一、胚胎生物技术在实验动物中的应用与展望（论文文献综述）
陆珊珊[1]（2021）在《SHH通路在缺血性脑卒中和新生小鼠肺发育中的作用机制研究》文中指出研究目的:在缺血性脑卒中发生后,大脑中缺血侧的细胞快速释放大量谷氨酸到细胞间隙并产生堆积,多余的谷氨酸溢出细胞间隙后作用在间隙外的谷氨酸受体上,使缺血侧的神经元处于过度激活的状态,对神经元产生兴奋性毒性作用。谷氨酸在缺血性脑损伤中具有至关重要的作用,细胞间谷氨酸清除的唯一途径是通过细胞膜上的谷氨酸转运体将谷氨酸转运到细胞内,转运到细胞内的谷氨酸在谷氨酰胺转化酶的作用下转化成谷氨酰胺,再经谷氨酰胺转运体释放到细胞间隙被神经元吸收,从而达到细胞外谷氨酸清除和转化的目的。大脑中的谷氨酸转运体有五种表现形式,不同形式的转运体表达在不同的细胞中,其中表达在星形胶质细胞上的谷氨酸转运体GLT-1,承担了细胞间约90%的谷氨酸的转运任务。然而,细胞外堆积的谷氨酸在缺血过程中是如何被调控的目前仍不是很清楚。在缺血模型中,缺血部位的神经元快速释放大量的Shh,并激活SHH通路,而该通路的过度激活也会造成神经元的丢失,与组织损伤的发生有关。在我们之前的研究工作中发现,SHH通路可以通过快速调节细胞膜上的谷氨酸转运体的表达量实现对细胞外谷氨酸浓度的快速调节,抑制SHH通路可以有效降低细胞外谷氨酸的含量,并且在这一过程发挥作用的转运体是GLT-1。因此我们的研究目的是明确在脑缺血过程中SHH通路调节GLT-1清除细胞间谷氨酸的机制,进而通过抑制SHH通路实现对缺血后的脑损伤的保护作用。研究内容:明确SHH通路对GLT-1的调节作用;找到SHH通路对GLT-1调节过程中的关键作用分子;进一步验证SHH通路在缺血过程中的作用,抑制SHH通路实现对缺血后的脑损伤的保护作用。研究方法:1.通过体外电生理全细胞膜片钳记录原代培养的星形胶质细胞膜上谷氨酸转运体的电流的方法,明确SHH通路对谷氨酸转运体的调节作用。2.通过细胞转染的方法在转染了谷氨酸转运体GLT-1的HEK293细胞中,通过细胞膜片钳记录方法明确SHH通路调节谷氨酸转运体的分子机制。3.在星形胶质细胞中通过RNA干扰的方法,实现对星形胶质细胞中分子蛋白表达的敲低,明确参与SHH通路调节谷氨酸过程中的信号分子。4.在小鼠和食蟹猴中建立MCAO模型,验证抑制SHH通路活性对缺血脑损伤的保护作用。研究结果:1)SHH通路可以通过调节星形胶质细胞膜上GLT-1的表达量来快速调节细胞外谷氨酸的浓度。2)SHH通路能够通过PKCα磷酸化GLT-1的563位点使其快速从细胞膜上转运到胞浆内。3)抑制SHH通路可以有效的改善小鼠MCAO模型后脑缺血导致的梗死面积。4)NVP-LDE225通过抑制SHH通路可以有效改善非人类灵长类MCAO模型缺血后的脑损伤,并建立短期和长期的保护作用。研究结论:SHH通路可以通过调节细胞膜上GLT-1的数量快速调节细胞外谷氨酸的浓度,而SHH信号通过激活PKCα使GLT-1上的563（562）位点的丝氨酸发生磷酸化从而降低膜上GLT-1的表达。抑制SHH信号通路能够维持膜上GLT-1的表达量,实现对细胞外谷氨酸的快速转运,从而降低细胞外谷氨酸的浓度。抑制SHH信号通路的活性可以改善缺血性脑损伤,减少缺血导致的脑梗死面积,并且能够改善缺血后的神经功能。FDA批准临床用于基底细胞癌的药物,NVP-LDE225可以通过抑制SHH通路的活性,维持细胞膜上谷氨酸转运体GLT-1的表达量,有效改善小鼠和食蟹猴缺血模型后导致的脑损伤,并且可以建立长期有效的保护作用。以上结果提示,SHH通路是降低谷氨酸兴奋性毒性,治疗缺血性脑损伤的一个有效靶点。Sonic hedgehog（Shh）作为一种有丝分裂素和形态形成素,通过Smoothened（SMO）受体介导的SHH通路在细胞增殖分化和发育过程中发挥着重要作用。胆固醇作为内源性的甾醇结构,可以直接与SMO结合来激活SHH通路。然而,SMO的内源性抑制作用的研究目前并不十分清晰。因此,在我们的研究中发现皮质醇能够直接与SMO结合,来竞争性地抑制胆固醇对SHH通路的激活作用,而消除皮质醇对SMO的抑制后,会促进肺部细胞过度增殖并导致肺发育的不成熟。Shh和胆固醇均可激活经典和非经典通路,两条途径都能够被皮质醇抑制。皮质醇和胆固醇能够在SMO上产生竞争结合。当SMO中的L112变为A112时,皮质醇不再能与胆固醇竞争结合在SMO上。Smoa/a（L116A）的突变小鼠出生后由于呼吸衰竭很快死亡,主要原因是肺间质成纤维细胞增加和表面活性蛋白的分泌减少。这些结果表明,皮质醇是SMO的内源性抑制剂,其对SMO的抑制对小鼠肺发育至关重要。
赵吉臣[2]（2021）在《基于多组学分析的日本囊对虾生长调控机制初步研究》文中进行了进一步梳理甲壳动物作为无脊椎动物中最大的类群之一,具有潜在的巨大经济价值。生长性状是经济类甲壳动物最重要的性状之一,直接影响养殖品种的产量与经济效益。然而,迄今为止甲壳动物生长性状的生物学机理研究并不充分,尤其是在日本囊对虾等十足目动物中。本文以日本囊对虾为研究对象,构建日本囊对虾零换水养殖模式,基于形态学分析研究该模式下日本囊对虾生长规律。在此基础上,进一步借助多种技术手段对同一家系不同生长阶段体质量显着差异的日本囊对虾从生理生化、肠道菌群、基因层面、蛋白层面和代谢物层面进行研究,旨在解析日本囊对虾生长调控机制。以期为完善甲壳动物生长性状基础理论提供参考资料,为对虾乃至其它经济类甲壳动物育种和养殖提供理论支撑。主要结果如下:本研究以构建的日本囊对虾全同胞家系为实验材料,采用零换水养殖模式养殖日本囊对虾,日本囊对虾在无底质、不换水的情况下,存活90 d以上并且活力良好。试验期间水体理化因子稳定,pH 为（8.13±0.07）～（8.61±0.01）,NH4+-N 为 0～（0.769±0.124）mg/L,NO2--N为0～（0.167±0.034） mg/L,NO3--N为0～（1.267±0.120） mg/L。该模式下日本囊对虾的生长大致分为两个生长阶段:30～50日龄为快速生长期,特定生长率和相对增长率最大,分别为4.28～9.51 %/day和53.46%～158.83%;50～100日龄为稳定生长期,特定生长率为2.15～2.37 %/day,相对增长率为24.00%～26.7 1%。本研究构建日本囊对虾零换水养殖模式并证实其具有可行性,得到该养殖模式下日本囊对虾生长规律,为后续研究取样时间的选择提供了依据,为日本囊对虾生产实践提供了理论参考。通过对不同生长阶段体质量显着差异的日本囊对虾生理生化指标和肠道菌群进行分析,来研究动态变化的生理指标与日本囊对虾生长之间的关系。快速生长组（FG）α-淀粉酶（α-Amylase,AMS）活性在40和100日龄高于缓慢生长组（SG）,FG组脂肪酶（Lipase,LPS）活性在每个生长阶段均高于SG组,胰蛋白酶（Trypsin,TRS）活性刚好与LPS相反。FG组溶菌酶（Lysozyme,LZM）活性在每个生长阶段均高于SG组。FG组过氧化氢酶（Catalase,CAT）和总超氧化物歧化酶（Total Superoxide Dismutase,T-SOD）活性在40日龄高于SG组,在100日龄时刚好相反。12个肠道菌群样品的Q20均在73.63%以上,Clean Reads均在90.29%以上。注释到2,771个OTUs,FG组OTUs数量高于SG组,1,484个OTUs为两组共有。FG和SG组Alpha Diversity指数无统计学差异（p>0.05）。在门分类水平上,FG组厚壁菌门（Firmicutes）丰度高于SG组（p>0.05）;在属分类水平上,FG组弧菌属（Vibrio）丰度低于SG组（p>0.05）。FG组碳水化合物代谢（Carbohydrate Metabolism）功能高于SG组（p<0.05）。对全虾体成分分析,FG组水分含量比SG组低（p<0.05）,粗蛋白含量比SG组高（p>0.05）。上述结果表明,FG组日本囊对虾可能通过增强对碳水化合物和脂肪的吸收、利用能力,以及减少一些不必要能量的消耗,来合成更多蛋白质,实现生长优势。通过对来自同一家系不同生长阶段体质量显着差异的日本囊对虾进行转录组学分析,获得111.64 Gb Clean Data,鉴定到10,194个基因。日本囊对虾全长转录组相比二代组装转录组,得到的基因平均长度更长,基因注释率更高。在特定生长率大的快速生长期（40日龄）相比特定生长率小的稳定生长期（70日龄）,鉴定到更多差异表达基因（DEGs）。215个DEGs为快速生长期和稳定生长期共有,其中106个DEGs在两个生长阶段表达趋势一致,其余109个趋势相反。通过qPCR对在两个生长阶段表达趋势一致的DEGs进行验证,实验结果与转录组一致,证实转录组数据可靠。快速生长期和稳定生长期得到的DEGs功能相对保守,包括糖酵解（Glycolysis）通路在内的12条显着富集通路为两个生长阶段共有。首次报道Hippo信号通路（Hippo signaling pathway-fly）直接参与甲壳动物生长,克隆得到该通路中的关键基因Mj14-3-3-like。其ORF为741 bp,编码246 个 AA。 Mj14-3-3-like在快速生长组对虾高表达,在蜕皮间期表达量最低,这些结果表明Mj14-3-3-like可能负调控日本囊对虾生长。通过对来自同一家系不同生长阶段体质量显着差异的日本囊对虾进行蛋白质组学分析,鉴定得到1,720个蛋白质。在日本囊对虾快速生长期和稳定生长期,分别鉴定到52和70个差异表达蛋白（DEPs）。10个DEPs为快速生长期和稳定生长期共有,并且每个DEP在两个生长阶段表达趋势一致,提示它们可能是日本囊对虾潜在的生长标志物。对蛋白质组和转录组做联合分析,在快速生长期和稳定生长期分别筛选到10和7个DEPs/DEGs,大多数基因表达趋势一致。蛋白质组、转录组和qPCR均证实MHC-1a和MHC-1b在快速生长组对虾中低表达,提示它们可能负调控日本囊对虾生长。克隆得到Mj14-3-3-epsilon-like、MjGPI和MjGPD1,它们的ORF分别为822、1,671 和 1,098 bp,编码 273、556 和 365 个 AA。Mj14-3-3-epsilon-like 在快速生长组中低表达,在蜕皮间期表达量较低;MjGPI和MjGPD1在快速生长组中高表达,在蜕皮间期表达量较高;这些结果表明它们可能调节日本囊对虾生长。快速生长组对虾可能通过Hippo信号通路促进细胞增殖和抑制细胞凋亡,实现生长优势;快速生长组对虾还可能通过激活包括糖酵解途径在内的多种代谢途径,实现生长优势。通过对来自同一家系不同生长阶段体质量显着差异的日本囊对虾进行代谢组学分析,在正、负离子模式下分别鉴定到2,342和1,811种代谢物。在正离子模式下的快速生长期和稳定生长期,分别鉴定到229和275种差异代谢物;在负离子模式下的快速生长期和稳定生长期,分别鉴定到149和85种差异代谢物。在正、负离子模式下,分别有75和30种差异代谢物为快速生长期和稳定生长期共有,并且每种差异代谢物在两个生长阶段表达趋势一致,提示它们可能在日本囊对虾生长中起重要作用。通过ELISA试剂盒,对鉴定到的共有差异代谢物丙酮酸等进行检测,实验结果与代谢组一致,证实代谢组数据可信。在100日龄的快速生长组对虾中,丙酮酸含量同样低于缓慢生长组。这些结果表明丙酮酸是日本囊对虾一种潜在的生长标志物。快速生长组对虾可能通过激活包括糖酵解途径在内的多种代谢途径,实现生长优势。此外,本团队前期构建了一种地膜池养殖日本囊对虾模式,这种养殖模式以塘底铺设“地膜”取代传统养殖模式塘底铺设的“沙子”。该养殖模式下日本囊对虾可以存活5个月以上,不过相比传统养殖模式养殖的日本囊对虾生长缓慢,体色由黄变蓝。本研究通过对传统养殖模式和地膜池养殖模式养殖日本囊对虾鳃和肝胰腺进行比较转录组学分析,得到60,780个基因。在鳃中鉴定到1,005个DEGs （427个上调,578个下调）,在肝胰腺中鉴定到115个DEGs （41个上调,74个下调）。这些结果表明鳃相比肝胰腺对外部环境变化更敏感。包括肌动蛋白和淀粉酶在内的多个必需基因受到抑制,可能是导致地膜池养殖日本囊对虾生长缓慢的原因。虾青蛋白（Crustacyanin subunit A和C）在地膜池养殖日本囊对虾中高表达,可能是导致地膜池养殖日本囊对虾体色变蓝的原因。本研究初步解析了地膜池养殖日本囊对虾生长缓慢和体色变蓝的分子机制,为完善地膜池养殖模式提供了理论依据。
周婷婷[3]（2021）在《BMP信号通路影响罗氏沼虾附肢再生的分子机制初步研究》文中提出罗氏沼虾（Macrobrachium rosenbergii）是具有强大断肢再生能力的水生甲壳动物,其整个生命过程均具有断肢再生能力,再生新肢断肢后仍具再生能力,且再生肢体的结构和功能也很完善。尽管如此,其再生的分子信号转导机制研究几乎空白。为探究罗氏沼虾附肢再生的分子机制,本论文以罗氏沼虾为研究对象,从形态学及组织学分析其附肢再生过程,明确再生重要阶段,并对其中关键再生阶段进行比较转录组研究,分析罗氏沼虾附肢不同再生阶段的基因表达谱,从中候选参与再生的关键信号通路BMP信号通路,再深入研究BMP信号通路关键基因在附肢再生过程中的功能,以期探讨BMP信号通路影响罗氏沼虾附肢再生的分子机制,为甲壳动物的再生研究提供理论依据。具体研究内容及结果如下:1.罗氏沼虾附肢再生过程的形态学观察及组织学分析通过压力法迫使罗氏沼虾步足自切,观察其附肢再生完整过程,了解到新肢体再生所需时间约10天,此外明确了罗氏沼虾附肢再生的重要阶段,分别划分为伤口愈合期（24h）、芽基形成期（48h）、肢芽形成期（4d）、肢芽生长期（7d）以及新肢形成期（10d）。同时通过组织切片观察,发现罗氏沼虾附肢再生早期阶段的细胞组织形态变化明显。2.基于不同再生阶段转录组解析罗氏沼虾附肢再生分子机制基于罗氏沼虾附肢再生过程的形态学及组织学分析结果,选择罗氏沼虾再生0h（对照组）、6h（伤口愈合早期）、24h（伤口愈合期）和10d（新肢生长期）等4个时期的断肢基部肌肉组织进行高通量转录组测序。测序一共得到了91,044个unigene,平均长度为1,655bp,N50值为3,345bp。unigene功能注释结果显示,NR、Swiss-portdatabase、KOG和KEGG数据库中分别注释了37,056（40.7%）、28,723（31.54%）、16,616（18.25%）和20,078（22.05%）个unigene。此外,大量差异基因在不同再生阶段显着富集,同时在再生早期阶段多个转录因子包括Mr ELK4-like、MrELF124、MrPRDM79、MrFOG1、MrHAND2、MrHES1、MrARNT、MrGATA2、MrSOX4和MrRUNXAB,及多个信号通路包括BMP、MAPK、NOTCH、HIPPO通路中关键基因差异表达,提示它们可能在罗氏沼虾附肢的再生中发挥重要作用。3.罗氏沼虾BMP信号通路关键基因dpp、BMPR1B、BMPR2、Smad1以及Smad4的克隆与表达分析基于转录组测序分析结果,候选BMP信号通路作为罗氏沼虾附肢再生的研究方向。通过转录组数据分析筛选出罗氏沼虾BMP2/4、BMPR1B、BMPR2、Smad1及Smad4基因序列,利用PCR扩增技术,克隆得到了这五个基因的cDNA全长,分别为1,612bp、982bp、2,940bp、1,785bp以及2,160bp,分别命名为Mrdpp、MrBMPR1B、MrBMPR2、MrSmad1和MrSmad4,通过推导这五个基因的功能结构域,发现它们均与甲壳动物同源基因高度相似。然后进行各基因的表达特征分析,发现Mrdpp、MrBMPR1B、MrBMPR2、MrSmad1和MrSmad4基因在雌雄罗氏沼虾各组织中的表达差异显着,但各基因均在步足基部肌肉、眼柄及神经组织中的表达相对较高。其次,Mrdpp、MrBMPR2以及Mr Smad1基因在蜕皮周期中的表达规律相似,均在蜕皮后期（A、B）期高表达。最后在罗氏沼虾附肢再生早期阶段检测各基因的表达,结果发现Mrdpp、MrBMPR1B、MrBMPR2、MrSmad1及MrSmad4基因存在组织表达特异性,但总体均呈显着上调趋势,初步推断BMP通路中这5个关键基因参与了罗氏沼虾附肢再生过程。4.利用RNA干扰技术探究BMP信号通路关键基因对罗氏沼虾附肢再生的影响通过体外转录方法获得了Mrdpp、MrBMPR1B、MrBMPR2、Mr Smad1和Smad4等关键基因的ds RNA,首先进行ds RNA-Mrdpp长期体内注射实验,再通过罗氏沼虾附肢再生过程的形态学观察及组织学分析,结果发现,长期注射ds RNA-Mrdpp组罗氏沼虾与对照组罗氏沼虾相比,其附肢伤口愈合时间明显延长,且再生芽基的生长及延长受到严重影响,组织切片结果也证实Mrdpp基因的敲降会影响罗氏沼虾附肢再生部位的伤口愈合。后续进行了罗氏沼虾体外组织孵育实验,结果表明在添加ds RNA-Mrdpp的实验组罗氏沼虾步足基部肌肉组织中,除Mr Smad4基因外,Mrdpp、MrBMPR1B、MrBMPR2、Mr Smad1基因均极显着下调（p<0.01）。再通过BMP I型受体抑制剂（LDN-193189）的体内注射实验,检测罗氏沼虾断肢后BMP信号通路中各基因的表达特征,结果发现,注射抑制剂后,在断肢罗氏沼虾步足基部肌肉及胸节神经组织中MrBMPR1B及Mr Smad1基因均显着下调（p<0.05）,此外,在24h及48h,Mrdpp基因在各组织中均极显着下调（p<0.01）,MrBMPR2基因在眼柄及胸节神经组织中的表达量均显着降低（p<0.05）。最后进行Mrdpp、MrBMPR1B、MrBMPR2、MrSmad1及MrSmad4等关键基因的ds RNA体内注射短期实验,在罗氏沼虾断肢后,分别检测这几个基因在不同组织中的表达特征,结果发现BMP信号通路中各关键基因敲降后,反而引起其他基因的高表达（p<0.05）,此外,下游各基因敲降后,Mrdpp基因均呈显着下调趋势,推测该通路可能存在多水平调控及反馈调节。通过以上的研究明确了BMP信号通路缺失会显着影响罗氏沼虾的附肢再生。5.过表达MrDpp和MrBMPR1B对断肢罗氏沼虾BMP信号通路各关键基因表达的影响通过构建原核表达载体,获得了重组蛋白pET-Dpp以及重组蛋白pET-BMPR1B,然后进行体外组织孵育实验,实验结果表明,在过表达重组蛋白pET-Dpp以及重组蛋白pET-BMPR1B,均会导致其他基因在不同组织中差异显着表达,但都存在孵育时间及蛋白浓度依赖性;此外发现胸节神经组织很可能是Dpp浓度调控的枢纽,在胸节神经组织中,只有当pET-Dpp重组蛋白浓度适中时,下游各基因显着表达,当浓度过低或过高,均会抑制其他基因的表达（p<0.05）。最后在罗氏沼虾体内进行了pET-Dpp重组蛋白,pET-Dpp重组蛋白与ds RNA-Mrdpp共注射实验,结果发现在注射pET-Dpp蛋白之后,在步足基部肌肉以及眼柄组织中,除MrBMPR1B基因之外所有基因的表达量显着上调（p<0.05）,当共注射pET-Dpp及dsRNA-Mrdpp后,与对照组相比Mrdpp表达量又显着下调（p<0.05）,而其他基因表达差异不显着（p>0.05）。然而,在胸节神经组织中Mrdpp、MrBMPR1B、MrBMPR2、MrSmad1以及MrSmad4基因均在注射pET-Dpp蛋白之后极显着下调（p<0.01）,再次表明在神经组织中过高的pET-Dpp重组蛋白浓度可能导致BMP信号通路基因的显着下调。总的来说,BMP信号通路在罗氏沼虾附肢再生过程发挥关键作用,此外,BMP通路的调控方式复杂,可能存在多水平调控及反馈调节。以上研究结果将有助于更深入的解析甲壳动物再生机制。
韩思兰[4]（2021）在《鱼类脂滴自噬与脂滴水解在脂代谢调控中的互作机制研究》文中认为胞质脂滴是一种复杂的动态变化的细胞器,表面包裹着磷脂单层膜,其核心由中性脂组成,包括甘油三酯和胆固醇酯。通过调节脂质的储存和释放,脂滴在能量代谢中发挥着重要作用。目前,脂滴水解和脂滴自噬被公认为哺乳动物细胞内分解脂滴的两条主要途径。前者通过甘油三酯脂肪酶（ATGL）-激素敏感脂肪酶（HSL）-单酰甘油脂肪酶（MGL）级联反应降解甘油三酯。后者则是一个更为复杂的生物学过程:脂滴先被双层囊泡膜包裹形成自噬体,随后与溶酶体融合形成自噬溶酶体,最后溶酶体中的酸性脂肪酶将脂滴分解为甘油和游离脂肪酸。近年来,这两条通路在鱼类脂代谢工作中先后得到证实,但两者对鱼类营养代谢、能量供应方面的作用并不清楚。同时,即使在哺乳动物中,脂滴水解和脂滴自噬至今尚无详细的比较研究,尤其在活体水平,它们在脂分解中的地位仍有待商榷。此外,已有文献报道在特定细胞类型或环境条件下,脂滴水解和脂滴自噬存在一定的相互作用,而类似的互作研究在鱼类中至今尚不明确、鲜有涉及。因此,本研究首先通过药物分别抑制罗非鱼或斑马鱼的自噬/脂解途径,探究它们对鱼体生长代谢的重要性,并运用CRISPR/Cas9基因编辑技术分别建立脂滴水解关键酶基因（atgl/pnpla2）和脂滴自噬关键酶基因（lal/lipf）的斑马鱼敲除模型。通过分析组织表达、幼鱼表型、生化检测数据、全鱼转录组,并运用薄层层析、气相色谱、肝脏H&E染色、免疫荧光、透射电镜观察、RT-PCR、Western blot、ELISA等多种检测方法,试图从中性/酸性脂肪酶缺失的角度探究脂滴水解和脂滴自噬在鱼类脂代谢中行使的具体功能,以及一方受阻对另一方造成的影响。另外,本研究还在基因敲除斑马鱼的基础上额外添加了自噬抑制剂或脂解抑制剂,即将脂滴水解与脂滴自噬同时抑制,探究鱼体的应对方式。本论文的主要结果如下:1.自噬受抑制罗非鱼的三大代谢变化研究本实验室已利用模式生物斑马鱼,首次证明鱼类肝脏中亦存在脂滴自噬这一生物学现象。然而,自噬与鱼类（尤其是经济鱼类）代谢疾病之间的关系尚未得到较好的阐述。为检验自噬受损可能是鱼类脂肪过度沉积的重要因素这一猜想,本研究首先安排了为期一周的预实验,设置三种浓度摸索出自噬抑制剂氯喹（CQ）的合理添加剂量为100mg/kg饲料。随后,进行了长达8周的尼罗罗非鱼养殖实验,经过驯化且初重均匀的健康罗非鱼随机分成两组,分别投喂对照饲料以及额外添加CQ的实验饲料。该实验检测了罗非鱼生长、自噬以及糖、脂、蛋白三大代谢的生化和分子指标。结果表明,CQ能够显着抑制自噬并阻碍鱼体生长,且CQ通过抑制m TOR的基因与蛋白表达,使得全鱼蛋白含量下降,这说明自噬损伤会减少蛋白质的合成。在糖代谢方面,自噬受阻促进了鱼体糖原分解,不同组织的基因表达结果表明CQ处理所提高的糖酵解主要发生在肌肉中,其次是脂肪组织,且CQ还降低了肝脏糖异生能力。因此,由CQ引起的自噬抑制减少了脂来源的能量供应,作为补偿,糖酵解总体上得到了增强。此外,抑制自噬会使原本健康的鱼代谢状况恶化,具体表现为脂质积累、抗氧化能力减弱和炎症反应增加。具体分析不同组织的脂代谢数据,发现CQ处理显着抑制了肝脏和肌肉的脂肪生成基因,这可能是脂肪沉积的负反馈调节。在肌肉中,CQ组dgat和脂分解代谢基因不断下调,而在脂肪组织中,CQ对这些基因没有影响。该结果表明:与对照组相比,CQ会造成一定程度的脂代谢紊乱,且不同组织对此的反应敏感性由强到弱依次为肝脏、肌肉和脂肪组织。本实验提示自噬受损可能是水产养殖中常见的代谢性疾病发生的原因之一,且抑制自噬可以显着影响鱼类的糖、脂、蛋白质代谢。因此,自噬在维持养殖鱼类营养代谢的稳态方面具有重要作用,它很可能是调节三大营养素代谢的一个有效靶标。2.脂滴水解受阻斑马鱼的能量代谢机制研究已有研究证实,编码ATGL的基因在硬骨鱼类中是高度保守的,且鱼类的脂滴水解同样经历ATGL-HSL-MGL的过程。然而,ATGL在鱼类代谢中的确切作用尚未得到阐明。此外,相比哺乳动物,鱼类对碳水化合物的利用能力普遍较低,先前的研究表明,脂代谢的改变会影响葡萄糖和蛋白质的代谢,从而影响能量稳态。然而,ATGL介导的脂滴水解在鱼类能量稳态中的具体作用鲜有报道。Atglistatin（AI）是第一个合成的ATGL强效抑制剂,其对鱼类脂解的抑制效果尚不明确。本研究选择斑马鱼作为实验对象,首先进行了一周的预实验,摸索出AI的适宜添加浓度为80mg/kg饲料（无明显毒性效应）,然后挑选雄性斑马鱼随机分为两组（对照组和AI处理组）,开展为期5周的养殖实验。养殖结束后,检测了脂沉积,脂质组成,血糖和组织糖原含量,鱼体耗氧率、脂肪酸β氧化以及脂酶活性等指标。结果显示,AI处理组斑马鱼的肥满度、全鱼总脂、血浆甘油三酯明显升高,且在鱼体解剖过程中,该组发现了明显的白色脂肪组织,而对照组斑马鱼没有观察到类似现象。此外,AI组斑马鱼耗氧率较低,且肝脏和肌肉的β-氧化效率显着减少,全鱼总脂中TG和PL含量显着增加,而FFA,DG和MG含量显着下降。总之,抑制ATGL造成了斑马鱼严重的脂肪累积,改变了脂质组成,减弱了脂分解代谢,并引发了一定程度的氧化应激和炎症反应。此外,AI处理组斑马鱼肝脏组织HSL功能的部分增强无法逆转ATGL的抑制作用,也未观察到自噬的补偿性升高。全鱼转录组数据进一步揭示了抑制ATGL改变了斑马鱼系统的营养代谢。从营养素利用的角度来看,脂解受阻也导致了糖原分解和蛋白更新的加速,但不影响鱼体的蛋白含量,反而降低了糖酵解相关基因的表达。综上所述,ATGL在鱼类的代谢稳态中起着至关重要的作用,且抑制ATGL导致的脂源性供能障碍并不能通过激活HSL和自噬,或者提高其他营养物质的分解供能来弥补。3.Atgl和Lal敲除斑马鱼的代谢特征比较研究为排除抑制剂处理造成的靶标不确定性,本研究利用CRISPA/Cas9基因编辑技术分别构建了全身性Atgl或Lal敲除斑马鱼纯合品系（AKO或LKO）,并对这两个基因在野生型斑马鱼不同组织中的表达情况进行了检测。结果发现atgl和lal在斑马鱼全身表达均较为广泛,尤其是atgl的组织分布,区别于哺乳动物仅在脂肪组织或乳腺组织极端高表达,这两个基因在鱼类各个组织的表达量差异并不特别显着。幼鱼表型探索实验发现:较野生型斑马鱼,Atgl敲除纯合斑马鱼运动活力更强,摄食量更多,且全鱼在第16天已经出现明显的脂肪累积;而Lal敲除纯合子运动活性显着降低,虽然食欲旺盛,但脂肪沉积的效果不如Atgl敲除纯合子明显。此外,经过长达7周的养殖实验,虽然AKO和LKO斑马鱼均出现了生长缓慢、蛋白质减少、耗氧率降低以及运动活力减弱的现象,但两者有着截然相反的全鱼总脂和甘油三酯含量差异,且脂质组成也明显不同。具体而言,与WT相比,AKO全鱼总脂显着增加,其中甘油三酯所占的比例更高,且AKO斑马鱼的C16:1、C18:1n-9和C18:3n-6的百分比高于野生型,而C24:1和C22:6n-3的百分比低于WT鱼。另一方面,相较野生型斑马鱼,LKO全鱼总脂含量显着减少,其中甘油三酯所占百分比降低,CE、PE和PC的比例增加,且LKO鱼中超长链多不饱和脂肪酸,如C20:5n-3和C22:6n-3的百分比高于WT。除了生化差异,Atgl敲除斑马鱼和Lal敲除斑马鱼还表现出明显不同的组织学差异。比如活体解剖后,两者肝脏呈现出来的颜色相差甚远,前者偏白,后者偏黄;H&E染色显示两者的肝脏空泡形态也有所区别,AKO大而多,LKO小而密。随后,通过转录组数据的整理与分析,发现斑马鱼无论是敲除Atgl还是Lal,都对代谢产生了重大影响,且前者影响更为显着,尤其是脂代谢方面,这不仅表现在差异基因个数上,还表现在对甘油三酯、胆固醇以及PE/PC合成或分解通路的调控上。转录组数据进一步揭示了AKO和LKO确实存在脂代谢模式上的差异,且以中性脂肪酶Atgl为代表的脂滴水解和以酸性脂肪酶Lal为代表的脂滴自噬在维持鱼类机体内稳态方面发挥关键作用。4.斑马鱼肝脏脂滴自噬与脂滴水解关系研究考虑到AKO和LKO斑马鱼解剖后,肝脏部分引人注目的特征差异,以及鉴于脂解相关基因在鱼类肝脏中高表达（相比于哺乳动物）,后续涉及脂滴水解和脂滴自噬相互关系的研究则聚焦于斑马鱼的肝脏组织。首先,利用AKO雄性斑马鱼和对应的F3代WT开展了4周养殖实验,并在饲料中额外添加了自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3MA）来抑制AKO斑马鱼的自噬,进一步探索两种脂滴分解过程的相互关系,即Atgl缺陷是否会影响脂滴自噬功能的发挥。目前的结论是:Atgl敲除严重阻碍了斑马鱼肝脏的脂滴水解,但脂滴自噬并没有被激活,且3MA处理进一步加剧了AKO斑马鱼肝脏甘油三酯的积累,这意味着当Atgl被阻断时,脂滴自噬仍然起着较为基础的降解脂滴的作用。透射电镜图片以及生化数据表明AKO斑马鱼肝脏中积累着大量的大脂滴,且这些脂滴富含甘油三酯。其次,利用LKO雄性斑马鱼及其对应的F3代野生型同样进行了4周养殖实验,试图于酸性脂肪酶缺失的条件下再度检测肝脏中脂滴水解和脂滴自噬的变化情况。与此同时,还在饲料中添加了AI来抑制LKO斑马鱼的脂解,以期探索Lal缺陷是否会影响鱼类脂滴水解功能的发挥。结果发现,LKO斑马鱼肝脏积累大量小脂滴,且这些脂滴富含胆固醇而非甘油三酯。这部分结果验证了溶酶体酸性脂肪酶降解CE的功能在脊椎动物中是较为保守的,同时也说明,脂滴水解和脂滴自噬在调节甘油三酯和胆固醇代谢方面分别发挥着不同的作用。此外,相较WT,LKO组肝脏脂滴水解相关基因均极显着上调,说明Lal的缺失激活了脂滴水解,尤其是Atgl功能的增强。令人惊讶的是,额外的AI处理诱导了LKO斑马鱼肝脏非Lal依赖的自噬途径。透射电镜照片提示当脂滴水解和脂滴自噬同时受阻时,很可能引发了线粒体自噬。随后,检测了上述六组肝脏样品（WT/AKO/AKO+3MA;WT/LKO/LKO+AI）中有关细胞凋亡、炎症、内质网应激等的基因表达以及重点关注了线粒体相关指标,如线粒体DNA拷贝数,肝细胞线粒体形态学分析等。数据表明,线粒体肿胀在AKO+3MA组格外严重,且LKO+AI组肝损伤相关基因显着高表达。溶酶体标志蛋白Lamp1和线粒体标志蛋白Hsp60的免疫荧光共定位进一步证实了LKO+AI组肝脏存在线粒体自噬现象。因此,当细胞内的两种脂滴降解途径被同时阻断时,可能通过线粒体自噬为机体供能,这暗示着脂滴水解和脂滴自噬在鱼类能量供应中存在协同作用。
陈璇[5]（2021）在《褐飞虱热激蛋白不同家族基因及其功能研究》文中进行了进一步梳理昆虫属于小型变温动物,温度胁迫能影响昆虫的生存、种群动态和分布。热激蛋白（Heat shock protein,HSP）是受温度胁迫后响应最为显着的一类蛋白。除在应对温度胁迫中至关重要,HSP对维持细胞和蛋白稳态也不可或缺,保障了昆虫在正常环境条件下的基本生长发育。目前,HSP在昆虫的研究主要集中在HSP70和HSP90家族,其它家族涉猎有限,缺乏系统、完整的研究。此外,昆虫中的研究以基因鉴定与温度诱导表达分析为主,HSP的生物学功能及互作关系亟待挖掘。褐飞虱（Nilaparvata lugens（St（?）l））是亚洲“头号”水稻害虫,其发生和生长发育都易受到温度的影响,因此研究褐飞虱热激蛋白具有重要的理论及应用价值。本论文结合基因组、转录组和RNAi等技术,对褐飞虱热激蛋白HSP进行了系统鉴定及深入研究,揭示了HSP与温度胁迫的相关性,以及HSP的生物学功能。所取得的主要结论如下:1.揭示了褐飞虱热激蛋白HSP基因的种类和数量。利用生物信息学分析,本研究共在褐飞虱中鉴定得到62个HSP家族基因,分属于6个家族:s HSP（7个）、DNAJ（31个）、Chaperonin（10个,其中CCT共8个,HSP10、HSP60各1个）、HSP70（9个）、HSP90（3个）及HSP100（2个）。其中HSP100是首次在昆虫中得到报道。通过序列及系统发育分析,发现褐飞虱DNAJ家族呈现出较高的多样性,其它HSP在进化上相对保守。2.分析了褐飞虱HSP基因的时空表达模式及温度诱导特点。q RT-PCR定量结果显示,绝大多数HSP基因在各发育阶段均广泛表达。基于组织表达分析,除少数基因的表达模式呈现高度多样性外,大部分HSP在生殖系统（卵巢和精巢）中具有较高的表达水平,表明HSP可能在生殖中发挥重要功能。温度胁迫诱导表达分析显示,共有20个HSP基因（6个sHSP,3个DNAJ,9个HSP70和2个HSP90,占总数的32.3%）能在不同阶段显着受到高温诱导而上调表达,其中以卵期和成虫期最为明显。然而,本研究未发现明显受低温胁迫影响的HSP。3.揭示了30个HSP在褐飞虱正常生长发育和繁殖中的重要功能。选取褐飞虱若虫及初羽化雌虫,分别对62个HSP基因进行RNA干扰实验,共鉴定出30个对该飞虱正常生命活动不可或缺的HSP基因。其中,Nls HSP21.1在卵的发育中起重要作用;10个Nl DNAJ和7个Nl HSP70分别在若虫生长发育、卵巢发育和雌性生殖中发挥重要功能;8个Nl CCT发挥的功能相似,不仅可影响若虫的生长发育,而且对雌雄虫的生殖都至关重要;Nl Hsp10/Nl Hsp60也均可对若虫发育和雌虫生殖产生影响;HSP90家族中有2个基因对若虫正常发育、雌虫生殖力及维系正常表皮结构不可或缺。4.提供了HSP家族内或家族间相互关联的线索。以RNA干扰介导的功能缺失产生相应表型作为切入点,发现Nl HSC70-3,Nl HSC70-4和Nl HSC70-5沉默后表型极其相似;干扰Nl DNAJA3、Nl DNAJC19以及Nl Hsp10/Nl Hsp60均出现了虫体焦化变黑的类似表型;沉默8个Nl CCT的表型一致。实验结果为这些家族成员之间的潜在互作或调控关系提供了线索。5.明确了Nls HSP20.7和Nl HSP68在胚胎发育阶段应对高温胁迫中不可或缺。正常温度下干扰这2个基因,并无明显影响;干扰后进行37°C高温处理,导致胚胎发育异常,无法成功孵化,表明这2个基因在胚胎发育阶段应对高温胁迫时发挥了极其重要的作用。
戴生飞[6]（2021）在《Dmrt1和Foxl3在尼罗罗非鱼性别分化和生殖细胞命运决定中的功能研究》文中研究表明生殖是最基本的生命活动之一,也是物种延续的保障。生殖包括性别决定、性腺分化、配子发生、受精等一系列过程。脊椎动物的性腺主要由体细胞和生殖细胞构成,其中生殖细胞是唯一能将遗传信息传递至下一代的细胞。因此,脊椎动物性别决定可分为体细胞性别决定和生殖细胞性别决定两部分。胚胎发育过程中,性腺体细胞性别由遗传因子（性别决定基因）和环境因子（光照,温度,p H等）共同决定。传统观点认为,性腺中生殖细胞根据其所处的体细胞环境获得相应的性别。然而,青鳉（Oryzias latipes）中对foxl3的研究挑战了这一观点,缺失foxl3的XX青鳉生殖细胞在雌性体细胞环境中进行了精子发生,并产生可育的精子。由此提出生殖细胞中存在自主的性别决定机制。然而,尚未解决的重要问题是,缺失foxl3后生殖细胞中的哪些关键基因起始了雌性环境中的精子发生过程?在雌性生殖细胞中与foxl3相拮抗的雄性命运决定基因是什么?已有的研究表明,脊椎动物性腺中保守的转录因子dmrt1和foxl2相互拮抗并分别维持雌雄性别分化和性腺发育过程。尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）中结果表明,敲降dmrt1会导致雄性性腺体细胞雌性化和生殖细胞缺失。敲除foxl2或过表达其显复性突变体导致完全的由雌向雄的性逆转。foxl3是foxl2的一个古老的旁系同源基因,罗非鱼foxl3的功能研究尚未见报道。罗非鱼生殖细胞中相互拮抗的雌雄基因是什么?这个问题还有待进一步的研究。本研究通过转录组测序、蛋白免疫印记（Western blot,WB）、荧光原位杂交（FISH）等方法分析了dmrt1和foxl3在尼罗罗非鱼性腺的表达模式和细胞定位。运用CRISPR/Cas9基因编辑技术分别构建了dmrt1和foxl3单基因突变体,并通过双杂合突变体进一步繁殖获得dmrt1;foxl3双纯合突变体。采用组织学染色（HE）、荧光免疫组化（IF）、荧光原位杂交、real-time PCR等方法,分析了各突变体性腺表型和基因表达情况,并尝试使用外源雌激素（17β-estradiol,E2）和芳香化酶抑制剂（Fadrozole）对突变鱼进行表型回救。最后,利用启动子分析、凝胶迁移（EMSA）和染色质免疫共沉淀（ChIP）等体外实验探究了dmrt1和foxl3之间的相互调控关系。并通过在dmrt1和foxl3突变体中敲降体细胞特异的foxl2,探究了生殖细胞基因和体细胞基因间的上下位关系。具体结果如下:1、尼罗罗非鱼foxl3细胞定位和功能研究。性腺转录组测序结果表明,foxl3在孵化后30天（days after hatching,dah）XX罗非鱼卵巢中表达最高,而不在精巢中表达。荧光原位杂交和生殖细胞标记Vasa共定位结果显示,foxl3 m RNA主要定位于卵巢卵原细胞中,精巢组织中检测不到foxl3的表达。通过CRISPR/Cas9成功突变尼罗罗非鱼foxl3并获得缺失5bp和7bp的两种纯合突变体。组织学检测发现,120 dah天foxl3突变XY鱼精巢发育正常。而foxl3突变XX鱼性腺外形仍像正常卵巢,且存在卵巢的特征结构卵巢腔;但与对照XX鱼不同,foxl3突变XX性腺中不存在卵母细胞而是含有各级生精细胞。这表明foxl3突变导致XX性腺中生殖细胞起始了精子发生。荧光原位杂交和荧光免疫组化结果显示,foxl3突变XX性腺中存在精子细胞（表达Sox30）,而不存在卵母细胞（不表达bmp15和42Sp50）。荧光免疫组化结果显示,突变性腺体细胞中表达雌激素合成的关键酶Cyp19a1a,而不表达雄激素合成酶Cyp11c1。血清激素测定结果表明,foxl3突变XX鱼血清雌激素水平与对照XX雌鱼相比显着降低,但仍然显着高于对照XY雄鱼。与对照XX雌鱼一致,foxl3突变XX鱼血清雄激素（11-ketotestosterone,11-KT）水平很低。表明foxl3突变XX性腺中生殖细胞在雌性化的体细胞环境中进行了精子发生。Real-time PCR结果证实了foxl3突变性腺中体细胞的雌性化环境和生殖细胞中进行的精子发生。值得注意的是,雄性特异基因dmrt1在foxl3突变XX性腺中有显着的升高。另一方面,foxl3的突变不影响XY鱼性腺精子发生过程和育性。2、尼罗罗非鱼dmrt1的表达模式和功能研究。90 dah时,荧光原位杂交结果显示,罗非鱼dmrt1 m RNA定位于精巢中精原细胞、初级精母细胞和支持细胞（Sertoli cell）中,卵巢中没有检测到dmrt1的表达。利用设计的高效CRISPR/Cas9g RNA靶点成功在1号外显子突变尼罗罗非鱼dmrt1,获得缺失2 bp和5 bp的两种纯合突变体。60 dah时组织学检测发现,所有dmrt1突变XY鱼发生了由雄向雌的性逆转,其性腺发育为卵巢。免疫荧光结果表明,dmrt1纯合突变XY鱼性腺中表达雌激素合成酶Cyp19a1a,不表达雄激素合成酶Cyp11c1。成年期dmrt1突变鱼卵子发生正常,性腺中存在有卵黄的卵母细胞。性别决定关键时期4 dah时,免疫荧光结果显示,罗非鱼性别决定基因amhy的表达在XY dmrt1突变性腺不受影响,而另一个重要的dmrt1下游雄性通路基因Gsdf不表达,表明dmrt1突变鱼发生了原发性逆转。孵化后15天时,dmrt1突变XY性腺中可检测到Cyp19a1a的表达。这些结果证实在雄性通路中,dmrt1位于amhy和gsdf之间,也就是说,尼罗罗非鱼雄性通路由amhy-dmrt1-gsdf构成。3、尼罗罗非鱼dmrt1;foxl3双基因突变系的建立及表型分析。利用dmrt1杂合突变XY鱼和foxl3杂合突变XX鱼繁殖获得dmrt1;foxl3双杂合突变XX和XY后代。进一步通过双杂合突变鱼繁殖获得dmrt1;foxl3双纯合突变后代。60 dah时组织学观察发现,dmrt1;foxl3双突变XX鱼性腺生殖细胞发育为卵母细胞,表明dmrt1的缺失回救了XX foxl3突变体生殖细胞性逆转的表型。另一方面,dmrt1;foxl3双突变XY鱼性腺发育为精卵巢,性腺中除卵母细胞外,还存在精母细胞,表明突变foxl3部分回救了XY dmrt1突变体生殖细胞的表型。荧光免疫组化结果显示,双突变性腺中有明显的Cyp19a1a表达。双突变XX/XY鱼血清雌激素水平和对照XX鱼接近。这些结果提示,dmrt1和foxl3在生殖细胞性别命运决定过程中存在相互拮抗的作用。4、尼罗罗非鱼Dmrt1和Foxl3相互调控影响生殖细胞可塑性。Dmrt1和Foxl3双突变鱼生殖细胞性别的相互回救促使我们进一步检测dmrt1在foxl3突变XX性腺中的表达和foxl3在dmrt1突变XY性腺中的表达。RT-PCR、real-time PCR和Western blot结果证实foxl3突变XX性腺中dmrt1在m RNA和蛋白水平显着升高。荧光原位杂交结果显示,dmrt1主要定位于foxl3突变XX性腺中生殖细胞,而不在对照XX卵巢中表达。另一方面,real-time PCR结果显示,dmrt1突变XY性腺中foxl3表达量显着升高。荧光原位杂交结果表明,30 dah时dmrt1突变XY性腺中生殖细胞表达foxl3,而对照XY性腺生殖细胞中不表达foxl3。进一步的调控实验证实,在HEK293细胞中,Dmrt1和Foxl3分别以剂量依赖的方式下调foxl3和dmrt1的启动子活性。删除或突变相应的启动子上结合位点,可以去除两者之间的抑制效果。凝胶迁移和染色质免疫共沉淀实验分析表明,Dmrt1和Foxl3可以在体外直接结合foxl3和dmrt1启动子上相应的结合位点。这些结果表明,Dmrt1和Foxl3通过直接结合对方启动子发挥转录抑制作用。利用外源雌激素处理对foxl3突变鱼进行回救。结果显示,E2处理1个月后foxl3杂合突变XY鱼性腺发育为卵巢,而foxl3突变XX鱼性腺中生殖细胞仍进行精子发生,不能诱导卵母细胞产生。表明foxl3是生殖细胞中雌激素下调dmrt1诱导卵母细胞发育所必须的关键基因。采用芳香化酶抑制剂（Fadrozole,aromatase inhibitor,AI）回救dmrt1突变鱼。结果显示,同批处理的dmrt1杂合突变XX鱼发生性逆转,而处理的dmrt1突变XX/XY鱼性腺仍发育为卵巢。Real-time PCR结果显示,AI处理后dmrt1突变性腺中foxl3表达水平与对照雌鱼接近。这些结果表明,AI诱导的由雌向雄的性逆转依赖于dmrt1的存在。突变foxl3或dmrt1后导致的性逆转不能被雌激素或芳香化酶抑制剂回救,表明生殖细胞的可塑性依赖于这两个基因的存在。不同的是,双突变dmrt1;foxl3后再使用AI处理,双突变XX/XY鱼性腺发育为精巢,性腺中不存在卵母细胞。表明突变foxl3后再抑制雌激素合成,能够回救Dmrt1缺失造成的性逆转。此外,AI处理foxl3突变XX鱼后,其性腺发育为正常精巢。前期研究结果表明,敲降或敲除foxl2会导致XX罗非鱼发生性逆转。AI处理的dmrt1突变性腺仍发育为卵巢,这可能是由于foxl2不能被有效抑制所致。在dmrt1突变鱼中敲降foxl2后,dmrt1;foxl2双突变XX/XY性腺发育为精巢,但生殖细胞数目显着减少,且不能起始精子发生。表明dmrt1对于生殖细胞的存活和精子发生的起始是必需的。综上所述,尼罗罗非鱼dmrt1和foxl3分别表达于精巢和卵巢组织中,体外实验证实二者间存在直接的转录抑制。突变dmrt1或foxl3分别导致由雄向雌和生殖细胞由雌向雄的性逆转。双突变体表型分析证实,dmrrt1和foxl3在尼罗罗非鱼生殖细胞性别命运决定过程中起着相互拮抗的作用。外源雌激素和芳香化酶抑制剂回救实验表明,罗非鱼生殖细胞的可塑性依赖于这两个基因的存在。敲降foxl2后,foxl3和dmrt1单突变性腺都发育为精巢,但缺失dmrt1导致精子发生不能正常起始。本研究解析了尼罗罗非鱼dmrt1和foxl3在雌雄性别分化和生殖细胞性别命运决定过程中的关键功能,揭示了dmrrt1和foxl3通过直接的转录抑制作用相互拮抗,决定生殖细胞性别的分子机制,丰富了我们对脊椎动物性别分化和生殖细胞性别决定的认识。
张圆圆[7]（2021）在《山核桃萜类醌的生物合成途径及其成分胡桃醌抑制Ishikawa癌细胞增殖的分子机理》文中进行了进一步梳理山核桃,胡桃科,是一种广泛栽培的木本油料树种。山核桃仁因富含油脂、蛋白质、纤维、酚酸和萜类等生物活性成分而受到人们亲睐。子宫内膜癌是女性生殖道最常见的恶性肿瘤之一,膳食干预是预防疾病的重要措施。本论文首先调查了山核桃授粉后萜类醌的合成,联合转录组学与代谢组学方法明确了山核桃发育期萜类合成与代谢的机制;接着考察了山核桃青皮中胡桃醌对子宫内膜癌Ishikawa细胞增殖抑制效果,利用mRNA-miRNA组学从整体水平明确了胡桃醌对子宫内膜癌Ishikawa细胞的增殖抑制的机制;最后,明确了胡桃醌抑制子宫内膜癌Ishikawa细胞增殖和迁袭的机制。本学位论文的研究结果为山核桃萜类化合物胡桃醌开发成特殊医学用途的功能性食品提供了理论的支持。（1）山核桃授粉后发育期萜类物质代谢机制。山核桃授粉后90-105天（P1-P2）是次级代谢物形成的关键时期。从P1至P2阶段,山核桃中的萜类化合物大量累积,而山核桃授粉后120-165天（P2-P6）萜类化合物含量急剧下降,此外,MENB和C4H基因在山核桃胚胎中高表达,最高的转录组表达量分别为671和1469,其中MENB的高表达水平可能是山核桃胚胎中萜类醌（萘醌）含量高的重要原因。通过网络共表达分析,6种萜烯醌代谢物与86个差异表达基因之间存在显着的正负相关性（r>0.8或<0.8,p<0.05）,且次级代谢产物的表达水平在早期是最高的,这与调控其差异表达基因水平基本一致。（2）山核桃青皮提取物胡桃醌抑制子宫内膜癌Ishikawa细胞的增殖作用。利用超声波辅助提取山核桃青皮提取物的工艺条件为:85%乙醇浸泡8 h、料液比为1:8、超声提取30 min,40℃减压浓缩,在此条件下得到的山核桃青皮粗提取物经大孔树脂与硅胶柱联合纯化后,化合物含量为3.31 mg/kg,纯度为98%,经二次质谱和离子碎片数据数据库比对后该组分鉴定为胡桃醌。胡桃醌处理Ishikawa细胞24 h的半增殖抑制率(IC50)为20.81μmol/L。用不同浓度的胡桃醌（0、10、15、20μM）处理24 h后,Ishikawa细胞的形态变化呈剂量依赖性。（3）转录组学和miRNA组学联合分析胡桃醌抑制Ishikawa细胞增殖。子宫内膜癌Ishikawa细胞经胡桃醌（20μM）处理24 h后,942个mRNA的表达量差异显着。差异表达的mRNA中,789个上调、153个下调,其富集分析在与细胞周期和凋亡相关的通路上。通过Cytoscape的Cytohubba插件分析String数据库构建的差异表达mRNA间蛋白质-蛋白质互作关系（PPI）,发现筛选出的16个特征（Hub）基因主要参与细胞周期G1/S期和铁死亡相关HIF-1信号通路。胡桃醌处理Ishikawa细胞后50个miRNA的表达量显着变化,其中24个上调、26个下调。通过构建miRNA共表达网络,鉴定出4个关键的miRNA（hsa-let-7i-5p,hsa-let-7g-5p,hsa-mir-148b-3p和hsa-mir-148a-3p）,其靶基因富集分析在与凋亡相关通路中。miRNA-mRNA调控网络分析表明,胡桃醌诱导子宫内膜癌Ishikawa细胞增殖抑制与铁死亡和细胞凋亡、周期机制密切相关,且为进一步探究成为功能性食品成分提供线索。（4）胡桃醌诱导Ishikawa细胞凋亡及其机理。胡桃醌通过Cdc25A/CDK2/Cyclin A信号途径将Ishikawa细胞阻滞在S期,显着促进子宫内膜癌Ishikawa细胞的晚期凋亡的发生。胡桃醌诱导Ishikawa细胞凋亡,线粒体途径和死亡受体途径都参与其中。在线粒体途径中,抑凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-x L的表达显着下调,而促凋亡蛋白Bad和Bak表达上调。Caspase 3抑制剂与胡桃醌的联合作用在一定程度上减弱了这种抑制作用,表明线粒体途径中的Caspase3在胡桃醌诱导的Ishikawa细胞凋亡中起关键作用,进一步证实了线粒体途径参与胡桃醌诱导的细胞凋亡。同时在死亡受体途径中,TNF-α、TNF-R1、TRADD、FAS、FADD、Caspase 8、Caspase 10和DR3/5的mRNA和蛋白表达显着上调。当用Caspase-8抑制剂（Z-IETD-FMK）处理时,Caspase 8的表达水平显着降低;而胡桃醌的添加在一定程度上减弱了这种抑制作用,进一步说明了死亡受体通路参与了胡桃醌诱导的Ishikawa细胞凋亡。（5）胡桃醌诱导的子宫内膜癌Ishikawa细胞铁死亡及其机理。胡桃醌处理子宫内膜癌Ishikawa细胞24 h后,出现了Fe2+的积累、脂质过氧化、GSH消耗、HMOX1上调等现象,说明铁死亡可能参与了胡桃醌诱导的细胞死亡。在胡桃醌处理的Ishikawa细胞中,Beclin 1呈剂量依赖性下调。此外,胡桃醌和铁死亡抑制剂Fer-1联合处理24 h后,Ishikawa细胞中Beclin 1的表达增加,表明胡桃醌诱导细胞发生铁自噬。在胡桃醌处理的Ishikawa细胞中,E-cadherin、MMP 9和MMP 2蛋白发生显着变化。结果表明胡桃醌可能通过抑制上皮-间充质转化（EMT）来抑制Ishikawa细胞的迁移。同时,通过用Fer-1抑制剂和胡桃醌处理,进一步说明了胡桃醌诱导的Ishikawa细胞死亡与铁死亡有关。此外,胡桃醌诱导子宫内膜癌Ishikawa细胞发生内质网应激。
梁晶婕[8]（2021）在《小鼠胚胎着床相关microRNA的筛选及miR-192-5p调控子宫内膜容受性的机制》文中认为早期胚胎流失是导致哺乳动物妊娠失败的主要原因之一。研究表明,绝大多数胚胎流失发生在胚胎着床阶段,这一现象普遍存在于高产奶牛、母猪等家畜,严重影响了动物的繁殖效率。辅助生殖技术的诞生使得体外授精和胚胎移植成为可能,但移植后着床率低下的问题依然没有得到显着改善。因此明确胚胎着床的调控机制对于提升哺乳动物的妊娠效率至关重要。影响胚胎着床的因素主要包括胚胎的活性、子宫内膜容受性的建立及二者之间有效的交流对话。其中,子宫内膜容受性的建立是胚胎着床启动的必要前提,也是调控着床进程的主导因素。子宫内膜容受性是指母体子宫在其生殖周期有限时间段内所达到的一种能够接纳胚胎附着的特殊生理状态。研究表明,尽管物种之间采用的着床方式不同,着床早期阶段子宫内膜容受性的建立机制却具有相似之处。然而,由于子宫内膜中各个组分在容受阶段的作用不同,其背后的分子调控网络也十分复杂,目前对于子宫内膜容受性建立的具体机制尚未明确。MicroRNA（miRNA）是一类短链非编码小RNA分子,因其能在转录后水平同时靶向调控多个基因的表达而广泛参与多种生物学进程。目前已有许多研究表明miRNA参与胚胎着床的调控,但其在子宫内膜容受性建立过程中的作用还不清晰。考虑到物种间胚胎着床早期阶段的相似性,本研究利用模式动物小鼠作为实验对象,采用小RNA测序技术对容受前期、容受期和着床期小鼠子宫内膜中的miRNA表达谱进行分析,随后结合荧光定量PCR检测技术和子宫角注射miRNA agomir或antagomir的方法筛选出差异表达且能够影响着床进程的miRNA确立为目标miRNA。随后对目标miRNA在小鼠妊娠早期的时空表达情况进行检测,并且通过建立不同小鼠模型探究影响其呈现特异表达趋势的因素。最终通过体内体外实验调控miRNA的表达,探究其对子宫内膜容受性的影响及其分子调控机制。本研究所得到的主要实验结果如下:（1）对小鼠不同妊娠时期子宫内膜组织中的miRNA表达谱进行分析,结果显示共有42个miRNA在容受前期（妊娠第1天）、容受期（妊娠第4天）和着床期（妊娠第5天）的表达呈现显着差异（|log2（Foldchange）|≥1.5且FDR<0.05）,对部分差异表达的miRNA进行荧光定量PCR验证和体内miRNA表达量干扰后发现,miR-192-5p在容受期和着床期的小鼠子宫内膜中表达量极显着降低（P<0.001）,瞬时上调着床期间子宫内膜中miR-192-5p的表达水平将导致着床失败,提示其可能参与小鼠胚胎着床的调控。（2）miR-192-5p在小鼠妊娠早期（妊娠第1-7天）呈现出持续下滑的表达趋势,在着床期及之后一直维持低水平表达。原位杂交结果显示miR-192-5p主要表达于子宫内膜腔上皮和腺上皮层,且随着子宫进入容受期,腔上皮中miR-192-5p的表达量显着降低。检测正常妊娠小鼠模型、假孕小鼠模型、延时着床模型、人工诱导蜕膜模型中miR-192-5p的表达发现胚胎因素不是导致其在着床期间子宫内膜中表达下调的主要原因;在未孕小鼠的自然发情周期内,miR-192-5p在发情期表达量升高,在间情期表达量降低,提示其表达水平更倾向于受到子宫内膜自身周期性生理变化的影响。（3）通过构建卵巢摘除小鼠模型,并给予不同规模的激素处理发现,雌激素（β-Estradiol,E2）能够显着诱导子宫内膜上皮层中miR-192-5p的表达上调;而孕酮（Progesterone,P4）在单独作用时具有下调miR-192-5p的趋势但尚未达到显着水平,当与E2共同作用时能够极显着抑制miR-192-5p的表达。采用E2和P4共同处理小鼠以模拟容受期间子宫中的激素环境,结果显示miR-192-5p的表达受到显着抑制,提示着床期间子宫内膜中miR-192-5p表达下调是由E2和P4共同影响所致。（4）体内研究表明,上调容受期间子宫中miR-192-5p的表达致使子宫内膜容受性受损,具体表现为细胞表面微绒毛的数量得以维持、胞饮突的形成减少等;此外,部分表达于上皮层中的容受性标记分子的表达出现异常,提示miR-192-5p主要干扰了容受期间上皮细胞的转化行为。体外实验表明,miR-192-5p在非容受性子宫内膜上皮细胞系（HEC-1-A细胞）中的表达极显着高于容受性子宫内膜上皮细胞系（Ishikawa、RL95-2细胞等）。抑制HEC-1-A细胞中miR-192-5p的功能致使细胞形态变圆、细胞间连接蛋白（E-cadherin、ZO-1等）的表达水平降低、细胞骨架相关结构（如应力纤维、表面微绒毛等）发生重排,最终导致上皮细胞极性减弱。此外,抑制miR-192-5p的表达导致细胞表面抗黏附蛋白Mucin1的表达下调,进而提升了细胞表面接纳胚胎附着的能力。探索miR-192-5p的潜在靶基因结果显示,转录因子抑制因子E盒结合锌指蛋白2（Zinc finger E-box-binding homeobox 2,ZEB2）和细胞骨架相关调控因子Rho GTP酶激活蛋白19（Rho GTPase-activating protein 19,ARHGAP19）是 miR-192-5p 的靶基因。二者的蛋白均在容受状态下的子宫组织和细胞中高表达,且改变子宫组织、子宫内膜上皮细胞系中miR-192-5p的表达水平能够导致二者内源性蛋白出现相应的表达变化。此外,在非容受性细胞中过表达ARHGAP19能够部分重现抑制miR-192-5p后产生的表型现象,包括细胞骨架结构的重排、细胞间E-cadherin表达量降低等。不仅如此,过表达ARHGAP19能够促使细胞间E-cadherin表达分布发生变化,细胞呈现出堆积生长的趋势。这些表型与容受期间子宫内膜上皮细胞中发生的变化相类似,提示该分子的表达上调可能促使非容受性细胞向容受性表型过渡。综上所述,本研究探索了小鼠妊娠早期在胚胎着床阶段子宫内膜中差异表达的miRNA谱,并且针对其中一个miRNA,即miR-192-5p在小鼠胚胎着床时期子宫内膜容受性建立过程中的调控作用展开了深入研究。本研究证实了 miR-192-5p高表达于非容受状态的子宫内膜上皮细胞中,参与维持上皮细胞极性和细胞表面的抗黏附特性。妊娠期间,在雌激素和孕激素的共同作用下,miR-192-5p的表达水平被显着抑制,导致细胞表面抗黏附因子表达下调;此外一些调控细胞形态和细胞骨架相关的靶基因如ZEB2、ARHGAP19等的表达水平得以释放,促使细胞连接蛋白和细胞骨架发生重排,最终导致上皮细胞极性减弱,细胞状态向容受态过渡,使得胚胎着床得以启动。这些研究成果进一步揭示了 miRNA介导下子宫内膜容受性建立的分子机制,为提升哺乳动物的胚胎着床率和妊娠率提供了新的理论参考。此外,miR-192-5p还有望作为一个新的分子标记用于辅助生殖中子宫内膜容受性的评估和诊断。
张银[9]（2020）在《拟穴青蟹早期发育转录组分析及Hox基因SpUbx/SpAntp/SpAbd-A功能初步研究》文中指出拟穴青蟹早期发育过程属于典型的变态发育,其幼体变态过程包括从胚胎到溞状幼体、大眼幼体再到仔蟹的过程。变态过程中,其个体形态和生活习性均发生巨大改变,最显着的形态变化是其腹部形态的改变,包括形状变扁、腹肢退化、失去游泳功能、折叠于头胸甲下方等,这种变化与拟穴青蟹底栖生活适应性密切相关。青蟹早期幼体在变态发育过程中存活率极低,这严重制约了青蟹人工养殖发展的步伐,因此对拟穴青蟹早期发育阶段的研究显得尤为必要。个体在变态过程中的形态和生活习性均发生巨大改变,然而,其变态发育的分子机制尚不清楚。为阐明拟穴青蟹幼体变态发育的分子机制,本研究首先通过转录组学手段,对拟穴青蟹早期变态发育阶段的基因及通路进行分析,探究拟穴青蟹早期变态发育阶段的关键生物学变化;然后,通过转录组数据筛选与形态发育相关的基因-Hox基因,分析Hox基因家族基因在拟穴青蟹早期不同发育时期的表达规律,并借助基因组对Hox基因簇进行基因组定位;最后,对在拟穴青蟹早期变态发育过程中形态发育相关的关键差异表达Hox基因SpUbx、SpAntp和SpAbd-A进行功能解析及调控机制研究。主要研究结果如下:1、通过对拟穴青蟹早期发育胚胎期、溞状幼体I期、溞状幼体III期、溞状幼体V期、大眼幼体和仔蟹I期的转录组测序,构建了拟穴青蟹早期变态发育时期的基因表达库,这些基因较多的参与机体催化活性、细胞过程、代谢过程和结合等功能以及嘌呤代谢、溶酶体、内吞作用、吞噬体和RNA转运等代谢通路。在拟穴青蟹幼体中高表达的胰凝乳蛋白酶可能与幼体食性的转变相关,在胚胎期高表达的基因中有较多的核糖体蛋白,钙化表皮蛋白在仔蟹I期中高表达可能与仔蟹表皮硬化相关,视蛋白在溞状幼体V期中高表达说明溞状幼体V期可能是视觉形成关键期,除此之外,还发现一些与消化、免疫、肌肉生长和能量代谢相关的基因也在不同时期中高表达。差异表达基因在各个时期的表达规律揭示了拟穴青蟹早期个体在消化功能、视觉形成和外壳形成等方面的特征变化。2、通过对拟穴青蟹早期变态发育关键的四个时期（胚胎、溞状幼体、大眼幼体和仔蟹）的转录组的比较分析发现,在胚胎期高表达的基因主要富集在核糖体、RNA转运、剪切体等与蛋白的翻译有关的通路和功能模块中,说明胚胎期中转录翻译过程较强;在溞状幼体I期上调的基因显着性的富集在无机离子转运和代谢、电压门控钙通道复合物、电压门控钠通道复合物和溶质:钠同工酶活性等与离子交换和渗透压调节相关的通路和功能模块中,同时视觉发育相关的通路--光传导也被显着富集,说明拟穴青蟹胚胎期到溞状幼体I期变态发育的过程中发生的主要变化体现在渗透压调节、视觉发育和消化功能等方面。在溞状幼体到大眼幼体及大眼幼体到仔蟹I期的发育过程中,在大眼幼体上调的基因显着富集的通路ECM受体相互作用和血管平滑肌收缩主要与肌肉生成相关,这可能与大眼幼体运动功能的加强有关。此外,还有一些与消化代谢和视觉相关的通路被显着富集。而在仔蟹中上调表达的基因主要编码钙化表皮蛋白和表皮原蛋白等,仔蟹时期表皮钙化的加强也是对底栖生活的一种适应。3、重点分析了与形态发育密切相关的Hox基因在拟穴青蟹早期不同发育时期的表达特征。从转录组数据中共筛选到122条与Homeobox相关的基因,其中有51个在拟穴青蟹早期发育过程中差异表达,包括5个簇状Hox基因Dfd、ftz、Antp、Ubx和Abd-A和一些非簇状Hox基因aristaless、cut-like、empty spiracles、engrailed、even-skipped、prospero和six1-like等,并且表达模式主要分为四类:Dfd、ftz、aristaless、empty spiracles和engrailed在胚胎期高表达,随后表达开始下降,这类基因占大多数;Antp和six1-like在胚胎期高表达,溞状幼体I期和III期表达开始下降,到溞状幼体V期又上升,大眼幼体和仔蟹I期开始表达降低;Ubx和Abd-A基因在溞状幼体V期显着高表达,其它时期无太大浮动。这些表达模式可能说明Hox基因参与了拟穴青蟹胚胎时期和幼体的形态发育。研究发现,拟穴青蟹簇状Hox基因在基因组上的位置与其它节肢动物一样是共线性的。4、Hox基因Ubx、Antp和Abd-A基因在幼体变态过程中的表达水平发生显着改变,暗示其可能参与了变态的调控。通过基因克隆、荧光定量和原位杂交等技术对Ubx、Antp和Abd-A基因的功能进行了初步研究。结果表明,SpUbx、SpAntp和SpAbd-A的c DNA全长分别为1,401 bp、1,402 bp和1,282 bp,分别编码315、236和180个氨基酸。在这三个基因的蛋白结构中,无规卷曲均占到大多数,预测这三个基因编码的蛋白均无跨膜结构域和信号肽切割位点。SpUbx和SpAntp基因在雌蟹和雄蟹的神经节、肠道、鳃和肌肉中高表达,SpAbd-A在肠道中的表达显着高于其它组织。在早期发育过程中,SpUbx、SpAntp和SpAbd-A的表达模式比较相近,在溞状幼体III期和V期的表达均较高。此外,在溞状幼体III期到V期的腹部,SpUbx和SpAntp显着低表达,SpAbd-A高表达,原位杂交结果显示三者在溞状幼体中的表达位置也主要位于胸腹部,而拟穴青蟹溞状幼体III期到V期主要处于胸腹部发育的关键阶段,由此推测,SpUbx、SpAntp和SpAbdA可能参与拟穴青蟹早期个体胸腹部发育过程。SpUbx和SpAntp在m RNA水平和蛋白水平的表达具有一致性,通过染色质免疫共沉淀技术发现UBX蛋白能与SpAntp启动子共同沉淀下来,说明Ubx可能通过结合SpAntp启动子区域来调节SpAntp基因在拟穴青蟹中的表达。综上所述,本研究构建了拟穴青蟹早期变态发育阶段的基因表达库。对变态发育关键阶段的差异表达基因进行了剖析。对与形态发育相关的Hox基因家族基因在早期不同发育时期的表达特征进行了研究,结合基因组定位,发现了Hox基因簇的共线性关系。筛选到在拟穴青蟹早期变态发育时期差异表达的Hox基因SpUbx、SpAntp和SpAbd-A基因,通过对这三个基因的克隆和表达特性分析,推测这三个基因参与拟穴青蟹早期个体胸腹部的发育,通过染色质免疫共沉淀技术发现Ubx通过结合SpAntp启动子区域来调节SpAntp基因在拟穴青蟹中的表达。本研究初步探究了拟穴青蟹幼体变态发育的调控机理,深入揭示拟穴青蟹变态发育机制和节肢动物Hox基因系统进化提供理论依据,对于促进苗种繁育工作的开展亦具有重要的现实和理论意义。
毕美玉[10]（2020）在《利用CRISPR/Cas9构建DGAT1基因在MSTN位点定点整合小鼠的研究》文中指出近年来,CRISPR/Cas9技术因操作简单、耗时短等优势被广泛应用于多个领域。在家畜育种方面,已经利用CRISPR/Cas9技术成功构建了多种动物模型,这些育种模型的构建对于家畜新品种培育具有重要的参考价值。肌肉生长抑制素（myostatin,MSTN）作为骨骼肌增殖分化和生长发育的负调控因子,它的缺失或低表达均会导致肌肉肥大。二酰甘油酰基转移酶1（Acyl Co A:diacylglycerol acyltransferase 1,DGAT1）是调控甘油三酯合成的唯一的关键酶,在动物机体的脂肪代谢、脂类沉积等过程中起着重要作用。该研究主要利用CRISPR/Cas9技术构建DGAT1基因在MSTN位点定点整合小鼠模型,为培育产肉量高且肉质鲜美的优良家畜新品种提供研究基础。研究结果如下:1.Cas9-gRNA表达载体和DGAT1定点整合载体的构建首先,根据CRISPR Design软件设计了4对gRNA并筛选出剪切活性较高的gRNA（命名为1-1）,构建了T7-Cas9-gRNA表达载体和U6-Cas9-gRNA表达载体。此外,我们还以pc DNA3.0为骨架载体成功构建了针对MSTN位点的DGAT1定点整合载体。2.Cas9-gRNA表达载体和DGAT1定点整合载体在细胞水平的功能验证通过电穿孔转染法将构建成功的U6-Cas9-gRNA表达载体、DGAT1定点整合载体和pc DNA3.0空载体按不同的组合及比例转入C2C12细胞中。通过PCR检测发现在同时转入U6-Cas9-gRNA表达载体和DGAT1定点整合载体组中随机整合鉴定和定点整合鉴定均出现了符合预期的条带。通过实时定量PCR检测发现,在转入U6-Cas9-gRNA表达载体组以及同时转入U6-Cas9-gRNA表达载体和DGAT1定点整合载体组中,MSTN基因在mRNA水平的表达量均低于转入空载体组和未经转染组,而在同时转入U6-Cas9-gRNA表达载体和DGAT1定点整合载体组中DGAT1基因的表达量则明显高于转入U6-Cas9-gRNA表达载体组、转入空载体组和未经转染组。结果表明,所构的U6-Cas9-gRNA表达载体和DGAT1定点整合载体不仅能实现DGAT1基因在MSTN基因位点的定点整合,还可以在mRNA水平实现MSTN基因低表达的同时DGAT1基因高表达。3.基因编辑小鼠模型的制备及鉴定通过原核注射技术将gRNA和Cas9 mRNA以及线性化的DGAT1定点整合载体注射到小鼠受精卵的原核中来制备基因编辑小鼠模型。本实验中,我们共获取4006枚小鼠受精卵,挑选其中状态良好的3041枚受精卵进行了原核注射,体外培养获得2082枚胚胎,将其移植到61只ICR代孕母鼠体内,共出生124只小鼠,最终存活111只,经PCR鉴定我们发现有4只DGAT1基因在MSTN位点定点整合小鼠,1只DGAT1基因随机整合且MSTN基因敲除小鼠,8只DGAT1基因随机整合小鼠,8只MSTN基因敲除小鼠,出生率为5.95%,阳性率为16.93%,定点整合效率为3.2%。
二、胚胎生物技术在实验动物中的应用与展望（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、胚胎生物技术在实验动物中的应用与展望（论文提纲范文）
（1）SHH通路在缺血性脑卒中和新生小鼠肺发育中的作用机制研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| PartⅠ:探究SHH通路在缺血性脑卒中中的作用及其分子机制 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 脑卒中 |
| 1.2 脑卒中的风险因素 |
| 1.3 急性缺血性脑卒中的治疗 |
| 1.3.1 静脉溶栓 |
| 1.3.2 血管内治疗 |
| 1.3.3 支架回收器 |
| 1.4 脑卒中的损伤机制 |
| 1.5 脑卒中损伤的分子机制 |
| 1.5.1 缺血引起的细胞外谷氨酸积累 |
| 1.5.2 谷氨酸大量释放的机制 |
| 1.5.3 缺血后再灌注时激活谷氨酸能递质 |
| 1.5.4 细胞外谷氨酸积累与神经元损伤 |
| 1.5.5 缺血后脑梗死 |
| 1.6 脑卒中的保护机制 |
| 1.6.1 阻断突触前谷氨酸释放 |
| 1.6.2 阻断突触后谷氨酸受体激活 |
| 1.6.3 促进细胞外谷氨酸的重吸收 |
| 1.7 SHH通路调节细胞外谷氨酸浓度 |
| 1.7.1 SHH通路 |
| 1.7.2 SHH非经典通路 |
| 1.8 本课题的研究依据和目的 |
| 第二章 实验材料与实验方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 实验材料和试剂 |
| 2.1.3 实验仪器 |
| 2.1.4 常用试剂及配方 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞培养 |
| 2.2.2 克隆与细胞转染 |
| 2.2.3 实时荧光定量PCR |
| 2.2.4 电生理细胞膜片钳 |
| 2.2.5 ~3H标记的谷氨酸重吸收检测 |
| 2.2.6 细胞膜蛋白提取 |
| 2.2.7 蛋白样品制备及免疫印迹 |
| 2.2.8 免疫沉淀 |
| 2.2.9 脑缺血模型与TTC染色 |
| 2.2.10 数据分析 |
| 第三章 实验结果 |
| 3.1 SHH通路通过GLT-1 调节胞外谷氨酸的浓度 |
| 3.2 SHH通路通过PKCα调节GLT-1 |
| 3.3 SHH通路通过PKCα调节GLT-1a使其下膜 |
| 3.4 SHH通路通过PKCα磷酸化GLT-1的563 位点使其下膜 |
| 3.5 抑制GLT-1 的磷酸化改善小鼠缺血后的脑梗死面积 |
| 3.6 抑制SHH通路改善小鼠脑缺血后的脑梗死面积 |
| 3.7 NVP-LDE225 可以有效改善非人类灵长类缺血模型后的脑损伤 |
| 第四章 讨论 |
| 4.1 讨论 |
| 4.2 不足之处 |
| 第五章 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| PartⅡ:探究SHH通路在新生小鼠肺发育中的作用及其分子机制 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 HH通路 |
| 1.2 SHH通路 |
| 1.3 SHH经典通路 |
| 1.4 SHH非经典通路 |
| 1.4.1 Ⅰ型非经典SHH通路 |
| 1.4.2 Ⅱ型非经典SHH通路 |
| 1.5 SHH通路的作用 |
| 1.5.1 SHH通路在胚胎肺发育中的作用 |
| 1.5.2 SHH通路在疾病中的作用 |
| 1.6 SHH通路的激活与抑制 |
| 1.6.1 SHH通路的激活 |
| 1.6.2 SHH通路的抑制 |
| 1.7 本课题的研究依据和目的 |
| 第二章 实验材料与实验方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 实验材料和试剂 |
| 2.1.3 实验仪器 |
| 2.1.4 常用试剂及配方 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞培养 |
| 2.2.2 电生理细胞膜片钳 |
| 2.2.3 实时荧光定量PCR |
| 2.2.4 克隆与细胞转染 |
| 2.2.5 蛋白样品制备及免疫印迹 |
| 2.2.6 CCK8 检测细胞增殖 |
| 2.2.7 分子模拟 |
| 2.2.8 结合实验 |
| 2.2.9 免疫组化 |
| 2.2.10 数据分析 |
| 第三章 实验结果 |
| 3.1 糖皮质激素可以抑制SHH通路 |
| 3.2 Cortisol抑制SHH通路 |
| 3.3 Cortisol与 SMO结合抑制SHH通路 |
| 3.4 Cortisol通过与SMO的112 位点结合抑制SHH通路 |
| 3.5 Cortisol在小鼠中抑制SMO的活性 |
| 第四章 讨论 |
| 4.1 讨论 |
| 4.2 不足之处 |
| 第五章 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 附录:SHH通路在发育和疾病过程中的作用 |
| 参考文献 |
| 作者在学期间取得的学术成果 |
| 主要简历 |
| 致谢 |
（2）基于多组学分析的日本囊对虾生长调控机制初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词 |
| 1 文献综述 |
| 1.1 对虾生长发育与蜕壳 |
| 1.1.1 胚胎发育 |
| 1.1.2 幼体变态发育 |
| 1.1.3 蜕壳与生长 |
| 1.2 影响甲壳动物生长的关键因子 |
| 1.2.1 年龄因素 |
| 1.2.2 性别因素 |
| 1.2.3 遗传背景 |
| 1.2.4 其它因素 |
| 1.3 生长性状相关候选基因 |
| 1.3.1 与蜕壳过程相关基因 |
| 1.3.2 肌肉生长抑制蛋白 |
| 1.3.3 Hippo信号通路及相关基因 |
| 1.3.4 α-淀粉酶 |
| 1.3.5 肌球蛋白重链 |
| 1.4 组学技术及其在甲壳动物生长性状研究中的应用前景 |
| 1.4.1 转录组学 |
| 1.4.2 蛋白质组学 |
| 1.4.3 代谢组学 |
| 1.4.4 多组学联合分析 |
| 1.5 本研究的目的、意义和主要研究内容 |
| 1.5.1 研究目的和意义 |
| 1.5.2 研究主要内容和技术路线 |
| 2 日本囊对虾零换水养殖试验及生长规律分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 全同胞家系的构建及育苗管理 |
| 2.1.2 零换水养殖试验及饲养管理 |
| 2.1.3 水质指标的测定 |
| 2.1.4 生长指标测量 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 不同发育时期育苗水体理化因子分析 |
| 2.2.2 育苗成活率统计 |
| 2.2.3 养殖水体理化因子变化情况分析 |
| 2.2.4 零换水养殖模式下日本囊对虾生长规律分析 |
| 2.3 讨论 |
| 3 生理生化指标和肠道菌群对日本囊对虾生长的影响 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验用虾及饲养管理 |
| 3.1.2 肝胰腺生理指标的测定 |
| 3.1.3 肠道菌群分析 |
| 3.1.4 体成分分析 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 三种消化酶活性比较分析 |
| 3.2.2 三种免疫相关酶活性比较分析 |
| 3.2.3 肠道菌群分析 |
| 3.2.4 体成分分析 |
| 3.3 讨论 |
| 4 转录组学解析日本囊对虾生长调控机制 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 实验用虾 |
| 4.1.2 肌肉总RNA提取 |
| 4.1.3 SMRT文库构建和测序 |
| 4.1.4 Illumina文库构建和测序 |
| 4.1.5 SMRT测序数据处理 |
| 4.1.6 功能注释 |
| 4.1.7 差异表达基因分析 |
| 4.1.8 Simple Sequence Repeats(SSR)预测 |
| 4.1.9 编码区序列(Coding Sequence,CDS)预测 |
| 4.1.10 lncRNA预测 |
| 4.1.11 转录因子分析 |
| 4.1.12 Quantitative Real Time PCR(qPCR) |
| 4.1.13 Mj14-3-3-like基因克隆与表达分析 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 SMRT和NGS测序数据统计 |
| 4.2.2 功能注释 |
| 4.2.3 快速生长组和缓慢生长组差异表达基因分析 |
| 4.2.4 与生长相关的通路和基因 |
| 4.2.5 差异表达基因验证 |
| 4.2.6 Mj14-3-3-like克隆和表达分析 |
| 4.2.7 SSR预测 |
| 4.2.8 CDS分析 |
| 4.2.9 LncRNA预测 |
| 4.2.10 转录因子分析 |
| 4.3 讨论 |
| 5 蛋白质组学解析日本囊对虾生长调控机制 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 实验用虾 |
| 5.1.2 iTRAQ技术原理 |
| 5.1.3 iTRAQ实验流程 |
| 5.1.4 qPCR验证 |
| 5.1.5 Mj14-3-3-epsilon-like、MjGPI和MjGPD1克隆与表达分析 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 蛋白质鉴定及注释 |
| 5.2.2 差异表达蛋白(DEPs)分析 |
| 5.2.3 蛋白质组(DEPs)与转录组(DEGs)联合分析 |
| 5.2.4 qPCR验证 |
| 5.2.5 Mj14-3-3-epsilon-like、MjGPI和MjGPD1克隆与表达分析 |
| 5.2.6 与日本囊对虾生长相关的通路解析 |
| 5.3 讨论 |
| 6 代谢组学解析日本囊对虾生长调控机制 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 实验用虾 |
| 6.1.2 代谢物提取 |
| 6.1.3 上机检测 |
| 6.1.4 数据处理 |
| 6.1.5 差异代谢物检测 |
| 6.2 结果与分析 |
| 6.2.1 过程质控与数据质控 |
| 6.2.2 各分组主成分分析 |
| 6.2.3 差异分组的正交偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA) |
| 6.2.4 代谢物鉴定和差异分析 |
| 6.2.5 SG40 vs FG40和SG70 vs FG70差异代谢物比较分析 |
| 6.2.6 差异代谢物检测 |
| 6.3 讨论 |
| 7 转录组学解析地膜替代沙底对日本囊对虾生长和体色的影响 |
| 7.1 材料与方法 |
| 7.1.1 实验用虾 |
| 7.1.2 RNA提取、文库构建和测序 |
| 7.1.3 转录组组装和功能注释 |
| 7.1.4 差异表达基因分析和功能富集 |
| 7.1.5 qPCR验证 |
| 7.2 结果和分析 |
| 7.2.1 转录组组装和功能注释 |
| 7.2.2 差异表达基因分析 |
| 7.2.3 qPCR验证 |
| 7.3 讨论 |
| 8 全文结论、创新点及研究展望 |
| 8.1 全文结论 |
| 8.2 创新点 |
| 8.3 研究展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 导师简介 |
（3）BMP信号通路影响罗氏沼虾附肢再生的分子机制初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 文献综述 |
| 1.1 动物自切行为及再生研究 |
| 1.1.1 动物自切 |
| 1.1.2 动物附肢再生过程研究 |
| 1.2 动物再生的分子机制研究 |
| 1.2.1 参与再生过程中的关键因子 |
| 1.2.2 参与再生过程中的信号通路 |
| 1.3 BMP-Smad信号通路研究进展 |
| 1.3.1 BMP-Smad信号通路分子生物学基础 |
| 1.3.2 BMP-Smad信号通路的功能 |
| 1.4 研究目的和意义 |
| 1.5 主要内容及技术路线 |
| 2 罗氏沼虾断肢再生的形态学观察和组织学分析 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验对象与饲养管理 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.1.3 实验仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 罗氏沼虾附肢再生的周期及再生情况 |
| 2.2.2 取样及组织固定 |
| 2.2.3 石蜡包埋组织切片和H.E染色 |
| 2.2.4 镜检 |
| 2.3 实验结果与分析 |
| 2.3.1 罗氏沼虾断肢再生过程的形态学观察 |
| 2.3.2 罗氏沼虾断肢再生初期阶段组织学分析 |
| 2.4 讨论 |
| 3 罗氏沼虾断肢不同再生阶段的比较转录组分析 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验试剂 |
| 3.1.2 实验耗材及仪器 |
| 3.1.3 动物及样品采集 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 RNA提取、文库构建和测序 |
| 3.2.2 转录组组装和基因注释 |
| 3.2.3 差异表达基因(DEGs)分析 |
| 3.2.4 qPCR验证差异表达基因 |
| 3.2.5 数据处理 |
| 3.3 实验结果与分析 |
| 3.3.1 转录组测序和组装 |
| 3.3.2 功能注释与分类 |
| 3.3.3 差异表达基因聚类分析 |
| 3.3.4 筛选可能参与再生初始信号转导的转录调节因子 |
| 3.3.5 断肢再生相关通路注释 |
| 3.3.6 qPCR验证 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 候选参与再生初始信号转导的转录调节因子 |
| 3.4.2 候选参与罗氏沼虾附肢再生的相关信号通路 |
| 4 罗氏沼虾BMP信号通路关键基因的克隆与表达分析 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 实验动物 |
| 4.1.2 实验试剂 |
| 4.1.3 实验仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 罗氏沼虾步足基部肌肉组织总RNA提取 |
| 4.2.2 罗氏沼虾cDNA模板的合成 |
| 4.2.3 罗氏沼虾BMP信号通路各关键基因编码区(ORF)序列扩增 |
| 4.2.4 BMP信号通路各关键基因生物信息学分析 |
| 4.2.5 罗氏沼虾BMP信号通路各关键基因时空表达特征分析 |
| 4.2.6 数据处理 |
| 4.3 实验结果与分析 |
| 4.3.1 罗氏沼虾BMP信号通路各关键基因的克隆及生物信息学分析 |
| 4.3.2 罗氏沼虾BMP信号通路各关键基因空间表达特征分析 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 罗氏沼虾BMP信号通路各关键基因的结构特征 |
| 4.4.2 罗氏沼虾BMP信号通路各关键基因的表达模式 |
| 5 去表达BMP信号通路各关键基因对罗氏沼虾附肢再生的影响 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 实验动物 |
| 5.1.2 实验试剂 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 引物设计 |
| 5.2.2 RNA双链合成 |
| 5.2.3 Mrdpp敲降后罗氏沼虾断肢再生过程的形态学观察 |
| 5.2.4 Mrdpp敲降后罗氏沼虾断肢再生初期阶段组织学分析 |
| 5.2.5 dsRNA-Mrdpp体外组织孵育实验 |
| 5.2.6 BMPⅠ型受体抑制剂LDN-193189体内注射实验 |
| 5.2.7 BMP信号通路各关键基因dsRNA体内注射实验 |
| 5.2.8 数据处理 |
| 5.3 实验结果与分析 |
| 5.3.1 长期敲降Mrdpp基因表达对罗氏沼虾附肢再生的影响 |
| 5.3.2 体外组织中敲降Mrdpp,对BMP信号通路关键基因表达的影响 |
| 5.3.3 BMPⅠ型受体抑制剂对断肢罗氏沼虾BMP信号通路各关键基因表达的影响 |
| 5.3.4 断肢罗氏沼虾BMP信号通路各关键基因敲降后的相互影响 |
| 5.4 讨论 |
| 5.4.1 长期敲降Mrdpp基因表达对罗氏沼虾附肢再生的影响 |
| 5.4.2 探究BMPⅠ型受体抑制剂对断肢罗氏沼虾BMP信号通路各关键基因表达的影响 |
| 5.4.3 断肢罗氏沼虾BMP信号通路各关键基因的敲降后的相互影响 |
| 6 过表达MrDpp及其受体MrBMPR1B对断肢罗氏沼虾BMP信号通路各关键基因表达的影响 |
| 6.1 实验材料 |
| 6.1.1 实验动物 |
| 6.1.2 质粒与菌株 |
| 6.1.3 实验试剂 |
| 6.1.4 实验仪器 |
| 6.1.5 溶液配制 |
| 6.2 实验方法 |
| 6.2.1 罗氏沼虾Mrdpp及MrBMPR1B原核表达载体的构建 |
| 6.2.2 重组蛋白pET-Dpp及pET-BMPR1B的诱导表达与复性 |
| 6.2.3 重组蛋白pET-Dpp及pET-BMPR1B体外孵育实验 |
| 6.2.4 重组蛋白pET-Dpp体内注射实验 |
| 6.2.5 数据处理 |
| 6.3 结果与分析 |
| 6.3.1 罗氏沼虾Mrdpp和MrBMPR1B原核表达载体构建 |
| 6.3.2 体外过表达pET-Dpp及pET-BMPR1B对BMP信号通路各关键基因表达水平的影响 |
| 6.3.3 体内过表达pET-Dpp对BMP信号通路各关键基因表达水平的影响 |
| 6.4 讨论 |
| 7 全文总结与展望 |
| 7.1 全文总结 |
| 7.1.1 了解了罗氏沼虾附肢再生所需时间及再生重要阶段 |
| 7.1.2 获得了罗氏沼虾不同再生阶段转录组基础数据 |
| 7.1.3 鉴定了罗氏沼虾BMP信号通路各关键基因及其组织表达特征 |
| 7.1.4 明确了Mrdpp的敲降能够显着抑制罗氏沼虾附肢再生 |
| 7.1.5 探究了过表达重组蛋白pET-Dpp及其受体pET-BMPR1B调控BMP信号通路各关键基因表达 |
| 7.2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 导师简介 |
（4）鱼类脂滴自噬与脂滴水解在脂代谢调控中的互作机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 第一节 鱼类脂滴自噬研究进展 |
| 1.1 脂滴自噬的定义和发生过程 |
| 1.2 脂滴自噬在鱼类营养领域的研究进展 |
| 1.3 鱼类脂滴自噬与哺乳动物研究现状的简要比较 |
| 第二节 鱼类脂滴水解研究进展 |
| 2.1 脂滴水解的概念和关键步骤 |
| 2.2 脂滴水解在不同鱼类中的作用与调控 |
| 2.3 鱼类脂滴水解与哺乳动物研究现状的简要比较 |
| 第三节 哺乳动物脂滴自噬与脂滴水解关系研究进展 |
| 3.1 脂滴水解与自噬/脂滴自噬的互作研究 |
| 3.2 调控脂滴水解与脂滴自噬的信号通路 |
| 第四节 本研究的科学问题 |
| 第五节 本论文研究目的和意义 |
| 第二章 自噬与脂解对鱼类生长代谢的重要性研究 |
| 第一节 抑制自噬对尼罗罗非鱼整体营养代谢的影响研究 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 材料与方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第二节 抑制脂解对斑马鱼生长代谢的影响研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 斑马鱼脂滴水解与脂滴自噬关键基因敲除品系的建立 |
| 第一节 斑马鱼脂滴水解关键基因atgl纯合品系的构建 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 Atgl敲除斑马鱼建系过程 |
| 1.3 atgl基因组织分布情况 |
| 1.4 atgl~(-/-)幼鱼表型 |
| 1.5 小结 |
| 第二节 斑马鱼脂滴自噬关键基因lal纯合品系的构建 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 Lal敲除斑马鱼建系过程 |
| 2.3 lal基因组织分布情况 |
| 2.4 lal~(-/-)幼鱼转录组以及表型摸索 |
| 2.5 小结 |
| 第四章 Atgl和 Lal敲除斑马鱼的代谢模式探索 |
| 第一节 Atgl敲除斑马鱼的整体表型 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 材料与方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 讨论和小结 |
| 第二节 Lal敲除斑马鱼的整体表型 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论和小结 |
| 第三节 Atgl和 Lal敲除斑马鱼的成鱼转录组比较 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论和小结 |
| 第五章 从中性脂肪酶和酸性脂肪酶角度探究鱼类脂滴自噬与脂滴水解之间的关系 |
| 第一节 敲除斑马鱼Atgl对肝脏脂解与自噬的影响 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 材料与方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 讨论和小结 |
| 第二节 敲除斑马鱼Lal对肝脏脂解与自噬的影响 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论和小结 |
| 第三节 脂解与自噬同时受阻对斑马鱼肝损伤和线粒体稳态的影响 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论和小结 |
| 第六章 结论与展望 |
| 第一节 主要结论 |
| 第二节 论文创新点 |
| 第三节 研究展望 |
| 参考文献 |
| 作者简历及在研期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（5）褐飞虱热激蛋白不同家族基因及其功能研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 昆虫对温度胁迫的响应 |
| 1.1.1 温度胁迫对昆虫的影响 |
| 1.1.2 昆虫应对温度胁迫的机制 |
| 1.2 热激蛋白概述 |
| 1.2.1 sHSP |
| 1.2.2 DNAJ/HSP70 |
| 1.2.3 Chaperonin |
| 1.2.4 HSP90 |
| 1.2.5 HSP100 |
| 1.3 褐飞虱热激蛋白相关研究 |
| 1.4 研究的内容与意义 |
| 第二章 主要实验仪器、材料及方法 |
| 2.1 供试昆虫 |
| 2.2 温度胁迫处理 |
| 2.3 主要仪器设备 |
| 2.4 主要实验试剂 |
| 2.4.1 常用试剂 |
| 2.4.2 常用试剂盒 |
| 2.5 实验方法 |
| 2.5.1 Trizol法提取总RNA |
| 2.5.2 总RNA反转录 |
| 2.5.3 实时荧光定量PCR(q RT-PCR) |
| 2.5.4 DNA琼脂糖凝胶纯化回收 |
| 2.5.5 T载体连接 |
| 2.5.6 热激法转化 |
| 2.5.7 挑斑摇菌 |
| 2.5.8 双链RNA合成 |
| 2.5.9 褐飞虱显微注射 |
| 第三章 褐飞虱s HSP家族基因鉴定及功能分析 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 褐飞虱种群及饲养 |
| 3.2.2 褐飞虱s HSP基因鉴定及序列分析 |
| 3.2.3 sHSP基因时空表达模式分析 |
| 3.2.4 RNA干扰实验 |
| 3.2.5 正常生长条件下褐飞虱雌虫生殖力测定 |
| 3.2.6 高温胁迫下褐飞虱雌虫生殖力测定 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 褐飞虱sHSP基因鉴定及系统发育分析 |
| 3.3.2 时空表达模式分析 |
| 3.3.3 表型观察 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 褐飞虱HSP70/DNAJ家族基因鉴定及功能分析 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 褐飞虱种群及饲养 |
| 4.2.2 基因鉴定与序列分析 |
| 4.2.3 时空表达模式分析 |
| 4.2.4 正常生长条件下RNA干扰实验 |
| 4.2.5 RNAi后高温胁迫处理 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 褐飞虱HSP70和DNAJ家族基因鉴定 |
| 4.3.2 系统发育分析 |
| 4.3.3 褐飞虱HSP70和DNAJ基因组织表达模式分析 |
| 4.3.4 褐飞虱HSP70和DNAJ基因发育表达模式分析及对温度胁迫的响应 |
| 4.3.5 大规模RNAi鉴定得到几个褐飞虱必需的HSP |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 HSP70 对褐飞虱生长发育及耐热性的重要性 |
| 4.4.2 DNAJ对褐飞虱生长发育的重要性 |
| 第五章 褐飞虱Chaperonin家族基因鉴定及功能分析 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 褐飞虱种群及饲养 |
| 5.2.2 基因鉴定与系统进化分析 |
| 5.2.3 时空表达模式 |
| 5.2.4 RNA干扰 |
| 5.2.5 RNAi对雌虫生殖的影响 |
| 5.2.6 RNAi对雄虫生殖的影响 |
| 5.2.7 扫描电镜观察(SEM) |
| 5.2.8 透射电镜观察(TEM) |
| 5.2.9 原核表达及多克隆抗体制备 |
| 5.2.10 蛋白质免疫印迹(Western blot) |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 褐飞虱Chaperonin基因鉴定和系统发育分析 |
| 5.3.2 时空表达模式分析 |
| 5.3.3 八个NlCCT基因沉默对若虫的影响 |
| 5.3.4 NlCCT基因沉默对雌雄虫生殖力的影响 |
| 5.3.5 沉默Hsp10/Hsp60 对褐飞虱的影响 |
| 5.3.6 多克隆抗体验证 |
| 5.4 讨论 |
| 5.4.1 NlCCTs在褐飞虱中的重要功能 |
| 5.4.2 NlHsp10/NlHsp60 在褐飞虱中的重要功能 |
| 第六章 褐飞虱HSP90 家族基因鉴定及功能分析 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 材料与方法 |
| 6.2.1 褐飞虱种群及饲养 |
| 6.2.2 HSP90 基因鉴定与系统进化分析 |
| 6.2.3 时空表达模式 |
| 6.2.4 RNA干扰 |
| 6.2.5 褐飞虱生殖力测定 |
| 6.2.6 透射电镜观察 |
| 6.3 结果与分析 |
| 6.3.1 褐飞虱HSP90 基因鉴定与序列分析 |
| 6.3.2 系统发育分析 |
| 6.3.3 时空表达模式分析 |
| 6.3.4 RNAi及生存分析 |
| 6.3.5 褐飞虱Hsp90 对卵巢发育和生殖力的影响 |
| 6.3.6 透射电镜观察 |
| 6.4 讨论 |
| 第七章 褐飞虱HSP100 家族基因鉴定及功能分析 |
| 7.1 引言 |
| 7.2 材料与方法 |
| 7.2.1 褐飞虱种群及饲养 |
| 7.2.2 基因鉴定与系统进化分析 |
| 7.2.3 时空表达模式 |
| 7.2.4 RNA干扰 |
| 7.3 结果与分析 |
| 7.3.1 褐飞虱HSP100 基因结构和系统发育分析 |
| 7.3.2 HSP100 基因的时空表达模式分析 |
| 7.3.3 表型观察 |
| 7.4 讨论 |
| 第八章 总结与展望 |
| 8.1 全文总结 |
| 8.2 本研究创新点 |
| 8.3 未来研究方向 |
| 附录 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
（6）Dmrt1和Foxl3在尼罗罗非鱼性别分化和生殖细胞命运决定中的功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 文献综述 |
| 1 脊椎动物性腺发育 |
| 1.1 生殖细胞的来源 |
| 1.2 生殖细胞的迁移与原始性腺的形成 |
| 2 脊椎动物性别决定 |
| 2.1 脊椎动物性别决定方式 |
| 2.2 脊椎动物生殖细胞的性别决定 |
| 3 脊椎动物性别分化 |
| 3.1 哺乳动物性别分化 |
| 3.2 鸟类性别分化 |
| 3.3 爬行类性别分化 |
| 3.4 两栖类性别分化 |
| 3.5 鱼类性别分化 |
| 4 Dmrt家族基因与性别分化 |
| 4.1 Dmrt1 |
| 4.2 Dmy/dmrt1bY |
| 4.3 Dm-w |
| 5 Fox家族基因与性别分化 |
| 5.1 Foxl2 |
| 5.2 Foxl3 |
| 6 科学问题的提出和本研究的目的意义 |
| 7 本研究的技术路线 |
| 第2章 尼罗罗非鱼foxl3 在生殖细胞性别命运决定中的功能研究 |
| 1 引言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 实验动物 |
| 2.2 试剂和仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 尼罗罗非鱼foxl3 序列进化分析和性腺表达模式 |
| 3.2 尼罗罗非鱼foxl3 纯合突变系的建立 |
| 3.3 尼罗罗非鱼foxl3 纯合突变导致卵巢中出现精子发生 |
| 3.4 尼罗罗非鱼XX foxl3 纯合突体性腺体细胞维持雌性环境 |
| 4 讨论 |
| 4.1 尼罗罗非鱼foxl3 特异表达于雌性生殖细胞中 |
| 4.2 尼罗罗非鱼foxl3 决定XX个体性腺生殖细胞性别命运 |
| 第3章 尼罗罗非鱼dmrt1 在雄性性别分化中的功能研究 |
| 1 引言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 实验动物 |
| 2.2 试剂和仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 尼罗罗非鱼dmrt1 在精巢中的细胞定位 |
| 3.2 尼罗罗非鱼dmrt1 纯合突变系的建立 |
| 3.3 尼罗罗非鱼dmrt1 纯合突变导致由雄向雌的性逆转 |
| 4 讨论 |
| 4.1 尼罗罗非鱼dmrt1 表达于精巢支持细胞和生殖细胞 |
| 4.2 尼罗罗非鱼dmrt1 是精巢分化所必需的 |
| 第4章 尼罗罗非鱼dmrt1和foxl3 相互拮抗研究 |
| 1 引言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 实验动物 |
| 2.2 试剂和仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 双突变dmrt1;foxl3 导致性腺发育为精卵巢 |
| 3.2 尼罗罗非鱼Foxl3 直接抑制dmrt1 的转录 |
| 3.3 尼罗罗非鱼Dmrt1 直接抑制foxl3 的转录 |
| 3.4 外源雌激素不能回救foxl3 突变导致的生殖细胞性逆转 |
| 3.5 阻断雌激素合成无法回救dmrt1 突变导致的性逆转 |
| 3.6 阻断雌激素合成导致foxl3 突变性腺完全雄性化 |
| 3.7 阻断雌激素合成导致dmrt1;foxl3 双突变性腺雄性化 |
| 3.8 敲降foxl2 成功回救dmrt1 突变导致的性逆转 |
| 4 讨论 |
| 4.1 尼罗罗非鱼foxl3与dmrt1 相互拮抗决定生殖细胞性别命运 |
| 4.2 尼罗罗非鱼dmrt1 拮抗foxl2/cyp19a1a决定性腺分化方向 |
| 4.3 体细胞环境对生殖细胞性别命运的影响 |
| 结论 |
| 本研究的主要创新点 |
| 本研究的不足与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在读期间发表的主要论文 |
| 在读期间参加科研情况 |
（7）山核桃萜类醌的生物合成途径及其成分胡桃醌抑制Ishikawa癌细胞增殖的分子机理（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 引言 |
| 1.1 山核桃 |
| 1.1.1 山核桃概述 |
| 1.1.2 山核桃主要成分及功能 |
| 1.1.3 山核桃青皮中主要活性成分的抗癌机制 |
| 1.2 多组学探究植物生长机制 |
| 1.2.1 转录组学与植物生长 |
| 1.2.2 代谢组学与植物生长 |
| 1.3 子宫内膜癌 |
| 1.3.1 子宫内膜癌的现状 |
| 1.3.2 子宫内膜癌的发展机制 |
| 1.3.3 子宫内膜癌的治疗措施 |
| 1.3.4 子宫内膜癌细胞系研究的选择 |
| 1.4 多组学探究癌症机制 |
| 1.4.1 miRNA组学探究癌症机制 |
| 1.4.2 mRNA组学探究癌症机制 |
| 1.5 课题研究背景、意义及主要内容 |
| 1.5.1 课题研究背景、意义 |
| 1.5.2 课题研究主要内容 |
| 1.5.3 研究技术路线 |
| 第二章 不同发育期山核桃的转录组与代谢组分析 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 样本采集 |
| 2.1.2 实验试剂和仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 不同发育期山核桃仁总RNA的提取 |
| 2.2.2 RNA纯度及浓度检测 |
| 2.2.3 山核桃仁文库的制备和测序建立 |
| 2.2.4 生物信息学分析 |
| 2.2.5 基因功能注释和分类 |
| 2.2.6 基因总体表达水平分析 |
| 2.2.7 差异基因表达分析 |
| 2.2.8 代谢组学实验流程分析 |
| 2.2.9 代谢物提取 |
| 2.2.10 液相参数 |
| 2.2.11 质谱参数 |
| 2.2.12 代谢组学信息分析流程 |
| 2.2.13 代谢组学信息分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 山核桃仁转录组测序质控分析 |
| 2.3.2 不同发育期山核桃仁基因组装结果分析 |
| 2.3.3 基因功能注释和分类 |
| 2.3.4 基因总体表达水平分析 |
| 2.3.5 不同发育期差异基因表达分析 |
| 2.3.6 代谢物检测 |
| 2.3.7 代谢物检测质控 |
| 2.3.8 代谢物鉴定 |
| 2.3.9 不同发育期山核桃仁代谢物定量分析 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 基于转录组学与代谢组联合分析山核桃萜类化合物合成规律 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 实验试剂 |
| 3.1.3 实验仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 萜类化合物的提取 |
| 3.2.2 RNA提取和Illumine测序 |
| 3.2.3 山核桃基因组装,基因注释以及功能分析 |
| 3.2.4 脂质代谢差异表达基因的KEGG和GO分析 |
| 3.2.5 RNA提取 |
| 3.2.6 反转录 |
| 3.2.7 定量PCR实验 |
| 3.2.8 代谢物提取与分析 |
| 3.2.9 关键萜类代谢组学的靶向测定 |
| 3.2.10 代谢物和转录物的综合分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 萜类化合物含量的动态变化 |
| 3.3.2 萜类化合物代谢差异表达基因的KEGG和GO分析 |
| 3.3.3 萜类化合物生成 |
| 3.3.4 山核桃发育过程中的关键萜类代谢产物 |
| 3.3.5 代谢组与转录组共表达网络分析 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 山核桃青皮胡桃醌的制备及其Ishikawa细胞增殖的抑制作用 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 细胞株 |
| 4.1.2 实验试剂 |
| 4.1.3 实验仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 山核桃青皮提取 |
| 4.2.2 纯化样品检测鉴定 |
| 4.2.3 细胞培养 |
| 4.2.4 MTT细胞实验 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 胡桃醌的提取 |
| 4.3.2 胡桃醌纯化及检测 |
| 4.3.3 胡桃醌对Ishikawa细胞增殖的抑制作用 |
| 4.3.4 胡桃醌对Ishikawa细胞形态的影响 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 转录组学与miRNA联合分析胡桃醌对Ishikawa细胞抑制作用的机制 |
| 5.1 实验材料与方法 |
| 5.1.1 实验材料与试剂 |
| 5.1.2 细胞处理 |
| 5.1.3 制备文库和测序 |
| 5.1.4 测序信息分析 |
| 5.1.5 mRNA和 miRNA的提取 |
| 5.1.6 mRNA和 miRNA的反转录 |
| 5.1.7 mRNA和 miRNA的荧光定量PCR检测 |
| 5.1.8 功能和途径富集分析 |
| 5.1.9 PPI网络建立及模块分析 |
| 5.1.10 差异表达miRNA靶基因预测 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 总RNA质检分析 |
| 5.2.2 差异表达miRNA和mRNA分析 |
| 5.2.3 qRT-PCR检测差异表达miRNAs和差异表达基因的表达 |
| 5.2.4 差异表达基因的GO与 KEGG富集分析 |
| 5.2.5 PPI网络构建及模块分析 |
| 5.2.6 差异表达miRNA的靶基因预测 |
| 5.3 本章小结 |
| 第六章 胡桃醌诱导Ishikawa细胞凋亡及其机制 |
| 6.1 实验材料 |
| 6.1.1 实验试剂 |
| 6.1.2 实验仪器 |
| 6.2 实验方法 |
| 6.2.1 细胞培养 |
| 6.2.2 胡桃醌处理Ishikawa细胞 |
| 6.2.3 细胞周期检测 |
| 6.2.4 细胞凋亡荧光 Hoechst 33342/PI 双染 |
| 6.2.5 Annexin V-Alexa Fluor 488/PI 凋亡检测 |
| 6.2.6 活性氧检测 |
| 6.2.7 mRNA提取和定量PCR |
| 6.2.8 蛋白提取和 Western blot |
| 6.3 结果与分析 |
| 6.3.1 胡桃醌对Ishikawa细胞周期的影响 |
| 6.3.2 胡桃醌对细胞凋亡形态学的影响 |
| 6.3.3 胡桃醌对Ishikawa细胞凋亡的影响 |
| 6.3.4 胡桃醌对线粒体途径影响 |
| 6.3.5 胡桃醌对死亡受体通路相关基因表达的影响 |
| 6.3.6 胡桃醌对细胞凋亡相关基因表达的影响 |
| 6.3.7 胡桃醌诱导ROS介导的Ishikawa细胞凋亡 |
| 6.4 本章小结 |
| 第七章 胡桃醌作为诱导剂诱导Ishikawa细胞铁自噬 |
| 7.1 实验材料 |
| 7.1.1 实验试剂 |
| 7.1.2 实验仪器 |
| 7.2 实验方法 |
| 7.2.1 细胞培养 |
| 7.2.2 细胞死亡检测 |
| 7.2.3 铁含量测定 |
| 7.2.4 丙二醛(MDA)测定 |
| 7.2.5 谷胱甘肽的测定 |
| 7.2.6 透射电镜观察 |
| 7.2.7 免疫荧光检测 |
| 7.2.8 细胞集落形成实验 |
| 7.2.9 细胞迁袭 |
| 7.2.10 转录组学分析 |
| 7.2.11 RNA提取和定量PCR实验 |
| 7.2.12 Western Blot实验 |
| 7.3 结果与分析 |
| 7.3.1 胡桃醌诱导Ishikawa细胞死亡 |
| 7.3.2 胡桃醌诱导Ishikawa细胞铁死亡 |
| 7.3.3 透射电镜显示胡桃醌诱导的铁自噬 |
| 7.3.4 胡桃醌诱导Ishikawa细胞铁自噬机制 |
| 7.3.5 胡桃醌抑制Ishikawa细胞的迁移和侵袭 |
| 7.3.6 胡桃醌诱导Ishikawa细胞内质网应激 |
| 7.4 本章小结 |
| 第八章 结论与展望 |
| 8.1 结论 |
| 8.2 创新点 |
| 8.3 展望 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间的学术活动及成果情况 |
（8）小鼠胚胎着床相关microRNA的筛选及miR-192-5p调控子宫内膜容受性的机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表(Abbreviations) |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 胚胎着床概述 |
| 1.1.1 不同物种的着床方式 |
| 1.1.2 影响着床的主要因素 |
| 1.1.3 雌激素和孕激素在胚胎着床中的调控作用 |
| 1.2 MicroRNA概述 |
| 1.2.1 microRNA的合成与分泌 |
| 1.2.2 miRNA的作用方式 |
| 1.3 miRNA在胚胎着床中的调控作用 |
| 1.3.1 miRNA参与调控胚胎活性 |
| 1.3.2 miRNA参与调控着床期间子宫内膜生理状态的变化 |
| 1.3.3 miRNA参与着床期间母-胎对话 |
| 1.3.4 循环miRNA和妊娠 |
| 1.4 本研究的目的与内容 |
| 1.4.1 研究的目的与意义 |
| 1.4.2 研究内容 |
| 1.4.3 技术路线 |
| 第二章 不同胚胎着床时期小鼠子宫内膜差异表达miRNA的筛选及鉴定 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 实验方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 测序结果分析 |
| 2.3.2 荧光定量PCR检验miRNA的表达水平 |
| 2.3.3 miR-192-5p抑制小鼠胚胎着床 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 miR-192-5p在小鼠妊娠早期子宫中的表达及其影响因素 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 实验方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 小鼠模型有效性鉴定 |
| 3.3.2 miR-192-5p在不同小鼠模型中的表达规律 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 雌激素和孕激素对子宫中miR-192-5p表达的调控 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 实验方法 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 小鼠激素模型鉴定 |
| 4.3.2 miR-192-5p在不同激素处理下小鼠子宫中的表达规律 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 miR-192-5p调控容受期间子宫上皮细胞转化的机制 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 实验材料 |
| 5.2.2 实验方法 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 瞬时上调miR-192-5p的表达量致使小鼠子宫内膜容受性受损 |
| 5.3.2 miR-192-5p在子宫内膜上皮细胞生理调控中的作用 |
| 5.3.3 miR-192-5p靶基因的筛选及鉴定 |
| 5.3.4 靶基因ARHGAP19调控细胞极性促使子宫内膜上皮细胞向容受态过渡 |
| 5.4 讨论 |
| 第六章 结论、创新点及展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简历及攻读学位期间的研究成果 |
（9）拟穴青蟹早期发育转录组分析及Hox基因SpUbx/SpAntp/SpAbd-A功能初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 拟穴青蟹早期发育研究 |
| 1.1.1 拟穴青蟹的早期发育模式 |
| 1.1.2 拟穴青蟹早期发育过程中重要的生物学过程 |
| 1.1.2.1 拟穴青蟹早期发育时期的蜕皮 |
| 1.1.2.2 拟穴青蟹早期发育时期的形态变化 |
| 1.1.2.3 拟穴青蟹早期发育时期的食性转变 |
| 1.1.3 拟穴青蟹早期发育和幼体变态的研究进展 |
| 1.2 转录组测序及其在拟穴青蟹早期发育研究中的应用 |
| 1.2.1 组学技术和生物信息学的快速发展 |
| 1.2.2 拟穴青蟹的组学研究进展 |
| 1.2.3 组学解析在虾蟹早期发育研究中的应用 |
| 1.3 Hox基因家族在甲壳动物中的研究进展 |
| 1.3.1 无脊椎动物的Hox基因研究 |
| 1.3.2 Hox基因在甲壳动物中的表达模式 |
| 1.4 本研究的研究目的、意义及主要研究内容 |
| 第二章 拟穴青蟹早期不同发育时期的转录组研究 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 胚胎及幼体的取样 |
| 2.2.2 总RNA的提取 |
| 2.2.3 转录组测序 |
| 2.2.4 测序数据处理与分析 |
| 2.2.5 功能注释、GO分类与代谢通路分析及基因表达量分析 |
| 2.2.6 qRT-PCR定量验证 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 拟穴青蟹早期形态变化显微观察 |
| 2.3.2 拟穴青蟹早期发育时期转录组测序 |
| 2.3.2.1 转录组整体结果分析 |
| 2.3.2.2 基因功能注释 |
| 2.3.2.3 基因表达分析及相关性分析 |
| 2.3.2.4 差异表达基因功能注释 |
| 2.3.2.5 差异表达基因聚类分析 |
| 2.3.2.6 拟穴青蟹早期不同发育时期共差异表达基因分析 |
| 2.3.2.7 qRT-PCR验证 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 拟穴青蟹早期变态发育时期的比较转录组分析 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 基因的差异表达分析 |
| 3.2.2 差异表达基因的聚类及功能注释 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 胚胎期(E)与溞状幼体I期(Z1)的差异表达基因解析 |
| 3.3.1.1 EvsZ1 上调DEGs的功能注释 |
| 3.3.1.2 EvsZ1 下调DEGs的功能注释 |
| 3.3.2 溞状幼体V期(Z5)与大眼幼体(M)的差异表达基因解析 |
| 3.3.2.1 Z5 vs M上调DEGs的功能注释 |
| 3.3.3.2 Z5 vs M下调DEGs的功能注释 |
| 3.3.3 大眼幼体(M)与仔蟹(C1)的差异表达基因解析 |
| 3.3.3.1 Mvs C1 上调DEGs的功能注释 |
| 3.3.3.2 Mvs C1 下调DEGs的功能注释 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 Hox基因簇筛选及表达分析 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 拟穴青蟹Hox基因的筛选 |
| 4.3.2 簇状Hox基因在拟穴青蟹早期发育过程中的表达 |
| 4.3.3 非簇状homeobox基因在拟穴青蟹早期发育过程中的表达 |
| 4.3.4 在拟穴青蟹早期发育过程中差异表达的Hox基因 |
| 4.3.5 Hox基因在拟穴青蟹基因组中的定位 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 Hox基因Ubx/Antp/Abd-A基因的克隆和表达特性分析及互作关系研究 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 实验材料 |
| 5.2.1.1 主要仪器和设备 |
| 5.2.1.3 主要试剂 |
| 5.2.1.4 幼体样品的采集 |
| 5.2.1.5 拟穴青蟹各组织样品的采集 |
| 5.2.2 实验方法 |
| 5.2.2.1 总RNA的提取 |
| 5.2.2.2 第一链c DNA的合成 |
| 5.2.2.3 基因克隆 |
| 5.2.2.3.1 基因片段的验证 |
| 5.2.2.3.2 基因两端序列的克隆 |
| 5.2.2.3.3 序列拼接 |
| 5.2.2.3.4 生物信息学分析 |
| 5.2.2.3.5 qRT-PCR |
| 5.2.2.3.6 数据统计 |
| 5.2.2.4 整体原位杂交 |
| 5.2.2.4.1 探针的制备 |
| 5.2.2.4.2 整体原位杂交 |
| 5.2.2.5 多克隆抗体的制备 |
| 5.2.2.6 Western blotting |
| 5.2.2.7 RNA干扰 |
| 5.2.2.8 染色质免疫共沉淀 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 SpUbx、SpAntp和 SpAbd-A基因的克隆和生物信息学分析 |
| 5.3.1.1 SpUbx基因的c DNA全长序列和特征分析 |
| 5.3.1.2 SpAntp基因的c DNA全长序列和特征分析 |
| 5.3.1.3 SpAbd-A基因的c DNA全长序列和特征分析 |
| 5.3.2 SpUbx、SpAntp和 SpAbd-A基因的时空表达特性分析 |
| 5.3.3 SpUbx、SpAntp和 SpAbd-A基因在雌雄腹肢中的表达 |
| 5.3.4 SpUbx、SpAntp和 SpAbd-A基因在早期个体头胸部和腹部的表达 |
| 5.3.5 SpUbx、SpAntp和 SpAbd-A基因在早期个体中的表达定位 |
| 5.3.6 SpUBX和 SpANTP的蛋白表达 |
| 5.3.7 RNA干扰SpUbx基因的表达 |
| 5.3.8 SpUbx和 SpAntp的相互作用研究 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 第六章 总结、创新与展望 |
| 6.1 全文总结 |
| 6.2 创新点 |
| 6.3 展望 |
| 参考文献 |
| 附表 |
| 附录 |
| 一、个人简介 |
| 二、攻读博士期间发表论文情况 |
| 三、攻读博士期间参与项目情况 |
| 四、攻读博士期间参加学术会议情况 |
| 五、攻读博士期间获得的荣誉和奖励 |
| 致谢 |
（10）利用CRISPR/Cas9构建DGAT1基因在MSTN位点定点整合小鼠的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 第一章 文献综述 家畜育种中MSTN基因、DGAT1基因及CRISPR/Cas9系统的研究概述 |
| 1 MSTN基因在家畜育种以及医学领域中的应用 |
| 1.1 MSTN基因概述 |
| 1.2 MSTN基因的生物学功能及调控机制 |
| 1.2.1 MSTN基因参与调控肌肉的生长发育 |
| 1.2.2 MSTN基因参与调控脂肪形成 |
| 1.2.3 MSTN基因参与调控生殖过程 |
| 1.2.4 MSTN基因参与调控骨密度 |
| 1.3 MSTN基因的应用前景 |
| 1.3.1 MSTN基因在家畜育种中的应用 |
| 1.3.2 MSTN基因在医学领域中的应用 |
| 1.4 总结与展望 |
| 2 DGAT1基因与家畜生产性状的关系及其在构建小鼠模型中的研究 |
| 2.1 DGAT1基因概述 |
| 2.2 DGAT1基因与家畜生产性状的关系 |
| 2.2.1 DGAT1基因与泌乳性状的关系 |
| 2.2.2 DGAT1基因与肉质性状的关系 |
| 2.2.3 DGAT1基因与生长性状的关系 |
| 2.2.4 DGAT1基因与繁殖性状的关系 |
| 2.3 DGAT1基因在构建小鼠模型中的应用 |
| 2.4 总结与展望 |
| 3 CRISPR/Cas9 系统在动物转基因过程中的研究进展 |
| 3.1 CRISPR/Cas系统概述 |
| 3.1.1 CRISPR/Cas系统的研究历程 |
| 3.1.2 CRISPR/Cas系统的结构及分类 |
| 3.1.3 CRISPR/Cas9 系统的作用机制 |
| 3.2 CRISPR/Cas9 系统在哺乳动物基因编辑中的应用 |
| 3.2.1 CRISPR/Cas9 在构建小鼠动物模型中的应用 |
| 3.2.2 CRISPR/Cas9 在培育家畜新品种中的应用 |
| 3.3 CRISPR/Cas9 在转基因动物的制备中存在的问题及优化策略 |
| 3.3.1 提高靶向特异性,减少脱靶效应 |
| 3.3.2 提高基因编辑效率 |
| 3.4 总结与展望 |
| 第二章 利用CRISPR/Cas9 构建DGAT1 基因在MSTN位点定点整合小鼠的研究 |
| 引言 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 主要仪器设备 |
| 1.2 主要试剂及耗材 |
| 1.3 主要实验材料 |
| 1.4 溶液配制 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 Cas9-gRNA表达载体构建 |
| 2.1.1 gRNA靶点的设计 |
| 2.1.2 spCas9-gRNA靶点效率检测 |
| 2.1.3 Cas9-gRNA表达载体构建 |
| 2.2 DGAT1基因定点整合载体的构建 |
| 2.2.1 上下游同源臂序列的获取 |
| 2.2.2 MCK特异性启动子序列的获取 |
| 2.2.3 DGAT1基因序列的获取 |
| 2.2.4 PolyA序列的获取 |
| 2.2.5 上游同源臂与骨架载体的连接 |
| 2.2.6 MCK启动子与中间载体pcDNA3.0-5hr的连接 |
| 2.2.7 DGAT1 基因与中间载体pcDNA3.0-5hr-MCK的连接 |
| 2.2.8 Poly A与中间载体pcDNA3.0-5hr-MCK-DGAT1 的连接 |
| 2.2.9 下游同源臂与中间载体pcDNA3.0-5hr-MCK-DGAT1-Poly A的连接 |
| 2.3 Cas9-gRNA表达载体和DGAT1 定点整合载体在细胞水平的功能验证及相关检测 |
| 2.3.1 细胞的解冻与培养 |
| 2.3.2 电穿孔法转染小鼠C2C12细胞 |
| 2.3.3 PCR鉴定载体在C2C12细胞中的整合情况 |
| 2.3.3.1 电转后细胞基因组的提取 |
| 2.3.3.2 PCR鉴定载体整合情况 |
| 2.3.4 实时定量PCR鉴定载体在细胞中的转录情况 |
| 2.3.4.1 提取细胞总RNA |
| 2.3.4.2 RNA反转录 |
| 2.3.4.3 实时定量PCR |
| 2.4 转基因小鼠的制备 |
| 2.4.1 质粒的获取 |
| 2.4.2 gRNA的制备 |
| 2.4.3 DGAT1定点整合载体的线性化 |
| 2.4.4 注射载体的纯化 |
| 2.4.5 实验用鼠的准备 |
| 2.4.6 受精卵的采集 |
| 2.4.7 原核注射 |
| 2.4.8 胚胎移植 |
| 2.5 基因编辑小鼠的PCR鉴定 |
| 3 结果 |
| 3.1 Cas9-gRNA表达载体的构建 |
| 3.1.1 sp Cas9-gRNA靶点效率检测 |
| 3.1.2 Cas9-gRNA共表达载体构建 |
| 3.2 DGAT1基因定点整合载体的构建 |
| 3.2.1 上下游同源臂序列的获取与鉴定 |
| 3.2.2 DGAT1基因序列的获取与鉴定 |
| 3.2.3 MCK特异性启动子序列的获取与鉴定 |
| 3.2.4 polyA序列的获取与鉴定 |
| 3.2.5 上游同源臂与骨架载体的连接鉴定 |
| 3.2.6 MCK特异性启动子与中间载体pc DNA3.0-5hr的连接鉴定 |
| 3.2.7 DGAT1 基因与中间载体pcDNA3.0-5hr-MCK的连接鉴定 |
| 3.2.8 Poly A序列与中间载体pcDNA3.0-5hr-MCK-DGAT1 的连接鉴定 |
| 3.2.9 下游同源臂与中间载体pcDNA3.0-5hr-MCK-DGAT1-Poly A的连接鉴定 |
| 3.2.10 DGAT1基因定点整合载体的鉴定 |
| 3.3 Cas9-gRNA表达载体和DGAT1 定点整合载体在细胞水平的功能验证及相关检测 |
| 3.3.1 电转后C2C12细胞状态的检测 |
| 3.3.2 Cas9-gRNA表达载体和DGAT1 定点整合载体在DNA水平的检测及功能验证 |
| 3.3.3 Cas9-gRNA表达载体和DGAT1 定点整合载体在mRNA水平的检测及功能验证 |
| 3.4 基因编辑小鼠的制备 |
| 3.4.1 gRNA的制备 |
| 3.4.2 DGAT1定点整合载体的线性化 |
| 3.4.3 实验用鼠的准备 |
| 3.4.4 原核注射的结果 |
| 3.5 基因编辑小鼠的PCR鉴定 |
| 4 讨论 |
| 4.1 Cas9-gRNA表达载体和DGAT1 定点整合载体的构建 |
| 4.2 Cas9-gRNA表达载体和DGAT1 定点整合载体在细胞水平的验证 |
| 4.3 DGAT1 基因在MSTN基因位点定点整合的基因编辑小鼠的制备 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
四、胚胎生物技术在实验动物中的应用与展望（论文参考文献）
- [1]SHH通路在缺血性脑卒中和新生小鼠肺发育中的作用机制研究[D]. 陆珊珊. 军事科学院, 2021(02)
- [2]基于多组学分析的日本囊对虾生长调控机制初步研究[D]. 赵吉臣. 广东海洋大学, 2021
- [3]BMP信号通路影响罗氏沼虾附肢再生的分子机制初步研究[D]. 周婷婷. 广东海洋大学, 2021(02)
- [4]鱼类脂滴自噬与脂滴水解在脂代谢调控中的互作机制研究[D]. 韩思兰. 华东师范大学, 2021(12)
- [5]褐飞虱热激蛋白不同家族基因及其功能研究[D]. 陈璇. 浙江大学, 2021(01)
- [6]Dmrt1和Foxl3在尼罗罗非鱼性别分化和生殖细胞命运决定中的功能研究[D]. 戴生飞. 西南大学, 2021
- [7]山核桃萜类醌的生物合成途径及其成分胡桃醌抑制Ishikawa癌细胞增殖的分子机理[D]. 张圆圆. 合肥工业大学, 2021(02)
- [8]小鼠胚胎着床相关microRNA的筛选及miR-192-5p调控子宫内膜容受性的机制[D]. 梁晶婕. 浙江大学, 2021
- [9]拟穴青蟹早期发育转录组分析及Hox基因SpUbx/SpAntp/SpAbd-A功能初步研究[D]. 张银. 汕头大学, 2020(01)
- [10]利用CRISPR/Cas9构建DGAT1基因在MSTN位点定点整合小鼠的研究[D]. 毕美玉. 内蒙古大学, 2020(04)