出目的研究熏洗一号方促进失神经支配骨骼肌损伤修复的机理。方法120只雄性SD大鼠,随机取90只大鼠造模成功后,随机分为熏洗一号方组、丹参组和模型组,剩余30只设为空白对照组,不做处理。各组实验动物分别在术后7天、14天和21天处死,股直肌肌腹组织块取材,常规HE染色,分别观察失神经支配后骨骼肌结构,乙酰胆碱酯酶活性,NGF、bFGF免疫组织化学染色和骨骼肌匀浆液Na+-K+-ATP酶改变。结果1.HE染色结果:术后7天:失神经早期骨骼肌中绝大多数肌丝肌节排列尚规则,可见到着色变浅。熏洗一号方组,肌纤维未见明显改变,部分肌纤维充血或坏死,但形态完整,有血管内皮充血。丹参组肌纤维水肿,肌纤维排列紊乱。术后14天:熏洗一号方组,肌纤维周围无明显增生的胶原纤维。丹参组肌纤维坏死或变性。模型组肌纤维增生显着,深入肌梭,代替肌肉组织,肌纤维排列紊乱。术后21天:熏洗一号方组,肌纤维排列尚整齐,极少有胶原纤维组织长入肌组织。丹参组肌细胞皱缩,纤维组织增生明显。模型组肌丝排列明显紊乱,大量纤维组织增生。2.乙酰胆碱酯酶活性:术后7天:各组乙酰胆碱酯酶活性较弱,丹参组和模型组与空白对照组相比（P＜0.05）,熏洗一号方组与空白组相比（P＞0.05）。术后14天:熏洗一号方组乙酰胆碱酯酶活性增强,但与空白组相比（P＞0.05）,丹参组分别与模型组和空白对照组相比（P＜0.01）。术后21天:熏洗一号方组乙酰胆碱酯酶活性强,接近于正常,染色均匀,运动终板结构规则,呈椭圆形或卵圆形花纹状结构,与空白组相比（P＞0.05）;模型组和丹参组乙酰胆碱酯酶活性弱,与空白对照组相比（P＜0.01）。3.免疫组织化学染色观察:（1）NGF表达:术后7天:熏洗一号方组,肌梭梭内纤维肌细胞染色阳性,成纤维细胞、血管内皮细胞染色较弱。丹参组肌梭肌细胞染色弱阳性。模型组肌梭变小,未见明显染色。术后14天:熏洗一号方组,增生的胶原纤维染色阳性,血管内皮细胞染色阳性,肌梭未见明显染色。丹参组丹参组成纤维细胞染色阳性。模型组肌梭萎缩,肌细胞染色阴性。术后21天:熏洗一号方组,增生的胶原纤维组织染色弱阳性。丹参组纤维组织未见染色。（2）bFGF表达:术后7天:熏洗一号方组肌细胞和成纤维细胞染色阳性。丹参组成纤维细胞染色阳性。模型组成纤维细胞染色阳性。术后14天:熏洗一号方组骨骼肌基底膜染色强阳性,成纤维细胞染色阳性,肌梭内有少量肌细胞染色阳性。丹参组核肌梭内成纤维细胞染色阳性。模型组肌梭内细胞染色很浅。术后21天:熏洗一号方组肌梭肌细胞染色阳性,神经末梢处成纤维细胞染色强阳性。丹参组血管内皮细胞有散在阳性细胞。模型组未见染色,肌纤维边缘不规则相对大于正常。4.骨骼肌匀浆液Na+-K+-ATP结果:术后7天各组Na+-K+-ATP酶组间比较没有统计学意义（P＞0.05）。术后14天熏洗一号方组与空白对照组对比（P＜0.05）。术后21天,熏洗一号方组与空白对照组对比（P＜0.01）,且熏洗一号方组Na+-K+-ATP酶含量最高。结论1.失神经支配骨骼肌损伤的修复与NGF和bFGF的变化有关,骨骼肌失去神经营养因子（NGF）的营养发生萎缩。bFGF能促进运动神经纤维的再生,对神经肌肉接头的形成具有重要作用,能促进神经损伤后肌肉功能的恢复。2.熏洗一号方能延缓神经肌肉运动终板（Motor endplate,MEP）与效应器的变性。3.熏洗一号方能改善失神经支配骨骼肌的营养供应、延缓骨骼肌的萎缩。

二、细胞外ATP防治失神经肌肉萎缩的实验研究（论文开题报告）

（1）论文研究背景及目的

此处内容要求：

首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。

写法范例：

本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。

（2）本文研究方法

调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。

观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。

实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。

文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。

实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。

定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。

定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。

跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。

功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。

模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。

三、细胞外ATP防治失神经肌肉萎缩的实验研究（论文提纲范文）

（1）利用RNA-Seq技术探究三法三穴对坐骨神经损伤大鼠的修复机制（论文提纲范文）

（2）失神经骨骼肌萎缩的研究现状及进展（论文提纲范文）

（3）间充质祖细胞源性神经元样细胞体内移植延缓骨骼肌萎缩的实验研究（论文提纲范文）

（5）细胞外ATP对失神经大鼠腓肠肌细胞中FoXO3a通路的影响（论文提纲范文）

（6）应用端侧吻合方法防治失神经肌肉萎缩的实验研究（论文提纲范文）

（7）补气活血法防治失神经肌萎缩的机理研究（论文提纲范文）

（8）腓总神经卡压的解剖与修复方法的实验研究（论文提纲范文）

（9）人体失神经支配肌肉萎缩程度与临床可修复时限的研究（论文提纲范文）

（10）中药熏洗促进大鼠失神经支配骨骼肌损伤修复的实验研究（论文提纲范文）

四、细胞外ATP防治失神经肌肉萎缩的实验研究（论文参考文献）

• [1]利用RNA-Seq技术探究三法三穴对坐骨神经损伤大鼠的修复机制[D]. 吕桃桃. 北京中医药大学, 2020(04)
• [2]失神经骨骼肌萎缩的研究现状及进展[J]. 段斐,张华,吴越,姚振威,王静. 现代生物医学进展, 2017(07)
• [3]间充质祖细胞源性神经元样细胞体内移植延缓骨骼肌萎缩的实验研究[D]. 赵文勇. 重庆医科大学, 2013(03)
• [4]细胞外三磷腺苷对失神经大鼠腓肠肌细胞中FoxO3 a通路的影响[J]. 彭春辉,梁炳生,王鹏飞,王红兵,任晋华. 中华手外科杂志, 2012(03)
• [5]细胞外ATP对失神经大鼠腓肠肌细胞中FoXO3a通路的影响[D]. 彭春辉. 山西医科大学, 2012(09)
• [6]应用端侧吻合方法防治失神经肌肉萎缩的实验研究[D]. 庞涛. 泰山医学院, 2012(07)
• [7]补气活血法防治失神经肌萎缩的机理研究[D]. 周岚. 南京中医药大学, 2011(02)
• [8]腓总神经卡压的解剖与修复方法的实验研究[D]. 曾维铨. 福建医科大学, 2010(01)
• [9]人体失神经支配肌肉萎缩程度与临床可修复时限的研究[D]. 姜晓琪. 复旦大学, 2010(02)
• [10]中药熏洗促进大鼠失神经支配骨骼肌损伤修复的实验研究[D]. 刘傲霜. 湖北中医学院, 2008(10)

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