一、急性白血病多药耐药相关蛋白及P糖蛋白表达与临床耐药的关系（论文文献综述）
赵欢[1]（2020）在《复方浙贝颗粒逆转小鼠急性淋巴细胞白血病多药耐药的研究》文中指出急性淋巴细胞白血病（acute lymphoblastic leukemia,ALL）是造血系统常见的恶性肿瘤,以克隆性增殖异常分化的恶性细胞浸润骨髓、血液及其他组织为特点,是全球最常见的儿童恶性肿瘤之一,约占成人白血病的20%。化疗、造血干细胞移植及生物靶向治疗是其主要手段,目前的化疗使将近80%的患者缓解期达到10年以上,随着复发现象的发生,最终治愈率约为25～40%[1]。骨髓移植及多药联合强化治疗方案的应用,ALL临床治愈率进一步提高,但仍有一些患者治疗效果不佳,研究表明,白血病细胞对化疗药物耐药是ALL复发和难治的重要因素[2-4]。因此发现逆转ALL多药耐药的药物对增加化疗药物的敏感性,提高临床疗效具有重要意义。复方浙贝颗粒是我科陈信义教授针对急性白血病“痰瘀互阻”基本病机拟定的针对白血病复发难治的中药复方,在前期大量的临床研究中发现,复方浙贝颗粒联合化疗可减轻急性髓系白血病（AML）患者的临床症状,提高临床缓解率,并在基础研究中证实复方浙贝颗粒可以降低AML多药耐药相关耐药蛋白和基因的表达,从而提高化疗敏感性,对AL的治疗具有重要意义,为验证复方浙贝颗粒是否在ALL的治疗中具有类似的机制,我们复制了小鼠ALL耐药模型,从药效学和逆转多药机制的角度观察复方浙贝颗粒的有效性,为临床用药提供理论依据。目的1.构建L1210/CDDP皮下移植瘤小鼠模型,从药效学和多药耐药机制角度观察复方浙贝颗粒对急性淋巴细胞白血病的作用。2.构建L1210/CDDP尾静脉小鼠模型,从药效学探讨复方浙贝颗粒对尾静脉模型小鼠的治疗作用。方法1.L1210/CDDP细胞经维持耐药培养,于小鼠右腋下注射细胞1×106个构建荷瘤ALL模型,观察复方浙贝颗粒对该模型小鼠的治疗作用。2.应用real-time PCR方法观察复方浙贝颗粒对荷瘤ALL小鼠瘤块组织Mdr-1基因表达的影响;免疫组化法观察复方浙贝颗粒对荷瘤ALL小鼠瘤块组织p-gp、GST、TopoⅡ、Bcl-2、Bax 表达的影响。3.构建L1210/CDDP尾静脉模型,观察复方浙贝颗粒对L1210/CDDP尾静脉模型小鼠的治疗作用。结果1.注射细胞7天后成功复制L1210/CDDP模型,复方浙贝颗粒联合顺铂干预后可减小荷瘤小鼠的肿瘤体积,减轻瘤质量,增加抑瘤率,并延长生命时长。2.与模型组比较,CDDP 组 Mdr-1、p-gp、Topo Ⅱ、bax 表达升高,GST、Bcl-2 表达降低,（P<0.05）。与CDDP组比较,中剂量复方浙贝组、中剂量联合组Mdr-1表达升高;中剂量复方浙贝组、低、中、高剂量联合组P-gp表达升高;高剂量联合组TopoⅡ表达升高;中剂量复方浙贝组、低剂量联合组GST表达升高,中、高剂量联合组GST表达降低;中剂量复方浙贝组Bcl-2表达升高,高剂量联合组Bcl-2表达降低;中剂量联合组Bax表达升高（P<0.05）。3.尾静脉注射L1210/CDDP细胞21d后,随机抽取6只小鼠,取骨髓,作涂片,观察计算原始细胞比例在5～15%之间。外周血未见骨髓原始细胞外排,与正常对照组相比,模型组白细胞计数、血小板数降低（P<0.05）;与模型组相比,低剂量联合组生存期延长、骨髓原始细胞比例降低（P<0.05）;与CDDP组相比,低剂量联合组血红蛋白含量、白细胞计数、血小板计数升高（P<0.05）。结论复方浙贝颗粒联合顺铂可延长L1210/CDDP荷瘤小鼠生存期,减小肿瘤质量、体积,增加肿瘤抑制率;对于L1210/CDDP尾静脉模型可延长小鼠生命期、降低骨髓原始细胞比例,保护血象,从而起到治疗作用,即可以提高两种ALL耐药模型治疗效果并可通过Mdr-1、P-gp、GST、Bcl-2、Bax机制逆转L1210/CDDP多药耐药,增强化疗有效性。
王珍珍[2]（2016）在《维药异常黑胆质成熟剂总黄酮对K562/ADR细胞多药耐药的研究》文中进行了进一步梳理目的:研究异常黑胆质成熟剂总黄酮对白血病K562/ADR细胞株多药耐药（MDR）的影响。方法:不同浓度的总黄酮联合不同浓度的ADR作用于体外培养的K562/ADR细胞株,用四甲基偶氮噻唑蓝（MTT）法检测K562/ADR的存活及耐药逆转,Real-Time PCR方法检测耐药相关基因ABCB-1及ABCC-1和BCL-2的表达,用Western Blot方法分析总黄酮对K562/ADR细胞耐药相关蛋白ABCC-1、ABCB-1、BCL-2表达的影响。结果:异常黑胆质成熟剂总黄酮可以抑制K562/ADR细胞的增值,且呈剂量依赖性,并且可以下调K562/ADR细胞耐药基因ABCB-1、ABCC-1及凋亡相关基因BCL-2的表达,并下调耐药相关蛋白ABCC-1、ABCB-1、BCL-2表达。结论:异常黑胆质成熟剂总黄酮通过下调K562/ADR细胞耐药相关基因ABCB-1、ABCC-1、凋亡相关基因BCL-2及其相关蛋白ABCC-1、ABCB-1、BCL-2表达的机制,促使癌细胞凋亡,逆转K562/ADR细胞的多药耐药。
黄山[3]（2011）在《复方浙贝颗粒改善难治性急性白血病患者生存的临床观察》文中研究指明对化疗反应差,诱导缓解率低,病死率高是难治性急性白血病的主要特点。目前,轮换化疗方案与加大化疗药物剂量为治疗难治性白血病的主要手段,但临床上仍只有30%-45%的缓解率。除此之外,难治性白血病尚存在持续缓解时间短,易复发,生存期短等问题。因此,在提高难治性白血病患者缓解率同时,延长其持续缓解时间以及降低其死亡率,也具有重要意义。本临床研究为“十一五”国家科技支撑计划《难治性急性白血病围化疗期中医干预治疗方案临床应用研究》的部分内容。研究目的：观察以“复方浙贝颗粒”为主的中医干预治疗方案,对难治性急性白血病患者持续缓解时间、中位生存时间,以及患者复发率、死亡率等方面的影响。研究方法：依据科技部关于“国家科技支撑计划”要求与GCP规范,采用随机双盲、安慰剂对照、多中心协作的临床试验原则,在围化疗期对238例难治性急性白血病患者实施中医干预治疗方案与西医标准化疗方案联合应用,并对一个标准化疗疗程结束后取得完全缓解的受试者开始随访,了解其持续缓解时间、生存时间,复发率及死亡率等情况。进入统计病例共41例,其中浙贝组20例,对照组21例。研究结果：治疗组与对照组比较：①浙贝组和对照组的中位持续缓解时间分别为172天、115天；中位生存期分别为363天、201天,均无明显差异（P>0.05）。但浙贝组在持续缓解时间及生存期上更有优势。②浙贝组在3个月内、6个月内、1年内以及总复发率分别为30%、50%、70%、90%,均低于对照组的42%、76%、90.48%、90.48%,无统计学意义（P>0.05）。浙贝组有降低复发率的趋势。③浙贝组的死亡率为80%,与对照组的85.71%相比,低了5.7个百分点,两组无统计学意义（P>0.05）。但浙贝组有降低死亡率的趋势。与国外文献比较：浙贝组的中位持续缓解时间及中位生存时间与近几年国外相关文献比较,均有一定优势。结论：复方浙贝颗粒具有延长难治性急性白血病患者持续缓解时间,提高患者生存时间,降低患者复发率以及死亡率等趋势。
吴遐,王俊和[4]（2010）在《急性白血病多药耐药研究进展》文中认为肿瘤细胞对多种化疗药物产生交叉耐药性称为多药耐药（multidrug resistance,MDR）,它是造成急性白血病治疗效果不良甚至化疗失败的重要原因。近20多年大量研究发现多药耐药的发生除了经典的MDR1还存在多种机制、多个环节,它们可以是独立存在,也可两种或多种因素联合作用引起多药耐药。因此,对MDR机制研究成为急性白血病治疗上亟待解决的问题,它可以帮助制定有效的治疗方案,从而改善白血病患者的治疗效果。
杨景柯[5]（2010）在《线粒体ATP酶β亚单位在急性白血病多药耐药中的作用及调控机制研究》文中研究表明研究背景急性白血病（AL）是最常见的血液系统恶性肿瘤。对化疗药物产生多药耐药（MDR）是AL患者治疗失败的主要原因。虽然肿瘤细胞MDR的产生机制已经得到广泛研究,一些新的耐药逆转措施也在临床得以应用,但是MDR现象的分子机制仍未能完全阐明,且目前临床的耐药逆转措施治疗效果十分有限。因此,寻找新的耐药环节及分子靶位,并探讨白血病细胞耐药机制及逆转措施,对于提高AL治疗的有效率具有重要的临床意义。研究表明线粒体不仅控制机体细胞的能量代谢,而且在维持细胞钙稳态,调节细胞凋亡等过程中起着关键作用。线粒体ATP酶是线粒体能量转化的核心酶,其β亚单位（β-F1-ATPase）是氧化磷酸化合成ATP的限速组分。有研究发现β-F1-ATPase在多种实体肿瘤中表达下降。由于线粒体ATP酶表达降低或缺失,可导致细胞氧化磷酸化受阻,ATP产生减少,线粒体相关的细胞凋亡受抑,从而使肿瘤细胞对化疗和放疗产生耐受,并“赋予”线粒体ATP酶与凋亡耐受的化疗耐药相关的新的“含义”。新近研究发现线粒体ATP酶表达下调与结肠癌细胞对5-氟尿嘧啶耐药相关,然而耐药产生的机制并不清楚。近年研究表明,恶性肿瘤细胞中特定基因的启动子区域CpG岛甲基化异常及基因的转录活性改变与MDR的形成存在着内在联系。我们课题组在前期的研究中发现,β-F1-ATPase表达下调与慢性粒细胞白血病（CML）对阿霉素（ADR）耐药有关：进一步研究提示β-F1-ATPase基因启动子区域高甲基化与CML耐药有关。本研究立足于前期的[作基础,探讨β-F1-ATPase在AL患者原代细胞中的表达与临床疗效及体外对ADR药敏性的关系,以及原代细胞β-F1-ATPase启动子区甲基化对耐药的影响,以期在探索AL新的潜在的耐药机制,定位新的逆转耐药的分子靶点上有所突破。第一部分线粒体ATP酶p亚单位在急性白血病患者骨髓原代细胞中的表达及与临床疗效和体外药敏的关系目的：探讨线粒体ATP酶ββ亚单位（β-F1-ATPase）的异常表达在AL患者多药耐药中的作用。方法：以82例AL患者为研究对象,其中包括51例急性髓细胞白血病（AML）患者和31例急性淋巴细胞白血病（ALL）患者,另设11例骨髓相对正常非血液肿瘤患者作为对照。根据临床耐药诊断标准,将AL患者分为临床化疗敏感组和临床化疗耐药组。分离受试者骨髓单个核细胞（BMMCs）并原代培养。采用实时定量PCR （RQ-PCR）和Western blot方法分别检测AL患者BMMCs中β-F1-ATPase mRNA和蛋白的表达,比较化疗敏感组和化疗耐药组之间β-F1-ATPase mRNA和蛋白表达水平的差异,并动态观察6例AL患者在初治和首次复发时β-F1-ATPase mRNA表达的变化；用MTT法检测化疗敏感和化疗耐药的AL患者BMMCs体外对ADR的敏感性,并分别分析两组AL患者BMMCs中β-F1-ATPase mRNA和蛋白表达水平与体外药敏的相关性结果：1.β-F1-ATPase mRNA和蛋白在所有AL和对照组BMMCs中均有小同程度的表达。与对照组相比,β-F1-ATPase mRNA和蛋白农达水平在AL患者BMMCs中均显着绛低（P<0.01）。2.与化疗敏感组AL患者相比,化疗耐药组AL患者BMMCs中β-F1-ATPase mRNA和蛋白表达水平均显着降低（P<0.05）。3.与化疗敏感组AML患者相比,化疗耐药组AML患者BMMCs中β-F1-ATPase mRNA和蛋白表达水平显着降低（P<0.05）。而在ALL,化疗耐药组BMMCsβ-F1-ATPase mRNA和蛋白水平较化疗敏感组有降低趋势,但差异无统计学意义（P>0.05）。4.6例初次诱导获完全缓解的AL患者BMMCsβ-F1-ATPase mRNA表达水平在疾病首次复发时较初治时呈显着性降低（P<0.05）。5.ADR对化疗敏感组和化疗耐药组AL患者原代BMMCs的平均半数抑制浓度（IC50）分别为O.94μg/mL和7.39μ/mL,化疗耐药组为化疗敏感组的7.9倍。6.化疗耐药组AL患者BMMCs的β-F1-ATPase mRNA和蛋白表达水平与相应的ADR体外药敏试验IC50值均呈显着性负相关（两者r分别为-0.467与-0.628,P均小于0.05）。结论：AL化疗耐药组骨髓原代细胞存在β-F1-ATPase mRNA和蛋白表达的明显降低,这一降低与细胞体外对ADR的抵抗存在显着相关性,提示AL化疗耐药与β-F1-ATPase活性下调相关。第二部分线粒体ATP酶β亚单位基因启动子区CpG岛甲基化与急性白血病临床耐药的关系目的：探讨β-F1-ATPase基因启动子区CpG岛甲基化状态与AL患者临床耐药的内在联系。方法：以52例AL患者为研究对象（AML患者34例,ALL患者18例）,另设8例骨髓相对正常非血液肿瘤患者作为对照。根据临床耐药诊断标准,将AL患者分为化疗敏感组和化疗耐药组。根据β-F1-ATPase基因启动子区甲基化状况,将AL患者分为甲基化组和非甲基化组。分离骨髓单个核细胞（BMMCs）并原代培养。采用甲基化特异性PCR（MSP）和RQ-PCR分别检测化疗敏感组与化疗耐药组患者BMMCs中β-F1-ATPase基因甲基化状况及mRNA表达,比较化疗敏感组和化疗耐药组之间甲基化阳性率的差异,以及甲基化组与非甲基化组之间β-F1-ATPase mRNA表达的差异；选取11例β-F1-ATPase基因呈完全甲基化且化疗耐药的AL患者,观察其体外培养的BMMCs在应用甲基化抑制剂5-氮杂胞苷（5-Aza）后对ADR耐药逆转情况。结果：1.β-F1-ATPase基因在8例非血液肿瘤患者BMMCs中均呈非甲基化状态,甲基化阳性率为0。52例AL患者BMMCs中β-F1-ATPase基因甲基化阳性率为55.8%2. 25例化疗耐药AL患者BMMCsβ-F1-ATPase基因甲基化阳性率为76%,显着高于27例化疗敏感组AL患者（37%）（P<0.05）。3.16例化疗耐药组AML患者BMMCsβ-F1-ATPase基因甲基化阳性率为81.3%,显着高于18例化疗敏感组AML（38.9%）（P<0.05）。4.52例AL患者、34例AML患者和18例ALL患者中,β-F1-ATPase mRNA在甲基化组患者BMMCs中的表达水平均显着低于非甲基化组患者。5.ADR对11例化疗耐药AL患者BMMCs的IC50在5-Aza干预后（平均值3.14μg/mL）较单用ADR（平均值7.71μg/mL）显着降低（P<0.01）；其β-F1-ATPase mRNA表达水平在5-Aza干预后（平均值0.0704）较未经干预（平均值0.0458）显着增高（P<0.05）。结论：1.AL化疗耐药组与化疗敏感组β-F1-ATPase基因启动子的甲基化状态存在显着差异。化疗耐药组存在高甲基化状态,并影响β-F1-ATPase mRNA表达。2.甲基化抑制剂5-Aza可提高耐药白血病细胞对ADR的敏感性,并上调β-F1-ATPase mRNA表达,有望成为AL逆转耐药的一种新的干预措施。
赵丽[6]（2009）在《孤啡肽对白血病敏感及耐药细胞的调节作用以及恶性血液病预后相关因素分析》文中研究说明目的:近年来,肿瘤细胞抗死亡特性的发现,尤其是发现抗细胞凋亡是肿瘤发生及耐药性产生的重要原因之一。目前,许多新的肿瘤治疗方法都集中在诱导肿瘤细胞凋亡与克服肿瘤细胞的耐药性上。本研究通过观察孤啡肽（OFQ）对体外培养的白血病K562与K562/ADM细胞株细胞生长增殖、凋亡的影响及表达Fas/FasL的变化,探讨OFQ与白血病细胞凋亡的关系及初步探讨孤啡肽对人白血病K562/ADM细胞阿霉素耐药性的逆转作用及其逆转耐药的作用机制。同时应用荧光原位杂交技术对多发性骨髓瘤及慢性淋巴细胞白血病的预后相关因素进行分析,为临床恶性血液病的研究提供理论基础。方法:应用MTT观察了OFQ对白血病K562与K562/ADM细胞株生长增殖的影响;应用流式细胞仪等技术检测了OFQ对白血病K562与K562/ADM细胞株的诱导凋亡作用及相关基因的表达;应用流式细胞仪检测了K562/ADM细胞株逆转耐药前后的P-gp、ADM浓度和Ca2+浓度的变化;应用荧光原位杂交技术检测多发性骨髓瘤及慢性淋巴细胞白血病的分子细胞遗传学异常,并结合临床指标进行恶性血液病预后相关因素分析。结果:①孤啡肽对于K562细胞的抑制作用具有时间依赖性,随作用时间的延长而增强。在10-9mol·L-1孤啡肽对K562细胞作用96 h抑制率最高,72 h后10-7、10-9、10-12mol·L-1三个浓度上有较强的细胞毒作用（P＜0.05）。②经FCM检测发现10-7、10-8、10-9 mol·L-1的孤啡肽作用72 h后,出现明显的凋亡峰,凋亡率分别为22.8%、23.8%、26.5%,且G0/G1细胞增多、S期细胞减少。③OFQ可逆转K562/ADM细胞的耐药性,耐药细胞的IC50分别为93.3±0.14μg·ml-1、46.99±0.25μg·ml-1、35.31±0.26μg·ml-1,ADM与非细胞毒性剂量的OFQ(10-7 mol·L-1)共同作用24 h、48 h、72 h,耐药细胞的IC50分别降低为70.04±0.19μg·ml-1、33.21±0.27μg·ml-1、23.11±0.29μg·ml-1,其逆转倍数为1.33倍、1.42倍、1.53倍。④K562细胞P-gp的表达率为1.28%,K562/ADM细胞P-gp的表达率为98.23%。经不同浓度的OFQ处理细胞48 h后,K562/ADM细胞P-gp的表达率降低,呈明显的量效关系。⑤K562/ADM细胞对ADM的蓄积能力增强（P＜0.01）,随作用时间的延长细胞内ADM的平均荧光强度增强,呈时间依赖性。⑥MM患者的FISH研究结果显示:75%（12/16）有染色体异常,其发生率由高到低依次为IgH重排69%（11/16）,13q缺失50%（8/16）,其中RB1 38%（6/16）,D13S319 25%（4/16）,1q21扩增38%（6/16）,P53缺失0。其中三种或三种以上染色体异常的有5/12（42%）。4例（25%）两种染色体异常的患者中,3例为13q缺失和IGH重排,1例为1q21扩增和IGH重排。单独1q21缺失患者1例（7%）,未检出p53异位患者。⑦CLL患者的FISH研究结果显示:9例患者均存在至少一种分子遗传学异常,仅1例正常。2例BinetB期患者仅1例存在基因位点的异常。8例BinetC期患者二例染色体核型异常,7例存在不同基因位点的缺失,1例存在基因位点的扩增,其中2例存在纯合缺失。结论:①孤啡肽在体外可抑制K562细胞与K562/ADM细胞的生长,且存在时效、量效性。②孤啡肽可诱导K562细胞的凋亡。③孤啡肽可部分逆转K562/ADM细胞对ADM的耐药性,提高ADM的敏感性。④孤啡肽可降低P-gp的表达,抑制药物外排泵,从而提高了细胞内ADM的浓度,增强化疗药物的细胞毒性。⑤孤啡肽可使K562/ADM细胞Fas、FasL的表达增高,可通过Fas/FasL途径直接诱导凋亡,从而逆转白血病耐药。⑥IGH重排发生在MM早期且发生率最高,与高水平的β2微球蛋白有显着相关性,为不良预后因素;1q21重排一般发生在疾病进展阶段;13q缺失在MM染色体异常中占第二位,其多发性骨髓瘤患者中13q缺失发生范围很广,也作为一项独立的不良预后因素;1q21扩增不是MM最初的生物学改变,而是在骨髓瘤疾病进展中出现的第二阶段的表现,与多发性骨髓瘤的临床进展是否相关有待于进一步研究。⑦del（13q14）异常是CLL最常见的染色体异常。del（ATM）和del（17p13.1）异常多提示预后较差。+12异常同时伴有多种基因位点异常的CLL患者预后较差。
顾静文[7]（2009）在《白血病多药耐药性及其逆转的研究》文中提出研究目的1．了解P糖蛋白（Pgp）、多药耐药基因（mdr1）、多药耐药相关蛋白基因（MRP）和DNA拓扑异构酶Ⅱ（TopoⅡ）是否为急性白血病临床耐药的预后因素。2．确定Pgp、mdr1、MRP和TopoⅡ诊断急性白血病临床耐药的准确性。3．研究发夹状小分子干扰RNA（hairpin siRNA）对白血病多药耐药细胞株K562／A02 mdr1和GSTπ基因的表达和功能的影响。研究方法1．45例急性白血病患者用单抗UIC2标记的流式细胞仪法测定Pgp；用RT-PCR方法检测其mdr1、MRP和TopoⅡ的表达，用单因素和多因素Logstic回归分析它们与白血病预后的关系。2．以临床耐药作为金标准，用受试者工作特征（ROC）曲线下面积评价上述参数的准确性；在ROC曲线上确定各种参数的最佳临界点；为了提高这些参数的诊断价值，采用平行试验和系列试验计算其诊断临床耐药的灵敏度（Se）和特异度（Sp）。3．根据mdr1 mRNA第79-99和GSTπmRNA第308-327核苷酸为作用靶点，合成针对靶区域序列的发夹状siRNA，克隆入pSilencer2．1-U6 neo，克隆产物为pSilence-mdr1和pSilence-GSTπ，转染K562／A02细胞株。用实时荧光定量PCR检测K562／A02 mdr1和GSTπmRNA的表达；用Westernblot和荧光免疫组化观察Pgp和GSTπ蛋白的表达；MTT法检测阿霉素对K562／A02细胞半数抑制浓度(IC50)。研究结果：1．耐药组Pgp、mdr1、MRP阳性率均高于敏感组（P＜0．01），而TopoⅡ耐药组较低（P=0．049）。经单因素Logistic回归分析，Pgp、mdr1、MRP的过度表达，TopoⅡ的表达降低和55岁以上年龄组与临床耐药性显着相关；性别、发病时WBC、FAB亚型和骨髓原+（早）幼细胞比例与耐药性无关。多因素Logistic回归分析经以上变量校正后显示Pgp、mdr1、MRP、TopoⅡ和年龄仍与耐药性显着相关：Pgp（RR=14．87，P=0．003）；mdr1（RR=19．98，P=0．003）；MRP（RR=16．53，P=0．006）；TopoⅡ（RR=0．23，P=0．046）；年龄（RR=10．87，P=0．013）。将36例初发急性白血病患者单独分析，结果发现Pgp、mdr1和MRP亦与完全缓解密切相关。Pgp（RR=9．8，P=0．005）；mdr1（RR=12．1，P=0．005）；MRP（RR=33，P=0．002）。直线相关分析发现在所有病例组和临床耐药组中Pgp和mdr1；Pgp和MRP：mdr1和MRP具有相关性（P＜0．001）。2．ROC曲线下面积(AUCROC)：TopoⅡ明显低于Pgp、mdr1和MRP（P＜0．05），而Pgp、mdr1和MRP的ROC曲线下面积差别无显着意义（P＞0．05）；Pgp、mdr1、MRP和TopoⅡ的最佳临界点分别为10％、0．8、1．0和0．9，在对应的灵敏度中，Pgp最高为74％，特异度中mdr1最高为86％；Pgp、mdr1和MRP的平行试验和系列试验计算，灵敏度和特异度均可提高至91％。3．经pSilence-mdr1转染后的K562／A02细胞株mdr1 mRNA表达量下降了71．5％，从（2．8±1．65）×108拷贝／μgRNA下降至（3．9±2．37）×107拷贝／μgRNA，（P＜0．01）；同时pSilence-GSTπ作用后，K562／A02 GSTπmRNA表达量较mock下降了39．8％，从（2．3±1．14）×105拷贝／μgRNA下降至（5．4±2．45）×104拷贝／μgRNA（P＜0．01）。4．Western blot结果显示pSilence-mdr1和pSilence-GSTπ分别转染K562／A02细胞株后与mock相比，Pgp和GSTπ的表达明显下降；而pSilence-mdr1和pSilence-GSTπ对α-tubulin的表达没有影响；K562／A02细胞株转染pSilence-laminA／C后与mock相比，laminA／C的表达明显下降，但对Pgp和GSTπ的表达没有作用；灰度扫描显示与内对照B-actin的比值，Pgp的表达量从K562／A02（mock）的0．75±0．019下降到K562／A02（pSilence-mdr1）的0．48±0．049（P＜0．001）；GSTπ的表达量从K562／A02（mock）的0．54±0．025下降到K562／A02（pSilence-GSTπ）的0．39±0．022（P＜0．01）。荧光免疫组化结果显示荧光显微镜下可见Pgp在K562／A02组有大点状的绿色荧光，阳性细胞比例从转染前的71．25±9．65％到pSilence-mdr1转染后的35．25±5．97％（P＜0．001）；GSTπ在K562／A02组有多量点状的红色荧光，阳性细胞从转染前的81．25±6．49％下降到pSilence-GSTπ转染后的41．25±4．43％（P＜0．001）。5．MTT结果示对阿霉素的耐药指数从空载体转染后的23，到pSilence-mdr1转染后的8和pSilence-GSTπ转染后的10，差别有显着性。研究结论：1．Pgp、mdr1、MRP和TopoⅡ是急性白血病临床耐药的独立预后因素。mdr1和MRP具有相关性。2．Pgp、mdr1和MRP诊断临床耐药价值较高；其联合试验可以提高灵敏度和特异度。3．siRNA可有效、特异地逆转K562／A02 mdr1和GSTπ的多药耐药性。
薛芳[8]（2008）在《和厚朴酚对人急性白血病细胞株U937细胞增殖凋亡及耐药性影响的研究》文中进行了进一步梳理目的:细胞凋亡（apoptosis）或程序化死亡（programmed cell death, PCD）是有机体为保持自身稳定、调控自身细胞增殖与死亡之间的平衡,由基因控制的细胞主动性死亡的过程,具有特殊的形态学和生化特征,不导致明显的炎症反应,这些变化是caspase介导的特定底物分解的直接结果。研究发现Bcl-2家族的基因参与与细胞凋亡,扮演着重要的角色。Bcl-2家族由抑凋亡因子（如Bcl-2,Bcl-XL）和促凋亡因子（如Bax,Bid,Bak）组成,两组成员之间的比例决定着细胞的生死存亡。当Bax/Bcl-2比例增加时,引起细胞色素C和其他多肽从线粒体膜间隙释放入细胞质,细胞色素C活化caspase-9,后者接着活化其他caspase成员,引起细胞凋亡。白血病细胞同其他肿瘤细胞一样,其特征性表现是逃逸细胞周期调控、无限制增殖,而诱导白血病细胞凋亡是目前治疗的主要机制,用药物诱导白血病细胞发生凋亡也已成为治疗肿瘤的有效途径。随着新的化疗药物或靶向治疗药物的不断出现,急性白血病的近期和远期疗效有了明显提高,但是一些患者在治疗过程中出现原发或者继发的多药耐药（multidrug resistance,MDR）现象,导致治疗失败。MDR指白血病细胞一旦对某种化疗药物产生耐药性,就同时对其他结构上无关、作用机理各异的药物也产生交叉耐药性,是一种特殊的广谱耐药现象。而耐药细胞株的建立是探讨白血病MDR产生的机制及对MDR进行逆转研究的基础。近年来,人们发现中药在诱导白血病细胞凋亡和逆转耐药方面正在显示出不容置疑的优势。中药厚朴属木兰科木兰属乔木植物,其树皮为我国传统中药材,和厚朴酚（ honokiol,HNK）是其主要化学成分之一,属于联苯酚类化合物。传统中医认为厚朴具有消除胸腹满闷、止痛、健胃、下气降逆、止咳、祛除水毒、活血化瘀等作用。现代医学发现和厚朴酚具有抗氧化、抗炎、抗焦虑、抗菌、抗血栓形成和抗肿瘤的作用。近年来体内外试验均证实和厚朴酚对多种实体肿瘤细胞有抑制作用,引起人们极大关注,但是国内外尚未见和厚朴酚在体外诱导U937细胞凋亡和调控凋亡相关基因的研究报道;此外,还有研究发现和厚朴酚对耐药的人多发性骨髓瘤具有逆转耐药作用。但和厚朴酚对急性白血病的相关耐药细胞株是否有逆转耐药作用,未见报导。以往研究中建立耐药细胞株时多采用药物低浓度化疗药物逐渐加量持续诱导法,这与临床短疗程、大剂量、反复用药的方式不一致。本研究模拟临床用药特点,采用高浓度反复间歇诱导的方法,建立白血病细胞株U937对阿霉素（ADR）多药耐药细胞系—U937/ADR。阿霉素（Adriamycin,ADR）是一种抗肿瘤抗生素,属于拓扑异构酶II（topoisomerase II,Topo II）毒性抑制剂,主要通过稳定Topo II-DNA断裂复合体,抑制DNA的再连接,造成DNA断裂损伤,而达到对肿瘤细胞的杀灭作用,临床疗效肯定。U937细胞系于1976年建立,遗传背景清楚,生物学性状稳定。经检索国内、外文献,未见由ADR诱导的U937细胞耐药亚系建立的报道。目前用于研究白血病耐药相关研究的理想模型较少,因此,U937/ADR的建立对今后从细胞和分子水平研究白血病多药耐药机制具有较大的实用价值,也为体外筛选化疗药物,研究耐药逆转等提供了必要的实验材料。引起白血病的多药耐药机制非常复杂,通常有多种因素参与其中。目前已经明确的与耐药有关的机制有:（1）药物吸收减少:许多药物进入进入细胞膜需要与载体蛋白结合,如果参与此过程的载体蛋白结构改变,可导致细胞对药物吸收的减少,细胞内有效药物浓度降低,其后果是细胞逐渐对药物产生耐药。如MTX、全反式维甲酸等药物。（2）细胞内药物溢出增多:①P-170糖蛋白（P-gp）介导的药物泵出,导致细胞内药物被主动泵出。诱导其过度表达产生耐药的药物有蒽环类、长春新碱、柔红霉素、表鬼臼毒素和紫杉醇等。②MRP介导的药物泵出,MRP是整合于细胞膜的糖基化磷蛋白,属于ATP酶活性的转移蛋白的超家族成员。许多天然药物如抗生素、生物碱是MRP的底物。③LRP介导的药物转运,LRP蛋白广泛分布于许多正常组织和肿瘤组织,位于核膜孔和胞浆颗粒的结构中,参与核浆之间的物质运输。在LRP高度表达的细胞中,柔红霉素可在核浆之间进行快速的重新分布,说明LRP参与了抗肿瘤药物的转移,与多药耐药有关。④乳癌耐药蛋白BCRP,与P-gp和MRP同属于ATP依赖转运,是通过药物外排泵的作用降低细胞中的药物聚集,从而引起MDR。（3）细胞解毒能力的增强:谷胱苷肽S转移酶π（GST-π）等,在许多人类肿瘤和动物致癌模型中谷胱苷肽S转移酶π（GST-π）常常高度表达,可以作为肿瘤细胞耐药的一个标志。烷化剂耐药如MTX、马法兰、苯丁酸氮芥等的耐药与GST-π有关。（4）肿瘤细胞内Topo II活性和表达量下降,引起肿瘤细胞出现不典型多药耐药。（5）凋亡调控基因介导的耐药机制:由于细胞凋亡调控的bcl-2、P53、Ras、c-myc等基因的表达失控,而导致白血病细胞对化疗药物的耐受。抗肿瘤药物是细胞凋亡的诱导剂,化疗药物的细胞毒效应可能主要是触发肿瘤细胞程序化死亡的通路,凋亡有可能是大多数化疗药物作用的最终共同途径。从这个意义上来说,白血病细胞的耐药是细胞凋亡受抑制。因此,本研究课题在建立对阿霉素耐药的细胞株U937/ADR的基础上,我们采用蛋白印迹（Western blotting）方法对U937/ADR白血病细胞产生耐药所涉及的主要蛋白、酶和凋亡调节基因:P-gp、MRP、LRP、BCRP、Topo II、GST-π和bcl-2、bax的表达量进行检测,以期能深入探讨U937/ADR的耐药机制。并进一步观察了和厚朴酚逆转U937/ADR耐药的特点,以及和厚朴酚对产生多药耐药的上游调控因子的影响,旨在初步探讨和厚朴酚逆转多药耐药的作用机制。方法:1和厚朴酚对体外培养的U937细胞增殖凋亡的影响1.1 U937白血病细胞株的体外培养采用含有10%新生牛血清、青霉素100u/ml、链霉素100μg/ml的RPMI 1640培养基。置于37℃,5%CO2,饱和湿度环境下培养。1.2采用噻唑蓝比色法（MTT）检测不同浓度的和厚朴酚对U937细胞和正常人外周血单个核细胞的增殖抑制率分别取相同密度的对数生长期U937细胞和正常人外周血单个核细胞,加于96孔板中培养。两种细胞分别设立实验组和对照组。实验组设立10个药物浓度组,每组HNK的终浓度为5、10、15、20、25、30、35、40、45、50μg/ml,每个药物浓度组设8个复孔。对照组加入同样浓度的二甲基亚砜（DMSO）,分别培养24小时和48小时,培养结束前4h每孔加入20μl噻唑蓝（MTT）溶液（5mg/ml）,离心弃上清,加入200μl DMSO充分溶解结晶物,用酶标仪测490nm处吸光度A值,计算细胞增殖抑制率。1.3细胞周期检测乙醇固定各组U937细胞24小时后,碘化丙啶染色30分钟,上机测定细胞内DNA含量,实验结果经计算机软件ModFit LT2.0处理,计算出细胞周期的分布。1.4透射电镜观察U937细胞的超微结构变化调整U937细胞密度为1×106/ml,在含有终浓度为0、10μg/ml的HNK的RPMI1640培养液中培养12h。之后分别收集细胞,1000rpm离心10 min,PBS （pH 7.4）洗一遍,4%戊二醛固定过夜,PBS洗3遍,1%锇酸固定1h,PBS充分清洗。梯度乙醇脱水,丙酮浸透,包埋,超薄切片,醋酸双氧铀-柠檬双染,HITACHI 1200ES型透射电镜观察细胞形态变化并拍照。1.5 FCM用Annexin V/PI双染的方法检测U937细胞的凋亡率变化将U937细胞或PBMCs分别在含有不同终浓度的HNK的培养液中培养24和48小时。收集各组细胞,悬于binding buffer液中,加入AnnexinV,避光室温反应15 min,加入binding buffer液,上机检测前加入PI,用流式细胞术检测细胞凋亡率。1.6 Capase-3活性检测按每孔1×106个/ml细胞的密度将U937细胞200μl接种于6孔板,终浓度为10μg/ml的HNK处理6、12和24小时后,同时设立对照组（HNK 0μg/ml）,每组每个样本收集约2×104个细胞,加入50μl的冰cell lysis buffer重悬,冰浴10min,离心10000g/min,转移上清至新的EP管,置于冰上。测蛋白浓度后,加入相应cell lysis buffer稀释蛋白至相同浓度,加入50μl反应液及5μl 4mM DEVD-pNA,37℃孵育1小时后加入96孔板测OD405,与对照组比较,计算增加倍数。1.7检测线粒体PT孔抑制剂CsA对细胞增殖的影响按每孔1×106个/ml细胞的密度将U937细胞200μl接种于96孔板,每孔加入终浓度为5μM的Cyclosporin A（CsA）,2小时后再加入终浓度为10μg/ml的和厚朴酚处理U937细胞6h和12h;同时设立HNK单独用药组,终浓度为10μg/ml,作用同密度的U937细胞200μl 6h和12h,每组设复孔3个。收集细胞,MTT法测定细胞增殖抑制率。1.8 RT-PCR检测凋亡相关基因bcl-2和bax mRNA的表达分别收集1×106/ml个U937细胞,经过终浓度为0、5、10和15μg/ml的HNK处理24小时,以Trizol提取细胞总RNA,紫外分光光度计检测RNA纯度并定量,取2μg采用M-MLV逆转录合成cDNA。以特异的引物扩增目的基因,琼脂糖凝胶电泳后goldview染色,图像分析系统分析扩增条带积分光密度值,以β-肌动蛋白为内参,计算mRNA相对表达水平。1.9 Western blotting法检测U937细胞中Bax和Bcl-2的蛋白表达水平采用细胞浆蛋白提取试剂盒提取经不同终浓度的HNK处理的U937细胞中的胞浆蛋白,用考马斯亮兰G250试剂盒测定蛋白浓度。每梳孔加150μg样品蛋白。采用SDS-PAGE不连续变性蛋白质电泳,电泳至溴酚蓝到达分离胶的底部,参照标准分子量蛋白质,截取相应位置的凝胶转膜,封闭后结合一抗,4℃过夜,漂洗后与辣根过氧化物酶标记的二抗结合,化学发光显色,扫描后分析光密度,计算蛋白含量。2人白血病多药耐药细胞株U937/ADR的建立及其生物学性状分析2.1采用阿霉素（ADR）诱导建立对其耐药的细胞株取对数生长期U937细胞,采用MTT法和IC50计算软件,筛查使50%的U937细胞生长抑制时的HNK浓度（IC50）。将U937细胞加入含有IC50浓度的ADR的RPMI1640培养液中孵育2小时后,弃含药培养液,用普通培养液继续培养,大部分细胞死亡,存活细胞缓慢生长,待存活细胞长满培养瓶后传代,进入对数生长期后,再次与此浓度的ADR孵育,如此反复换液、传代,每4周检测其耐药性,直至产生耐药性,并且在无药培养液中耐药性保持稳定。对U937/ADR细胞生物学性状分析。2.2绘制细胞生长曲线分别接种1×104个U937和U937/ADR细胞,每日进行细胞计数,共7天,按Patterson公式计算细胞在对数生长期的群体倍增时间。2.3克隆形成率的检测接种200个U937和U937/ADR细胞到含有甲基纤维素软琼脂培养基的24孔板,培养14天,分别计算克隆形成率（%）=形成克隆数/接种细胞数×100%。2.4流式细胞术分析细胞周期乙醇固定U937和U937/ADR细胞24小时后,碘化丙啶染色30分钟,上机测定细胞DNA含量,实验结果经计算机软件ModFit LT2.0处理,计算出细胞周期的分布。2.5采用MTT法分析耐药谱将1×106个/ml U937和U937/ADR细胞各200μl,接种到96孔板,按照不同浓度加入各种化疗药物（足叶乙甙、吡喃阿霉素、长春新碱、米托蒽醌、阿糖胞苷）,作用24小时,采用MTT法计算细胞增殖抑制率。采用IC50计算软件,计算出使50%U937细胞和U937/ADR细胞生长抑制师弟各种药物浓度（IC50）,由此计算耐药指数（resistant index,RI）= U937/ADR耐药细胞的IC50/U937亲代细胞的IC50。2.6耐药机制研究:采用western blotting检测U937细胞和U937/ADR细胞的P-gp、MRP1、LRP、BCRP、GST-π、Topo II、bcl-2、Bax蛋白表达3和厚朴酚对人急性白血病多药耐药细胞系U937/ADR耐药的影响3.1噻唑蓝（MTT）法体外药敏检测取对数生长期的U937/ADR细胞（2×104/ml） 200μl接种于96孔培养板,分别加入不同终浓度的HNK溶液,每个浓度组设3个重复孔。对照组加入相应溶剂。37℃孵育72h后加入MTT,继续培养4h,弃上清,加入二甲基亚砜,混匀后置于酶标仪,测定570 nm波长的吸光度值（A）,计算出使50%和20%的U937/ADR细胞生长抑制时的HNK浓度（IC50,IC20）3.2检测HNK对U937/ADR的耐药逆转作用取HNK对U937/ADR细胞的IC20浓度做耐药逆转实验。取对数生长期的U937/ADR细胞,以1×105/ml细胞密度接种于96孔培养板中,每孔加入200μl。24h后加入20μl用无血清的RPMI 1640培养基稀释的HNK （终浓度为0,6.5μg/ml）和浓度为0,2、4、6、8、10μg/ml的ADR 20μl,每种药物浓度均做3个复孔。置5 %CO2 ,37℃培养24 h后,每孔加5mg/ml MTT 25μl,37℃继续培养4 h后终止培养,小心吸弃上清液,每孔加150μl DMSO,振荡10 min使结晶物充分溶解。用酶标仪测D570。按照金氏公式[1]:Q=（Ea+b）/（Ea+Eb-Ea×Eb）判断两药合用的药理效应。公式中Ea代表HNK的细胞增殖抑制率,Eb代表ADR的细胞增殖抑制率,Ea+b代表两药联合应用的细胞增殖抑制率,即实测合并效应;Ea+Eb-Ea×Eb为期望合并效应。Q值在0.851.15时,两药联合应用效应相加（+）,Q值在1.1520之间为协同（++）,Q值>20为明显协同（+++）,Q值在0.850.05之间为拮抗（-）,Q值<0.05为明显拮抗（――）。本实验比较了HNK处理组与不加HNK处理的对照组的ADR IC50值的差异,从而判断HNK的增敏作用,并计算增敏倍数。增敏倍数=无增敏剂时的IC50值/增敏剂作用下的IC50值。3.3 HNK对U937/ADR细胞P-gp功能的影响罗丹明123孵育法检测:U937/ADR细胞和亲代U937细胞密度为5×106个/ml,加入HNK（终浓度0、6.5μg/ml）置5 %CO2,37℃分别培养1h和12h,再加入罗丹明123（180ng/ml）2ml,共培养60min;2000r/min离心,去上清,U937/ADR细胞用PBS洗2次,把细胞重新悬浮于5ml生理盐水中,加入-20℃,75%乙醇10ml,冰浴30min,流式细胞仪检测细胞内的荧光强度。3.4 NF-κB对HNK逆转U937/ADR多药耐药机制的调控3.4.1 U937/ADR细胞和U937细胞内NF-κB的激活情况分别提取U937/ADR和U937细胞的核蛋白,测定蛋白浓度。（方法同第二部分）,应用康成生物公司ArrayStar?检测转录因子NF-κB活性的ELISA试剂盒检测NF-κB的活性。在检测NF-κB活性的试剂盒中,标记探针是生物素标记的双链寡核苷酸片断,含有NF-κB特异性DNA结合序列（5-gggactttcc-3）。当标记探针与细胞核抽提物一起孵育时,核抽提物中活性形式的NF-κB与探针特异性结合。随后转录因子/探针复合物与链亲和素包被的微孔板孵育,转录因子/探针复合物与微孔板上链亲和素结合固定在微孔板上。洗去未结合物,加入抗p65特异性一抗。然后加入HRP标记的二抗及底物,HRP催化底物发生颜色改变。根据颜色深浅即可检测NF-κB p65或p50 DNA结合活性改变3.4.2 HNK对U937/ADR细胞内NF-κB/p65转录因子的DNA结合活性及P-gp表达的影响用终浓度为0,2,4,6,8,10μg/ml的HNK分别作用于1×106/ml U937/ADR细胞12h后,提取细胞核蛋白,测定蛋白浓度（同第1部分）。NF-κB/p65活性检测同前,Western blotting方法检测P-gp蛋白表达,方法同前。结果:1.和厚朴酚对体外培养的U937细胞和正常外周血单个核细胞增殖的影响1.1 HNK抑制U937细胞增殖结果显示HNK作用24h的IC50为13.2μg/ml , 48小时的IC50为11.8μg/ml;高浓度组（25μg/ml）对U937细胞的生长抑制率均达90%以上,且增殖抑制作用随HNK浓度的加大和作用时间的延长而增强,呈现出剂量和时间效应关系。而对正常外周血单个核细胞的增殖抑制作用不明显。1.2 HNK使U937细胞阻滞在G0/G1期HNK作用于U937细胞后,G0/G1期细胞所占比例随着HNK作用时间的延长而增加,S期与G2/M期细胞所占比例则呈时间依赖性下降。1.3电镜观察结果显示HNK诱导U937细胞凋亡经和厚朴酚作用后,U937细胞呈现凋亡形态（包括细胞膜皱缩和起泡、染色质凝聚、核碎裂和凋亡小体的形成）。而空白对照的U937细胞的电镜下形态,未见明显凋亡形态特征。1.4 AnnexinV/PI方法进一步证实HNK诱导U937细胞凋亡HNK作用于U937和PBMCs后,凋亡的U937细胞所占比例随着药物浓度和作用时间的增加而增加,呈现对HNK的时间-浓度依赖性。1.5 HNK处理U937细胞后Caspase-3活性增强终浓度为10μg/ml的HNK处理U937细胞6、12和24小时后,处理组的caspase-3活性与对照组caspase-3活性比值分别为:1.94±0.05,3.59±0.31,11.91±0.17。U937细胞经HNK处理12和24小时后,细胞内caspase-3活性较对照组有显着增高（P<0.01）1.6线粒体PT孔抑制剂CsA能降低HNK对U937细胞的增殖抑制作用单独用HNK或用线粒体PT孔抑制剂环胞菌素A（CsA,终浓度5μM）与终浓度为10μg/ml的HNK联合处理U937细胞后,细胞增殖抑制率有所不同。HNK单独作用6h、12h的细胞增殖抑制率分别为8.45±0.35%,31.25±1.30%。而CsA和HNK联合作用6h、12h后,细胞增殖抑制率依次为3.14±0.51%,19.39±0.92%,较HNK单独处理组明显降低（P<0.05）,同时5μM CsA对U937细胞基本无毒性作用。1.7 HNK影响U937细胞内bcl-2和bax mRNA的表达与对照组U937细胞相比,HNK处理组的U937细胞内Bax mRNA的表达量呈明显的剂量依赖性上升趋势,而Bcl-2 mRNA表达变化无统计学差异。各浓度组的Bcl-2与Bax表达量的比值呈减少趋势。1.8 HNK影响U937细胞内的Bcl-2和Bax蛋白的表达U937细胞经HNK处理后,Bax蛋白的表达水平与对照组细胞蛋白的表达量比较呈现升高趋势,各组间有统计学差异;Bcl-2蛋白在各浓度组的表达水平与对照组相比无明显差异;各浓度Bcl-2与Bax蛋白表达的比值呈减少趋势。2人白血病多药耐药细胞系U937/ADR的建立及其生物学性状分析结果2.1成功建立U937/ADR细胞株采用大剂量（IC50浓度:0.85μg/ml）的ADR短时间（2h）暴露法,历时32周,经过45次传代,成功建立U937细胞系的ADR耐药细胞亚系,命名为U937/ADR。U937细胞对ADR的IC50为0.85μg/ml,U937/ADR细胞对ADR的IC50为9.35μg/ml ,耐药指数为11倍。在普通培养液中培养2周后,其耐药性仍稳定。2.2检测U937/ADR的生长曲线和克隆形成率与亲代U937细胞有差异U937及U937/ADR在普通培养液中的生长曲线显示:U937细胞的群体倍增时间为34.7h,U937/ADR群体倍增时间为43.6h,增加8.9h;而U937及U937/ADR在ADR浓度为0.85μg/ml的培养液中的生长曲线显示:U937/ADR的倍增时间为46.9小时,但U937细胞不能生长,72小时后细胞几乎全部死亡;克隆形成率检测显示,U937/ADR及U937细胞的克隆形成率分别为81%及86%,无统计学差异（P>0.05）。2.3处于G0/G1期的U937/ADR细胞增多与U937细胞相比U937/ADR的G0/G1期细胞增多,而G2/M期细胞减少,两种细胞系S期细胞无明显变化。2.4 U937ADR细胞呈现多药耐药U937/ADR细胞系对ADR的耐药指数为11,除此之外,该细胞系对VP-16、THP、VCR、MTX等药物也产生了交叉耐药,耐药倍数分别为6.5、13.4、6.1、4.8,对Ara-C仍保持敏感。2.5与耐药相关的P-gp在U937/ADR中高表达在亲代U937和耐药的U937/ADR细胞株中,均有P-gp、LRP、GST-π、Topo II、bcl-2、Bax的表达,尤其是P-gp在U937/ADR中的表达水平显着高于其在U937细胞中的表达,二者有显着统计学差异（P<0.05）。MRP1和BCRP在两种细胞株中均未见表达。3和厚朴酚对人急性白血病多药耐药细胞系U937/ADR耐药机制的影响3.1 HNK对U937/ADR细胞的IC50和IC20值HNK处理U937/ADR细胞24小时后,使50%和20%的U937/ADR细胞生长抑制的浓度为:IC50值14.3μg/ml,IC20值6.5μg/ml。3.2 HNK可以逆转U937/ADR细胞对ADR的耐药我们选取终浓度为6.5μg/ml的HNK做耐药逆转实验。分组实验结果显示:以终浓度为6.5μg/ml的HNK与不同浓度ADR合用,随着药物浓度的增加,对U937/ADR细胞的增殖抑制率明显增加,两药合用组的抑制率明显高于单独用药组。根据金氏公式计算,两药合用有协同作用,并且其协同作用随着ADR药物浓度的增加而增强（见表3-2）。与终浓度为6.5μg/ml HNK的联合用药时,ADR的IC50是4.28μg/ml,增敏倍数=9.35/4.28=2.2（P<0.05）3.3罗丹明123实验证实HNK可使U937/ADR细胞内罗丹明123增加U937/ADR细胞经终浓度为6.5μg/ml的HNK处理1h后,与未经HNK处理组比较,细胞内罗丹明123的平均荧光强度值差异无显着性（P>0.05）;但将终浓度为6.5μg/ml的HNK处理时间延长至12h后,与未经HNK处理组比较,细胞内罗丹明123的平均荧光强度值明显增高（处理组710±12.26,对照组1639±28.13）,有显着差异性（P<0.01）。同时检测终浓度为0、6.5μg/ml的HNK对亲代U937细胞的作用1h或12h,没有明显影响。3.4 NF-κB对HNK逆转U937/ADR多药耐药机制的调控3.4.1 U937/ADR细胞核内NF-κB/p65的活性增强在亲代U937细胞核蛋白中,未检测到NF-κB/p65或p50的活性（反应孔中无颜色的变化）;而在U937/ADR细胞核蛋白中,可以检测到NF-κB/p65的活性增强（反应孔中颜色变为茶色）,但未检测到p50活性。3.4.2 HNK影响U937/ADR细胞中NF-κB/p65的DNA结合活性和P-gp表达终浓度为2μg/ml的HNK作用于U937/ADR细胞6h后,细胞中NF-κB/p65的活性（0.898±0.013）,与未经HNK处理的U937/ADR细胞中NF-κB/p65的活性（0.922±0.005）相比略微下调,但差异没有统计学意义（P=0.093）。随着HNK作用浓度的增加,NF-κB/p65蛋白的活性呈逐渐下调。终浓度为4、6、8μg/ml的HNK处理组的U937ADR细胞中NF-κB/p65蛋白的活性分别为0.719±0.004,0.472±0.019,0.386±0.006,在HNK终浓度达到10μg/ml时,NF-κB/p65的活性下降到0.259±0.011,比对照组减少,经统计学分析,差异有显着性（P<0.05）。经Pearson直线相关法分析,结果显示:NF-κB/p65的DNA结合活性变化与HNK的浓度呈负相关（r=-0.313,P=0.017）。见表3-3。在空白对照组中,P-gp蛋白的表达水平为59.85±24.38,随着HNK作用浓度的增加,P-gp蛋白的表达水平呈下调趋势,当HNK终浓度达到10μg/ml时,P-gp的表达水平下降到31.74±16.06。与对照组相比,有统计学差异（P<0.05）。经Pearson直线相关法分析显示:P-gp蛋白表达水平与HNK的浓度呈负相关（r=-0.420,P=0.008）。Pearson直线相关分析法结果显示,U937/ADR细胞中NFκB/p65的活性变化与P-gp蛋白的表达呈正相关（r=0.528,P=0.013）结论:1. HNK对白血病细胞系U937细胞的增殖有明显的抑制作用,并可以时间和浓度依赖方式促进U937细胞的凋亡,其作用机制可能与抑制U937的细胞分裂和诱导促凋亡基因Bax表达有关。2.本实验采用高浓度反复间歇诱导的方法,建立了对阿霉素耐药的细胞系U937/ADR,与亲代细胞相比,U937/ADR的生长速度减慢,该细胞系对阿霉素的耐药倍数为11,除此之外,该细胞系其它化疗药物也产生了交叉耐药,属于典型的多药耐药细胞系。3.和厚朴酚与阿霉素序贯联合应用可产生协同抗白血病作用,在体外能明显提高ADR对U937/ADR耐药株的增殖抑制作用,并能下调P-gp的表达,可有效逆转多药耐药。4.和厚朴酚可以通过减少细胞内NF-κB/p65活化水平、可以下调P-gp的表达,而提高耐药细胞U937/ADR对化疗药物的敏感性,从而逆转耐药。5.和厚朴酚可能是一种有效的治疗急性白血病的药物。
高志学[9]（2007）在《人骨肉瘤细胞多药耐药机制及其逆转剂的研究》文中研究指明骨肉瘤作为一种常见的骨源性恶性肿瘤,其化疗后的多药耐药现象严重影响患者的治疗效果和预后,其耐药机制和逆转剂的研究一直是研究的热点。在体外建立多药耐药的细胞模型已逐渐成为研究骨肉瘤多药耐药性的有利工具。氨甲蝶呤作为骨肉瘤化疗的基础药物,其在临床初始化疗缓解后常会产生耐药性。目前临床上己证实与肿瘤多药耐药有关的耐药基因主要有MDRl、MRP、LRP、GST-π、TOPOⅡa等。因此,检测U-2 OS/MTXr中这5个耐药基因及其表达产物表达水平的变化,基本能反映出骨肉瘤组织产生耐药时耐药基因表达水平的变化情况。放疗作为骨肉瘤化疗的辅助手段,也可以收到不错的治疗效果,但骨肉瘤放疗与其多药耐药的关系尚无人研究。骨肉瘤多药耐药逆转的研究也不是很多,这和以往的逆转剂效果不理想有关。本实验采用氨甲蝶呤大剂量冲击间歇诱导的方法建立了骨肉瘤多药耐药细胞模型,通过对耐药细胞的基本特征、交叉耐药、细胞生长曲线、细胞周期及凋亡以及5个耐药基因的表达变化情况、放疗与骨肉瘤多药耐药的关系、新的逆转剂的尝试等进行了研究。为进一步研究人骨肉瘤耐药机制和耐药逆转剂提供一定的帮助。
叶霈智[10]（2006）在《浙贝母颗粒逆转急性白血病多药耐药临床研究》文中研究指明成人AL初治患者约有30%左右难治,CR后仍有60%左右最终复发难治,甚至造血干细胞移植后复发。难治性急性白血病对治疗反应差,诱导缓解率低,复发率高,生存期短,是白血病治疗中的难题,目前仍以联合化疗为主要治疗方法。多药耐药性（MDR）的形成是难治的主要原因。研究MDR现象产生的机制及克服方法是提高白血病疗效的主要途径之一。已被证实具有逆转肿瘤/白血病细胞多药耐药性的化合物、生物制剂和中药很多,但现有逆转剂大多数停留在体外研究阶段,且存在不良反应大、临床疗效不满意等缺点,临床应用受到限制。我科既往MDR相关研究表明,浙贝母生物碱体外具有逆转白血病细胞MDR的生物活性,并能增加急性白血病细胞内抗癌药物浓度。临床预实验显示,常规化疗加用浙贝母粉,治疗组完全缓解率显着高于对照组,对难治及复发白血病患者优势更为明显,且能提高Pgp高表达患者临床疗效。在上述研究基础上,我们在国内首次进行以中药为主,干预围化疗期难治性急性白血病前瞻性随机、双盲、多中心临床研究。严格遵守随机双盲临床研究原则,统一制定临床研究方案和病例观察表,拟定规范的难治性白血病诊断标准;由计算机产生随机排列表划分治疗组和对照组,两组比例为1:1。在使用标准化疗方案的同时,于化疗开始前3天加用颗粒剂,治疗组为浙贝母颗粒,每次1袋（10g）,每日3次;对照组为麦芽颗粒,每次1袋（10g）,每日3次。除此以外,不加用任何具有逆转白血病多药耐药性的中西药。所有病例均连续服药14天,以标准化疗疗程为一个治疗周期。若一个疗程无效,可随下一周期化疗继续服用颗粒剂,继续观察一个疗程,并记作另一人次。研究者使用统一制定的《浙贝母颗粒逆转急性白血病多药耐药临床研究》CRF表,参加临床研究者需经过一定的培训,充分了解临床研究方案,严格记录化疗前后各项指标（骨髓及外周原始细胞、外周血象、MDR相关蛋白、安全性指标）和不良事件,判定临床疗效。最终对研究结果分两次揭盲,并进行统计分析。本次研究病例来源于在全国12家医院,为2004年1月～2006年4月间住院患者,共127例（治疗组66例,对照组61例）。研究结果表明:①两组患者性别、年龄、病型、病程等基线资料均衡可比。②疗效结果显示,两组完全缓解（CR）病例分别为26例、占39.4%（治疗组）与15例、占24.6%（对照组）;部分缓解（PR）病例分别为24例,占36.4%（治疗组）与17例,占27.9%（对照组）;未缓解病例（NR）病例分别为16例,占24.2%（治疗组）与29例,占47.5%（对照组）。两组病例疗效整体比较,经秩和检验,有统计学意义（P<0.05）,治疗组优于对照组;两组病例有效性（CR+PR）比较,经χ2检验,具有显着统计学意义（P<0.01）,治疗组有效率显着高于对照组（75.8%>52.5%）。③疾病分型与疗效关系分析结果,两组间ALL患者有效性（CR+PR）比较,经χ2检验,具有统计学意义（P<0.05）,治疗组高于对照组（92%>60%）。④性别与疗效关系分析结果,治疗组男性患者疗效与对照组相比,经秩和检验,有统计学意义（P<0.05）,治疗组疗效优于对照组。⑤病程与疗效关系分析结果,治疗组病程<6个
二、急性白血病多药耐药相关蛋白及P糖蛋白表达与临床耐药的关系（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、急性白血病多药耐药相关蛋白及P糖蛋白表达与临床耐药的关系（论文提纲范文）
（1）复方浙贝颗粒逆转小鼠急性淋巴细胞白血病多药耐药的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词 |
| 第一部分 文献综述 |
| 综述一 成人急性淋巴细胞白血病耐药机制研究进展 |
| 1. ABC转运体 |
| 2. 细胞质/核内蛋白 |
| 3. 细胞凋亡与耐药 |
| 4 癌相关基因 |
| 5 其他 |
| 6 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 综述二 中医药诊治成人急性淋巴细胞白血病研究进展 |
| 1 中医病名 |
| 2 临床研究 |
| 3 基础研究 |
| 4. 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 第二部分 实验研究 |
| 实验一 复方浙贝颗粒对L1210/CDDP移植瘤抑制作用研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验二 复方浙贝颗粒对L1210/CDDP移植瘤抑制作用机制研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验三 复方浙贝颗粒对L1210/CDDP尾静脉小鼠模型抑制作用研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在校期间主要科研成果 |
| 个人简历 |
（2）维药异常黑胆质成熟剂总黄酮对K562/ADR细胞多药耐药的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 研究内容与方法 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 试剂配制 |
| 2.2 细胞培养基本操作方法 |
| 2.3 K562/ADR细胞培养 |
| 2.4 ASMq对K562/ADR细胞毒活性的影响 |
| 2.5 ASMq对K562/ADR细胞的耐药逆转作用 |
| 2.6 Real-time PCR 法检测耐药相关基因的表达 |
| 2.7 Western Blot分析方法及步骤 |
| 3.统计学处理 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
（3）复方浙贝颗粒改善难治性急性白血病患者生存的临床观察（论文提纲范文）
| 目录 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词英汉对照 |
| 上篇: 综述文献 |
| 综述一 难治性白血病相关危险因素分析 |
| 参考文献 |
| 综述二 难治性白血病西医化疗与中西医结合治疗进展 |
| 参考文献 |
| 下篇: 临床研究 |
| 前言 |
| 研究方案 |
| 诊疗标准 |
| 研究结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（4）急性白血病多药耐药研究进展（论文提纲范文）
| 1 膜糖蛋白介导的药物外排机制 |
| 1.1 P-糖蛋白 (P-gp) |
| 1.2 多药耐药相关蛋白 (MRP) |
| 1.3 肺耐药相关蛋白 (LRP) |
| 1.4 乳腺癌耐药蛋白 (BCRP) [11] |
| 2 酶介导机制 |
| 2.1 DNA拓扑异构酶Ⅱ (topoisomerase, TopoⅡ) |
| 2.2 谷胱甘肽-s-转移酶基因 (GST) |
| 3 凋亡调控基因介导的机制 |
| 3.1 Bcl-2基因家族 |
| 3.2 p53基因 |
| 4 PKC与MDR表型有关 |
（5）线粒体ATP酶β亚单位在急性白血病多药耐药中的作用及调控机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略词简表 |
| 前言 |
| 第一部分 线粒体ATP酶β亚单位在急性白血病患者骨髓原代细胞中的表达及与临床疗效和体外药敏的关系 |
| 1. 前言 |
| 2. 材料与方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 结论 |
| 第二部分 线粒体ATP酶β亚单位基因启动子区CpG岛甲基化与急性白血病临床耐药的关系 |
| 1. 前言 |
| 2. 材料与方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 结论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间的主要研究成果 |
（6）孤啡肽对白血病敏感及耐药细胞的调节作用以及恶性血液病预后相关因素分析（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 目录 |
| 研究背景 |
| 1. 白血病与细胞凋亡 |
| 2. 阿片肽与细胞凋亡 |
| 3. 孤啡肽 |
| 4. 白血病多药耐药发病机制及对策 |
| 5. 恶性血液病的检测方法 |
| 参考文献 |
| 第一部分 孤啡肽对白血病K562细胞及白血病K562/ADM细胞的调节作用 |
| 导言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 多发性骨髓瘤预后相关因素分析 |
| 导言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 慢性淋巴细胞白血病预后相关因素分析 |
| 导言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 在读期间的研究结果 |
| 致谢 |
| 附录 |
（7）白血病多药耐药性及其逆转的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 急性白血病患者Pgp、mdrl、MRP和Topo Ⅱ表达及其与预后关系的临床流行病学研究 |
| 引言 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 发夹状siRNA逆转K562/A02多药耐药性的研究 |
| 引言 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 英文缩写和简写注释 |
| 致谢 |
| 在校期间获得的成果和发表的文章 |
（8）和厚朴酚对人急性白血病细胞株U937细胞增殖凋亡及耐药性影响的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩写 |
| 研究论文和厚朴酚对人急性白血病细胞株U937细胞增殖凋亡及耐药性影响的研究 |
| 引言 |
| 第一部分 和厚朴酚对人急性白血病细胞株U937细胞增殖和凋亡的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 人白血病多药耐药细胞系U937/ADR 的建立及其生物学性状的研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 和厚朴酚对人急性白血病多药耐药细胞系U937/ADR 作用机制研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述一 |
| 和厚朴酚药理作用的研究现状 |
| 参考文献 |
| 综述二 |
| 白血病多药耐药的研究进展及其治疗现状 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（9）人骨肉瘤细胞多药耐药机制及其逆转剂的研究（论文提纲范文）
| 提要 |
| 英文缩写词 |
| 第一部分：文献综述部分 |
| 一、肿瘤多药耐药的研究进展 |
| 二、放疗与多药耐药 |
| 三、肿瘤多药耐药逆转的研究进展 |
| 四、骨肉瘤化疗及多药耐药 |
| 第二部分：实验部分 |
| 前言 |
| 一、氨甲蝶呤诱导人骨肉瘤多药耐药细胞模型的建立 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 附图 |
| 二、骨肉瘤耐药细胞中多药耐药基因及其表达产物的变化 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 附图 |
| 三、放射线对骨肉瘤耐药表型的影响 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 附图 |
| 四、两种逆转剂对骨肉瘤多药耐药的逆转作用 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的文章 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 致谢 |
（10）浙贝母颗粒逆转急性白血病多药耐药临床研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩略语 |
| 前言 |
| 研究方案 |
| 1 病例来源 |
| 2 病例纳入标准 |
| 3 排除病例标准 |
| 4 病例剔除、脱落标准 |
| 5 研究方法 |
| 6 记录内容与方法 |
| 7 观测指标 |
| 8 疗效判定 |
| 9 不良事件发生与处理 |
| 10 质量控制 |
| 11 统计处理 |
| 12 伦理学问题 |
| 研究结果 |
| 1 临床资料 |
| 2 治疗方法 |
| 3 治疗结果 |
| 讨论 |
| 1 急性白血病与 MDR |
| 2 中药逆转剂研究 |
| 3 浙贝母逆转研究情况 |
| 4 病例特点分析 |
| 5 治疗结果分析 |
| 6 结论 |
| 7 存在问题与对策 |
| 参考文献 |
| 文献综述：肿瘤多药耐药逆转剂研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
四、急性白血病多药耐药相关蛋白及P糖蛋白表达与临床耐药的关系（论文参考文献）
- [1]复方浙贝颗粒逆转小鼠急性淋巴细胞白血病多药耐药的研究[D]. 赵欢. 北京中医药大学, 2020(04)
- [2]维药异常黑胆质成熟剂总黄酮对K562/ADR细胞多药耐药的研究[D]. 王珍珍. 新疆医科大学, 2016(12)
- [3]复方浙贝颗粒改善难治性急性白血病患者生存的临床观察[D]. 黄山. 北京中医药大学, 2011(10)
- [4]急性白血病多药耐药研究进展[J]. 吴遐,王俊和. 中华全科医学, 2010(11)
- [5]线粒体ATP酶β亚单位在急性白血病多药耐药中的作用及调控机制研究[D]. 杨景柯. 中南大学, 2010(02)
- [6]孤啡肽对白血病敏感及耐药细胞的调节作用以及恶性血液病预后相关因素分析[D]. 赵丽. 兰州大学, 2009(09)
- [7]白血病多药耐药性及其逆转的研究[D]. 顾静文. 复旦大学, 2009(12)
- [8]和厚朴酚对人急性白血病细胞株U937细胞增殖凋亡及耐药性影响的研究[D]. 薛芳. 河北医科大学, 2008(12)
- [9]人骨肉瘤细胞多药耐药机制及其逆转剂的研究[D]. 高志学. 吉林大学, 2007(03)
- [10]浙贝母颗粒逆转急性白血病多药耐药临床研究[D]. 叶霈智. 北京中医药大学, 2006(12)
标签：急性淋巴细胞白血病论文; 急性白血病论文; 化疗药物论文; 糖蛋白论文; 基因合成论文;