一、肝细胞癌组织中PTEN和p27蛋白的表达（论文文献综述）
周林,汪京,赵阳,李瀚,杜国盛,史宪杰,贺强,郎韧[1]（2021）在《乏氧诱导因子-1α与肝细胞癌患者预后生存相关性分析》文中指出目的:探讨乏氧诱导因子-1α（hypoxia-inducible factor 1-alpha,HIF-1α）对肝细胞癌患者预后生存的影响。方法:回顾性分析了136例2016年1月至2017年6月在解放军总医院接受肝切除术的患者病例信息。同时以免疫组织化学（immunohistochemistry,IHC）染色检测癌及癌旁组织中HIF-1α、p-Akt、p-mTOR、PTEN与p27,以及糖酵解中LDHA、GLUT-1、VEGF蛋白的表达,分析与肿瘤分化程度的相关性,探讨HIF-1α在肝细胞癌发生中的作用机制;对两组患者的预后生存进行单因素预后分析,以Cox回归模型分析影响肝细胞癌患者预后生存的危险因素。结果:HIF-1α、VEGF、GLUT1、LDHA、p-Akt和p-mTOR在低分化肝细胞肝癌和癌组织中高表达;HIF-1α分别与VEGF、GLUT1、LDHA、p-Akt和p-mTOR呈正相关。同时,高-中分化肝细胞癌患者较低分化肝细胞癌患者有更好的生存优势。Cox回归分析显示,肿瘤分化程度、HIF-1α和Ki-67是影响预后的独立危险因素。结论:HIF-1α是肝细胞癌预后的独立危险因素,低分化肝细胞癌同时伴有HIF-1α高表达和高Ki-67提示预后生存更差。
杨娟[2]（2021）在《Sirt6及其抑制剂OSS＿128167在弥漫大B细胞淋巴瘤中的作用及机制研究》文中认为弥漫大B细胞淋巴瘤（Diffuse Large B-cell Lymphoma,DLBCL）在成人初治非霍金淋巴瘤（non-Hodgkin lymphoma,NHL）中占比最高,具有高度侵袭性和异质性。近几十年来,随着以抗CD20的利妥昔单抗（Rituximab）为代表的新型靶向治疗药物的应用,DLBCL患者的疗效得到了明显改善,然而仍有约30%——40%的DLBCL患者出现初始治疗耐药或完全缓解后早期复发,最终因疾病进展而难以获得长期生存。基于此,亟待临床医生及科研人员探究DLBCL发生发展相关的生物分子异常表达及信号通路异常传导,精准诊疗,进而有效改善患者预后。Sirtuin6（Sirt6）衍生自哺乳动物Sirtuins（Sirts）家族,是高度保守的ADP-核糖基化酶和NAD+依赖性脱酰基酶,涉及广泛的细胞学过程,例如调控衰老,DNA修复,葡萄糖代谢,以及转录调节等。Sirt6作为细胞途径检查点控制器,负责细胞增殖和存活的调节,因而它的异常表达与多种癌症相关。在小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）中,Sirt6敲除导致与癌基因激活无关的肿瘤发生,这表明它可能起抑癌作用。临床样品分析显示,Sirt6在包括直肠癌在内的几种恶性肿瘤中下调,主要通过抑制厌氧糖酵解和共抑制MYC来抑制癌症的发生发展。然而,与之相反的是,Sirt6在乳腺癌,前列腺癌,肝细胞癌和皮肤癌中具有致癌性,敲除Sirt6基因可导致DNA损伤水平增加和对化疗药物的敏感性增强。在血液系统疾病中,Michele Cea.等人报道Sirt6在多发性骨髓瘤（Multiple Myeloma,MM）细胞中高表达,并且与对DNA损伤剂的抗性密切相关,这一作用归因于MAPK/ERK2/p90RSK信号传导抑制。Cagnetta等人报道了急性髓细胞性白血病（Acute myeloid leukemia,AML）细胞中Sirt6 mRNA表达上调相关的生物学相关性,基因组不稳定性和不良预后。在人类AML的体外和鼠异种移植模型中,Sirt6表达的下调会促进基因组不稳定性,增加药物敏感性。如上所述,Sirt6在癌症中发挥双刃剑的作用,是肿瘤治疗的潜在靶点。精准治疗时代,小分子靶向药已取得良好的临床获益,其应用在癌症治疗中愈显重要。OSS＿128167是靶向Sirt6的新型特异性抑制剂,对Sirt6,Sirtl和Sirt2的IC50值分别为89、1578和751μM。它能够渗透细胞膜,在培养的细胞中具有生物学活性,增加H3K9的乙酰化和GLUT-1的表达。鉴于其研发不久,针对它的研究仍处于早期阶段。Michele Cea.等人的研究提示OSS＿128167能够使原代MM细胞以及对阿霉素和美法仑耐药的MM细胞系敏感,增加对化疗反应的敏感性,具有一定的临床应用前景。然而,Sirt6在DLBCL中的作用及其分子机制目前仍不甚清楚,OSS＿128167在DLBCL是否具有调控作用和治疗潜力也有待探究。本研究旨在探讨Sirt6在DLBCL中的表达模式,功能机制和潜在的临床相关性,并进一步研究其靶向小分子抑制剂OSS＿128167在DLBCL中的调控作用,寻找DLBCL诊断治疗的新靶点。第一部分 Sirt6在弥漫大B细胞淋巴瘤中的表达、生物学作用及临床意义目的:弥漫大B细胞淋巴瘤是临床,病理和分子异质性疾病,目前已相应开发出各种临床、病理及分子标志物来表征该疾病。DLBCL患者的治疗是一个活跃的研究领域,使用标准一线治疗的5年总生存率约为60-70%。多达三分之一的DLBCL患者最终对R-CHOP方案产生耐药性,而其余的治疗选择受到限制。针对特定分子发现的精准医疗,靶向药物的发明和免疫疗法为改善DLBCL的治疗打开了新大门。Sirt6的酶促活性多样,可以调节葡萄糖/脂质代谢,DNA修复,转录调控和端粒维护等生物学过程。Sirt6充当细胞途径检查点控制器,并负责细胞增殖和存活的调节。它的异常表达与多种疾病密切相关,如糖尿病、心脏病以及癌症等。在MEF中,Sirt6敲除导致肿瘤发生,而与癌基因的激活无关,这表明该分子可能起抑癌作用。临床样品分析也显示,Sirt6在几种恶性肿瘤（如直肠癌）中下调。相反,据报道,Sirt6在乳腺癌,前列腺癌,肝细胞癌和皮肤癌中具有致癌性。敲除Sirt6导致DNA损伤水平增加,且对化学疗法的敏感性增强。Sirt6在MM细胞中高表达,并且与对DNA破坏剂的抗性密切相关。目前尚无Sirt6在DLBCL中的表达水平和生物学功能的文献报道,因此本部分主要探讨Sirt6在DLBCL中的表达水平,生物学功能和临床意义。材料与方法:1.使用GEO数据分析Sirt6在DLBCL中的表达情况及预后意义;2.DLBCL/反应性淋巴结炎（reactive hyperplasia lymphoid,RHL）病例选择及标本收集;3.免疫组织化学（Immunohistochemistry,IHC）;4.DLBCL细胞培养;5.PBMCs（peripheral blood mononuclear cells,外周血单个核细胞）提取;6.实时荧光定量 PCR（real-time quantitative polymerase chain reaction,qRT-PCR）;7.蛋白质免疫印迹分析（Western Blot,WB）;8.慢病毒载体介导Sirt6基因的敲减及过表达;9.RNA 测序（RNA-sequencing,RNA-seq）检测 shSirt6 与 shControl 组的差异表达基因;10.Cell Counting Kit-8（CCK-8）实验检测细胞增殖;11.Annexin V-PE/7AAD双染法检测细胞凋亡;12.PI检测细胞周期;13.DLBCL异种移植小鼠模型体内检测Sirt6对DLBCL生长的影响;14.统计学分析。结果:1.在GEO数据库中分析Sirt6在DLBCL患者和正常对照中的表达水平,发现Sirt6在DLBCL中的表达水平显着上调（p<0.001）。qPCR和WB结果表明,在DLBCL细胞系（LY1,LY8,LY3,Val）中,Sirt6的mRNA和蛋白水平均高于健康对照细胞。免疫组化染色显示,DLBCL中Sirt6表达显着高于对照组,且Sirt6蛋白表达水平与DLBCL患者的年龄（p=0.009）,Ann Arbor分期（p=0.036）和国际预后指标（IPI,p=0.045）得分呈正相关。2.GEO数据集GSE32918的Kaplan-Meier生存曲线分析表明,DLBCL中Sirt6表达较高患者的总生存时间（Overall survival,OS）相对较短（p=0.0023）。基于免疫组化结果的生存分析亦表明,Sirt6染色阳性的DLBCL患者较染色阴性的DLBCL患者OS缩短（p=0.039）。3.采用 GeneChem 公司构建的 Sirt6 敲减慢病毒（shSirt6#1,shSirt6#2,shSirt6#3）,Sirt6过表达慢病毒（lvSirt6）以及阴性对照慢病毒（shControl）转染DLBCL细胞（LY1,LY8,Val）。3种敲减慢病毒介导的RNA干扰载体在人DLBCL细胞中均显示出敲低作用,其中shSirt6#1敲减效率最高。转染lvSirt6的细胞显示出明显升高的Sirt6表达。与带有空载体的细胞相比,shSirt6组的DLBCL细胞表现出明显的生长抑制作用（p<0.01）,而lvSirt6对细胞的增殖能力没有影响（p>0.05）。在体内实验中,接种稳定转染shSirt6组的小鼠与shControl组相比,皮下肿瘤生长受到明显抑制（p<0.01）,且伴有Sirt6低表达的小鼠DLBCL组织显示出较低的Ki-67阳性率。提示Sirt6对DLBCL细胞增殖发挥了正调控的作用。4.RNA测序分析显示,Sirt6似乎与细胞凋亡、周期,DNA损伤修复（DNA damage response,DDR）密切相关。Annexin V-PE/7AAD 细胞凋亡试验表明,shSirt6促进DLBCL细胞的凋亡。相反,Sirt6过表达抑制细胞凋亡。此外,Sirt6敲减可促进cleaved-PARP的表达增加。PI染色检测细胞周期,结果表明与转染shControl的细胞相比,Sirt6敲减后发生G2/M期细胞阻滞,p27和CDK2的蛋白表达也随之变化。提示Sirt6可以通过加速细胞周期的G2/M期并降低细胞凋亡率来促进DLBCL细胞存活。5.通过细胞毒性试验研究了 Sirt6在对阿霉素和苯达莫司汀的药物反应中的作用。将shSirt6细胞和对照细胞暴露于预定浓度的阿霉素或苯达莫西汀48小时检测细胞增殖,发现联合shSirt6后DLBCL细胞增殖明显减少（p<0.05）。ATM-Chk2和ATR-Chkl信号级联反应调节DDR和细胞周期检查点,我们的蛋白质印迹实验表明,转染shSirt6的细胞中,磷酸化的ATR和磷酸化的Chk1的表达降低,这可能揭示了 Sirt6敲减可以使DLBCL细胞对化疗药物敏感的机制。这些结果与我们RNA测序分析的结果也是一致的。结论:1.Sirt6在DLBCL病理组织中及细胞系中表达水平显着增高,且Sirt6蛋白表达增高与DLBCL患者的疾病进展及较短的OS相关。2.Sirt6促进DLBCL的增殖;3.Sirt6抑制DLBCL的细胞凋亡,促进细胞周期G2/M期进展;4.Sirt6抑制可增强DLBCL对化疗药物的敏感性。第二部分 Sirt6特异性抑制剂OSS＿128167在弥漫大B细胞淋巴瘤中的生物学作用目的:近年来,小分子靶向治疗在癌症治疗,包括恶性血液系统疾病的治疗中已取得良好的临床获益。OSS＿128167是一种Sirt6特异性小分子抑制剂,可渗透细胞膜并在培养的细胞中具有生物活性,能够增加H3K9乙酰化和GLUT-1表达。哈佛大学研究团队发现,OSS＿128167能够增加MM细胞对化疗反应的敏感性,具有一定的临床应用前景。但是,目前针对Sirt6及其抑制剂OSS＿128167的研究仍处于早期阶段,因此我们旨在探究Sirt6抑制剂在DLBCL中是否具有调控作用和治疗潜力。材料与方法:1.DLBCL原代细胞及细胞系培养;2.CCK-8实验检测细胞增殖和药物增敏;3.Annexin V-PE/7AAD双染法检测细胞凋亡;4.PI检测细胞周期;5.DLBCL异种移植小鼠模型体内检测OSS＿128167对DLBCL生长的影响;6.免疫组织化学染色;7.统计学分析。结果:1.不同浓度的OSS＿128167作用于原代DLBLC细胞和DLBCL细胞系（LY1,LY8）24-72小时,与对照组相比,OSS＿128167降低了原代DLBCL细胞的细胞活力,在DLBCL细胞系中,细胞增殖亦出现明显抑制,且抑制显示出时间和剂量依赖性。2.与80μM OSS＿128167孵育48小时后,与对照组相比,原代DLBCL细胞和DLBCL细胞系（LY1,LY8）中早期凋亡的细胞数显着升高。3.逐渐增加的OSS＿128167浓度也影响DLBCL细胞的细胞周期进程。随着OSS＿128167浓度逐渐增高,G2/M期细胞计数也逐渐升高。这与先前研究中Sirt6抑制后引起G2/M期细胞阻滞一致。4.在SCID小鼠的异种移植模型中,用OSS＿128167处理的小鼠肿瘤与PBS处理组相比,生长受到明显抑制,且小鼠皮下肿瘤组织中Sirt6、Ki-67表达水平降低。结论:OSS＿128167在DLBCL细胞中抑制细胞增殖,促进细胞凋亡,诱导周期阻滞。说明OSS＿128167在DLBCL中发挥抗淋巴瘤作用,有望成为DLBCL新的靶向治疗药物。第三部分 Sirt6通过激活PI3K/Akt信号通路促进弥漫大B细胞淋巴瘤的生长目的:我们通过前期实验发现Sirt6在DLBCL中表达水平增高,与预后相关,且可参与调节DLBCL细胞的多种生物学功能,如细胞增殖、凋亡、细胞周期、DNA损伤修复等,而Sirt6调节DLBCL细胞的机制尚不清楚。本研究旨在探讨Sirt6对DLBCL细胞调控的作用机制,为寻找DLBCL的新的治疗靶点提供理论依据。材料与方法:1.细胞培养;2.慢病毒载体介导Sirt6基因的敲减;3.RNA 测序的差异基因富集分析（gene set enrichment analysis,GSEA）;4.蛋白提取和Western Blot;5.CCK-8法检测细胞增殖;6.DLBCL异种移植小鼠模型建立,小鼠肿瘤组织提蛋白WB;7.统计学分析。结果:1.筛选稳定低表达Sirt6的细胞以及对照细胞行RNA测序,使用GSEA探索了Sirt6调控的潜在机制,发现Sirt6在PI3K/Akt和FOXO信号传导途径中功能丰富。WB提示,与对照细胞相比,在shSirt6细胞中PI3Kpll0α及其下游靶分子Akt（Ser473）和mTOR蛋白的活化水平显着降低,PTEN、p-4EBP1和FoxO1蛋白的表达水平增加。2.在DLBCL细胞的异种移植小鼠肿瘤组织中,shSir6组与shControl组相比,Sirt6表达降低,并且PI3Kp110α、Akt、mTOR磷酸化水平降低,PTEN表达增高,与体外实验相一致。3.使用PI3K信号激活剂胰岛素样生长因子-1（insulin-like growth factor-1,IGF-1）来进一步研究Sirt6修饰DLBCL细胞中PI3K信号的能力。与shControl相比,未接受IGF-1处理的shSirt6细胞显示出较低的LY1和LY8细胞增殖,接受IGF-1处理的细胞的增殖能力有部分恢复。IGF-1处理shSirt6细胞后,部分逆转了 PI3K、Akt和mTOR磷酸化蛋白表达的降低。结论:Sirt6可能通过激活PI3K/Akt/mTOR信号通路来促进DLBCL细胞的生长,从而促进DLBCL的发生发展。这些发现为Sirt6在DLBCL中的致癌活性提供了机制方面的见解,并为DLBCL的预后评估及靶向治疗提供了新的实验基础和理论依据。
张桂冀[3]（2021）在《囊泡蛋白分选相关蛋白35通过激活PI3K/AKT信号通路促进肝细胞癌增殖的机制研究》文中研究指明背景:原发性肝癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）是全球范围内最常见的恶性肿瘤之一,其发病率居全球癌症发病第六位,死亡率居全球癌症死亡第四位,而中国肝癌新发病例和死亡病例数约占全球总数的50%以上[1]。在癌症总体发病率和死亡率呈下降趋势的情况下,肝癌的发病率仍以每年2%-3%的增速增长[2]。肝炎病毒感染、过量摄入酒精,黄曲霉毒素等是肝癌发生的高危因素。我国肝癌患者中,约90%为慢性乙型肝炎病毒（Chronic Hepatitis B virus,CHB）感染,因此HBV感染仍是我国肝癌最主要的病因。由于肝癌恶性程度高、较早发生转移,5年生存率在5%-30%之间。目前肝细胞癌的治疗仍是一个医学难题,尤其是对于没有显着血管浸润,局部淋巴结或远端转移的早期肝细胞肝癌病人。因此,深入研究肝细胞肝癌发生发展过程中的具体分子事件,有望为肝癌的早期诊断和治疗提供理论依据以及新的治疗策略。在肝癌的发病过程中往往伴随肝细胞炎症,纤维化和肝细胞异常再生,增生性结节形成过程中遗传变异不断积累,为发育异常的细胞提供增殖、侵袭和生存优势,最终导致肝癌的发生[3]。基因突变及其表达调控的改变与HCC的发生发展有着重要联系,高通量的下一代测序技术解析了HCC的突变图谱,目前已报道的与人类肝癌发生密切相关的驱动基因主要包括TERT、TP53、CTNNB1、NRAS、ARID1A和AXIN1等,对于鉴定HCC中具有抑癌或促癌功能的癌症驱动基因起到了极大的推动作用（表1）。TERT启动子区突变,HBV病毒基因组插入TERT启动子区,染色体易位和基因扩增等导致端粒酶激活是最常见的遗传变异,其突变频率达60%[4]。在30%-50%的HCC样本中发现了编码β-catenin的基因CTNNB1的突变,以及Wnt通路抑制剂AXIN1或APC失活,导致Wnt-β-catenin信号通路激活[5]。其他如TP53,RB1,PTEN,CCNA2,CCNE1,ARID1A基因突变或遗传变异等导致肝癌细胞周期调控异常。ARID1A,ARID2,KMT2家族基因突变引起表观修饰的改变[6,7]。FGF3,FGF4和FGF19基因扩增,TSC1,TSC2和PTEN的失活突变激活AKT-m TOR-MAPK信号通路。NFE2L2,KEAP1突变激活氧化应激途径[8,9]。此外,CCND1,FGF19,VEGFA,MYC和MET基因扩增导致多种致癌信号途径（包括受体酪氨酸激酶）的激活[10]。总体而言,每个HCC患者约含有50个基因组异常改变,其中约20%-25%的HCC患者含有一种以上的致癌突变。根据不同的转录图谱和组织学表型,特定的驱动基因突变可以对HCC进行分子分型[11-13]。由于肝癌的高度异质性,目前仍有必要深入研究HCC发病过程中的相关驱动事件,进一步阐明其在HCC发生发展过程中的作用及具体分子机制。课题组前期对临床HBV相关肝细胞癌队列进行了全外显子测序（whole-exome sequencing,WES）和转录组测序（RNA sequencing,RNA-Seq）。通过聚类算法分析,筛选出四个枢纽基因:VPS35,SH3BP4,PPP1R12C和PNO1,与肝癌中已报道的致癌突变存在重叠的功能簇,提示其在肿瘤中的恶性生物学行为,有可能成为新的肿瘤相关基因。通过细胞功能学实验我们发现过表达VPS35在体外显着促进肝癌细胞增殖。囊泡蛋白分选相关蛋白35（Vacuolar Protein Sorting-Associated Protein 35,VPS35）是retromer复合物的关键组分。VPS35的C端与VPS29结合,N端与VPS26结合形成异源三聚体,即货物识别复合物（Cargo recognition complex,CRC）,主要功能是识别并结合细胞内的货物蛋白。CRC复合物与分选连接蛋白（Sorting nexin,SNX）形成的异二聚体一起,构成retromer复合物。最初在酵母中发现retromer复合物介导羧肽酶受体从内体转运至高尔基体[14]。Retromer作为内体蛋白分选机制的重要组成成分,介导货物蛋白从内体转运至高尔基体或直接从内体转运至细胞膜表面（图1）,其功能异常参与神经退行性疾病的发病。通过介导细胞膜上多种货物蛋白的分选,retromer复合物的功能与细胞内重要的生理过程如溶酶体起源、自噬、信号受体的调节和细胞扩散等密切相关。此外,retromer通过调控信号受体的转运和回收,参与了细胞内信号通路的调控,如β2-肾上腺素能受体（β2-adrenergic receptor,β2-AR）[15],甲状旁腺素受体（Parathyroid hormone receptor,PTHR）[16-18]和干扰素受体2（Interferon receptor 2,IFNAR2）[19]等。VPS35与N-Ras相互作用,促进黑素瘤细胞的增殖,沉默VPS35下调丝裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinase,MAPK）信号,抑制黑素瘤细胞增殖[20,21]。目前VPS35在肝细胞癌和癌旁组织中的表达水平及其在肝癌发生发展过程中的作用和具体机制尚未见相关文献报道。课题组前期通过对临床肝癌组织和癌旁组织进行WES和RNA-Seq测序,通过图表聚类算法筛选枢纽基因,这些枢纽基因可能在HCC中发挥关键作用,因此可能成为功能研究的候选基因。联合细胞功能学鉴定我们筛选出潜在的肝癌驱动相关新基因VPS35,在癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas,TCGA）数据库中对VPS35基因进行深度挖掘,分析其在肝癌中的致癌作用和调控的关键信号通路。在体内外实验中,我们首先明确了VPS35在临床肝癌样本中的表达水平,证实过表达VPS35促进肝癌细胞增殖,进一步对VPS35敲除的肝癌细胞进行RNA-Seq测序,研究其发挥促癌效应的具体分子机制。本研究在临床HCC队列中鉴定了潜在的HCC候选基因,对于retromer复合物在肿瘤发生发展中的作用提供了新的见解,有望为临床肝癌个性化防治策略提供新的思路。实验方法:1.鉴定潜在的肝癌驱动基因。首先通过图表聚类算法筛选可能在HCC中发挥关键作用的枢纽基因。然后通过细胞功能学验证筛选出潜在的肝癌驱动基因VPS35。利用TCGA数据库资料对VPS35基因进行深度挖掘,分析其在肝细胞癌中的致癌作用和调控的关键信号途径。进一步明确VPS35在肝癌组织中的表达情况。通过TCGA数据库分析VPS35在肝癌组织中的表达及与预后的关系。采用Real-time PCR,Western blot和免疫组织化学染色（Immunohistochemistry,IHC）的方法检测VPS35在临床肝癌和癌旁组织中的表达情况。通过Western blot,Real-time PCR实验以及分析TCGA数据库资料从HBV感染、转录因子调控和DNA甲基化三个方面探讨VPS35在肝癌组织中表达上调的机制。2.通过体外细胞功能学实验观察VPS35对肝癌细胞系增殖能力和细胞周期的影响。利用Ad Easy腺病毒载体系统构建过表达VPS35的重组腺病毒表达载体,获得过表达VPS35的肝癌细胞模型;利用CRISPR/Cas9技术构建VPS35特异性敲除的肝癌细胞模型。通过MTS实验、克隆形成实验和Ed U细胞增殖检测观察VPS35对肝癌细胞增殖能力的影响;通过流式细胞术和Western blot实验观察VPS35对肝癌细胞的细胞周期的调控作用;在裸鼠皮下移植瘤模型中观察VPS35基因敲除对肿瘤生长的影响:皮下注射VPS35敲除的肝癌细胞,观察VPS35敲除对肿瘤生长速度、大小的调控,通过Ki67染色观察肿瘤内细胞增殖能力变化,验证体外实验结果。3.检测VPS35对PI3K/AKT信号通路的调控。对VPS35敲除的肝癌细胞和对照Parental细胞进行转录组测序,对差异表达基因进行通路富集分析,发现这些差异基因主要富集在溶酶体和PI3K/AKT信号通路。通过Real-time PCR在m RNA水平验证VPS35过表达和基因敲除对PI3K/AKT和RAS信号通路相关分子的调控。采用Western blot在蛋白水平验证VPS35过表达和基因敲除对AKT信号活化的影响。采用AKT抑制剂MK2206处理后,通过MTS和克隆形成实验观察MK2206对肝癌细胞增殖的影响,流式细胞术和Western blot实验观察MK2206对肝癌细胞周期的影响。在裸鼠原位移植瘤模型中观察过表达VPS35对PI3K/AKT信号通路的调控:肝脏原位注射VPS35过表达的肝癌细胞,设置MK2206处理组,观察过表达VPS35对肿瘤生长速度、大小的调控,通过Western blot和IHC染色观察肿瘤内细胞增殖能力的变化,观察MK2206是否可以逆转VPS35的致癌效应,验证体外实验结果。4.探索VPS35激活PI3K/AKT信号的具体机制。通过TCGA数据库HCC队列资料进行相关性分析,发现VPS35表达与RTK家族成员（FGFR3,FGFR3,和NTRK1）呈正相关。通过流式细胞术,Western blot和免疫荧光实验检测VPS35敲除后细胞膜上RTKs表达水平。进一步在VPS35敲除肝癌细胞中重新过表达VPS35,通过Western blot和免疫荧光实验观察回复VPS35是否可以调控细胞膜上FGFR3的表达。结果:1.运用图表聚类算法对发生转录的238个突变等位基因进行蛋白-蛋白相互作用（Protein-protein interaction,PPI）网络分析和基因本体论（Gene ontology,GO）分析,挖掘潜在的肝癌相关新基因。联合MTS和克隆形成实验在体外进行验证,我们筛选出肝癌相关新基因VPS35。通过TCGA数据库分析发现VPS35在肝癌组织中的表达显着上调（P<0.05）。Real-time PCR、Western blot和免疫组化染色检测结果显示与癌旁组织相比,肿瘤组织中VPS35表达水平明显上调。VPS35在肝癌组织中表达上调的机制探讨:HBV感染对VPS35表达水平无明显影响;两个重要的转录因子TBP和TCF3与VPS35的表达成正相关,Real-time PCR实验提示肿瘤组织中TBP和VPS35均表达上调,TCF3表达水平无明显变化;Meth HC DNA甲基化数据库分析显示肝癌组织内（n=204）VPS35启动子甲基化水平显着降低（P=0.037）,因此,基于转录水平和表观修饰的调控可能均参与了VPS35在肝癌组织中的高表达。VPS35与PI3K/AKT信号通路相关基因的体细胞突变互相协同,如FGFR3（P=0.05）。在TCGA数据库中,体细胞VPS35突变或表达上调均与肝癌预后不良相关,提示VPS35在肝癌中的恶性生物学效应。2.VPS35过表达显着促进肝癌细胞增殖能力和肝癌细胞周期G1/S期转换和细胞周期进程;而敲除VPS35显着抑制肝癌细胞增殖,肝癌细胞周期阻滞于G1期。裸鼠皮下移植瘤实验显示VPS35基因敲除显着抑制肿瘤生长。3.RNA-Seq结果显示差异基因主要富集在PI3K/AKT信号通路中,Real-time PCR和Western blot实验验证了过表达VPS35激活RAS和PI3K/AKT信号,VPS35敲除抑制PI3K/AKT信号活化。AKT抑制剂MK2206在体内外可逆转VPS35促肝癌细胞生长和细胞周期进程效应。4.VPS35敲除后肝癌细胞FGFR3染色阳性的细胞百分比显着减少,细胞膜成分中FGFR3表达显着下调。而在VPS35敲除细胞中过表达VPS35可以回复细胞膜上FGFR3的表达水平,提示FGFR3在细胞内的回收增多和（或）溶酶体降解减少,从而激活下游PI3K/AKT信号,促进肝癌细胞增殖。结论:课题组前期通过对临床肝癌组织和匹配的癌旁硬化组织进行WES和RNA-Seq测序,通过图表聚类算法和细胞功能学验证,我们鉴定了一个潜在的肝癌驱动候选基因VPS35。VPS35在肝癌组织的表达明显高于癌旁组织,体内外实验中均证明VPS35通过促进肝癌细胞周期G1/S期转换促进肝癌细胞增殖。研究其机制发现:VPS35作为retromer复合物的关键组分,通过介导细胞膜表面FGFR3受体的循环,激活下游PI3K/AKT信号,促进肝癌细胞G1期到S期转换和细胞周期进程,促进肝癌细胞增殖;而AKT抑制剂MK2206可逆转VPS35的致癌效应。本课题阐释了VPS35通过激活PI3K/AKT信号促进肝癌增殖的具体分子机制,对于retromer复合物在肿瘤发生发展中的作用提供了新的见解,有望为临床肝癌个性化防治策略提供新的思路。
郭盛虎[4]（2021）在《LncRNA TUG1通过调节miR-221/PTEN轴提高非小细胞肺癌化疗敏感性的研究》文中研究表明第一部分 化疗敏感组和化疗抵抗组NSCLC肿瘤组织lncRNA TUG1表达情况和临床病理特征目的:研究lncRNA TUG1在非小细胞肺癌化疗敏感组和化疗抵抗组肿瘤组织中的表达情况以及lncRNA TUG1与非小细胞肺癌临床病理特征及预后的相关性方法:采用qRT-PCR法对非小细胞肺癌化疗敏感组（n=43）和化疗抵抗组（n=65）肿瘤组织中lncRNA TUG1表达水平进行检测,Kaplan-Meier法用于绘制生存曲线,log Rank法用于分析化疗敏感组和化疗抵抗组患者生存差异。结果:1.lncRNA TUG1在非小细胞肺癌化疗敏感组和化疗抵抗组肿瘤组织中的表达情况qRT-PCR检测结果显示非小细胞肺癌化疗抵抗组lncRNA TUG1表达水平较化疗敏感组显着降低（P<0.01）。2.非小细胞肺癌化疗敏感组和化疗抵抗组患者临床病理学指标与lncRNA TUG1表达水平的相关性及生存分析非小细胞肺癌lncRNA TUG1的表达水平在化疗抵抗组与既往吸烟史（P=0.014）、组织分化等级（P<0.001）以及淋巴结转移（P=0.003）显着相关。化疗敏感组较化疗抵抗组具有更长的生存时间。小结:非小细胞肺癌化疗抵抗组较化疗敏感组lncRNA TUG1表达水平显着下调,且与不良预后相关,提示其可能参与非小细胞肺癌化疗抵抗的发生。第二部分 lncRNA TUG1对非小细胞肺癌细胞生物学特性及化疗敏感性影响的研究目的:评估lncRNA TUG1对非小细胞肺癌化疗敏感性及增殖、迁移、浸润、凋亡及自噬生物学特性的影响。方法:1.细胞培养、转染及检测人非小细胞肺癌细胞系SPC-A1采用高糖培养基培养,NCI-H1650、NCI-H520、NCI-H1299采用RPMI 1640培养,人正常肺上皮细胞系16HBE采用含10%FBS的高糖培养基（含100U/m L青霉素和100mg/L链霉素）培养。采用药物浓度递增培养法诱导非小细胞肺癌耐药细胞。脂质体转染法将si-TUG1转染至SPC-A1和NCI-H520细胞构建lncRNA TUG1敲低细胞系,将pc DNA-TUG1转染至SPC-A1/DDP和NCI-H520/DDP细胞构建lncRNA TUG1过表达细胞系。qRT-PCR用于检测转染效率。2.MTT实验检测SPC-A1、NCI-H520细胞lncRNA TUG1敲低和SPC-A1/DDP、NCI-H520/DDP细胞lncRNA TUG1过表达对非小细胞肺癌化疗敏感性的影响。3.集落形成实验检测SPC-A1、NCI-H520细胞lncRNA TUG1敲低和SPC-A1/DDP、NCI-H520/DDP细胞lncRNA TUG1过表达对非小细胞肺癌细胞增殖能力的影响。4.划痕实验和Transwell实验检测SPC-A1、NCI-H520细胞lncRNA TUG1敲低和SPC-A1/DDP、NCI-H520/DDP细胞lncRNA TUG1过表达对非小细胞肺癌细胞迁移和浸润能力的影响。5.流式细胞术检测SPC-A1、NCI-H520细胞lncRNA TUG1敲低和SPC-A1/DDP、NCI-H520/DDP细胞lncRNA TUG1过表达对非小细胞肺癌细胞周期分布和细胞凋亡的影响。6.GFP-LC3融合蛋白标记法、MDC染色法和Western blot检测SPC-A1、NCI-H520细胞lncRNA TUG1敲低和SPC-A1/DDP、NCI-H520/DDP细胞lncRNA TUG1过表达对非小细胞肺癌细胞自噬能力的影响。7.裸鼠皮下移植瘤模型的构建裸鼠皮下注射过表达lncRNA TUG1的SPC-A1/DDP或NCI-H520/DDP构建移植瘤模型。8.Western blot实验检测lncRNA TUG1过表达对非小细胞肺癌异种移植瘤细胞凋亡能力的影响。9.TUNEL实验检测lncRNA TUG1过表达对非小细胞肺癌异种移植瘤细胞自噬能力的影响。结果:1.lncRNA TUG1敲低和过表达效率的验证本研究中SPC-A1和NCI-H520细胞用于构建lncRNA TUG1敲低表达模型,SPC-A1/DDP和NCI-H520/DDP细胞用于构建lncRNA TUG1过表达模型。qRT-PCR检测结果提示敲除及过表达成功,P<0.01。2.体外细胞实验结果显示lncRNA TUG1能够抑制非小细胞肺癌细胞增殖、迁移和浸润,促进细胞凋亡、自噬和衰老,且能够提高DDP治疗敏感性。3.体内实验结果显示lncRNA TUG1过表达抑制非小细胞肺癌异种移植瘤生长,促进其细胞凋亡和自噬。小结:lncRNA TUG1能够抑制非小细胞肺癌细胞增殖、迁移及浸润能力,促进非小细胞肺癌细胞凋亡和自噬,提高DDP治疗敏感性。第三部分 lncRNA TUG1通过miR-221/PTEN轴调节非小细胞肺癌化疗敏感性的机制研究目的:研究lncRNA TUG1影响非小细胞肺癌化疗敏感性的内在机制。方法:1.双荧光素酶报告实验检测lncRNA TUG1与miR-221、miR-221与PTEN之间是否存在相互作用。2.qRT-PCR检测非小细胞肺癌化疗敏感组和化疗抵抗组miR-221和PTEN表达情况;检测lncRNA TUG1敲除或过表达对miR-221表达的影响,lncRNA TUG1或miR-221敲除或过表达对PTEN表达的影响。3.集落形成实验、划痕实验、Transwell实验、流式细胞术和Western blot检测SPC-A1和NCI-H520细胞转染si-NC、si-TUG1、si-TUG1+miR-NC和si-TUG1+miR-221,SPC-A1/DDP和NCI-H520/DDP细胞转染pc DNA-NC、pc DNA-TUG1、pc DNA-NC+NC inhibitor和pc DNA-TUG1+miR-221inhibitor对非小细胞肺癌细胞增殖、迁移、浸润、凋亡和自噬能力的影响。4.集落形成实验、划痕实验、Transwell实验、流式细胞术和Western blot检测SPC-A1和NCI-H520细胞转染sh-RNA、sh-PTEN、sh-RNA+pc DNA-TUG1和sh-PTEN+pc DNA-TUG1,SPC-A1/DDP和NCI-H520/DDP细胞转染pc DNA-NC、pc DNA-PTEN、pc DNA-NC+si-TUG1和pc DNAPTEN+si-TUG1对非小细胞肺癌细胞增殖、迁移、浸润、凋亡和自噬能力的影响。结果:1.miR-221在非小细胞肺癌肿瘤组织中高表达,PTEN在非小细胞肿瘤组织中低表达。双荧光素酶报告实验证实lncRNA TUG1与miR-221、miR-221与PTEN之间存在直接作用。非小细胞肺癌中,lncRNA TUG1与miR-221表达负相关,miR-221与PTEN表达负相关;lncRNA TUG1与PTEN表达正相关。2.miR-221过表达进一步加强lncRNA TUG1下调促进非小细胞肺癌细胞增殖、迁移和浸润,抑制细胞凋亡、自噬和衰老的能力;miR-221下调进一步提高lncRNA TUG1过表达抑制非小细胞肺癌细胞增殖、迁移和浸润,促进细胞凋亡、自噬和衰老的能力。3.lncRNA TUG1过表达能够部分逆转PTEN下调促进非小细胞肺癌细胞增殖、迁移和浸润,抑制细胞凋亡、自噬和衰老的能力;lncRNA TUG1下调能够部分克服PTEN过表达抑制非小细胞肺癌细胞增殖、迁移和浸润,促进细胞凋亡、自噬和衰老的能力。小结:lncRNA TUG1通过miR-221调节PTEN表达提高非小细胞肺癌化疗敏感性。
赵佳福[5]（2020）在《MicroRNA-31-5p调控14-3-3ε影响前列腺癌细胞增殖及凋亡的分子机制研究》文中研究说明前列腺癌（Prostate Cancer,PCa）是世界上最常见的恶性肿瘤之一,也是全球第二大最常见的男性癌症。几乎所有晚期PCa患者在接受内分泌治疗后都会发展成去势抵抗性前列腺癌。尽管雄激素受体是治疗转移性去势抵抗性前列腺癌（metastatic castrate-resistant prostate cancer,mCRPC）的有效方法,但2018年美国依然有29430人死于PCa。近年来对14-3-3蛋白家族的研究发现,该家族成员14-3-3ε在前列腺癌的发生发展中发挥了重要作用,可能成为前列腺癌诊断治疗的分子靶点。同样,大量研究也证实miRNAs在前列腺癌的发生发展中同样发挥了重要作用,在前列腺癌的分子诊断和靶向治疗方面同样具有广阔的应用前景,然而miRNAs调控14-3-3ε在前列腺癌发生发展中的具体分子机制尚不清楚。本研究采用UALCAN-TCGA在线数据库结合qRT-PCR、CCK-8、细胞划痕、Transwell、双荧光素酶系统、流式细胞术等试验手段,从细胞水平和分子水平,阐明miRNAs调控14-3-3影响前列腺癌细胞增殖凋亡的分子机制。相关研究可为前列腺癌的分子诊断和靶向抗癌药物研发提供新思路。主要研究结果如下:1.14-3-3ε在PCa组织和细胞中的表达及其对22Rv1细胞增殖的影响UALCAN-TCGA数据库分析结果表明,14-3-3蛋白不同亚型在PCa组织和癌旁组织具有不同的表达模式,其中14-3-3ε/YWHAE、14-3-3γ/YWHAG和14-3-3τ/YWHAQ在PCa组织中表达上调,14-3-3η/YWHAH、14-3-3β/YWHAB和14-3-3ζ/YWHAZ在PCa组织中表达下调;在前列腺癌不同细胞系中的研究发现,14-3-3ε在PC3、22Rv1、LNCaP中具有同PCa组织中相同的表达模式。CCK-8细胞增殖试验、细胞划痕试验和Transwell试验结果表明,干扰14-3-3ε的表达,严重影响了22Rv1细胞的增殖能力、迁移能力和侵袭能力（P<0.01）。以上结果暗示14-3-3ε在PCa中可能扮演原癌基因的角色。2.调控14-3-3ε表达的microRNAs筛选及功能验证TargetScan、miRSystem、miRanda和PicTar等在线软件预测发现,miR-155-5p、miR-31-5p、miR-29b-3p、miR-29a-3p及miR-29c-3p是调控14-3-3?得分最高的5条miRNAs;综合qRT-PCR试验、双荧光素酶试验和CCK-8试验结果发现,在22Rv1细胞中miR-31-5p与14-3-3?具有逆向表达关系,是调控14-3-3?表达效率最高的miRNA。通过构建野生型和突变型荧光素酶载体,我们发现:14-3-3?3’UTR中“UCUUGCC”7个碱基位点是miR-31-5p调控14-3-3?表达的特异性功能靶点,该位点的缺失,严重影响了miR-31-5p对14-3-3?基因的调控能力。3.miR-31-5p调控14-3-3ε对22Rv1细胞表型的影响CCK-8试验、细胞划痕试验、Transwell试验结果发现:mi R-31-5p过表达,严重影响了22Rv1细胞增殖、迁移和侵袭能力;流式细胞试验发现:miR-31-5p的上调直接导致22Rv1细胞停滞在G1期,间接抑制了22Rv1细胞增殖;细胞凋亡试验结果发现:miR-31-5p的上调促进了22Rv1细胞的早期凋亡和细胞坏死。补偿试验结果发现,miR-31-5p与14-3-3?共转染,部分逆转了miR-31-5p对22Rv1细胞增殖、迁移和侵袭能力,同时也部分逆转了miR-31-5p对22Rv1细胞周期的抑制和对22Rv1细胞的促凋亡能力。4.miR-31-5p调控14-3-3?对PI3K/Akt/Bcl-2信号通路的影响对miR-31-5p调控14-3-3?影响22Rv1增殖凋亡的信号通路研究发现,miR-31-5p的上调,显着下调了p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT的比值,上调了Bad、Bax/Bcl-2的表达水平,激活了caspase-9和caspase-3等与细胞凋亡相关的级联反应;然而,miR-31-5p与14-3-3?共转染,部分逆转了这一现象。以上结果暗示miR-31-5p靶向调控14-3-3?抑制22Rv1细胞增殖和促进细胞凋亡是通过调节PI3K/AKT/Bcl-2信号通路实现的。综上所述,本文明确了14-3-3?蛋白在前列腺癌组织和细胞中显着升高,发现miR-31-5p是靶向调控14-3-3?基因表达的最佳miRNAs,解析了miR-31-5p靶向调控14-3-3?与22Rv1细胞增殖凋亡的关联性,阐明了miR-31-5p靶向调控14-3-3?影响22Rv1细胞增殖凋亡的分子机制。为miR-31-5p和14-3-3ε联合应用于CRPC精准治疗提供了新的理论依据。
项一恩[6]（2020）在《miR-23a-3p通过靶向原钙粘蛋白17促进肝细胞癌G1/S细胞周期转化的作用研究》文中认为目的:原发性肝癌是最常见的消化系统恶性肿瘤之一。我国原发性肝癌的发生率和死亡率分别为第四位和第三位,五年生存率仅为18%。原发性肝癌主要的危险因素包括乙型或丙型病毒性肝炎、酒精和黄曲霉素等。典型的原发性肝癌病理生理学进展过程包括肝炎-肝硬化-肝癌三个主要阶段。原发性肝癌的病理类型分为肝细胞癌、胆管细胞癌和混合细胞癌,其中肝细胞癌是最主要的类型。肝细胞癌的基本治疗方式为根治性切除。由于其恶性程度很高,早期诊断困难,对放化疗等不敏感,术后肿瘤很容易复发、转移。近年来随着肝细胞癌相关的分子生物学机制的逐步阐明,基因治疗、分子靶向治疗以及免疫治疗等新兴治疗方式在抑制肝细胞癌复发、转移方面显示了较好的前景。microRNA作为肝细胞癌发生发展的重要机制之一受到了越来越多的关注。microRNA是内生性短链非编码RNA,主要在转录后水平通过促进mRNA降解和抑制mRNA翻译来调节靶基因的表达。一个microRNA可以靶向多个基因,一个基因也可以被多个microRNA靶向抑制,microRNA还可以被lncRNA和环状RNA等靶向抑制。lncRNA、环状RNA、microRNA和mRNA组成复杂的调控网络对各种信号通路的关键分子起到重要的调控作用。microRNA与细胞生长、分化、细胞周期、凋亡和代谢等一系列生物过程密切相关。microRNA表达异常还可以引起包括癌症和心血管疾病在内的多种疾病。多篇文献报道miR-23a-27a-24-2簇在肝细胞癌中表达异常增高,与肝细胞癌的复发、转移密切相关。miR-23a-3p是miR-23a-27a-24-2簇的重要组成分子,先前的研究表明miR-23a-3p可以促进肝细胞癌生长和转移,调节肝癌细胞的化学敏感性,还可以抑制肝癌细胞凋亡。但miR-23a-3p与肝细胞癌细胞周期之间是否存在调控关系尚不明确。原钙粘蛋白属于钙粘蛋白超家族的亚家族之一,功能尚不完全清楚。其表达由于基因突变和启动子甲基化等原因在乳腺癌、淋巴瘤、宫颈癌、亨廷顿病和非小细胞肺癌等疾病中常常被沉默。原钙粘蛋白PCDH17属于抑癌基因,位于人类染色体13q21.1上。PCDH17在急性髓性白血病、喉部鳞状细胞癌、膀胱癌、肝细胞癌和胃癌等多种癌症中表达明显下调。PCDH17可以诱导肿瘤细胞凋亡和自噬,但在胃癌和结肠癌中常常被甲基化。在肝细胞癌中PCDH17表达沉默可以通过激活EGFR/MEK/ERK信号通路促进肿瘤细胞的侵袭和转移。然而,PCDH17对肝细胞癌细胞周期的调节作用尚不明确。本研究检测了人类肝细胞癌和邻近正常肝组织中miR-23a-3p和PCDH17的表达水平。此外我们还通过一系列体外实验探究了肝细胞癌中miR-23a-3p与细胞周期、PCDH17与细胞周期以及miR-23a-3p与PCDH17的关系。miR-23a-3p是否通过PCDH17调控肝细胞癌细胞周期也得到了验证。最后,我们通过体内实验对miR-23a-3p与肿瘤生长的关系进行了探究。方法:（1）通过RT-qPCR和western blotting对人类肝细胞癌和邻近正常肝组织中miR-23a-3p和PCDH17的表达水平进行了检测,并通过线性回归分析了miR-23a-3p和PCDH17的相关性。（2）通过RT-qPCR检测了Hep3B,Huh-7和HepG2细胞系中miR-23a-3p的表达水平,筛选出Hep3B和HepG2用于后续实验。通过RT-qPCR检测了Hep3B转染miR-23a-3p mimics和HepG2转染miR-23a-3p inhibitor的效率。通过CCK-8细胞活性检测、流式细胞周期检测、EdU渗入S期细胞数量检测和western blotting等体外实验探究了miR-23a-3p对肝细胞癌细胞周期的调节关系。（3）通过CCK-8细胞活性检测和流式细胞周期检测等体外实验探究了PCDH17对肝细胞癌细胞周期的调节关系。（4）Hep3B转染miR-23a-3p mimics和HepG2转染miR-23a-3p inhibitor后,通过RT-qPCR和western blotting检测了PCDH17的表达水平。通过生物信息学分析预测了PCDH17 3’UTR中miR-23a-3p的特异性结合位点。最后通过双荧光素酶报告实验确认了miR-23a-3p和PCDH17的直接靶向关系。（5）分别对Hep3B和HepG2转染PCDH17 siRNA,NC siRNA,PCDH17过表达质粒或空载体,并通过western blotting检测了转染效率。对Hep3B共转染miR-23a-3p mimics或NC mimics和PCDH17过表达质粒或空载体。对HepG2共转染miR-23a-3p inhibitor或NC inhibitor和PCDH17 siRNA或NC siRNA。共转染后通过CCK-8细胞活性检测、流式细胞周期检测、EdU渗入S期细胞数量检测和western blotting等体外实验探究了miR-23a-3p是否通过靶向PCDH17来调节肝细胞癌细胞周期。（6）分别向裸鼠左侧腋窝皮下注射稳定转染pre-miR-23a的Hep3B细胞和稳定转染miR-23a-3p sponge的HepG2细胞,并测量肿瘤生长速率。处死裸鼠后,取肿瘤组织进行HE染色计算坏死、凋亡细胞的数量,并通过IHC染色进一步确认miR-23a-3p和PCDH17的靶向关系。结果:（1）与对照组相比,肝细胞癌组织中miR-23a-3p的表达水平明显上调,PCDH17 mRNA和蛋白的表达水平均明显下调。miR-23a-3p与PCDH17 mRNA的水平负相关。（2）在Hep3B,Huh-7和HepG2细胞系中,Hep3B的miR-23a-3p表达水平最低,HepG2的miR-23a-3p表达水平最高。Hep3B细胞转染miR-23a-3p mimics后miR-23a-3p的水平明显增加,而HepG2细胞转染miR-23a-3p inhibitor后miR-23a-3p的水平明显降低,表明转染是有效的。CCK-8实验中,转染48 h和72 h后,Hep3B的活性明显增加,而HepG2的活性明显降低。流式细胞周期检测中,转染miR-23a-3p mimics后Hep3B S期的细胞数量明显增加,G1期的细胞数量明显减少。而miR-23a-3p inhibitor转染HepG2的结果与Hep3B相反。EdU渗入实验的结果与流式细胞周期的结果相似。western blotting检测中,转染miR-23a-3p mimics后Hep3B细胞内cyclin D1,cyclin E,CDK2,CDK4,p-p27和p-RB的水平明显上调,而p27的水平明显下调。而miR-23a-3p inhibitor转染HepG2的结果与Hep3B相反。但是,RB的表达水平都没有明显改变。（3）PCDH17 siRNA转染Hep3B Cell后,CCK-8实验中,细胞活性明显增加。流式细胞周期检测中,S期细胞比例明显增加,G1期细胞比例明显减少。HepG2的转染实验结果与之相反。（4）miR-23a-3p mimics降低PCDH17 mRNA和蛋白的水平而miR-23a-3p inhibitor增加PCDH17 mRNA和蛋白的水平。miR-23a-3p mimics和携带PCDH17野生型3’UTR的质粒共转染后,细胞荧光素酶活性明显降低,表明miR-23a-3p和PCDH17存在直接靶向关系。（5）转染PCDH17 siRNA后PCDH17的水平明显降低。相反地,转染PCDH17过表达质粒后PCDH17的水平明显增加。CCK-8实验中,与miR-23a-3p mimics+空载体组相比,miR-23a-3p mimics+PCDH17过表达明显使Hep3B的细胞活性降低。流式细胞周期检测中,miR-23a-3p mimics+PCDH17过表达组Hep3B的S期细胞数量明显减少。EdU渗入实验的结果与流式细胞周期的结果相似。western blotting检测中,转染miR-23a-3p mimics和PCDH17过表达质粒的Hep3B细胞Cyclin D1和cyclin E的表达水平明显下调。HepG2的转染实验结果都和Hep3B相反。（6）体内实验表明注入裸鼠皮下的稳转pre-miR-23a的Hep3B细胞的生长速率明显加快,而稳转miR-23a-3p sponge的HepG2细胞的生长速率明显降低。HE染色显示转染pre-miR-23a的Hep3B细胞生长密集,但转染miR-23a-3p sponge的HepG2细胞坏死和凋亡较多。IHC检测中,转染pre-miR-23a的Hep3B细胞PCDH17的水平明显降低,而转染miR-23a-3p sponge的HepG2细胞PCDH17的水平明显增加。结论:（1）肝细胞癌组织中miR-23a-3p的表达水平明显上调,PCDH17的表达水平明显下调,二者呈负相关。（2）miR-23a-3p可以促进肝细胞癌G1/S细胞周期转化。（3）PCDH17可以抑制肝细胞癌G1/S细胞周期转化。（4）PCDH17为miR-23a-3p的直接靶基因。（5）miR-23a-3p通过靶向PCDH17促进肝细胞癌G1/S细胞周期转化。（6）体内实验表明miR-23a-3p可以促进肝细胞癌生长。
丁俊[7]（2020）在《SOCS1通过P21-CyclinD1/CDK4调控细胞周期抑制肝细胞癌进展的机制研究》文中研究表明【研究背景与实验目的】肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）是全球性的健康问题,具有发病率高,死亡率高的特征,严重威胁人类的健康。孤立的小肝癌通常首选外科手术治疗,五年存活率可达50%以上。但肝癌发病隐匿,患者确诊时一般已达中晚期,仅有部分患者有机会接受肝移植,仍有许多患者需要接受传统化疗或近年新兴的基因治疗、靶向药物治疗和免疫治疗。众所周知,传统化疗药物的选择性低,毒副作用强;免疫治疗更是对实体肿瘤,尤其是肝细胞癌的疗效不佳。除此之外,接受手术治疗后的患者仍有70%以上的概率出现肝内播散或是肝外转移,使得肝癌的术后复发成为困扰医务工作者的另一大难题。近年来,随着诸如索拉菲尼和伊马替尼等靶向药物的加入,传统肝癌治疗的方式被拓宽到局部结合系统治疗,肝癌的药物治疗正被逐步优化。基于肿瘤是一种多基因改变和信号通路传导异常的疾病,更多的生物分子有望成为治疗靶点,且亟待研究,以此提高肝癌患者的治疗效果和总体生存。细胞因子信号传导抑制因子1（Suppressors of cytokine signaling 1,SOCS1）基因是SOCS蛋白家族中的一员,所有成员在结构上十分相似,均具有N末端区域、SH2区和SOCS盒结构域,可分别参与到信号蛋白的磷酸化过程和靶蛋白的泛素-蛋白酶体途径中。SOCS1在多种肿瘤中被报道为抑癌因子,并在肝癌中存在异常甲基化,但其在肝癌中的具体作用机制研究仍旧局限,尤其是针对肝癌细胞周期调控的机制值得探索。【研究内容与方法】本研究拟通过两部分实验阐释SOCS1在肝癌中的作用和机制:1.明确SCSO1在人肝癌组织及癌旁正常组织和肝癌细胞系中的表达水平,结合临床病理数据统计分析SOCS1对肝癌诊断和预后评估的价值。（1）运用Oncomine国际数据库收集SOCS1在正常肝脏、肝硬化组织和肝癌组织中的m RNA表达量,分析比较正常组与异常组的表达水平差异;（2）运用实时荧光定量聚合酶链式反应检测SOCS1在159例肝细胞癌患者的肝癌组织及匹配癌旁正常组织的m RNA表达水平;（3）运用免疫组织化学染色法检测SOCS1在90例肝细胞癌患者的肝癌组织及匹配癌旁正常组织的蛋白表达水平;（4）选取正常肝脏细胞系QSG-7701和七种肝癌细胞系（SMMC-7721、HPEG2、HEP3B、HUH7、HCC-LM3、MHCC-97H和SK-HEP-1）验证SOCS1在细胞系中表达趋势与肝癌组织的一致性;（5）运用Kaplan–Meier生存分析和log-rank检验分析SOCS1表达与肝细胞癌患者预后的关系;运用卡方检验分析SOCS1表达与患者临床病理数据的相关性。2.探索SOCS1在肝细胞癌细胞周期调控中的作用和机制,寻找肝癌增殖进展的理论依据,发掘肝癌治疗的新型潜在靶点。（1）使用慢病毒转染,构建稳定过表达SOCS1的SMMC-7721、HCC-LM3和MHCC-97H人肝癌细胞株,蛋白质印迹实验验证过表达效率;（2）使用高通量测序技术分析转录组基因差异表达,富集SOCS1潜在影响的信号通路;运用CCK-8、流式细胞术周期检测和Ed U实验检测SOCS1对肝癌细胞周期的具体作用,并锁定关键调控节点采用蛋白质印迹实验印证;（3）使用稳定过表达SOCS1的SMMC-7721细胞株和对照组细胞建立裸鼠异种移植肿瘤,观察SOCS1在体内对肿瘤生长的影响;运用免疫组织化学染色,进一步验证上述所得关键调控蛋白的表达水平;（4）结合测序结果,分析差异表达蛋白的调控途径。分离提取细胞质和细胞核蛋白,检测核内关键蛋白表达水平;加入放线菌酮药物检测蛋白降解半衰期;运用Co-Immunoprecipitation（Co-IP）实验证实蛋白互做中的结合关系;过表达关键调控分子的表达量,观察其对下游信号通路的逆转;运用STRING蛋白互做数据库分析所得蛋白是否存在确切关联。【结果】1.肝癌细胞系、肝癌组织中SOCS1的m RNA和蛋白质表达水平较之正常肝癌细胞系和癌旁正常组织低表达（P<0.0001）;2.SOCS1与临床病理数据分析发现,SOCS1的表达水平与肿瘤大小相关（P=0.02）,且高表达SOCS1患者组较之低表达组拥有更高的无瘤生存率（P=0.0042）和总体生存率（P=0.0265）;3.高通量测序分析差异基因并富集信号通路,发现SOCS1与细胞周期和泛素化途径存在相关性,提示肝癌中可能存在SOCS1调控细胞周期关键分子的泛素化修饰从而抑制肝癌细胞增殖的信号通路;4.过表达SOCS1后,SMCC-7721,HCC-LM3和MHCC-97H的细胞扩增速率显着下降（P<0.0001）;HCC-LM3和SMCC-7721细胞株的细胞周期阻滞在G1期（P<0.05）,S期细胞占比显着减少（P<0.005）,MHCC-97H细胞株并未观察到明显的周期阻滞;Ed U实验证实HCC-LM3和SMCC-7721两种细胞株在过表达SOCS1后存在细胞周期的G1-S期转化阻滞;5.细胞周期G1期的关键调控分子Retinoblastoma（Rb）的磷酸化水平在SOCS1过表达后显着下调,阻断细胞周期进展。另一关键调控分子Cyclin D1蛋白质表达水平升高,其上游P21和P27的蛋白质表达水平下调;6.体内实验中,过表达SOCS1的SMCC-7721细胞株生长受到明显抑制,成瘤大小显着小于对照组（P<0.001）;肿瘤组织切片运用免疫组织化学染色证实关键调控蛋白分子差异表达与上述结果一致;7.SOCS1过表达后P21和P27的转录水平未受到明显改变,通过MG-132药物的时间梯度实验,提示P21存在泛素化修饰的可能,并通过Co-IP证实P21受泛素化调节,进而影响Cyclin D1/CDK4复合体在细胞核内稳定性;8.分离提取细胞质和细胞核蛋白后运用蛋白质印迹检测,发现SOCS1过表达后核内发挥作用的Cyclin D1蛋白总量下调,包含了更多失活的Phospho-Cyclin D1,无法正常结合CDK4;9.过表达SOCS1后的稳定转染细胞株,再经P21的过表达,可以将上述细胞周期信号通路的差异表达逆转,减少Cyclin D1在核内的失活量,利于稳定Cyclin D1/CDK4复合体;10.Co-IP实验进一步证实CDK4所能结合的Cyclin D1蛋白量在SOCS1过表达后显着减少;SOCS1与泛素连接酶E3复合体中的Ring-box 1（RBX1）存在结合关系,可募集泛素转移酶E2促进靶标蛋白经泛素-蛋白酶体途径降解。【结论】1.SOCS1在肝癌细胞和患者肝癌组织中低表达,且与肿瘤大小存在相关性。2.通过高通量测序分析和实验论证,在肝癌中发现SOCS1可以有效调控P21-Cyclin D1/CDK4-Rb细胞周期信号通路。3.SOCS1在肝癌中有明确的抑癌作用,通过细胞周期阻滞可以抑制肝癌的发展,在细胞周期信号网络中发挥了重要作用,可能作为潜在靶点治疗肝癌。
乔冠恩[8]（2019）在《miR-106b-3p靶向ZNRF3调控食管鳞癌恶性生物学行为及分子机制研究》文中指出目的:本实验主要研究食管鳞癌（esophageal squamous cell carcinoma,ESCC）组织中miR-106b-3p的表达情况,通过体外细胞实验和体内动物实验确认miR-106b-3p的差异表达能够影响ESCC细胞的增殖、迁移、侵袭、黏附和上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）进程。通过Target Scan以及双荧光素酶报告实验预测及验证miR-106b-3p在ESCC调控中的靶基因。最后,深入探讨miR-106b-3p调控ESCC恶性生物学功能的机制。方法:1、收集苏州大学附属第一医院和邯郸市第一医院的ESCC组织和癌旁样本3对,应用Agilent miRNAs表达谱芯片技术筛选出差异表达的miRNAs;2、RT-qPCR检测差异比较大的miR-106b-3p的表达水平;3、RT-qPCR检测miR-106b-3p在ESCC细胞株（KYSE150、ECA109和EC9706）和人正常食管上皮细胞（HET-1A）中的表达;MTT-8和克隆形成实验检测ESCC细胞株（KYSE150、ECA109和EC9706）和人正常食管上皮细胞（HET-1A）的增殖能力;4、将合成的miR-106b-3p mimics NC、miR-106b-3p mimics、miR-106b-3p inhibitors NC及miR-106b-3p inhibitors转染至ESCC细胞株（ECA109和KYSE150）中,RT-qPCR检测转染效率;MTT和克隆形成实验检测miR-106b-3p对ESCC细胞株（ECA109和KYSE150）增殖能力的影响,流式周期实验观察对周期分布的影响,Western blot实验观察对细胞周期、迁移、侵袭及EMT相关蛋白表达的影响,划痕实验观察对细胞非定向迁移能力的影响,Transwell迁移实验观察对细胞定向迁移能力的影响,Transwell侵袭移实验观察对细胞侵袭能力的影响,光镜观察细胞形态的变化,细胞黏附实验观察对细胞黏附能力的影响;5、构建ESCC细胞株（ECA109）裸鼠移植瘤模型,观察miR-106b-3p对ESCC细胞株移植瘤生长的作用;6、免疫荧光和Western blot实验检测ZNRF3在ESCC细胞株（KYSE150、ECA109和EC9706）和人正常食管上皮细胞（HET-1A）中的表达;RT-qPCR、Western blot和免疫荧光实验检测ESCC细胞株（ECA109和KYSE150）转染miR-106b-3p mimics NC、miR-106b-3p mimics、miR-106b-3p inhibitors NC及miR-106b-3p inhibitors后ZNRF3 m RNA和蛋白的表达;Target Scan预测miR-106b-3p的靶基因,双荧光素酶报告实验验证miR-106b-3p的靶基因;7、RT-qPCR和Western blot检测miR-106b-3p对ESCC细胞株（ECA109和KYSE150）中Wnt/β-catenin信号通路的影响。结果:1、利用Agilent miRNAs表达谱芯片筛选出62个ESCC差异表达的miRNAs,其中ESCC表达上调的miRNAs 41个,下调的miRNAs 21个;2、RT-qPCR实验结果显示miR-106b-3p在ESCC临床组织样本的表达水平要显着高于其在癌旁中的表达;3、RT-qPCR结果显示miR-106b-3p在ESCC细胞株（KYSE150、ECA109和EC9706）中的表达要显着高于其在人正常食管上皮细胞（HET-1A）的表达;MTT和克隆形成实验结果显示ESCC细胞株（KYSE150、ECA109和EC9706）的增殖能力要显着高于人正常食管上皮细胞（HET-1A）;4、转染miR-106b-3p inhibitors后,ESCC细胞株（ECA109和KYSE150）中miR-106b-3p的表达水平显着降低,转染miR-106b-3p mimics后,ESCC细胞株（ECA109和KYSE150）中miR-106b-3p的表达水平显着升高;MTT实验表明转染miR-106b-3p inhibitors后ESCC细胞株（ECA109和KYSE150）的增殖能力显着降低,而转染miR-106b-3p mimics后的增殖能力显着增强;克隆形成实验验表明转染miR-106b-3p inhibitors后ESCC细胞株的克隆形成能力显着降低,而转染miR-106b-3p mimics后的克隆能力显着增强;流式周期实验表明转染miR-106b-3p inhibitors后ESCC细胞株细胞阻滞在G1期,而转染miR-106b-3p mimics后的G1比例显着下调,且miR-106b-3p inhibitors能够显着抑制Cyclin D1蛋白的表达,促进p21和p27的表达,而miR-106b-3p mimics能够显着促进Cyclin D1蛋白的表达,抑制p21和p27的表达;划痕实验和Transwell迁移表明转染miR-106b-3p inhibitors后ESCC细胞株的迁移能力显着降低,而转染miR-106b-3p mimics后的迁移显着增强;Transwell侵袭实验表明转染miR-106b-3p inhibitors后ESCC细胞株的侵袭能力显着降低,而转染miR-106b-3p mimics后的侵袭显着增强;Western blot实验表明,miR-106b-3p inhibitors能够显着抑制MMP-2和MMP-9蛋白的表达,而miR-106b-3p mimics能够显着促进MMP-2和MMP-9蛋白的表达;细胞形态和黏附实验表明,miR-106b-3p inhibitors能够抑制ESCC细胞株对collagen I、collagen IV和fibronectin的黏附,而miR-106b-3p mimics能够增强对collagen I、collagen IV和fibronectin的黏附;Western blot实验表明,miR-106b-3p inhibitors能够显着抑制Snail、N-cadherin和Vimentin蛋白的表达,促进E-cadherin蛋白的表达,而miR-106b-3p mimics能够显着促进Snail、N-cadherin和Vimentin蛋白的表达,抑制E-cadherin蛋白的表达;5、裸鼠移植瘤实验表明,抑制miR-106b-3p的表达能够显着抑制移植瘤的生长,而促进miR-106b-3p的表达则显着促进移植瘤的生长;6、免疫荧光和Western blot实验表明ZNRF3在ESCC细胞株（KYSE150、ECA109和EC9706）的表达要显着低于其在人正常食管上皮细胞（HET-1A）中的表达;RT-qPCR、Western blot和免疫荧光实验结果表明,ESCC细胞株（ECA109和KYSE150）转染miR-106b-3p mimics后,ZNRF3 m RNA和蛋白的表达显着降低,转染miR-106b-3p inhibitors后,ZNRF3 m RNA和蛋白的表达显着升高;Target Scan预测ZNRF3是miR-106b-3p的潜在靶基因,且双荧光素酶报告实验验证ZNRF3是miR-106b-3p的靶基因;7、RT-qPCR结果显示抑制miR-106b-3p的表达可以显着抑制Wnt和β-catenin m RNA的表达,促进GSK3βm RNA的表达;促进miR-106b-3p的表达可以显着促进Wnt和β-catenin m RNA的表达,降低GSK3βm RNA的表达。Western blot实验示抑制miR-106b-3p的表达可以显着抑制Wnt和β-catenin蛋白的表达,上调p-GSK3β蛋白的表达;促进miR-106b-3p的表达可以显着促进Wnt和β-catenin蛋白的表达,降低p-GSK3β蛋白的表达。结论:1、miR-106b-3p在食管鳞癌临床样本中显着高表达;2、miR-106b-3p可以显着促进食管鳞癌细胞株的增殖、周期、迁移、侵袭、黏附及EMT进程;能够显着促进食管鳞癌细胞移植瘤的生长;3、miR-106b-3p能够靶向作用于ZNRF3;4、miR-106b-3p可以显着促进Wnt/β-catenin信号通路的表达。
胡晓晖[9]（2019）在《miR-221在骨肉瘤细胞中的作用及机制研究》文中进行了进一步梳理第一部分miR-221在骨肉瘤细胞中的表达情况目的:1.研究不同骨肉瘤细胞系中miR-221相对于人成骨细胞（对照）的表达水平,观察是否有一致性的上调或下降。2.从多种骨肉瘤细胞系中筛选出合适的细胞系进一步实验研究。方法:1.对人骨肉瘤HOS,SaOS2,MG63,U-20S细胞,人类成骨细胞系（hFOB1.19）进行细胞培养。2.通过qRT-PCR测定各骨肉瘤细胞系和人类成骨细胞系miR-221的表达水平。结果:1.人类成骨细胞系（hFOB1.19）miR-221表达的相对值:0.031759±0.004444;HOS 细胞 miR-221 表达的相对值:0.037717±0.003754;SaOS2 细胞 miR-221 表达的相对值:0.056151±0.003706;MG63 细胞 miR-221 表达的相对值:0.104026+0.013724;U-20S细胞miR-221表达的相对值:0.144812±0.010018。各组骨肉瘤细胞miR-221表达的相对值与对照组比较均有统计学差异（P<0.05）。2.MG63,U-20S细胞的miR-221表达的相对值与对照组比较均有显着的统计学差异（P<0.01）,MG63和U-20S细胞miR-221的表达水平升高特别明显。结论:不同骨肉瘤细胞系的miR-221表达水平相较于人类成骨细胞系显着升高。MG63和U-20S细胞的miR-221表达水平升高特别明显,筛选出进行下一步实验。第二部分miR-221抑制剂对骨肉瘤细胞系的生物学行为的影响目的:研究miR-221抑制剂对骨肉瘤细胞增殖、周期、凋亡、迁移和侵袭能力的影响,为进一步的机制研究提供依据。方法:1.通过qRT-PCR法检测miR-221抑制剂或NC抑制剂分别转染的MG63和U-20S细胞中miR-221的表达水平。2.MTT实验检测miR-221抑制剂或NC抑制剂分别转染的MG63和U-20S细胞在0,24,48和72小时的增殖情况。3.流式细胞仪检测分析miR-221抑制剂或NC抑制剂分别转染成功后MG63和U-20S细胞的周期和凋亡情况。4.通过transwell小室实验检测miR-221抑制剂或NC抑制剂分别转染成功后MG63和U-20S细胞的迁移、侵袭能力。结果:1.miR-221抑制剂显着下调MG63和U-20S细胞的miR-221表达水平（P<0.01）。miR-221表达的下降证明了细胞转染miR-221抑制剂的成功。2.与NC抑制剂转染相比较,miR-221抑制剂转染的MG63和U-20S细胞的增殖在24（P<0.01）,48（P<0.01）和72（P<0.01）小时3个时间点是显着下降的。3.miR-221抑制剂转染的MG63和U-20S细胞的G0-G1期细胞百分比和细胞凋亡率都是显着增加的（p<0.01）。4.miR-221抑制剂转染的MG63和U-20S细胞发生迁移和侵袭的数量显着下降（P<0.01）。结论:miR-221表达水平的下调能够显着抑制MG63和U-20S细胞的增殖,促进MG63和U-20S细胞的凋亡以及细胞周期停滞,能显着抑制MG63和U-20S细胞的迁移和侵袭能力。第三部分 miR-221在骨肉瘤细胞中作用的机制研究目的:1.寻找miR-221的靶基因。2.通过改变靶基因表达,研究对骨肉瘤细胞生物学行为的影响。3.找出miR-221在骨肉瘤细胞中的作用机制。方法:1.靶区扫描分析寻找miR-221的靶基因。2.将 pGL3-CDNK1B-3’-UTR（野生型或突变质粒）与 pRL-SV40 和 miR-NC（对照）或miR-221模拟物共转染到MG63和U-20S细胞中,检测相对荧光素酶活性。3.通过 qRT-PCR,Western blot 检测 miR-NC 或 miR-221 模拟物转染 MG63 和U-20S细胞后的CDKN1B/p27表达水平。4.下调CDKN1B表达水平,检测其对U-20S细胞增殖、周期、凋亡、迁移和侵袭能力的影响。5.Western blot 检测 p27,Cyclin E,Cyclin D1,Bax,Bcl-2,Caspase-3,Snail和Twist1的蛋白质表达。结果:1.CDKN1B/p27 是 miR-221 的结合靶标。2.miR-221模拟物转染组的相对荧光素酶活性显着降低（P<0.01）。荧光素酶活性测定显示miR-221的过表达通过结合后者3’-UTR位点抑制了 CDKN1B/p27的转录。3.转染miR-221模拟物后,CDKN1B mRNA在MG63和U-20S细胞的表达水平显着下调（P<0.01）,p27蛋白水平显着降低（P<0.05）。4.miR-221抑制剂+siCDKN1B转染显着增加U-20S细胞增殖能力（P<0.01）,显着抑制G0/G1停滞（P<0.01）,显着降低细胞凋亡率（P<0.01）,细胞发生迁移、侵袭的数量显着上升（p<0.01）。5.miR-221抑制剂显着增加U-20S细胞中Bax和Caspase-3的蛋白表达水平（P<0.01）,降低 Cyclin E,Cyclin D1,Bcl-2,Snail 和 Twist1 的蛋白表达水平（P<0.01）。然而,当U-20S细胞中CDKN1B的水平下调后,显着逆转了 miR-221抑制剂诱导的这些蛋白质表达（P<0.01）。结论:miR-221通过靶向作用于CDKN1B/p27调节骨肉瘤细胞增殖、周期、凋亡、迁移和侵袭,miR-221/CDKN1B/p27在骨肉瘤中起功能性作用,骨肉瘤细胞中miR-221下调的作用特别依赖于CDKN1B的增加。
邓志成[10]（2019）在《MicroRNA-221在肝细胞癌中作用及其机制研究》文中研究指明肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma HCC）是世界上最常见、恶性程度最高的肿瘤之一,在东亚及我国尤为明显。HCC总体预后目前仍然很差,主要原因之一是术后较高的转移复发率,因此深入探索HCC转移复发机制及其关键调控环节对于改善HCC患者的预后以及为HCC治疗提供新的治疗靶点具有十分重要的意义。微小RNA是一类由内源基因编码的长度约22nt的非编码单链RNA分子,通过与靶基因的3’UTR（3’Untranslational region）互补配对导致的mRNA降解或翻译抑制,所以能在转录后水平上对基因的表达进行负调控,从而参与发育、增殖、分化、凋亡等多种生物过程,同时miRNA的异常表达也参与了一些肿瘤的发生和发展,目前许多研究证实一些miRNA在HCC的发生、细胞增殖和凋亡、肿瘤的血管生成、侵袭和转移等方面发挥着重要的作用。因此,miRNA可能作为HCC转移新的治疗靶点和预测治疗。miRNA221是近几年逐渐引起关注的一种肿瘤相关的miRNA,受其调控的靶基因以及这些靶基因的功能也在陆续地得到揭示,有研究利用miRNA芯片技术发现miR-221在原发性肝癌中高表达,提示miR-221在肝癌的发生中发挥重要作用,然而miR-221在HCC中潜在的分子机制目前仍然不是很清楚。本研究中,我们探讨了 miR-221对HCC的预测价值以及发生和发展中的功能,进一步阐明miR-221调控HCC的潜在机制。第一部分miR-221在人肝癌组织、肝癌细胞系中的表达水平及其对HCC预后的影响目的:本研究通过检测HCC组织、HCC细胞株中miR-221表达水平,评估miR-221与HCC转移复发的关系及其对HCC预后的影响。方法:利用Real-time RT-PCR检测156例HCC组织（包括40例配对的癌旁组织）以及HCC细胞株miR-221的表达水平、分析miR-221在HCC组织和不同转移潜能细胞株的表达情况。Kaplan-Meier法绘制HCC患者的累积生存时间以及无瘤生存时间曲线,以log-rank法进行了组间比较。采用Cox 比例风险模型进行单因素和多因素生存分析,确定miR-221表达水平是否为HCC独立的预后预测指标。结果:（1）miR-221在HCC细胞株表达显着上升,并且表达量与HCC细胞株转移潜能呈正相关,与正常肝细胞株相比,HCC细胞株miR-221表达水平都显着上升（P<0.01）,低转移潜能组miR-221表达水平显着低于高转移潜能组（P<0.01）。（2）HCC组织miR-221水平与HCC的转移复发呈正相关:与相对应的癌旁组织相比,HCC组织miR-221表达水平显着增高（P<0.01）,与无转移HCC组织相比,伴转移HCC组织miR-221表达水平显着增高（P<0.01）,同时伴复发HCC组织miR-221表达水平显着高于无复发HCC组织（P<0.01）。（3）HCC组织中miR-221高表达的患者显示更短的总生存时间,两者之间比较有显着差异性（P=0.0002）。miR-221高表达的患者显示更高的复发率,两者之间比较有显着差异性（P<0.0001）（4）单因素、多因素分析提示miR-221是预测HCC患者预后的独立指标。结论:miR-221在HCC患者中表达上调,与HCC的转移和复发呈正相关。miR-221是HCC预后的一个独立预测指标。第二部分miRNA221调控REDD1以及mTOR信号通路对肝细胞癌侵袭和转移机制的研究目的:本研究通过对miR-221体外和体内功能试验的研究进一步验证并阐述miR-221参与调控HCC生长侵袭表型的相关分子机制。方法:通过慢病毒转染来沉默miR-221,获得稳定miR-221抑制细胞株HCCLM3,运用Transwell小室系统以及划痕实验来评价细胞的侵袭和迁移能力;流式细胞术检测细胞周期和凋亡情况;MTT法检测细胞生长抑制率改变;细胞克隆实验来验证细胞的克隆能力,同时利用数据库靶基因预测以及双荧光素酶报告基因检测,找到miR-221下游的靶基因REDD1,并通过皮下成瘤模型,验证细胞的成瘤能力,利用RT-PCR、Western Blot、免疫组化技术检测mTOR通路相关分子的表达情况。结果:（1）miR-221沉默抑制体外HCC细胞增殖、迁移和侵袭,诱导细胞周期阻滞,促进细胞凋亡。（2）REDD1是miR-221下游的靶基因,miR-221表达沉默明显上调含有野生型的REDD1 3UTR的荧光素酶活动,而对含有突变型的REDD1 3’UTR的荧光素酶活动没有影响。（3）miR-221通过mTOR信号通路调节HCC侵袭,mTOR信号通路的关键明星分子包括PI3K、Akt、mTOR、PTEN等均受miR-221的调控,miR-221沉默后mTOR、Akt、PI3K、S6K1表达量下调,PTEN、4EBP1表达量上调.（4）miR-221沉默在体外促进HCC肿瘤生长。结论:miR-221在体内和体外调控HCC的生长、迁移、侵袭和转移,并通过REDD1及mTOR信号通路介导发挥对HCC的调控作用。
二、肝细胞癌组织中PTEN和p27蛋白的表达（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、肝细胞癌组织中PTEN和p27蛋白的表达（论文提纲范文）
（1）乏氧诱导因子-1α与肝细胞癌患者预后生存相关性分析（论文提纲范文）
| 1 对象与方法 |
| 1.1 对象 |
| 1.2 纳入标准与分组 |
| 1.3 检测指标 |
| 1.4 样本制备及检测 |
| 1.5 统计学处理 |
| 2 结果 |
| 2.1 一般临床资料 |
| 2.2 免疫组织化学染色 |
| 2.2.1 HIF-1α表达 |
| 2.2.2 GLUT-1与LDHA表达癌细胞代谢功能增强， |
| 2.2.3 VEGF表达 |
| 2.2.4 p-Akt和p-m TOR表达 |
| 2.2.5 PTEN和p27表达 |
| 2.3 HIF-1α与其他指标的相关性分析 |
| 2.4 预后生存与危险因素分析 |
| 3 讨论 |
（2）Sirt6及其抑制剂OSS＿128167在弥漫大B细胞淋巴瘤中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语表 |
| 第一部分 Sirt6在弥漫大B细胞淋巴瘤中的表达、生物学作用及临床意义 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图表 |
| 第二部分 Sirt6特异性抑制剂OSS＿128167在弥漫大B细胞淋巴瘤中的生物学作用前 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图表 |
| 第三部分 Sirt6通过激活PI3K/Akt信号通路促进弥漫大B细胞淋巴瘤的生长 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图表 |
| 参考文献 |
| 中文综述 Sirt6在肿瘤中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文目录 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| English article Ⅰ |
| English article Ⅱ |
（3）囊泡蛋白分选相关蛋白35通过激活PI3K/AKT信号通路促进肝细胞癌增殖的机制研究（论文提纲范文）
| 中英缩略语名词对照 |
| 摘要 |
| abstract |
| 前言 |
| 第一部分 筛选潜在的肝癌相关基因 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第二部分 VPS35促进肝细胞癌增殖 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第三部分 VPS35通过激活PI3K/AKT信号通路促进肝细胞癌增殖 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第四部分 VPS35通过促进细胞膜上FGFR3受体的分选和转运激活下游PI3K/AKT信号 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 Rettromer复合物的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 攻读学位期间发表论文,申请课题和专利,参加会议及获奖情况 |
（4）LncRNA TUG1通过调节miR-221/PTEN轴提高非小细胞肺癌化疗敏感性的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩写 |
| 引言 |
| 第一部分 化疗敏感组和化疗抵抗组NSCLC肿瘤组织lncRNA TUG1表达情况和临床病理特征 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 lncRNA TUG1对非小细胞肺癌细胞生物学特性及化疗敏感性影响的研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 lncRNA TUG1通过miR-221/PTEN轴调节非小细胞肺癌化疗敏感性的机制研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述 TUG1:肿瘤发生发展中的重要lncRNA |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（5）MicroRNA-31-5p调控14-3-3ε影响前列腺癌细胞增殖及凋亡的分子机制研究（论文提纲范文）
| 英文缩略表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 文献综述 |
| 1.前列腺癌(Prostate Cancer,PCa) |
| 1.1 PCa的发病率和死亡率 |
| 1.2 PCa发病的遗传因素 |
| 1.3 PCa发生发展的分子机制 |
| 2.miRNAs与PCa |
| 2.1 MicroRNA与表观遗传 |
| 2.2 miRNA的表观遗传调控和PCa的关系 |
| 2.3 PCa中具有癌基因作用的miRNAs |
| 2.4 PCa中具有抑癌基因作用的miRNAs |
| 2.5 miRNAs在PCa诊断、治疗中的应用 |
| 3.14-3-3蛋白 |
| 3.1 14-3-3蛋白的结构与分子功能 |
| 3.2 14-3-3蛋白的细胞生物学功能 |
| 3.3 14-3-3蛋白与肿瘤 |
| 4.14-3-3蛋白与PCa |
| 4.1 通过自身表观遗传学修饰在PCa中发挥作用 |
| 4.2 通过影响与PCa发生相关的关键蛋白的细胞定位发挥作用 |
| 4.3 通过提高或降低自身表达水平发挥作用 |
| 5.本研究目的意义 |
| 6.研究技术路线 |
| 第一章 14-3-3ε在 PCa组织和细胞中的表达及其对22Rv1细胞增殖的影响 |
| 1.前言 |
| 2.材料 |
| 2.1 细胞系 |
| 2.2 主要试剂 |
| 2.3 主要仪器 |
| 3.方法 |
| 3.1 14-3-3ε基因荧光定量PCR引物的设计和合成 |
| 3.2 14-3-3ε基因siRNA的设计及合成 |
| 3.3 细胞培养和细胞转染 |
| 3.4 实时荧光定量PCR(q RT-PCR) |
| 3.5 细胞蛋白提取及Western blotting检测 |
| 3.6 CCK-8试验检测细胞的增殖能力 |
| 3.7 Transwell试验检测细胞的侵袭能力 |
| 3.8 细胞划痕实验检测细胞的迁移能力 |
| 3.9 数据分析 |
| 4.结果 |
| 4.1 14 -3-3ε基因在PCa组织和细胞中呈明显上调趋势 |
| 4.2 siRNA-4对14-3-3ε基因具有较强的干扰效率 |
| 4.3 干扰14-3-3ε基因对PCa细胞增殖、侵袭和迁移的影响 |
| 5.讨论 |
| 6.小结 |
| 第二章 调控14-3-3ε表达的microRNAs筛选及功能验证 |
| 1.前言 |
| 2.材料 |
| 2.1 细胞系 |
| 2.2 主要试剂 |
| 2.3 主要仪器 |
| 3.方法 |
| 3.1 miRNAs筛选及序列合成 |
| 3.2 引物设计及序列信息 |
| 3.3 细胞转染及qRT-PCR试验 |
| 3.4 双荧光素酶试验筛选调控14-3-3ε表达的最佳miRNAs |
| 3.5 CCK-8试验检测5条miRNA对22Rv1细胞的增殖能力 |
| 3.6 miR-31-5p与14-3-3ε相互作用位点的鉴定 |
| 3.7 统计学处理 |
| 4.结果 |
| 4.1 生物在线软件筛选调控14-3-3ε基因的microRNAs |
| 4.2 五条候选microRNAs在 PCa细胞中的表达 |
| 4.3 五条miRNAs在 PCa各细胞系中转染效率检测 |
| 4.4 五条miRNAs对14-3-3ε表达的影响 |
| 4.5 靶向调控14-3-3ε基因的miRNAs的筛选及鉴定 |
| 4.6 miR-31-5p与14-3-3ε/3’UTR具有直接相互作用 |
| 5.讨论 |
| 6.小结 |
| 第三章 miR-31-5p调控14-3-3ε对22Rv1细胞表型的影响 |
| 1.前言 |
| 2.材料 |
| 2.1 细胞系 |
| 2.2 质粒和菌株 |
| 2.3 主要试剂 |
| 2.4 主要仪器 |
| 3.方法 |
| 3.1 miR-31-5p不同miRNA浓度的细胞转染 |
| 3.2 重组质粒的构建 |
| 3.3 细胞转染 |
| 3.4 Western blot检测细胞转染效率 |
| 3.5 CCK-8检测细胞增殖试验 |
| 3.6 Transwell试验 |
| 3.7 细胞划痕试验 |
| 3.8 细胞周期试验 |
| 3.9 细胞凋亡试验 |
| 3.10 统计学处理 |
| 4.结果 |
| 4.1 miR-31-5p转染24h后转染效率检测 |
| 4.2 miR-31-5p不同转染浓度对14-3-3ε表达的影响 |
| 4.3 miR-31-5p对22Rv1细胞增殖、侵袭和迁移的影响 |
| 4.4 共转染miR-31-5p与14-3-3ε对22Rv1细胞增殖能力的影响 |
| 4.5 共转染miR-31-5p与14-3-3ε对22Rv1细胞侵袭能力的影响 |
| 4.6 共转染miR-31-5p与14-3-3ε对22Rv1细胞迁移能力的影响 |
| 4.7 共转染miR-31-5p与对22Rv1细胞周期的影响 |
| 4.8 共转染miR-31-5p与14-3-3ε对22Rv1细胞凋亡的影响 |
| 5.讨论 |
| 6.小结 |
| 第四章 miR-31-5p调控14-3-3ε对 PI3K/Akt/Bcl-2 信号通路的影响 |
| 1.前言 |
| 2.材料 |
| 2.1 细胞系及质粒载体 |
| 2.2 主要试剂 |
| 2.3 主要仪器 |
| 3.方法 |
| 3.1 细胞转染 |
| 3.2 Western blot检测细胞转染效率 |
| 3.3 数据统计 |
| 4.结果 |
| 4.1 miR-31-5p调控14-3-3ε对 PI3K/AKT/m TOR信号通路关键蛋白表达的影响 |
| 4.2 miR-31-5p调控14-3-3ε对 BCL-2 信号通路关键蛋白表达的影响 |
| 4.3 miR-31-5p调控14-3-3ε影响22Rv1细胞增殖和凋亡的分子机制 |
| 5.讨论 |
| 6.小结 |
| 结论、创新点及展望 |
| 1.结论 |
| 2.创新点 |
| 3.展望 |
| 致谢 |
| 主要参考文献 |
| 附录 |
| 附录Ⅰ:在读博士期间取得的科研成果 |
| 附录Ⅱ:论文涉及的试剂配方 |
（6）miR-23a-3p通过靶向原钙粘蛋白17促进肝细胞癌G1/S细胞周期转化的作用研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 第1章 综述 |
| 1.1 microRNA |
| 1.2 哺乳动物细胞周期 |
| 1.2.1 GO/G1 期转化 |
| 1.2.2 G1/S细胞周期检查点 |
| 1.2.3 G2/M细胞周期检查点 |
| 1.2.4 DNA损伤/复制细胞周期检查点 |
| 1.2.5 蛋白泛素化对细胞周期的调节 |
| 1.3 肝细胞癌中microRNA相关的细胞周期调节机制 |
| 1.3.1 G0/G1 细胞周期转化的microRNA调节 |
| 1.3.2 G1/S细胞周期检查点的microRNA调节 |
| 1.3.3 G2/M 细胞周期检查点的microRNA调节 |
| 1.3.4 DNA损伤/复制细胞周期检查点的microRNA调节 |
| 1.3.5 S/G2 细胞周期转化的microRNA调节 |
| 第2章 引言 |
| 第3章 材料与方法 |
| 3.1 材料 |
| 3.2 实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,RT-q PCR) |
| 3.3 蛋白免疫印迹法(western blotting) |
| 3.4 细胞培养和转染 |
| 3.5 细胞增殖实验 |
| 3.6 细胞周期检测 |
| 3.7 5-乙炔基-2’-脱氧尿苷(5-Ethynyl-2’-deoxyuridine,EdU)渗入实验 |
| 3.8 双荧光素酶报告实验 |
| 3.9 体内皮下肿瘤模型 |
| 3.10 苏木精-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色实验 |
| 3.11 免疫组织化学(immunohistochemistry,IHC)染色 |
| 3.12 统计分析 |
| 第4章 实验结果 |
| 4.1 HCC组织中miR-23a-3p表达上调,PCDH17 表达下调 |
| 4.2 miR-23a-3p促进G1/S细胞周期转化 |
| 4.3 PCDH17是miR-23a-3p的直接靶基因 |
| 4.4 PCDH17 介导miR-23a-3p对 HCC细胞周期的调节 |
| 4.5 体内实验中miR-23a-3p促进HCC移植肿瘤的生长 |
| 第5章 讨论 |
| 第6章 结论 |
| 第7章 创新点与不足 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间取得的科研成果 |
| 致谢 |
（7）SOCS1通过P21-CyclinD1/CDK4调控细胞周期抑制肝细胞癌进展的机制研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 中英文缩略词 |
| 绪论 |
| 参考文献 |
| 第一部分 SOCS1作为肝细胞癌辅助诊断生物标志物的研究 |
| 1 前言 |
| 2 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 SOCS1 在肝细胞癌组织和正常肝脏组织中的m RNA表达数据采集 |
| 3.2 SOCS1 在我院肝细胞癌患者肝组织中的m RNA表达水平检测 |
| 3.3 SOCS1在肝细胞癌患者肝脏组织中的蛋白表达水平检测 |
| 3.4 SOCS1 在肝癌细胞系中的m RNA表达水平检测 |
| 3.5 SOCS1在肝癌细胞系中的甲基化程度 |
| 3.6 肝细胞癌组织中SOCS1表达水平与患者临床病理特征和长期生存的相关性 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 6 参考文献 |
| 第二部分 SOCS1调控细胞周期信号通路对肝癌细胞增殖的影响和机制研究 |
| 1 前言 |
| 2 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 SOCS1在特定肝癌细胞系中的外源性过表达 |
| 3.2 SOCS1在体外实验中抑制肝癌细胞增殖能力并在体内抑制成瘤能力 |
| 3.3 SOCS1 通过泛素化P21 影响Cyclin D1/CDK4 复合体从而抑制肝癌细胞增殖 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 6 参考文献 |
| 综述 SOCS蛋白家族在癌症信号通路中的机制和临床应用前景 |
| 参考文献 |
| 作者简历及在学期间所取得的科研成果 |
（8）miR-106b-3p靶向ZNRF3调控食管鳞癌恶性生物学行为及分子机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 参考文献 |
| 第一章 食管鳞癌组织中microRNAs差异表达谱的筛选及研究 |
| 1.1 差异表达谱的筛选 |
| 1.1.1 材料 |
| 1.1.2 方法 |
| 1.1.3 结果 |
| 1.1.4 讨论 |
| 1.1.5 结论 |
| 1.2 食管鳞癌组织miR-106b-3p的研究 |
| 1.2.1 材料 |
| 1.2.2 方法 |
| 1.2.3 结果 |
| 1.2.4 讨论 |
| 1.2.5 结论 |
| 参考文献 |
| 第二章 miR-106b-3p对食管鳞癌细胞生物学功能的影响 |
| 2.1 对体外细胞生物学功能的影响 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 方法 |
| 2.1.3 结果 |
| 2.1.4 讨论 |
| 2.1.5 结论 |
| 2.2 对裸鼠移植瘤的影响 |
| 2.2.1 材料 |
| 2.2.2 方法 |
| 2.2.3 结果 |
| 2.2.4 讨论 |
| 2.2.5 结论 |
| 参考文献 |
| 第三章 miR-106b-3p调控食管鳞癌分子机制研究 |
| 3.1 miR-106b-3p的靶基因验证及二者关系 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.1.3 结果 |
| 3.1.4 讨论 |
| 3.1.5 结论 |
| 3.2 miR-106b-3p对 Wnt/β-catenin信号通路的影响 |
| 3.2.1 材料 |
| 3.2.2 方法 |
| 3.2.3 结果 |
| 3.2.4 讨论 |
| 3.2.5 结论 |
| 参考文献 |
| 全文小结 |
| 综述:食管癌相关研究进展 |
| 参考文献 |
| 缩略词表 |
| 攻读学位期间公开发表的文章 |
| 致谢 |
（9）miR-221在骨肉瘤细胞中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 miR-221在骨肉瘤细胞中的表达情况 |
| 1.前言 |
| 2.材料和方法 |
| 3.结果 |
| 4.讨论 |
| 5.参考文献 |
| 第二部分 miR-221抑制剂对骨肉瘤细胞的生物学行为的影响 |
| 1.前言 |
| 2.材料和方法 |
| 3.结果 |
| 4.讨论 |
| 5.参考文献 |
| 第三部分 miR-221在骨肉瘤细胞中的作用机制研究 |
| 1.前言 |
| 2.材料和方法 |
| 3.结果 |
| 4.讨论 |
| 5.参考文献 |
| 结论 |
| 综述一 |
| 参考文献 |
| 综述二 |
| 参考文献 |
| 缩略词表 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 致谢 |
（10）MicroRNA-221在肝细胞癌中作用及其机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 miRNA221在人肝癌组织、肝癌细胞系中的表达及意义 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 miRNA221调控REDD 1以及mTOR信号通路对肝细胞癌侵袭和转移机制的研究 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 主要中英文缩略语对照表 |
| 攻读博士学位期间公开发表的论文 |
| 致谢 |
四、肝细胞癌组织中PTEN和p27蛋白的表达（论文参考文献）
- [1]乏氧诱导因子-1α与肝细胞癌患者预后生存相关性分析[J]. 周林,汪京,赵阳,李瀚,杜国盛,史宪杰,贺强,郎韧. 肝癌电子杂志, 2021(03)
- [2]Sirt6及其抑制剂OSS＿128167在弥漫大B细胞淋巴瘤中的作用及机制研究[D]. 杨娟. 山东大学, 2021(11)
- [3]囊泡蛋白分选相关蛋白35通过激活PI3K/AKT信号通路促进肝细胞癌增殖的机制研究[D]. 张桂冀. 重庆医科大学, 2021(01)
- [4]LncRNA TUG1通过调节miR-221/PTEN轴提高非小细胞肺癌化疗敏感性的研究[D]. 郭盛虎. 河北医科大学, 2021(02)
- [5]MicroRNA-31-5p调控14-3-3ε影响前列腺癌细胞增殖及凋亡的分子机制研究[D]. 赵佳福. 贵州大学, 2020
- [6]miR-23a-3p通过靶向原钙粘蛋白17促进肝细胞癌G1/S细胞周期转化的作用研究[D]. 项一恩. 吉林大学, 2020(08)
- [7]SOCS1通过P21-CyclinD1/CDK4调控细胞周期抑制肝细胞癌进展的机制研究[D]. 丁俊. 浙江大学, 2020(01)
- [8]miR-106b-3p靶向ZNRF3调控食管鳞癌恶性生物学行为及分子机制研究[D]. 乔冠恩. 苏州大学, 2019(06)
- [9]miR-221在骨肉瘤细胞中的作用及机制研究[D]. 胡晓晖. 苏州大学, 2019(04)
- [10]MicroRNA-221在肝细胞癌中作用及其机制研究[D]. 邓志成. 苏州大学, 2019(04)