一、Th细胞的活化与树突状细胞(论文文献综述)
纪巧荣[1](2021)在《低氧影响小鼠实验性结肠炎发生发展的免疫学机制研究》文中研究指明【背景】近年来,由环境因素导致的胃肠道疾病逐渐被人们所关注,尤其在高海拔的偏远地区,胃肠道疾病和肠道寄生虫病的危害还相当严重。高原环境最主要的特征是低氧,低氧作为疾病最基本的病理环节,可出现于多种疾病的发生、发展过程,引起人体一系列生理机能的改变。低氧暴露对于呼吸、循环系统等相关研究也较多,而高原低氧环境对肠道免疫系统的影响,仍未受到足够关注。因此,研究高原人群肠道健康相关免疫机制,可为进入高原的人群提供健康保障,也为青藏高原的经济及国防提供有力的卫勤保障。【目的】胃肠道疾病如腹泻是严重危害人健康的感染性疾病之一。其中,肠致病性大肠杆菌(enteropathogenic e.coli,EPEC)及出血性大肠杆菌(enterohemorrhagic e.coli,EHEC)是细菌性腹泻的主要病原菌。由于高原地区缺氧引起的免疫抑制,尤其在高原地区由EPEC和EHEC引起的腹泻常导致严重的致死性疾病。因此,研究高原低氧影响机体抗感染能力的免疫学调节机制,对于高原感染性疾病的防治具有重要意义。本课题在成功建立C.rodentium感染模型的基础上,以低压氧舱模拟海拔5000米作为低氧实验条件,旨在探讨低氧对肠黏膜免疫的影响,且进一步明确低氧下抗原递呈细胞分化亚型、成熟活化状态的改变,以揭示高原低氧环境对机体抗病原菌感染的免疫反应机制。【方法】1.为了研究低氧影响宿主抵抗消化道病原菌感染的免疫反应机制,我们采取以下的研究方法:首先,建立低氧下结肠炎小鼠模型。32只雌性、8周龄BALB/c小鼠(18-20 g),随机分为正常组(Normal)及低氧组(Hypoxia),各组内又分为对照及C.rodentium感染组,每组8只小鼠,即共分为四组(n=8),正常对照组(Control)、C.rodentium感染组(C.rodentium)、低氧对照组(Hypoxia)和低氧C.rodentium感染组(Hypoxia+C.rodentium)。结肠炎小鼠通过灌胃C.rodentium(约5×108 CFU/mouse)造模。正常组(Normal)小鼠饲养于IVC鼠笼中(2260 m,大气压582 mm Hg,PO2 121.6 mm Hg,相当于海平面16%O2,中国西宁),低氧组(Hypoxia)小鼠饲养于低压氧舱,模拟海拔高度5000 m(大气压405 mm Hg,PO2 84.7 mm Hg,相当于海平面11%O2),2周后取材。造模期间监测小鼠体重及排菌量,并于取材当天检测Normal组及Hypoxia组小鼠生理指标及血生化参数,包括肺动脉压(pulmonary artery pressure,PAP)、心率(heart rate,HR),红细胞计数(red blood cell,Rbc)、血细胞比容(hematocrit,Hct)和血红蛋白(hemoglobin,Hb)。收集结肠进行H.E.染色,观察炎症病理改变,q RT-PCR检测肠黏膜中抗菌肽、炎性因子表达,酶联免疫吸附实验(Elisa)、流式细胞仪(FACS)检测肠系膜淋巴结(mesenteric lymph node,MLN)及脾脏(Spleen)CD4+T细胞分型及相关细胞因子表达,并检测血清相关免疫球蛋白水平。同时,检测结肠组织HIF-1α及Th1、Th17细胞分化相关元件表达。此外,为明确C.rodentium结肠炎中黏膜屏障的改变,对各组小鼠结肠组织中紧密连接蛋白(Occludin、ZO-1)及MUC2、i NOS进行检测。2.为了探讨低氧对黏膜抗原提呈细胞表型和功能的影响,我们采取以下的研究方法:首先,动物分组、模型建立及处理与上一部分一致。取材当天,收集肠系膜淋巴结(MLN)、派尔氏结(Peyer’s Patches),分离、制备单细胞悬液(1×107cells/ml),应用FACS检测树突状细胞(Dendritic cells,DC)不同分化亚型表达,包括髓系DC(MDC,CD11c+CD11b+CD8α-)及淋巴系DC(LDC,CD11c+CD11b-CD8a+),q RT-PCR检测淋巴细胞表达IL-12、IFN-γ水平。进一步应用FACS检测CD11c+DC表面成熟标志因子(MHC-II、CD80、CD86)表达,分析低氧对DC成熟和活化状态的影响。【结果】低氧处理2周后,Hypoxia组小鼠PAP、Hct、Hb较Normal组明显升高,结肠HIF-1α水平也相应增高,表明低氧模型构建成功。监测小鼠体重、排菌量发现,Hypoxia+C.rodentium组较C.rodentium组小鼠体重减轻明显,且粪便排菌量增加。Hypoxia+C.rodentium组小鼠结肠病理检测表现出更为严重的炎症改变,病理学评分明显升高。与C.rodentium组小鼠比较,Hypoxia+C.rodentium组小鼠结肠组织抗菌肽Reg 3γ、IL-17、IL-22 m RNA明显降低,且伴有炎性因子TNF-α、IL-6、COX-2 m RNA的增加。Th反应相关因子检测显示,Hypoxia+C.rodentium组小鼠较C.rodentium组IFN-γ、IL-17、Ig G2a水平明显降低,且q RT-PCR也显示Hypoxia+C.rodentium组较C.rodentium组结肠IL-12、IL-23p19m RNA降低,且伴有Th1、Th17细胞的分化上游蛋白T-bet及RORγt m RNA的表达下降,提示低氧暴露下Th1及Th17免疫反应下调。此外,Hypoxia+C.rodentium组小鼠结肠TLR4、NF-κB升高,且伴有炎性因子TNF-α、IL-6、COX-2的明显增多。黏膜屏障相关因子检测显示,Hypoxia+C.rodentium组较C.rodentium组小鼠结肠Occludin、ZO-1、MUC2降低,并伴有i NOS的升高。对低氧下树突状细胞状态及表型检测发现,Hypoxia+C.rodentium组较C.rodentium组小鼠LDC亚型表达明显降低,且伴有IL-12、IFN-γ的降低。进一步分析CD11c+DC表面标志成熟因子显示,Hypoxia+C.rodentium组小鼠树突状细胞表面表达MHC-II、CD86较C.rodentium组明显减少。【结论】综上所述,我们通过建立低氧环境下小鼠C.rodentium结肠炎模型,研究低氧影响结肠炎发生发展的免疫学机制,结果发现,低氧暴露下,Th1、Th17免疫反应的下调及肠黏膜屏障的破坏,诱导加重了C.rodentium结肠炎。进一步对黏膜抗原提呈细胞表型和功能的研究发现,低氧通过影响树突状细胞成熟、分化亚型的表达,最终诱导T细胞在肠道免疫反应中的功能发挥。
叶壮[2](2021)在《调节性B细胞亚群与系统性红斑狼疮发病的关系及其机制研究》文中提出背景:调节性B细胞(Regulatory B cells,Bregs)是以负性调节功能为特征的B细胞亚群,具有抑制炎症免疫反应、预防自身免疫反应的调节作用,参与多种免疫病理过程。Bregs既可通过分泌大量的抑制性细胞因子以浓度依赖的方式,亦可通过连接负性共刺激因子以接触依赖的方式发挥其功能。Bregs在包括自身免疫性疾病在内的多种疾病发病过程中扮演着重要角色。但Bregs在SLE病程中的分布规律、对于免疫细胞的影响以及免疫调节功能的作用机制目前尚不明确。目的:(1)明确SLE患者外周血Bregs亚群的表达情况及分布特点,比较SLE患者中Bregs的功能变化,分析Bregs亚群与SLE临床指标的相关性。(2)明确治疗前后SLE患者外周血Bregs的转归。(3)探索Bregs及其功能分子对CD4+T细胞分化、增殖以及功能的影响,探讨Bregs参与SLE疾病发生发展的可能机制。方法:(1)选取新发初治的SLE患者(n=72),同时选取年龄、性别匹配的健康对照,统计SLEDAI-2K、补体、血沉、C反应蛋白、尿蛋白等临床指标。(2)通过流式细胞术对外周血Bregs亚群、B细胞亚群、Th细胞亚群等细胞群的表达和分布进行分析,利用细胞内染色流式对Bregs亚群进行功能分析。应用ELISA技术测定了外周血中IL-10、IL-35、TGF-β1以及BAFF水平,CBA技术测定Th细胞功能分子水平。(3)分析Bregs亚群与SLE临床指标之间的相关性。(4)随访规范治疗的SLE患者,研究治疗前后Bregs亚群细胞水平和IL-10、IL-35、TGF-β1水平的变化。(5)通过在体外模拟SLE患者Bregs与CD4+T细胞的作用环境,建立transwell共培养体系,研究SLE中Bregs对CD4+T细胞的影响及其可能的作用机制。结果:(1)流式细胞术分析发现,SLE患者外周血中IL-10+Bregs以及IL-35+Bregs亚群细胞比例降低,TGF-β1+Bregs比例无明显变化。CD19+CD24hiCD38hi过渡期Bregs和CD19+CD24hiCD27+记忆Bregs细胞比例减低。CD19+CD24hiCD38hiBregs在外周血总CD3-CD19+B细胞中的比例要低于CD19+CD24hiCD27+Bregs。相关性分析发现,SLE患者外周血IL-10+Bregs的比例与CD19+CD24hiCD27+Bregs的比例呈明显正相关,IL-35+Bregs的比例与CD19+CD24hiCD38hiBregs、CD19+CD24hiCD27+Bregs的比例呈明显正相关。(2)SLE患者血浆中IL-35、TGF-β1水平明显减低,IL-10水平升高。IL-35水平与IL-35+Bregs亚群比例、CD19+CD24hiCD27+Bregs亚群比例明显相关。(3)体外细胞培养试验表明,SLE患者CD19+CD24hiCD27+Bregs产IL-10以及IL-35水平均高于CD19+CD24hiCD38hi Bregs。(4)SLE患者外周血中Th17细胞的频率明显升高,血浆中TNF-α、IL-6、IL-17A、BAFF等细胞因子水平升高,IL-2水平降低。SLE患者血浆中IL-17A水平与外周血中Th17细胞的频率呈正相关,BAFF水平与外周血CD19+CD24hiCD27+Bregs的比例呈负相关。(5)SLE患者CD27+CD38-/lo MB、CD27+CD38hi PB和CD27-CD38hi TB的频率增高,CD27-CD38-/lonaive B细胞的频率下降。IL-35+Bregs亚群比例与CD27+CD38-/loMB、CD27-CD38-/lonaive B细胞比例负相关。TGF-β1+Bregs亚群比例与CD27+CD38hiPB细胞比例负相关。CD19+CD24hiCD38hiBregs亚群比例与CD27-CD38-/lonaive B细胞比例正相关。CD19+CD24hiCD27+Bregs亚群比例与CD27-CD38hi TB细胞比例负相关。(6)临床指标相关性分析发现,SLE患者外周血的IL-35+Bregs亚群比例与ESR呈负相关,IL-10+Bregs亚群比例与CRP呈负相关。IL-35+Bregs、CD19+CD24hiCD38highBregs亚群比例与血清中C3水平呈正相关。外周血的IL-10+Bregs亚群比例与血清中C4水平呈正相关。外周血的IL-10+Bregs、IL-35+Bregs亚群比例与SLE疾病活动性评分SLEDAI水平呈负相关。(7)与轻中度活动的SLE患者相比,重度疾病活动的SLE患者IL-35+Bregs、CD19+CD24hiCD27+Bregs亚群比例明显降低。(8)与不伴有肾脏受累的患者相比,伴有狼疮性肾炎SLE患者的IL-10+Bregs、IL-35+Bregs、CD19+CD24hiCD27+Bregs亚群比例以及IL-35水平明显降低。(9)经激素及免疫抑制治疗后,IL-10+Bregs、IL-35+Bregs以及CD19+CD24hiCD38hi Bregs、CD19+CD24hiCD27+Bregs细胞频率,IL-10、IL-35水平较基线升高。(10)Transwell共培养CD19+B细胞与CD4+T细胞实验发现,健康人Bregs可抑制SLE患者Th1、Th17细胞水平,这种功能的发挥不完全依赖于细胞间的接触,但细胞间的接触可以强化这种抑制作用。健康人Bregs可抑制SLE患者Th1、Th17细胞功能。IL-10m Ab或rIL-35的刺激均可明显增强Bregs对Th细胞及其功能的抑制作用。SLE患者Bregs对健康人Th细胞的抑制作用受损。IL-10m Ab、rIL-35可以协助SLE患者受损的Bregs恢复对Th1、Th17细胞水平及功能的抑制作用。Th细胞IL-2、IFN-γ及IL-6的产生,在一定程度上受到IL-10和IL-35的调控。结论:(1)SLE患者外周血IL-10+Bregs、IL-35+Bregs、CD19+CD24hiCD38hi Bregs以及CD19+CD24hiCD27+Bregs细胞比例减低,产生IL-35、TGF-β1功能减弱。Bregs分泌功能的发挥主要以CD19+CD24hiCD27+Bregs为主。(2)外周血IL-10+Bregs、IL-35+Bregs以及CD19+CD24hiCD27+Bregs亚群比例、IL-35水平的降低可能与SLE患者合并LN有关。(3)SLE患者经有效治疗后,其外周血Bregs和IL-10、IL-35水平可部分恢复。(4)健康人Bregs可抑制SLE患者Th1、Th17细胞水平及细胞功能,IL-10m Ab或rIL-35的刺激均可明显增强Bregs的抑制作用。(5)SLE患者Bregs抑制功能受损。IL-10m Ab、rIL-35可以协助SLE患者受损的Bregs恢复功能。(6)Th细胞IL-2、IFN-γ及IL-6的产生,在一定程度上受到IL-10和IL-35的调控。
刘素萍[3](2021)在《四神丸调控树突状细胞活化治疗脾肾阳虚型结肠炎的作用机制研究》文中提出目的:通过葡聚糖硫酸钠(DSS)+肌肉注射氢化可的松+大黄灌胃法建立脾肾阳虚型结肠炎小鼠模型,观察四神丸(SSP)对UC的影响,以及对树突状细胞的调控作用,探讨SSP调控树突状细胞分化而治疗UC的作用机制。方法:1.小鼠脾肾阳虚型UC模型复制及药物治疗方法:40只小鼠适应性喂养1周后,将其随机分为4组,即正常组(Normal)、正常小鼠加用四神丸组(Normal+SSP)模型组(DSS)、四神丸组(DSS+SSP),每组10只。第一阶段复制“脾虚”模型:给正常组及正常小鼠加用四神丸组小鼠灌以蒸馏水,每只1 m L/d,模型组各组小鼠灌胃大黄溶液,每只1 mL/d,连续灌胃7 d;第二阶段复制“脾肾阳虚”溃疡性结肠炎模型:第8 d在模型组小鼠臀部左右交替注射氢化可的松25 mg/(kg·d),同时予以2.5%(w/v)DSS溶液自由饮用,连续7 d,其它组予蒸馏水饮用。末次注射氢化可的松、给予DSS后次日,按体表面积换算,正常小鼠加用四神丸组和四神丸组给予5 g/kg四神丸混悬液连续灌胃7 d,正常组和模型组给予等容积的蒸馏水灌胃。给药7 d后处死,采集小鼠外周血、结肠组织和脾脏。2.四神丸治疗脾肾阳虚型UC疗效评价:各组小鼠每天下午15时称重并记录体质量,同时观察小鼠的一般情况变化。第8 d开始收集每只老鼠的新鲜粪便,并按照隐血测试盒说明书操作。用2%戊巴比妥钠将小鼠深度麻醉,采集新鲜血液,提取血清,检测T3、T4、T指标;分离小鼠肛门至回盲部结肠部分和小鼠脾脏,测量结肠长度,称定结肠与脾脏质量,计算结肠单位长度重量以及脾脏质量指数,进行疾病活动指数(Disease activity index,DAI)评分;制作结肠组织石蜡切片和H&E染色,在显微镜下观察结肠的病理情况并采集图片,采用双盲法进行病理评分。采用ELISA检测结肠黏膜组织IL-10、TNF-α、IFN-γ、IL-12、IL-6、IL-1β等因子水平。3.树突状细胞的分析:采用流式细胞术检测树突状细胞亚群CD103+CD11c+CD324+、CD103+CD11c+TNF-α+、CD103+CD11c+INOS+细胞数量,探究四神丸治疗脾肾阳虚型UC的免疫学机制。4.TLR4/NF-κB通路蛋白分析:采用Western Bloting方法,对TLR4/NF-κB信号通路核心蛋白及相关蛋白进行检测分析,探究四神丸对TLR4/NF-κB信号通路的调控作用。5.实验数据分析:采用Graph Pad Prism software8.0软件进行统计,组间比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA),以平均数±标准((?)±s)表示,以P<0.05为统计结果有显着差异。结果:1.四神丸治疗脾肾阳虚型UC小鼠的疗效评价与正常组比较,模型组小鼠肛门肉眼可见出血,肛门污秽,体重增长较慢甚至负增长,DAI评分出现显着性的升高,小鼠出现体质量明显下降、结肠长度明显缩短和结肠单位长度重量升高,小鼠脾脏增重、脾重指数升高,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01);与模型组比较,治疗组小鼠通过四神丸灌胃治疗3-5 d后症状出现反转,6-7 d后明显得到恢复,小鼠体重逐渐稳定,DAI评分出现下降,小鼠结肠长度延长,小鼠脾脏减轻、脾重指数下降,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。提示四神丸可有效改善脾肾阳虚型UC小鼠症状。通过镜下观察结肠病理切片发现模型组小鼠结肠黏膜可见明显上皮脱落,腺体减少,溃疡形成,炎性细胞浸润。经四神丸治疗后的小鼠结肠上皮有所恢复,趋于完整,杯状细胞丰富度回升,炎性细胞浸润减少,无明显溃疡形成。提示四神丸可有效缓解脾肾阳虚型UC小鼠的病理损伤。与正常组比较,模型组小鼠血清中T3、T4、T水平显着下降(P<0.05或P<0.01),差异有统计学意义;经四神丸治疗后,T水平明显上升(P<0.01),提示四神丸可升高脾肾阳虚型UC小鼠的T水平。ELISA检测结肠细胞因子发现,模型组小鼠结肠黏膜组织中的TNF-α、IL-12、IL-6、IL-1β因子高度表达,IL-10、IFN-γ因子表达水平降低,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01);四神丸组小鼠经灌胃治疗7 d后,TNF-α、IL-12、IL-6、IL-1β因子的表达显着受到抑制,IL-10、IFN-γ因子的表达升高,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。提示四神丸可调控脾肾阳虚型UC小鼠结肠中细胞因子的水平。2.四神丸对脾肾阳虚型UC小鼠树突状细胞水平的影响与正常组比较,模型组CD103+CD11c+CD324+、CD103+CD11c+TNF-α+、CD103+CD11c+INOS+平升高,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01);与模型组比较,四神丸组CD103+CD11c+CD324+、CD103+CD11c+TNF-α+、CD103+CD11c+INOS+表达水平降低(P<0.05或P<0.01),差异有统计学意义。提示四神丸可降低脾肾阳虚型UC小鼠炎性树突状细胞的表达。3.四神丸对脾肾阳虚型UC小鼠TLR4/NF-κB信号通路蛋白表达与正常组比较,模型组小鼠结肠组织中TLR4、NF-κB、TRAF6、Myd88、TAB2蛋白表达显着上调,IκB蛋白水平被显着抑制,差异有统计学意义(P<0.01);与模型组比较,四神丸组小鼠结肠组织中TLR4、NF-κB、TRAF6、Myd88、TAB2蛋白表达均出现下降,IκB蛋白表达水平升高,差异有统计学意义(P<0.01)。提示四神丸能够有效调控TLR4/NF-κB通路信号核心蛋白及下游蛋白的表达。结论:四神丸可有效治疗脾肾阳虚型UC可能是通过干预TLR4/NF-κB信号通路,降低炎性因子的表达,从而调控DC的表达来实现的。
闫彦睿[4](2021)在《Th17细胞、Treg细胞及Breg细胞在儿童免疫性血小板减少症发病机制中的研究》文中指出背景免疫性血小板减少症(immune thrombocytopenia,ITP)是一种自身免疫性疾病,其特点是血小板破坏增加,生成减少,血小板计数降低。多数研究表明,ITP的发病机制涉及体液免疫、细胞免疫,但其具体发病机制目前尚不完全明确,尤其细胞免疫机制。随着对ITP发病机制研究的深入,发现T细胞亚群Th17细胞、Treg细胞和B细胞亚群Breg细胞也可能参与ITP的发病过程,但目前国内外研究对于Th17细胞、Treg细胞、Breg细胞在ITP发病机制中的作用仍不明确,Th17/Treg平衡失调机制也不清楚。目的探讨Th17细胞、Treg细胞、Breg细胞在ITP发病机制中的作用;分析Breg细胞与Th17细胞、Treg细胞、Th17/Treg比值之间的相关性,探讨Breg细胞是否参与Th17/Treg平衡失调机制。方法1.研究对象根据儿童ITP诊断标准,选择2019年08月至2020年08月于新乡医学院第一附属医院收治的24例初诊ITP患儿作为实验组,另选择同期来本院门诊体检的年龄和性别相当的21例健康儿童作为对照组。2.检测Th17细胞、Treg细胞、Breg细胞水平无菌操作下,采集两组受试者外周静脉血2ml,置于EDTA抗凝管内,轻轻混匀,再分别取抗凝血,采用Dx FLEX流式细胞仪检测Th17细胞、Treg细胞、Breg细胞水平,计算Th17/Treg比值;应用XN-2000型全自动血细胞分析仪检测血小板水平;应用固相凝集法检测实验组血小板抗体。3.统计学处理应用SPSS22.0统计软件进行数据分析,计量资料以均数±标准差(?χ?s)表示,组间比较采用两独立样本t检验,计数资料进行χ2检验,Breg细胞与Th17细胞、Treg细胞、Th17/Treg之间的相关性采用Pearson相关分析;以P<0.05为差异有统计学意义。结果1.实验组与对照组年龄、性别比较实验组24例,男性13例,女性11例,平均年龄(42.2±32.4)个月;对照组21例,男性15例,女性6例,平均年龄(43.0±39.8)个月;两组年龄、性别比较均无统计学差异(P>0.05)。2.实验组与对照组血常规结果实验组与对照组之间白细胞、红细胞以及血红蛋白水平均无显着差异(P>0.05);与对照组相比,实验组血小板计数明显减少,两组血小板计数分别为(14.79±9.82)×109/L、(356.00±88.48)×109/L,差异有统计学意义(P<0.05)。3.实验组与对照组Th17细胞、Treg细胞、Th17/Treg比值及Breg细胞水平比较实验组与对照组Th17细胞水平分别为(7.91±3.26)%、(3.42±1.74)%;Treg细胞水平分别为(6.93±1.79)%、(8.03±1.14)%;Th17/Treg比值分别为1.25±0.70、0.43±0.22;Breg细胞水平分别为(3.04±2.02)%、(6.59±1.74)%。实验组Th17细胞水平、Th17/Treg比值高于对照组,差异均有统计学意义(t=5.642、5.466,P<0.05)。实验组Treg细胞水平、Breg细胞水平低于对照组,差异均有统计学意义(t=-2.475、-6.261,P<0.05)。4.实验组Breg细胞与Th17细胞、Treg细胞、Th17/Treg比值相关性分析Pearson相关分析显示,实验组Breg细胞与Th17细胞、Treg细胞、Th17/Treg比值之间均无显着相关性(r=-0.001、-0.260、-0.097,P>0.05)。5.实验组Th17细胞、Treg细胞、Breg细胞与血小板计数相关性分析Pearson相关分析显示,实验组Th17细胞水平、Treg细胞水平、Breg细胞水平与血小板计数之间均无显着相关性(r=0.140、-0.185、0.004,P>0.05)。6.血小板抗体阳性组与阴性组Th17细胞、Treg细胞、Breg细胞水平比较血小板抗体阳性组和血小板抗体阴性组患儿的外周血Th17细胞水平分别为(9.58±3.31)%、(7.08±3.00)%;Treg细胞水平分别为(7.44±1.96)%、(6.68±1.71)%;Breg细胞水平分别为(2.48±0.60)%、(3.33±2.41)%。血小板抗体阳性组患儿的外周血Th17细胞、Treg细胞及Breg细胞水平与血小板抗体阴性组比较差异无统计学意义(t=1.860、0.989、-0.971,P>0.05)。结论1.初诊ITP患儿体内存在细胞免疫紊乱,Th17细胞、Treg细胞及Breg细胞参与ITP的发病过程;2.ITP患儿存在Th17/Treg比例失衡,Th17细胞占优势;未发现Breg细胞与Th17/Treg平衡失调相关。
涂丽裙[5](2020)在《转化生长因子-β2反义寡核苷酸的微生物疫苗及肿瘤疫苗的佐剂作用》文中指出转化生长因子-β2(TGF-β2)对免疫应答有全方位的负调节作用,可调节几乎每一种适应性免疫应答和固有免疫应答的细胞,包括树突状细胞、T细胞、B细胞、粒细胞和固有免疫淋巴样细胞。使用免疫检查点抑制剂治疗肿瘤的成功案例提示我们:抑制免疫抑制性细胞因子TGF-β2可能是一种新的策略去研制新型疫苗佐剂。为了研制出以核酸为基础的TGF-β2的抑制剂,我们设计了三个靶向人鼠的TGF-β2 m RNA3’UTR保守区域的反义寡核苷酸,并将其命名为TIO1,TIO2,TIO3。在小鼠巨噬细胞,人单核细胞及人浆细胞样树突状细胞,TIO1,TIO2及TIO3均明显下调TGF-β2的表达。在小鼠中,TIO3和TIO1,均可显着增强微生物疫苗所诱导的抗体反应。其中TIO3为佐剂的流感疫苗可抵抗流感病毒的攻击并减轻流感病毒引起的急性肺损伤。在小鼠中,TIO3可明显下调淋巴结及脾脏细胞CD4+T细胞及CD19+B细胞上s TGF-β2的表达,上调CD19+B细胞及CD11c+DC表面CD40,CD80,CD86,CD69及MHC II分子的表达,促进CD4+T细胞和CD8+T细胞产生IFN-γ,促进CD4+T细胞产生IL-4,抑制调节性T细胞(Tregs)的产生,促进CD4+T细胞和CD19+B细胞的增殖与活化,促进流感病毒感染的小鼠的肺脏中CD4+T细胞和CD8+T细胞表面CD69的表达。总的来说,通过干扰TGF-β2的表达,TIO3或TIO1,可作为新型微生物疫苗佐剂增强疫苗诱导的抗体反应;此外,TIO3为佐剂的胶质瘤细胞裂解物疫苗可显着延长原位接种胶质瘤预防模型小鼠的生存期。TIO3可通过抑制人和小鼠的胶质瘤细胞、CD4+T细胞和CD8+T细胞表达TGF-β2,诱生胶质瘤特异性的CD4+T细胞和CD8+T细胞,激活NK细胞,促进CD4+T细胞和CD8+T细胞产生IFN-γ,上调胶质瘤细胞表面MHCI分子的表达进而增强胶质瘤疫苗的抗肿瘤功效。单独应用TIO3可通过抑制胶质瘤细胞表达TGF-β2、促进胶质瘤细胞表达MHC I,IL-17A及IFN-α、抑制CD4+T细胞和CD8+T细胞表达s TGF-β2、抑制Tregs的产生、促进CD4+T细胞及CD8+T细胞的增殖而明显延长原位接种胶质瘤预防模型小鼠的生存期。单独应用TIO3可通过抑制胃癌细胞表达TGF-β2,促进MHC I,IL-13,IL-15,IL-17及IFN-γ的表达而显着减少肿瘤体积、延长胃癌背部移植瘤小鼠的生存期。TGF-β2的反义寡核苷酸有潜能作为微生物疫苗和肿瘤疫苗的新型佐剂,或单独治疗胶质瘤和胃癌的候选药物。
刘杰[6](2020)在《早期肺腺癌快速复发的基因芯片及免疫组库研究》文中研究指明研究背景及目的:随着低剂量螺旋CT(low-dose Computed Tomography,LDCT)的应用,早期肺癌包括早期肺腺癌的诊断取得了很大进展,越来越多的早期肺腺癌患者得到了手术治疗的机会。通过手术切除,早期肺腺癌患者的5年总生存率可达67%,但我们在临床实践中发现有少部分患者(约占15%)在术后1年内快速复发,其5年生存率仅为45.1%,远低于67%,这说明早期肺腺癌患者一旦快速复发则预后很差。更重要的是,我们还发现另一部分患者在术后3年内均未复发,其5年生存率则达到了惊人的94.5%。因此,我们推测早期肺腺癌可能是一种包含不同亚类的异质性极高的疾病;若将早期肺腺癌的两类患者预先区分开来,对快速复发风险高的患者可进行及早干预以改善临床结局,对迟复发患者则可避免过度医疗,这可能是目前在辅助治疗没有取得突破性进展的情况下对患者最有利的选择。当前已有许多关于早期肺腺癌复发的预测因子及生物标志物研究,包括单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms,SNP)、DNA甲基化、基因panel、蛋白表达等,但价值有限且均未能应用于临床,而且更重要的是这些标志物不能用于区分快速复发患者。本研究旨在寻找能区分早期肺腺癌快速复发的预测因子,并从新的角度理解和探讨早期肺腺癌快速复发的机制。研究方法:1.早期肺腺癌复发及快速复发与临床病理特征的关系研究:对早期肺腺癌的临床病理特征与无复发生存时间(Relapse free survival,RFS)进行单因素分析,得到影响患者RFS的临床病理特征;通过Cox回归模型的多因素分析,得到影响早期肺腺癌复发的独立预测因子。将早期肺腺癌1年内复发(RFS≤12个月)和3年内未复发(RFS>36个月)的患者分别定义为快速复发与迟复发患者,采用卡方检验比较两组患者的临床病理特征从而得到其中有统计学差异的指标。2.早期肺腺癌快速复发的基因芯片研究:提取20例(8例快速复发,12例迟复发)早期肺腺癌患者石蜡包埋肿瘤组织的RNA,进行基因表达谱芯片检测。将基因芯片数据导入软件Transcriptome Analysis Console(TAC)3.0.0得到基因聚类热图。通过limma软件包分析得到两组患者的差异表达基因(differentially expressed genes,DEGs);对DEGs进行GO(Gene Ontology,基因本体论)功能富集分析和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,京都基因与基因组百科全书)信号通路分析,得到差异显着的功能富集结果;对DEGs进行蛋白相互作用(protein–protein interaction,PPI)网络分析,得到其中的关键基因。增加患者例数后对得到的免疫相关的关键基因IL-1β和PTGS2进行免疫组化(immunohistochemistry,IHC)染色,分析其蛋白表达水平对早期肺腺癌RFS的影响,同时通过卡方检验比较其蛋白表达水平在快速复发与迟复发患者中的差异。对患者肿瘤浸润淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocytes,TILs)的标志包括CD3、CD4、CD8和CD20进行IHC染色,比较两组患者TILs浸润程度的差异。3.早期肺腺癌快速复发的免疫组库研究:提取39例(20例快速复发,19例迟复发)早期肺腺癌患者石蜡包埋肿瘤组织的DNA,通过多重PCR扩增技术对B细胞受体(B cell receptor,BCR)重链(IGH)及T细胞受体(T cell receptor,TCR)β链(TRβ)可变区的互补决定区3(complementarity determining area 3,CDR3)进行扩增,利用Illumina Hiseq3000平台进行超深度测序并对测序结果进行统计学及生物信息学分析。通过热图展示每名患者对于各个V基因片段(variable gene segment)、J基因片段(joining gene segment)的使用频率,并分组进行比较以得出两组患者间具有统计学差异的IGHV、IGHJ、TRβV、TRβJ基因。分组比较两组患者的基因重排组合以得到具有统计学差异的IGHV/J以及TRβV/J。计算BCR和TCR克隆的多样性指数Clonality和Evenness以评价两组患者克隆多样性的差异。将BCR和TCR的克隆频率分为5个等级(稀有、低、中、高、超高)并分组进行比较,探讨每个等级的克隆分布在两组患者间是否存在差异。4.APE1(apurinic/apyrimidinic endonuclease 1,脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶1)对肺腺癌免疫微环境的影响:将小鼠Lewis细胞接种于APE1基因敲除(knock-out,KO)小鼠及野生型(wildtype,WT)小鼠,取肿瘤组织并分离免疫细胞后用CD8+T细胞、巨噬细胞、树突状细胞、MDSC的相应抗体标记,流式细胞仪检测上述细胞。研究结果:1.早期肺腺癌复发及快速复发与临床病理特征的关系研究:单因素分析结果表明,肿瘤的大小及组织学类型是影响早期肺腺癌患者复发的因素。Cox多因素分析进一步表明肿瘤直径>2cm和非贴壁为主型的组织学类型是影响早期肺腺癌患者RFS的独立危险因素,其风险比(Hazard Ratio,HR)分别为2.688(95%CI:1.211-5.920)和2.040(95%CI:1.006-4.135),P<0.05。卡方检验结果表明,快速复发与迟复发患者的组织学类型和分化程度存在显着差异,前者的非贴壁为主型和低分化程度的人数占比明显高于后者,分别为95.5%vs 71.1%、54.5%vs 23.9%,P<0.05。2.早期肺腺癌快速复发的基因芯片研究:基因聚类热图结果表明,早期肺腺癌快速复发与迟复发患者从基因层面上基本可以各归为一类。通过Limma分析得到416个DEGs,对这些DEGs进行GO富集分析发现其与免疫功能密切相关:在排行前10项的功能类别里,细胞成分中有2项(2/10)、分子功能中有2项(2/10)、生物学过程中有9项(9/10)涉及免疫功能。KEGG分析结果表明具有统计学差异的8项通路中有6项涉及免疫或炎症。通过PPI网络分析从416个DEGs中鉴定出10个关键基因,包括与免疫或炎症密不可分的IL-1β和PTGS2。免疫组化及Kaplan-Meier分析表明IL-1β低表达患者组的中位RFS更低(21.5个月vs 55.0个月),P<0.05;卡方检验进一步表明IL-1β低表达患者人数在快速复发组中的比例更高(31.8%vs 8.1%,P<0.05)。PTGS2的结果与IL-1β类似,即PTGS2低表达患者的中位RFS更低(19.0个月vs 77.0个月,P<0.05),PTGS2低表达患者人数在快速复发组中占比更大(68.2%vs 10.8%,P<0.05)。IHC结果显示TILs低浸润的患者人数比例在快速复发组中更高,分别为CD3(81.8%vs 54.1%),CD4(86.4 vs 55.4%),CD8(90.9%vs 62.6%),CD20(95.5%vs71.6%),P<0.05。3.早期肺腺癌快速复发的免疫组库研究:⑴在V、J基因的使用频率方面:对于BCR而言,两组患者共存在4个差异基因(IGHV1-69D、IGHV3-NL1、IGHV4-59和IGHJ2)且均在快速复发患者中的使用频率更高;对于TCR则存在6个差异基因,其中TRβV6-9在快速复发组中使用频率更高,TRβV3-2、TRβV6-1、TRβV6-4、TRβJ1-4、TRβJ2-6在迟复发组中的频率更高。⑵在V/J基因重排方面:对于BCR而言,两组患者有8个差异的重排组合,其中IGHV3-43/IGHJ6,IGHV3-NL1/IGHJ3,IGHV3-69-1/IGHJ5,IGHV1-18/IGHJ3在快速复发患者中的出现频率更高,而IGHV3-23D/IGHJ6,IGHV3-11/IGHJ6,IGHV3-23/IGHJ6,IGHV3-11/IGHJ2在迟复发组中的频率更高(IGHV3-11/IGHJ2仅出现在迟复发组);对于TCR而言,两组患者有23个差异重排组合,其中TRBV14/TRBJ2-4,TRBV7-8/TRBJ1-4,TRBV3-1/TRBJ1-3,TRBV5-1/TRBJ2-4,TRBV13/TRBJ2-7,TRBV5-1/TRBJ1-4,TRBV4-1/TRBJ2-1,TRBV5-6/TRBJ1-1,TRBV4-3/TRBJ2-2,TRBV9/TRBJ2-1,TRBV6-1/TRBJ1-3,TRBV6-9/TRBJ2-7,TRBV3-2/TRBJ2-7在快速复发组中的频率更高(TRBV6-9/TRBJ2-7和TRBV3-2/TRBJ2-7仅出现在快速复发组),而TRBV28/TRBJ1-4,TRBV10-3/TRBJ2-3,TRBV7-9/TRBJ1-1,TRBV2/TRBJ2-2,TRBV6-6/TRBJ2-4,TRBV4-1/TRBJ2-2,TRBV12-5/TRBJ1-1,TRBV6-3/TRBJ2-5,TRBV10-2/TRBJ1-4,TRBV16/TRBJ1-1在迟复发组中的频率更高(TRBV16/TRBJ1-1仅出现在迟复发组)。⑶BCR及TCR的克隆多样性指数Clonality和Evenness方面:对于BCR,两组患者的Clonality和Evenness无显着差别;对于TCR,快速复发患者TCR克隆的Clonality更高,Evenness更低,即其TCR克隆的多样性低于迟复发患者。⑷BCR和TCR的克隆频率的分布方面:两组患者的BCR和TCR的频率分布均无显着差异。4.APE1对肺腺癌免疫微环境的影响:APE1 KO小鼠肿瘤浸润的功能性CD8+T细胞、树突状细胞均明显少于WT小鼠,而肿瘤浸润性的MDSC明显多于WT小鼠。研究结论:1.早期肺腺癌患者临床病理特征中的肿瘤大小(>2cm)和组织学类型(非贴壁为主型)是肿瘤复发的独立危险因素;而组织学类型和分化程度对于区分快速复发与迟复发患者具有一定的提示作用。2.快速复发与迟复发的早期肺腺癌患者在免疫相关分子、免疫功能相关的富集通路、肿瘤淋巴细胞浸润等方面存在显着差异。3.早期肺腺癌患者BCR及TCR特定的V或J基因使用频率、V/J基因重排组合对于区分快速复发与迟复发患者具有指示意义;TCR的克隆多样性降低可能是早期肺腺癌快速复发的重要原因。4.APE1能影响小鼠肺腺癌移植瘤的浸润性免疫细胞比例从而干预肿瘤免疫功能,这可能是APE1影响早期肺腺癌复发的重要原因。
刘芹芹[7](2020)在《树突状细胞NLRP3炎症小体及免疫失衡在急性髓系白血病作用和机制研究》文中认为急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)是恶性的血液系统疾病,其特征是骨髓造血干祖细胞克隆性增生、分化异常及凋亡受阻,在外周血、骨髓内及其他组织内大量增殖及浸润。AML骨髓微环境以免疫抑制为特征,与AML的发生发展相关,可促进免疫耐受和白血病细胞免疫逃逸。近年来虽然AML的治疗方法不断改进,但是许多患者仍然出现耐药、难治及复发,长期生存及预后不容乐观。树突状细胞(dendritic cells,DCs)是机体重要的抗原提呈细胞,在机体免疫应答中发挥重要的核心作用。DCs是连接机体适应性免疫和先天性免疫重要的桥梁,具有强大的抗原提呈能力,可以“驾驭”B细胞和T细胞两种重要的免疫细胞,在机体对病原体和抗肿瘤的保护性免疫应答中发挥重要的作用。DCs可以刺激体内的T细胞产生免疫应答,并在对肿瘤细胞杀伤的免疫反应中起重要作用。DCs具有免疫调节特性可以克服骨髓的免疫耐受,增强骨髓微环境免疫并诱导抗白血病特异性T细胞的增殖。活化的T细胞能够识别AML细胞上表达的抗原,并随后介导AML细胞杀伤。可以通过DCs免疫刺激自体T细胞减少或消除残留的白血病细胞预防AML复发,因此基于DCs的免疫疗法可能在根除AML患者残留白血病细胞方面更加成功。炎症小体是参与固有免疫的主要成分之一,NLRP3炎症小体是目前为止研究最多、最透彻的。NLRP3炎症小体在感染性疾病和免疫性疾病中影响Th亚群分化,但在AML中的研究很少。NLRP3炎症小体活化后,释放IL-1β活性细胞因子,可以诱导T细胞产生并释放细胞因子IL-2,维持T细胞的存活和促进T细胞增殖。T细胞是机体抗肿瘤反应的重要免疫细胞,通过释放细胞因子和细胞毒性物质来清除白血病细胞,NLRP3炎症小体通过调节T细胞增殖和分化,最终达到调控肿瘤的作用。尽管多数AML化疗后病情会缓解,但长期生存率并不理想。免疫抑制的骨髓微环境有利于白血病细胞的生长和免疫逃逸,具有免疫调节特性的治疗可以克服免疫耐受,提高骨髓微环境的免疫力,增强肿瘤的免疫原性,改善AML的预后。因此探究AML骨髓DCs细胞NLRP3炎症小体对骨髓微环境免疫的作用,研究免疫相关基因的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms,SNPs)与AML的关系,探索骨髓微环境免疫在AML发生发展中的作用及其机制,从而进一步探索抗白血病细胞免疫治疗的方法,为AML的免疫治疗提供策略。第一部分树突状细胞NLRP3炎症小体在急性髓系白血病骨髓Th1亚群分化的作用及机制研究背景急性髓系白血病(AML)机体免疫功能异常在其发生发展和耐药中发挥重要作用,免疫紊乱的骨髓微环境促进了免疫耐受,有利于白血病细胞逃逸,其作用机制可能与骨髓Th亚群失衡有关。免疫细胞主要包括T细胞、B细胞和NK细胞,是骨髓微环境免疫的重要组成部分,其中T细胞中的Th细胞免疫失衡引起了研究者的高度关注。AML骨髓中T细胞增殖和产生细胞因子的能力明显降低,AML白血病细胞通过骨髓髓系来源的抑制细胞(myeloid-derived suppressor cells,MDSCs)对T细胞发挥抑制作用,或阻止T细胞进入细胞周期或分泌Th1相关细胞因子。Th1细胞参与机体细胞免疫,在细胞免疫中发挥重要作用。Th1细胞与AML发病及预后密切相关,但其分子机制尚未明确。NLRP3炎症小体是一种细胞内传感器,感受“危险”信号后将细胞因子IL-1β和IL-18前体转变成其活性形式,该信号可以是宿主或病原体。NLRP3炎症小体是参与机体免疫的多蛋白复合物,其作用机制可能与介导Th亚群分化有关。NLRP3炎症小体在肿瘤微环境中能诱导Th1、Th2、Th17细胞及CTL细胞的分化并能抑制肿瘤的免疫逃逸。AML骨髓微环境免疫失衡及功能失调可以导致白血病的发生,且与治疗后残留白血病细胞的免疫逃逸相关,免疫功能紊乱的骨髓微环境可导致AML的复发及难治。研究发现AML骨髓Th1/Th2及Th17/Treg免疫失衡参与了白血病细胞的免疫逃逸,在AML发生发展和耐药中发挥重要作用。但是,目前树突状细胞NLRP3炎症小体是否参与了 AML骨髓T细胞分化尚未明确,尤其是Th1亚群分化的机制尚待研究。研究目的本研究旨在研究Th1亚群在AML骨髓微环境中是否存在免疫失衡;探索树突状细胞NLPR3炎症小体对AML骨髓中Th1亚群分化的影响及机制;研究树突状细胞NLRP3炎症小体对Th1相关细胞因子IFN-γ水平及相关转录因子表达的影响,进而分析NLRP3炎症小体对骨髓Th1亚群分化影响的关键分子,通过对关键分子的干预观察对Th1亚群的影响,明确NLRP3炎症小体参与AML免疫失衡尤其是Th1亚群分化的作用机制。研究方法(1)临床标本收集:本研究收集来自山东大学齐鲁医院的37例AML患者、30例AML治疗完全缓解(CR)患者、23例难治复发AML患者及16例对照的骨髓液,分离骨髓单个核细胞和CD4+T细胞,留取骨髓上清。(2)Th1细胞与AML患者临床特征的关系:收集、整理AML患者白细胞计数、治疗疗效等临床资料,流式细胞术检测骨髓中Th1细胞比例,分析骨髓Th1细胞比例与临床资料的相关性。(3)IFN-γ细胞因子水平与AML患者关系:酶联免疫吸附试验(ELISA)方法检测骨髓上清中的IFN-γ细胞因子水平,分析与AML的临床相关性。(4)树突状细胞及CD4+T细胞培养:AML患者骨髓单个核细胞(BMMCs)用IL-4和GM-CSF诱导培养为树突状细胞,并用流式细胞术检测树突状细胞CD14、CD11c、CD80、CD83、CD86分子表达情况及诱导DCs转化率。MACS分选骨髓BMMCs中的CD4+T细胞并用流式细胞术检测分选率。(5)树突状细胞NLRP3炎症小体活化及抑制:将诱导培养的树突状细胞分成三组:①实验组(LPS+ATP,LA):树突状细胞先用脂多糖LPS预处理6小时,然后加ATP激活45分钟;②NLRP3炎症小体抑制组:LPS处理前,LPS处理前先加入炎症小体抑制剂MCC950作用1小时(MLA);③对照组:加入对应量的无菌PBS。检测树突状细胞NLRP3炎症小体相关分子NLRP3、ASC、IL-18、Caspase-1、IL-1β及 NF-κB 的表达情况。(6)树突状细胞NLRP3炎症对CD4+T细胞分化影响:将以上3组DCs与CD4+T细胞共培养,7天后流式细胞术检测Th1、Th2、Th17及Treg细胞比例。(7)细胞因子检测:用多细胞因子阵列检测树突状细胞培养上清液中IL-12p70、IL-10、IFN-γ、IL-1β、IL-17A、IL-7、IL-4、IL-5、IL-6、IL-2、IL-8等细胞因子水平,用ELISA方法再次检测相关细胞因子水平。(8)IL-1β对Th1细胞分化的影响:在BMDCs和CD4+T细胞共培养对照组和抑制组加入重组人IL-1β细胞因子,在实验组加入人IL-1β中和抗体,流式细胞术检测Th1细胞比例。(9)树突状细胞NLRP3炎症小体促进Th1细胞分化的方式:将树突状细胞与CD4+T细胞进行接触或用小室分离共培养,流式细胞术检测CD4+T细胞中Th1比例,ELISA方法检测DCs与CD4+T细胞共培养上清液中IFN-y及IL-1β细胞因子水平。(10)IL-1β影响Th1细胞分化的机制:将分离的CD4+T细胞分为3组:①单独加入IL-12;②IL-12联合重组人IL-1β细胞因子;③加入对应量无菌PBS,RT-PCR检测各组CD4+T细胞中IFN-γ、IFN-γ受体和STAT1的表达。(11)树突状细胞NLRP3炎症小体对体内Th1细胞分化的影响:体外培养野生型(WT)或Nlrp3-/-C57BL/6J小鼠的树突状细胞,将WT小鼠树突状细胞分为3组:①实验组:LPS和ATP处理;②抑制组:炎症小体抑制剂MCC950作用1小时后LPS和ATP处理;③对照组:加入对应量的无菌PBS。Nlrp3-/-小鼠的树突状细胞分为实验组和对照组,然后将各组DCs通过尾静脉注入WT小鼠体内,观察树突状细胞NLRP3炎症小体对小鼠Th1亚群的影响,流式细胞检测小鼠骨髓、脾脏中Th1细胞比例。(12)IL-1β对小鼠Th1细胞分化的影响:将鼠IL-1β中和抗体注射到实验组小鼠体内,观察IL-1β对小鼠体内Th1亚群影响,流式细胞检测小鼠骨髓和脾脏中Th1细胞比例。研究结果:(1)AML初诊患者骨髓中Th1细胞比例与对照组相比显着降低,治疗达CR后患者骨髓Th1细胞比例明显增高;骨髓中Th1细胞比例与AML初诊患者外周血白细胞计数呈负相关,Th1细胞比例≤10%的AML患者外周血白细胞计数明显高于Th1>10%AML患者。(2)AML初诊患者骨髓上清液中细胞因子IFN-γ水平明显低于对照组,患者治疗骨髓达CR后骨髓上清液中细胞因子IFN-γ水平升高。(3)树突状细胞培养及CD4+T细胞:流式细胞仪检测结果为树突状细胞表达CD11c,不表达CD80和CD14,少量表达CD83和CD86,DCs诱导转化率在>90%。利用CD4+MACS磁珠分选骨髓中CD4+T细胞的分离纯度>90%。(4)树突状细胞NLRP3炎症小体活化及抑制:RT-PCR检测实验组较对照组树突状细胞NLRP3炎症小体激活后caspase-1和IL-1β的表达增加,抑制组caspase-1和IL-1β的表达较实验组有降低趋势。ELISA检测实验组与对照组相比BMDCs上清液中的IL-1β水平升高,而MCC950抑制组IL-1β分泌明显较实验组降低。此外,western blot结果表明,IL-1β的活化形式IL-1β(p17)蛋白在实验组树突状细胞NLRP3炎症小体活化后表达增加。(5)树突状细胞NLRP3炎症小体对CD4+T细胞分化影响:流式细胞术检测结果显示:实验组NLRP3炎症小体激活的BMDCs促进CD4+T细胞向Th1细胞分化,而NLRP3炎症小体被MCC950抑制后促进Th1细胞分化的作用明显降低。Th2、Th17和Treg细胞比例无明显变化。(6)细胞因子检测:多细胞因子阵列检测树突状细胞培养上清液,发现实验组NLRP3炎症小体激活后上清液中的IL-1β显着升高,MCC950抑制组较实验组明显降低。用ELISA方法检测验证了 12例AML患者树突状细胞NLRP3炎症小体激活后上清中的IL-1β水平升高,而MCC950抑制后降低。(7)IL-1β对Th1细胞分化的影响:在对照组和抑制组加入重组人IL-1β细胞因子后Th1细胞比例升高,IL-1β可以促进CD4+T细胞向Th1细胞分化,并且IL-1β可逆转抑制组MCC950的抑制作用,在实验组加入人IL-1β中和抗体后Th1细胞比例降低,IL-1β中和抗体可抑制NLRP3炎症小体激活的DCs促进CD4+T细胞向Th1细胞分化的作用。(8)树突状细胞NLRP3炎症小体促进Th1细胞分化的方式:树突状细胞和CD4+T细胞无论是接触共培养还是小室分离共培养,DCs NLRP3炎症小体激活促进CD4+T细胞向Th1分化的作用是一样的,而且共培养上清液中细胞因子IFN-y和IL-1β的水平没有显着差异。(9)IL-1β影响Th1细胞分化的机制:RT-PCR检测CD4+T细胞IFN-γ、IFN-γ受体和STAT1表达在IL-1β和IL-12联合组明显升高,IL-12单独刺激或PBS组升高不明显。(10)树突状细胞NLRP3炎症小体在体内对Th1细胞分化的影响:WT小鼠树突状细胞NLRP3炎症小体激活促进WT小鼠骨髓或脾脏中Th1细胞的分化,Th1细胞比例高于对照组,而抑制组MCC950可抑制这种作用。但是Nlrp3-/-小鼠树突状细胞无论在实验组还是对照组均不能促进WT小鼠中Th1细胞分化。(11)IL-1β对小鼠Th1细胞分化的影响:将鼠IL-1β中和抗体注射到实验组小鼠体内,与未注射IL-1β中和抗体的实验组小鼠相比Th1细胞比例明显降低。研究结论1.AML初诊患者骨髓Th1细胞比例及IFN-γ水平降低,且Th1细胞比例降低与白细胞计数呈负相关,提示AML骨髓微环境中存在免疫失衡。2.树突状细胞NLRP3炎症小体激活促进的Th1细胞分化需要一个有功能的炎症小体,该结果为纠正AML骨髓微环境的免疫失衡提供新的研究方向。3.树突状细胞NLRP3炎症小体激活不依赖于细胞接触通过IL-1β分泌的方式促进Th1细胞分化,表明IL-1β是促进Th细胞分化的关键分子,可以通过干预IL-1β提高骨髓微环境的免疫。第二部分树突状细胞NLRP3炎症小体在急性髓系白血病抗白血病作用及机制的研究研究背景急性髓系白血病(AML)是一种侵袭性致命的血液系统恶性肿瘤,为成人急性白血病最常见的一种,占儿童白血病的20%。AML标准诱导化疗方案可使50%到75%的AML患者得到缓解,由于化疗耐药性克隆的出现,标准疗法通常不足以维持持久缓解,细胞遗传学不良的AML即使采用积极的化疗效果也较差,大多数患者会复发并死于自身疾病,其5年生存率约为25%。但是年龄大于65岁的患者其预后并没有得到改善,最新报道其生存率低于10%,因此,迫切需要新的治疗方案,正是在这种情况下,免疫疗法在近年来脱颖而出。近年来基于免疫的治疗方法已经使某些晚期癌症患者的生存率得到意想不到的提高。免疫疗法治疗的前提是肿瘤会抑制免疫系统,肿瘤微环境中的T细胞功能受到抑制,并且可能与AML发病有关,而且新诊断的AML患者骨髓微环境中的T细胞浸润与总生存期之间存在显着关联。使用AML/树突状细胞融合的疫苗接种可引起白血病特异性T细胞的扩增,预防疾病复发,因此新型的个性化树突状细胞疫苗是一种新的治疗方法,产生防止疾病复发的免疫记忆,具有治疗AML的潜力。通过DCs刺激可以使T细胞产生免疫应答,并在针对肿瘤杀伤的免疫应答反应中起重要作用。活化的T细胞能够识别AML细胞上表达的抗原,并随后介导对AML细胞杀伤作用。近年来,DCs作为AML免疫治疗的工具引起了人们的极大兴趣,通过DCs免疫刺激自体T细胞是一种创新策略,可减少或消除残留的白血病细胞来预防AML复发,因此基于DCs的免疫疗法可能在根除AML患者中残留白血病细胞方面更加成功。AML患者在接受相当数量的DCs治疗后,可以获得非特异性和抗原特异性的免疫效应。NLRP3炎症小体在癌症发生和发展中的作用具有争议性。NLRP3炎症小体及其成分促进了恶性肿瘤如黑素瘤、肺癌、乳腺癌和多发性骨髓瘤的生长、增殖、侵袭和转移。但是,在NLRP3基因敲除动物模式中使用氧化偶氮甲烷(AOM)及葡聚糖硫酸钠(DSS)(AOM/DSS)诱发结肠癌的实验研究中,NLRP3炎症小体对癌变具有保护作用。NLRP3炎症小体在不同肿瘤中的功能也突出了炎症小体的治疗潜力。前期我们研究结果显示AML患者骨髓中Th1细胞比例降低,存在骨髓微环境免疫抑制,树突状细胞炎症小体激活可以促进CD4+T细胞向Th1细胞分化,Th1细胞效应细胞因子为IFN-γ,IFN-γ具有抗肿瘤免疫的作用,然而树突状细胞NLRP3炎症小体激活促进AML骨髓Th1细胞分化对白血病细胞是否具有杀伤作用及其机制尚待研究。研究目的本研究旨在探究树突状细胞NLRP3炎症小体激活促进AML骨髓Th1细胞分化是否对白血病细胞增殖和凋亡有影响;研究影响AML白血病细胞增殖和凋亡的关键分子,通过干预关键分子分析其对白血病细胞增殖和凋亡影响的机制,从而明确NLRP3炎症小体参与AML骨髓免疫促进Th1亚群分化抗白血病的作用机制。研究方法(1)树突状细胞NLRP3炎症小体对白血病细胞增殖和凋亡的影响:将AML患者BMDCs分成三组:①NLRP3炎症小体激活实验组(LA):DCs先用脂多糖LPS预处理6小时,再加ATP作用45分钟,激活NLRP3炎症小体;②抑制组(MLA):LPS处理前,预先加入炎症小体抑制剂MCC950作用1小时,抑制NLRP3炎症小体活性;③对照组:加入对应量的无菌PBS。用小室将CD4+T细胞与三组BMDCs共培养,共培养后的CD4+T细胞再与THP-1或U937 AML细胞系共培养,流式细胞术检测THP-1及U937白血病细胞的凋亡,用CCK-8检测细胞增殖试剂盒检测白血病细胞的增殖。(2)影响白血病细胞增殖和凋亡的机制:ELISA方法检测共培养细胞上清液中的Th1细胞主要效应细胞因子IFN-γ水平。在实验组共培养体系中加入人IFN-γ中和抗体,流式细胞术检测THP-1及U937白血病细胞的凋亡,CCK-8检测细胞增殖试剂盒检测白血病细胞的增殖,探讨细胞因子IFN-γ对影响白血病细胞的凋亡和增殖的影响。(3)树突状细胞NLRP3炎症小体对AML白血病小鼠的影响:体外培养WT或Nlrp3-/-C57BL/6J小鼠的树突状细胞,将WT小鼠树突状细胞分为3组:①激活NLRP3炎症小体实验组:LPS和ATP处理;②抑制NLRP3炎症小体抑制组:先用NLRP3炎症小体抑制剂MCC950作用1小时后LPS和ATP处理;③对照组:加入对应量的无菌PBS。Nlrp3-/-小鼠的树突状细胞分为实验组和对照组。先通过WT小鼠尾静脉注射了 MLL-AF9-GFP白血病细胞,3天后将各组BMDCs通过尾静脉注入小鼠体内,7天后检测各组白血病小鼠脾脏和肝脏体积和重量,流式细胞术检测小鼠骨髓、脾脏及肝脏中MLL-AF9-GFP白血病细胞比例。(4)IFN-y对白血病小鼠体内白血病细胞的影响:将MLL-AF9-GFP白血病细胞通过WT小鼠尾静脉注射入小鼠体内,3天后将对照组和实验组WT/BMDCs通过尾静脉注入小鼠体内,将鼠IFN-γ中和抗体在第4、6和8天注射入部分实验组小鼠体内,第10天检测各组白血病小鼠脾脏和肝脏体积和重量,流式细胞术检测小鼠脾脏、肝脏及骨髓中MLL-AF9-GFP白血病细胞比例。(5)IL-1β对白血病小鼠体内白血病细胞的影响:将MLL-AF9-GFP白血病细胞通过WT小鼠尾静脉注射入小鼠体内,3天后将对照组和实验组WT/BMDCs通过尾静脉注入小鼠体内,将鼠IL-1β中和抗体连续4天注射入部分实验组小鼠体内,第10天检测各组白血病小鼠脾脏和肝脏体积和重量,流式细胞术检测小鼠脾脏、肝脏及骨髓中MLL-AF9-GFP白血病细胞比例。研究结果(1)树突状细胞NLRP3炎症小体对白血病细胞增殖和凋亡的影响:与对照组相比,实验组CD4+T细胞与THP-1或U937白血病细胞共培养后白血病细胞凋亡明显增加,而抑制组MCC950会降低这种促凋亡作用。与对照组或抑制组的BMDCs组共培养的CD4+T细胞相比,实验组CD4+T细胞使THP-1或U937白血病细胞的增殖明显降低。(2)影响白血病细胞增殖和凋亡的机制:ELISA检测实验组NLRP3炎症小体激活的BMDCs与CD4+T细胞共培养上清液中的细胞因子IFN-γ水平明显高于对照组,而抑制组IFN-γ的水平显着降低。在实验组共培养体系中加入人IFN-γ中和抗体后THP-1或U937白血病细胞的凋亡显着降低。同样,在实验组共培养体系中加入IFN-γ中和抗体后THP-1或U937白血病细胞的增殖较未加入IFN-γ的实验组明显增加。(3)树突状细胞NLRP3炎症小体对白血病小鼠肿瘤影响:与对照相比,注射NLRP3炎症小体激活WT/BMDCs的实验组白血病小鼠的脾脏和肝脏的体积和重量显着降低,且骨髓、脾脏和肝脏中的MLL-AF9-GFP白血病细胞比例低于对照组,而MCC950可逆转WT/BMDCs NLRP3炎症小体激活抑制白血病细胞增殖的这种作用。但是Nlrp3-/-小鼠的实验组BMDCs NLRP3炎症小体激活后注射入白血病小鼠体内后,未观察到对白血病小鼠白血病细胞的抑制作用。(4)IFN-γ对白血病小鼠体内白血病细胞的影响:与未注射鼠IFN-γ中和抗体的实验组小鼠相比,注射鼠IFN-γ中和抗体的实验组小鼠的脾脏体积或肝脏重量和体积显着增加,小鼠中骨髓、脾脏或肝脏中的MLL-AF9-GFP白血病细胞比例显着增加。(5)IL-1β对白血病小鼠体内白血病细胞的影响:实验组小鼠注射鼠IL-1β中和抗体后,与未注射鼠IL-1β中和抗体的实验组小鼠相比白血病小鼠的脾脏和肝脏的体积和重量显着增加,且骨髓、脾脏和肝脏中的MLL-AF9-GFP白血病细胞比例显着增加。研究结论1.NLRP3炎症小体激活的BMDCs促进Th1细胞分化有抗白血病的作用,为AML的免疫治疗提供新的研究方向。2.IFN-γ是BMDCs NLRP3炎症小体激活抗白血病作用重要的效应分子。3.NLRP3炎症小体通过IL-1β/Th1/IFN-γ参与抗白血病作用,调节树突状细胞NLRP3炎症小体和IL-1β有望成为AML治疗新的靶点。第三部分免疫相关基因单核苷酸多态性在急性髓系白血病中的研究研究背景急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)是髓系原始幼稚细胞在骨髓内大量增殖导致正常造血功能受损,并伴有遗传学异常,是成人发病率最高的血液系统恶性肿瘤。恶性肿瘤存在免疫失衡,AML患者骨髓存在免疫系统损伤,免疫系统最重要的组成部分T细胞存在数量和功能上的缺陷。免疫T细胞是至关重要的抗肿瘤免疫细胞,通过释放细胞因子和细胞毒性物质消灭AML白血病细胞。同时,AML白血病细胞也会影响T细胞的分化和增殖,并通过释放抑制性细胞因子等方式发挥免疫抑制作用。T辅助(Th)细胞在T细胞免疫系统网络中起着举足轻重的作用,Th1/Th2及Th1 7/Treg失衡与实体瘤的发病机理以及血液系统恶性肿瘤有关,但是Th细胞在AML骨髓微环境中研究不多。单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms,SNPs)是最常见的遗传变异类型,其功能在生物学的许多领域被发现,特别是在人类各种疾病方面的研究最多。炎症相关的SNPs在AML患者中的作用已已有相关研究,并且发现SNPs与化疗敏感性、疾病预后和生存时间相关的SNPs。例如IL-1β(rs16944)GA基因型与AML遗传学预后良好相关,而含有IL-18(rs1946518)GT基因型的AML患者生存率较差。Zhu等报道IL-17F的G单突变体和GG突变纯合子与AML易感性有关。TNF-α、IL-10、TGF-β1等功能性变异可能与AML的发病机制有显着相关性。我们在前期研究中发现AML骨髓中Th亚群失衡及其相关细胞因子分泌紊乱,并发现失衡的Th亚群与紊乱的细胞因子可能共同参与AML的发生和发展。因此,我们进一步研究免疫相关基因(包括促炎或抗炎细胞因子以及T细胞亚群的关键调节因子)的SNPs与AML的关系,探索SNPs在AML发病过程中涉及一些尚未发现的功能及病理机制,寻找新的治疗AML重要的免疫靶点。研究目的本研究旨在探索免疫相关基因的单核苷酸多态性与AML易感性、预后危险分层和生存分析之间的关系;分析免疫相关基因的单核苷酸多态性不同基因型与AML临床特征之间的关系;结合相关基因mRNA表达和功能分析,进一步确定了潜在的信号通路,寻找AML新的免疫治疗靶点。研究方法标本收集:本研究收集来自山东大学齐鲁医院的269例初诊AML患者及200例健康对照标本,分离单个核细胞并提取DNA及RNA。收集整理患者临床相关资料。(1)将AML患者及健康对照标本进行质谱SNPs分型信息采集及分析。Sequenom MassARRAY平台对21个候选SNPs进行了引物延伸质谱的基因分型,得出269例AML病例和200例健康对照的基因分型准确性结果。本研究利用Hardy-Weinberg平衡和微小等位基因频率(MAF)对21个候选SNPs的适用性进行了评价。(2)实时荧光定量PCR检测AML骨髓单个核细胞中IL-12 mRNA的表达。研究结果:(1)免疫相关基因SNPs与AML易感性的关系:IL4(rs2070874、rs2243250)和IL22 rs1179251在显性模式下基因型频率与AML易感性显着相关;单因素logistic回归分析显示,调整年龄和性别后,在显性模式下只有IL4(rs2243250)与AML的易感性显着相关,但是经过Bonferroni多重校正后,没有SNPs与AML的易感性相关。(2)免疫相关基因SNPs与骨髓原始幼稚细胞的关系:在隐性模式下IL2(rs2069762)基因型频率在骨髓高幼稚细胞(≥42%)和低幼稚细胞(<42%)组间差异有统计学意义。(3)免疫相关基因SNPs与外周血白细胞的关系:IL22(rs2227491)在显性、共显性和等位基因模式下的基因型频率与白细胞计数显着相关;另外IL4(rs2243250)等位基因频率也与白细胞计数显着相关;rs2227491在显性和等位模式下的基因型频率经Bonferroni多重校正后与白细胞计数也显着相关;在调整年龄和性别后,IL22(rs2227491)在显性模式下AML患者携带TT基因型发生高白细胞计数的风险是TC/CC基因型携带患者的4.2倍,IL22 rs2227491等位基因的分布也有统计学差异。(4)免疫相关基因SNPs与血红蛋白、血小板及乳酸脱氢酶的关系:在共显性和显性模式下STAT6(rs324011)和IL12A(rs2243115)的基因型频率在高血红蛋白(≥80g/L)和低血红蛋白(<80/L)间差异有统计学意义;在共显性和隐性模式下IFN-γ(rs2069718)等位基因频率和基因型频率与血红蛋白高低也显着相关;在调整年龄和性别后,IL6R(rs2228145)基因型频率仅在显性模式下与高乳酸脱氢酶(LDH)显着相关性,但是在Bonferroni多重校正后,SNPs与血红蛋白、LDH无显着相关性。未发现SNPs与血小板高低相关。(5)免疫相关基因SNPs与WHO分型重现性遗传学异常的关系:STAT5B(rs6503691)在共显性和隐性模式下与AML重现性遗传学异常(RGAs)显着相关,即使Bonferroni多重校正后,rs6503691与重现性遗传学异常之间的相关性也具有统计学意义;调整年龄和性别后进行单变量逻辑回归分析,rs6503691 CC基因型(共显性模式)或CC/CT基因型(隐性模式)被作为参考时,TT或CT基因型(共显性模式)和TT(隐性模式)与重现性遗传学异常显着相关。(6)免疫相关基因SNPs与AML危险度分层的关系:在共显性、显性和隐性模式下TGF-β1(rs1800469)与AML危险度分层显着相关,但是经多元回归调整年龄和性别因素后rs1800469在共显性、显性和隐性模式下差异无统计学意义。(7)AML缓解组和难治组总生存时间(OS):对191名化疗诱导治疗患者的治疗效果进行OS的单因素分析,结果显示完全缓解(CR)组和难治组之间的结果有显着差异,中位OS分别为39个月和18个月。(8)免疫相关基因SNPs与AML非M3诱导化疗敏感性的关系:在共显性和隐性模式下STAT1(rs3771300)的等位基因频率和基因型频率在治疗敏感组、中等组和无效难治组间差异有统计学意义;在共显性模式下GATA3(rs3824662)等位基因频率和基因型频率在三组间均有显着相关性,但是经过Bonferroni多重校正后无SNPs与诱导化疗敏感性相关。(9)免疫相关基因SNPs与AML生存的关系:在显性和共显性模式下STAT3(rs744166)基因型频率与AML患者生存期显着相关;IL12A(rs6887695)在等位基因、隐性和共显性模式下的与AML患者的生存期显着相关;在Bonferroni多重校正后IL12A(rs6887695)只有在共显性和隐性模式下的与AML患者的生存显着相关;在IL12A(rs6887695)共显性模式下AML患者携带CC基因型的比GG基因型的携带患者OS降低22个月;IL12A(rs6887695)在GC/CC下的生存期(22.0个月)明显短于隐性模式下GG(33.0 个月)。(10)rs6887695与IL12 mRNA表达水平的关系:在共显性模式下,CC基因型患者IL12mRNA表达水平高于GG基因型患者;与GG基因型相比,CG杂合子患者的IL12水平也升高;在隐性模式下,与CG/GG基因型相比,GG基因型的样本中IL12表达显着降低;而在显性模式下,CC/CG基因型和GG基因型的IL12 mRNA表达无差异。研究结论1.IL22(rs2227491)与白细胞计数显着相关,提示IL22与AML预后有相关性。2.STAT5B(rs6503691)与AML患者重现性遗传学异常密切相关,提示STAT5B与AML预后关。3.IL12A(rs6887695)与 AML 患者的 IL12 mRNA 表达及 OS 相关,对 AML的预后有独立的负面影响。
徐光[8](2020)在《布鲁氏菌病患者Th淋巴细胞亚群的免疫动态评估及抑制性受体对免疫功能的影响分析》文中提出背景:布鲁氏菌感染后能依靠特定的免疫逃逸机制受到保护并在宿主的吞噬细胞内繁殖和生存。既能在感染灶的周围形成局部肉芽肿,也可以由吞噬细胞携带感染全身各组织器官,引起严重病变甚至死亡。布鲁氏菌的胞内生活方式使宿主难以从体内彻底清除,并引起宿主体内一系列复杂的免疫反应,辅助性T细胞(T helper cells,Th)及其相关的细胞因子、趋化因子参与宿主对抗布鲁氏菌免疫防御过程,并且与MO/Mf细胞和NK细胞等多种免疫细胞相互作用,影响临床表现和参与疾病的进展。然而,各种免疫细胞,尤其是Th22淋巴细胞亚群在布病感染过程中的具体免疫效应和作用机制尚未完全明确。而趋化因子和抑制性受体在布病中的作用也需要进一步深入研究。目的:1.研究布病患者体内Th1、Th17和Th22淋巴细胞亚群以及相关的细胞因子在布病中的动态变化趋势;探索Th22淋巴细胞亚群在布病中的免疫作用及机制;2.研究趋化因子及其受体在布病病程中的免疫作用和机制;3.研究免疫细胞基因和蛋白的差异表达及其在布病发病机制中的作用,探讨免疫耗竭对于布病慢性化进展的可能影响。方法:1.通过流式细胞术对布病患者外周血中Th1、Th17和Th22淋巴细胞亚群的表型及分布情况进行分析,通过微量样本多指标流式蛋白定量技术(Cytometric Bead Array,CBA)和酶联免疫吸附试验(ELISA)方法检测血清中细胞因子的水平。通过随访来观察研究免疫指标的动态变化趋势。2.通过流式细胞术对布病患者外周血中Th淋巴细胞表面趋化因子受体的表达情况进行分析,通过随访来观察其动态变化趋势。3.应用RNA测序(RNA-seq)及差异基因表达分析方法测定T淋巴细胞、MO/Mf细胞和NK细胞转录组表达谱,研究基因和蛋白的差异表达以及其与布病免疫状态之间的关系,用q PCR的方法验证转录组分析结果。分析免疫细胞之间的相关性和相互作用机制,探讨可能影响布病慢性化进展的关键因素。结果:布病患者外周血内的Th1淋巴细胞亚群在疾病早期比健康对照组明显升高,予以规范治疗后,约在病程6个月左右升至高峰,在病程6-12个月虽有下降,但始终维持在高于正常的水平。Th17淋巴细胞数在疾病早期高于健康人,经治疗后缓慢下降,6个月时已经下降至健康水平以下,病程12个月时仍无恢复趋势。Th22淋巴细胞亚群在疾病早期即开始下降,整个病程(12个月内)呈持续下降趋势,12个月左右仍无恢复。而且Th1和Th17细胞亚群的分布及活化状态,会影响Th22细胞的表达与活化。Th22淋巴细胞在布鲁氏菌感染后对IL-22的表达明显增强。在疾病早期,布病患者体内重要的Th淋巴细胞亚群(Th1、Th17和Th22)表面趋化因子受体的表达整体减低,而且在一段时间内(6个月左右)表现出持续性下降的趋势,病程6个月后趋化因子受体水平虽开始缓慢升高,但在12个月的时候仍未回升至正常水平。证实在患者的T细胞、MO/M?细胞和NK细胞中多项趋化因子及受体的m RNA表达水平明显降低,并受抑制性受体(FOXP3、TIGIT、PD-L1和LAG3)的调控。多种抑制性受体分子的表达水平明显升高,伴随着活化免疫细胞的功能降低。免疫细胞活化指标、趋化因子以及趋化因子受体与抑制性受体分子的表达水平之间存在着相关性。且抑制性受体各分子之间存在协同作用。结论:1.布病患者外周血内的Th1、Th17淋巴细胞数量在感染早期增加,Th1在布病急性期(6个月内)始终维持较高水平。Th17淋巴细胞高水平表达的状态维持时间较短。Th1和Th17细胞亚群的分布及活化情况,会影响Th22细胞的表达与活化。在布病中,宿主的Th22淋巴细胞起到保护靶器官,对抗组织损伤的作用,尤其在布病所致骨关节损伤中。Th22淋巴细胞的数量在布病的急性期中呈现整体减少的趋势,因此在感染布鲁氏菌后易于出现骨关节损伤。2.布鲁氏菌感染令宿主多种免疫细胞的趋化功能受损,导致免疫细胞向感染部位的募集功能减弱。3.布鲁氏菌感染后,T细胞、MO/M?细胞和NK细胞表达抑制性受体分子的水平升高,可以调控多项趋化因子及受体的表达水平降低,使免疫细胞向病灶处募集的数量减少;而且抑制性受体分子还能相互协同作用,共同抑制布病患者体内活化免疫细胞的功能,诱导病灶处免疫耗竭的发生,促使布病进展为慢性化病程。
刘果[9](2020)在《猪流行性腹泻病毒诱导派伊尔结内T细胞依赖性IgA+B细胞分化的机制研究》文中提出分泌型IgA抗体(sIgA)是黏膜表面主要的抗体类型,可与病原特异性结合从而阻止其入侵机体。派伊尔结(PP结)是肠道sIgA的主要的诱导位点,猪流行性腹泻病毒(PEDV)可诱导猪肠道PP结内IgA免疫应答,然而其分子机制尚不清楚。本研究旨在探讨PEDV感染免疫过程中促进猪肠道PP结内黏膜免疫应答的重要因子及其分子机制。为确定PEDV感染能在猪肠道有效诱导黏膜免疫应答,本研究首先将PEDV弱毒株采用口服并结合后海穴免疫途径接种一月龄仔猪并分析其免疫应答。结果表明,PEDV不仅诱导了血清中病毒特异性IgG和IgA的产生,也促进了肠道内容物中特异性IgA的生成;因此,PEDV感染免疫可成功诱导猪肠道黏膜免疫应答。为准确评价猪B细胞内IgA类别转换的发生,本研究建立了猪IgA+B细胞抗体类别转换过程中三种关键标志物(GLTα、PSTα及CTα)的PCR检测方法,获得了该三种重组产物的核酸序列,并对其扩增条件进行了优化,最终成功建立了重复性良好的检测上述三种关键分子的方法。该方法的建立为研究猪IgA产生机制奠定了坚实基础。为探明促进猪PP结内IgA产生的细胞因子及其作用机制,本研究分离并纯化了猪PP结内IgM+B细胞,将其与T细胞非依赖性细胞因子(BAFF和APRIL)及T细胞依赖性细胞因子(CD40L、TGF-β1、IL-6、IL-10、IL-17A和IL-21)共同培养,检测上清中IgA分泌量。结果表明,CD40L+IL-21可显着促进猪PP结B细胞的IgA产量。深入研究IL-21的作用机制发现,IL-21可促进PP结IgM+B细胞增殖,抑制其凋亡,从而提高了B细胞的活性;IL-21还可以通过上调IRF4和BLIMP1的表达及下调PAX5和BCL6的表达量来促进B细胞分化为浆细胞;此外,IL-21通过活化JAK-STAT信号通路从而促进IgM+B细胞发生类别转换重组,形成IgA+B细胞,最终促进B细胞分泌IgA抗体。为了证实猪PP结内IL-21是否主要来源于滤泡辅助性T(Tfh)细胞,本研究克隆了猪CXCR5的基因,制备了针对其N端54个胞外区氨基酸的多克隆抗体,并表明所制备的兔抗猪CXCR5多克隆抗体具有良好的的反应性和特异性。采用该CXCR5多克隆抗体标记猪外周血淋巴细胞,荧光定量PCR和流式细胞术的结果均表明猪CXCR5主要表达在B细胞中。此外,采用CXCR5多克隆抗体标记并分离了猪PP结内幼稚Th细胞、Tfh细胞和其他活化的非Tfh细胞,荧光定量PCR检测结果表明,猪Tfh细胞是PP结内产IL-21的最主要Th细胞类型。综上所述,本研究首先证明了口服感染结合后海穴注射PEDV可诱导猪肠道IgA的产生;其次,建立了猪IgA类别转换过程中三种关键标志分子(GLTα、PSTα及CTα)的PCR检测方法;最后阐明主要由Tfh细胞产生的IL-21通过JAK-STAT信号通路促进PP结内产IgA的浆细胞的分化,从而促进肠道IgA的产生。该研究丰富了猪肠道黏膜免疫学知识,为设计和创制高效黏膜疫苗提供了理论依据和新的思路。
张曦文[10](2020)在《肺瘤平膏及其有效组分通过调控脂质代谢逆转肿瘤相关树突状细胞功能的机制研究》文中提出肺癌是临床最常见的肿瘤,患病率和死亡率居所有恶性肿瘤的首位。肺癌的主要治疗方式包括手术、放化疗、靶向治疗和免疫治疗等。树突状细胞(Dendritic cells,DCs)是机体功能最强的专职抗原递呈细胞,能够有效激活T淋巴细胞免疫,是肿瘤免疫治疗中的调控关键。在肿瘤微环境中,肿瘤相关树突状细胞(Tumor-associated dendritic cells,TDCs)中脂质过氧化激活内质网应激,引起未折叠蛋白反(Unfolded Protein Response,UPR),激活下游 IRE1α-XBP1 通路,产生的剪切型XBP1-s通过靶向多个脂质合成基因,诱导TDCs内脂质的异常积累,表现出未成熟表型和功能障碍,抑制了抗肿瘤免疫。有研究表明,PI3K-AKT-mTOR信号途径在脂质代谢中起重要调控作用,能够通过调节脂肪合成相关基因的表达来调控脂质合成,XBP1过表达会导致PI3K/mTOR表达的上调,敲除XBP1后,PI3K/mTOR表达下调,还有研究表明,抑制mTOR2可以下调脂质的生成。“脂浊”既为病理产物也是致病因素,多归属于中医学“痰浊”的病理范畴。肺瘤平膏是由“全国名中医”朴炳奎教授研制的临床治疗肺癌具有确切疗效的中药复方,具有益气养阴、化痰散结、解毒活血的功效,可通过多作用靶点发挥抗肿瘤作用。前期研究表明,肺瘤平膏(FLP)能够明显提高DCs功能,通过调节DCs的抗原递呈功能发挥抗肿瘤效应,并且在调控PI3K/mTOR通路方面具有一定优势。作为肺瘤平膏中化痰类代表药物桔梗的主要有效组分,研究表明,桔梗皂苷D(PlatycodinD,PD)具有明确的抗肿瘤、免疫调节、降脂和抗氧化等功能,并且具有抑制ROS聚集、调节PI3K/mTOR信号的作用。因此,我们推测PD可能是FLP调控脂质代谢逆转TDCs功能的有效组分之一,可能通过抑制TDCs脂质异常堆积逆转TDCs功能,并希望对其效应机制进行初探。目的:(1)构建TDCs共培养体系,探究肺瘤平膏在毒胡萝卜素(TG)诱导ERS剪切XBP1s后,对TDCs中脂质含量和功能的影响及作用机制。(2)初探PD对TDCs的免疫调节功能,及探究TG激活ERS剪切XBP1s后,对TDCs中脂质含量和功能的影响及可能的效应机制。方法:(1)小鼠骨髓源树突状细胞的分离、培养,建立体外肿瘤相关树突状细胞共培养模型。(2)模拟肿瘤微环境,通过FLP含药血清干预TDCs模型后,流式细胞术观察对TDCs脂质含量、共刺激分子表达;通过混合淋巴细胞反应,CCK8检测混合淋巴细胞增殖、流式检测T淋巴细胞亚群活化,Luminex技术检测TDCs细胞因子分泌。(3)毒胡萝卜素干预TDCs模型,观察TG激活ERS,对IRE1α-XBP1通路的影响,及对TDCs脂质含量、共刺激分子表达、混合细胞增殖和亚群活化、细胞因子的影响。(4)FLP含药血清,作用TG干预后的ERS激活后的TDCs模型,观察对TDCs脂质含量、共刺激分子表达、混合细胞增殖和亚群活化、细胞因子的影响。(5)通过 Western blot、qPCR 技术,检测 FLP 含药血清对 BiP-IRE1α-XBPI、PI3K-AKT-mTOR通路mRNA和蛋白的表达情况,探索可能的作用机制。(6)通过LDH、CCK8检测技术,观察PD对DCs毒性和Lewis肺癌细胞的杀伤能力。(7)模拟肿瘤微环境,通过PD干预TDCs模型后,观察对TDCs脂质含量、共刺激分子表达、混合细胞增殖和亚群活化、细胞因子的影响。(8)通过构建TG激活ERS后的TDCs模型,观察PD对TDCs脂质含量、共刺激分子表达、混合细胞增殖和亚群活化、细胞因子的影响。(9)通过 Western blot、qPCR 技术,检测 PD 对 BiP-IRE1α-XBPI、PI3K-AKT-mTOR通路mRNA和蛋白的表达情况,探索可能的作用机制。结果:(1)流式检测诱导后DCs表面分子CD1 1c+阳性表达比例为76.5%,并与肺癌细胞培养上清共培养,冻融抗原刺激,构建TDCs共培养模型。(2)在模拟的肿瘤微环境中,FLP含药血清干预后,降低TDCs胞内脂质含量(P<0.01),提高TDCs表面分子的表达,其中以提高CD80、CD86的表达最为明显(P<0.05),FLP刺激共培养淋巴细胞增殖(P<0.05),明显提高T细胞中Th、CTL细胞亚群比例(P<0.05),降低Tregs细胞的表达(P<0.05),提高细胞因子 IL-12p70、IFN-γ 的分泌(P<0.05)。(3)TG作用后,在TDCs培养模型中,BiP-IRE1α-XBP1(t/u/s)通路mRNA、蛋白表达增加(P<0.05),脂质含量较模型组增加(P<0.05),影响TDCs表面分子的表达,MCH-Ⅱ、CD80、CD86的表达均明显降低(P<0.05);抑制混合淋巴细胞的增殖能力(P<0.05),降低Th、CTL细胞亚群的表达(P<0.05),提高Tregs亚群的表达(P<0.05),同时抑制细胞因子IL-12、IFN-γ的分泌(P<0.05)。(4)FLP含药血清作用于TG干预后的TDCs,脂质含量明显下降(P<0.05),恢复TDCs表面分子的表达,其中以提高CD80、CD86表达水平较为明显(P<0.05),提高TG干预后的混合淋巴细胞增殖能力(P<0.05),提高Th、CTL细胞亚群比例(P<0.05)、降低Tregs细胞的亚群表达(P<0.05),促进TG作用后 TDCs 细胞因子 IL-12p70、IFN-γ 的分泌(P<0.05)。(5)qPCR、Western blot 结果显示,对于 TG 激活 ERS 后,BiP-IRE1 α-XBP 1、PI3K-AKT-mTOR通路mRNA和蛋白表达量增加(P<0.05);FLP含药血清干预TG作用后的TDCs,FLP+TG组能够显着降低BiP-IRE1α-XBP1通路mRNA和蛋白的表达(P<0.05),对重要脂质调节转录因子XBP1-s,具有降低其mRNA和蛋白表达的作用;同时,肺瘤平膏含药血清作用后,TG激活的PI3K-AKT-mTOR通路mRNA和蛋白具有一定程度的下降,并且明显降低AKT蛋白的磷酸化水平。(6)LDH结果显示,30uM以下的PD浓度,对DCs无明显损伤,或影响DCs细胞LDH的释放;CCK-8实验结果显示,PD能够有效杀伤Lewis肺癌细胞,其IC50值在13uM左右。(7)在TDCs共培养体系中,PD高中低浓度均能够有效降低TDCs中的脂质含量(P<0.01),提高TDCs表面MCH-Ⅱ的表达(P<0.05),提高CD80(PDH、PDM,P<0.05)、CD86(PDM、PDL,P<0.05)的表达;PDH较强混合淋巴细胞的增殖(P<0.05);PD高中低组均能提高Th、CTL细胞的亚群表达率(P<0.05),抑制 Tregs 亚群表达(PDH,P<0.05);提高 IL-12p70(PDH、PDM,P<0.05)IFN-γ(PDH,P<0.05)细胞因子的分泌。(8)TG干预诱导RES后,PD高、中、低剂量组均能降低TG干预后TDCs中脂质含量(P<0.01);PDH能够提高表面MCH-Ⅱ的表达(P<0.05),各剂量组均能提高CD80及CD86的表达(P<0.05),PDH具有提高淋巴混合细胞的增殖能力(P<0.05),PDH、PDM能够明显提高Th、CTL细胞亚群的表达(P<0.05),PD各剂量组均能降低Tregs细胞亚群的表达(P<0.05),并能促进 TDCs 分泌 IL-12p70(PDH,P<0.05)、IFN-γ(PDH、PDM,P<0.05)细胞因子。(9)qPCR、Western blot结果显示,TG激活ERS后,PD+TG组能够显着降低BiP-IRE1α-XBP1(t/u/s)通路mRNA和蛋白的表达(P<0.01),同时,PD+TG组作用后,TG激活的PI3K-AKT-mTOR通路mRNA和蛋白具有一定程度的下降,其中降低p-AKT磷酸化蛋白表达(P<0.05)水平作用较为明显。结论:基于本实验条件下,我们推测:(1)TG诱导ERS,激活IRE1α-XBP1通路,产生XBP1-s剪切形式,可造成TDCs脂质异常堆积和TDCs的功能障碍。(2)FLP含药血清能够逆转TG激活ERS诱导XBP1剪切造成的TDCs脂质异常堆积和抗原呈递功能障碍。(3)PD可能是FLP发挥改善TDCs脂质异常堆积和抗原呈递功能的有效组分之一。(4)FLP含药血清及其有效组分PD调节改善TDCs脂质异常堆积和抗原呈递功能的作用机制可能是通过调控BiP-IRE1α-XBP1 和 PI3K-AKT-mTOR 通路实现的。
二、Th细胞的活化与树突状细胞(论文开题报告)
(1)论文研究背景及目的
此处内容要求:
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景,再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题,并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例:
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
(2)本文研究方法
调查法:该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法:用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法:通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法:通过调查文献来获得资料,从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法:依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法:对研究对象进行“质”的方面的研究,这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法:通过具体的数字,使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法:运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法:这是社会科学用来分析社会现象的一种方法,从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法:通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、Th细胞的活化与树突状细胞(论文提纲范文)
(1)低氧影响小鼠实验性结肠炎发生发展的免疫学机制研究(论文提纲范文)
摘要 |
Abstract |
主要符号对照表 |
引言 |
第一部分 低氧影响宿主抗消化道病原菌感染的免疫反应机制 |
第1章 背景 |
第2章 材料与方法 |
2.1 实验材料 |
2.2 实验方法 |
2.3 技术路线图 |
2.4 统计学分析 |
第3章 结果 |
3.1 低氧C.rodentium感染小鼠模型的建立 |
3.2 低氧暴露对C.rodentium结肠炎的影响 |
3.3 低氧下Th免疫反应的改变 |
3.4 低氧对HIF-1α及 Th免疫反应调控的影响 |
3.5 低氧对TLR4/NF-κB炎性通路的影响 |
3.6 低氧C.rodentium结肠炎黏膜屏障的改变 |
第4章 讨论 |
第5章 小结 |
第二部分 低氧对黏膜抗原提呈细胞表型和功能的影响 |
第1章 背景 |
第2章 材料与方法 |
2.1 实验材料 |
2.2 实验方法 |
2.3 技术路线图 |
2.4 统计学分析 |
第3章 结果 |
3.1 低氧对DC分化亚型的影响 |
3.2 低氧对DC成熟活化状态的影响 |
第4章 讨论 |
第5章 小结 |
结论 |
参考文献 |
致谢 |
综述 低氧与肠道免疫功能改变 |
参考文献 |
附录 |
作者简介 |
(2)调节性B细胞亚群与系统性红斑狼疮发病的关系及其机制研究(论文提纲范文)
摘要 |
英文摘要 |
第1章 综述 |
1.1 引言 |
1.2 SLE与自身免疫反应 |
1.2.1 固有免疫系统在SLE中的作用 |
1.2.2 适应性免疫系统在SLE中的作用 |
1.3 Bregs研究进展 |
1.3.1 Bregs的定义及表型 |
1.3.2 Bregs的来源及发育 |
1.3.3 Bregs的生成调节 |
1.3.4 Bregs的功能 |
1.3.5 Bregs与自身免疫性疾病 |
1.3.6 Bregs与感染及肿瘤性疾病 |
1.4 小结 |
第2章 材料和方法 |
2.1 研究对象、仪器和试剂 |
2.1.1 研究对象 |
2.1.2 主要实验仪器及试剂 |
2.2 实验方法 |
2.2.1 血液样本采集 |
2.2.2 PBMC分离及培养 |
2.2.3 流式细胞仪检测B细胞、Th细胞亚群 |
2.2.4 ELISA测定血浆标本和细胞上清液中的细胞分子水平 |
2.2.5 ELISA测定血浆标本和细胞上清液中的BAFF浓度 |
2.2.6 CBA试剂盒检测Th细胞功能分子水平 |
2.2.7 Bregs亚群分选及培养 |
2.2.8 共培养系统的建立 |
2.2.9 统计学方法 |
第3章 研究结果 |
3.1 研究对象的基本情况 |
3.2 SLE患者Bregs的表达情况 |
3.2.1 SLE患者外周血IL-10+/IL-35+/TGF-β1+Bregs亚群变化 |
3.2.2 SLE患者外周血不同表型Bregs的变化 |
3.2.3 SLE患者外周血IL-10、IL-35 以及TGF-β1水平 |
3.2.4 SLE患者外周血中Bregs功能变化的探索 |
3.2.5 小结 |
3.3 SLE患者外周血Th细胞及B细胞亚群的表达情况 |
3.3.1 SLE患者外周血Th细胞亚群及其功能分子的变化 |
3.3.2 SLE患者外周血B细胞亚群的变化 |
3.3.3 SLE患者外周血BAFF水平的变化 |
3.3.4 小结 |
3.4 Bregs及IL-10、IL-35、TGF-β1水平与SLE临床指标的关系 |
3.5 Bregs及IL-10、IL-35、TGF-β1水平与SLE器官受累的关系 |
3.6 免疫治疗后SLE患者外周血Bregs及及IL-10、IL-35、TGF-β1水平的变化 |
3.7 体外研究Bregs对SLE患者Th细胞亚群的影响 |
3.7.1 Transwell体系内Bregs对Th细胞的影响 |
3.7.2 小结 |
第4章 讨论 |
第5章 结论 |
第6章 创新点 |
参考文献 |
附表 |
作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
致谢 |
(3)四神丸调控树突状细胞活化治疗脾肾阳虚型结肠炎的作用机制研究(论文提纲范文)
致谢 |
中文摘要 |
abstract |
英文缩略词 |
引言 |
第一部分 综述部分 |
1 中医药治疗脾肾阳虚型UC的研究概况 |
1.1 UC的病因病机 |
1.2 UC的中医辨证分型研究进展 |
1.3 UC各分型的中医药治疗进展 |
2 树突状细胞 |
2.1 DC的来源及分布 |
2.2 DC在肠黏膜免疫屏障中的作用 |
3 DC与UC的关系 |
3.1 DC诱导免疫耐受调节UC |
3.2 DC调节Th17/Treg细胞间平衡 |
3.3 DC调节Th1和Th17 细胞间平衡 |
4 四神丸治疗脾肾阳虚型UC的作用依据 |
4.1 四神丸的方源 |
4.2 四神丸的方剂配伍特点 |
4.3 四神丸的现代药理概况 |
4.4 四神丸治疗脾肾阳虚型UC的临床研究概况 |
4.5 四神丸治疗脾肾阳虚型UC的药理学概况 |
4.6 四神丸治疗UC与树突状细胞之间的关系 |
5 小结 |
第二部分 实验研究 |
1 实验材料 |
1.1 实验动物 |
1.2 实验主要药物和试剂 |
1.3 实验主要药物和试剂的配制方法 |
1.4 实验主要仪器 |
2 实验方法 |
2.1 分组 |
2.2 造模 |
2.3 给药方法 |
2.4 一般情况观察 |
2.5 小鼠外周血的采集 |
2.6 小鼠结肠与脾脏的采集 |
2.7 疾病活动指数(Disease activity index,DAI)评分 |
3 实验步骤 |
3.1 病理切片的制作及HE染色 |
3.2 结肠组织中IL-10、TNF-α、IFN-γ、IL-12、IL-6、IL-1β表达水平的Elisa检测 |
3.3 流式细胞术 |
3.4 结肠组织蛋白表达水平的检测 |
4 统计学分析 |
5 实验结果 |
5.1 每组小鼠一般情况变化 |
5.2 每组小鼠结肠长度、体质量、结肠重量及单位长度重量的变化 |
5.3 每组小鼠结肠黏膜病理损伤HE染色比较 |
5.4 四神丸对小鼠脾脏重量及脾脏指数的影响 |
5.5 四神丸对小鼠T3、T4、T的影响 |
5.6 四神丸对IL-10、TNF-α、IFN-γ、IL-12、IL-6、IL-1β因子表达的影响 |
5.7 四神丸对树突状细胞表达的影响 |
5.8 四神丸对结肠组织中TLR4/NF-κB通路信号蛋白表达水平的影响 |
6 小结 |
第三部分 讨论部分 |
1 四神丸是治疗脾肾阳虚型UC的基础方剂 |
2 四神丸治疗脾肾阳虚型UC的疗效评价 |
3 四神丸调控炎性树突状细胞水平与药效关系的评价 |
结论 |
不足与展望 |
参考文献 |
个人简历 |
(4)Th17细胞、Treg细胞及Breg细胞在儿童免疫性血小板减少症发病机制中的研究(论文提纲范文)
摘要 |
Abstract |
前言 |
材料与方法 |
结果 |
讨论 |
结论 |
参考文献 |
综述:免疫性血小板减少症发病机制研究进展 |
参考文献 |
附录 |
中英文缩略语名词对照 |
新乡医学院第一附属医院医学科研伦理审批件 |
攻读学位期间发表文章情况 |
致谢 |
个人简历 |
(5)转化生长因子-β2反义寡核苷酸的微生物疫苗及肿瘤疫苗的佐剂作用(论文提纲范文)
提要 |
中文摘要 |
abstract |
文章缩略词表 |
引言 |
第1章 文献综述 |
1.1 TGF-β的概述 |
1.1.1 TGF-β的来源 |
1.1.2 TGF-β的表达 |
1.1.3 TGF-β的结构 |
1.1.4 TGF-β的信号通路 |
1.2 TGF-β的生物学活性 |
1.2.1 TGF-β对胚胎发育的调节 |
1.2.2 TGF-β对免疫应答的负向调节 |
1.2.3 TGF-β2对肿瘤的生长,侵袭及迁移的促进作用 |
1.2.4 TGF-β对组织损伤修复、创面愈合、瘢痕增生的促进作用及炎症反应的抑制作用 |
1.2.5 TGF-β2对纤维化的调节作用 |
1.2.6 TGF-β对肿瘤的抑制作用 |
1.3 靶向TGF-β2的药物 |
1.3.1 TGF-β2的反义寡核苷酸 |
1.3.2 TGF-β2的micro RNA |
1.3.3 TGF-β2的sh RNA |
1.3.4 TGF-β2的抗体 |
1.3.5 TGF-β2的反义基因修饰的同种异体肿瘤疫苗 |
1.3.6 TGF-β2的反义基因修饰的同种异体肿瘤疫苗 |
1.3.7 TGF-β2的抑制剂 |
1.4 疫苗佐剂的概述及其研究进展 |
1.4.1 增强第一信号的佐剂 |
1.4.2 增强第二信号的佐剂 |
1.4.3 增强第三信号的佐剂 |
1.4.4 抑制T细胞抑制信号的佐剂 |
1.4.5 改善肿瘤免疫抑制微环境的佐剂 |
1.4.6 病毒载体佐剂 |
1.4.7 其他佐剂 |
1.4.8 多佐剂肿瘤疫苗 |
1.4.9 佐剂的接种途径 |
1.4.10 佐剂发挥作用的机制 |
1.5 RNA靶向性寡核苷酸的研究进展 |
1.5.1 反义寡核苷酸(Antisense oligonucleotide) |
1.5.2 siRNA |
1.5.3 micro RNA |
1.5.4 反义寡核苷酸的化学修饰方法 |
第2章 材料方法 |
2.1 ODN及引物 |
2.2 实验试剂,仪器与耗材 |
2.3 细胞与细胞系 |
2.4 实验动物 |
2.5 IAV的扩增 |
2.6 IAV TCID50 的测定 |
2.7 IAV血凝效价的测定 |
2.8 聚合酶链式反应(RT-PCR) |
2.9 小鼠PBMC、脾脏及淋巴结单细胞悬液的制备 |
2.10 TIO对 TGF-β2 m RNA表达的抑制实验 |
2.11 流式细胞术(Flow cytometry) |
2.12 蛋白免疫印迹实验(Western Blotting analysis) |
2.13 免疫荧光技术 |
2.14 TIO在小鼠器官和组织中的分布检测 |
2.15 小鼠的免疫 |
2.15.1 疫苗的制备 |
2.15.2 小鼠的免疫和血清的收集 |
2.16 酶联免疫吸附试验(ELISA) |
2.17 流感病毒攻毒实验 |
2.18 小鼠肺组织的病理学观察 |
2.19 脑胶质瘤细胞裂解物(TCL)的制备 |
2.20 GL261脑胶质瘤原位模型的建立 |
2.21 脑胶质瘤预防模型的建立 |
2.22 脑胶质瘤治疗模型的建立 |
2.23 肿瘤周围浸润的炎性细胞的检测 |
2.24 肿瘤组织病理分析 |
2.25 胃癌背部移植瘤模型的建立 |
2.26 统计学分析 |
第3章 研究结果 |
3.1 靶向TGF-β2的反义寡核苷酸的设计与筛选 |
3.2 TIOs对 RAW264.7 细胞,U-937 细胞及CAL-1 细胞表达TGF-β2的影响 |
3.2.1 TIOs对 IL-4 诱导的RAW264.7 细胞TGF-β2 m RNA表达的影响 |
3.2.2 TIOs对 IL-4诱导的RAW264.7细胞Arg1及TNF-αmRNA表达的影响 |
3.2.3 TIOs对 LPS诱导的RAW264.7 细胞TGF-β2 mRNA表达的影响 |
3.2.4 TIOs对 LPS诱导的U-937 细胞表达TGF-β2 mRNA的影响 |
3.2.5 TIOs对甲型流感病毒(IAV)诱导的CAL-1 细胞TGF-β2mRNA表达的影响 |
3.2.6 TIOs对 IL-4/LPS诱导的RAW264.7/U-937细胞表达TGF-β2蛋白的影响 |
3.3 TIO3在细胞和组织中的分布 |
3.4 TIOs的微生物疫苗佐剂效应 |
3.4.1 TIOs对微生物疫苗诱导的抗体产生水平的影响 |
3.4.2 TIO3对流感病毒疫苗诱导的抗流感病毒效率的增强作用 |
3.4.3 TIO1和TIO3 的微生物疫苗佐剂效应的可能机制 |
3.4.4 TIOs的微生物疫苗佐剂的安全性评价 |
3.5 TIO的胶质瘤疫苗的佐剂作用 |
3.5.1 TIOs为佐剂的胶质瘤细胞裂解物疫苗对原位接种脑胶质瘤预防模型小鼠的影响 |
3.5.2 TIOs为佐剂的胶质瘤疫苗对原位接种胶质瘤治疗模型小鼠生存期的影响 |
3.6 单独应用TIO3的抗胶质瘤及抗胃癌作用 |
3.6.1 单独应用TIO3对脑胶质瘤原位移植瘤模型小鼠生存期的影响 |
3.6.2 单独应用TIO3对胃癌背部移植瘤模型小鼠体重、肿瘤大小及生存期的影响 |
3.6.3 单独应用TIO3对胃癌细胞腹腔种植模型小鼠生存期的影响 |
第4章 讨论 |
4.1 TIOs的微生物疫苗佐剂效应 |
4.1.1 TIO3对CD4~+T细胞表面s TGF-β2 表达的抑制作用 |
4.1.2 TIO3 对 CD19~+ B 细胞表面 sTGF-β2 表达的抑制作用 |
4.1.3 TIO3的药效动力学分析 |
4.1.4 TIO1,TIO2及TIO3 的不同功效的机理分析 |
4.1.5 TIO3用于微生物疫苗佐剂的副作用分析 |
4.1.6 TIO3用于微生物疫苗佐剂的可行性分析 |
4.2 TIO3的胶质瘤疫苗佐剂效应 |
4.2.1 TIO3 对胶质瘤细胞MHC I分子表达的上调作用 |
4.2.2 TIO3的胶质瘤疫苗佐剂效应的机理分析 |
4.3 单独应用TIO3的抗胶质瘤和抗胃癌作用 |
4.4 总结和展望 |
结论 |
创新点 |
附录1 |
附录2 The College of Basic Medical Sciences of Jilin University Ethics Committee Approval Form |
参考文献 |
作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
致谢 |
(6)早期肺腺癌快速复发的基因芯片及免疫组库研究(论文提纲范文)
缩略词表 |
Abstract |
摘要 |
第一章 前言 |
第二章 早期肺腺癌复发及快速复发与临床病理特征的关系研究 |
2.1 引言 |
2.2 材料与方法 |
2.3 实验结果 |
2.4 讨论 |
第三章 早期肺腺癌快速复发的基因芯片研究 |
3.1 引言 |
3.2 材料与方法 |
3.3 实验结果 |
3.4 讨论 |
第四章 早期肺腺癌快速复发的免疫组库研究 |
4.1 引言 |
4.2 材料与方法 |
4.3 实验结果 |
4.4 讨论 |
全文总结 |
参考文献 |
文献综述一 肺癌预后的预测因子——免疫相关生物标志物 |
参考文献 |
文献综述二 早期非小细胞肺癌的筛查及治疗进展 |
参考文献 |
攻读博士学位期间的研究成果 |
致谢 |
(7)树突状细胞NLRP3炎症小体及免疫失衡在急性髓系白血病作用和机制研究(论文提纲范文)
中文摘要 |
英文摘要 |
符号说明 |
第一部分 树突状细胞NLRP3炎症小体在急性髓系白血病骨黼Thl亚群分化的作用及机制 |
前言 |
材料和方法 |
结果 |
讨论 |
结论 |
附图 |
参考文献 |
第二部分 树突状细胞NLRP3炎症小体在急性髓系白血病抗白血病作用及机制的研究 |
前言 |
材料和方法 |
结果 |
讨论 |
结论 |
附图 |
参考文献 |
第三部分 免疫相关基因单核苷黢多态性在急性醢系白血病中的研究 |
前言 |
材料和方法 |
结果 |
讨论 |
结论 |
附表 |
附图 |
参考文献 |
致谢 |
攻读学位期间发表的学位论文目录 |
学位论文评阅及答辩情况表 |
英文文章 |
(8)布鲁氏菌病患者Th淋巴细胞亚群的免疫动态评估及抑制性受体对免疫功能的影响分析(论文提纲范文)
前言 |
中文摘要 |
Abstract |
中英文缩略词对照表 |
第1章 文献综述 |
1.1 引言 |
1.2 布病与宿主的免疫细胞 |
1.2.1 布病与固有免疫反应 |
1.2.2 布病与适应性免疫反应 |
1.3 布病中Th细胞相关趋化因子的作用 |
1.3.1 布病中的趋化因子受体CXCR3 |
1.3.2 布病中的趋化因子受体CCR4和CCR6 |
1.3.3 布病中的趋化因子受体CCR10 |
1.4 布病中的免疫耗竭 |
第2章 材料和方法 |
2.1 研究对象 |
2.1.1 研究对象组成 |
2.2 主要仪器 |
2.3 主要试剂 |
2.4 实验方法 |
第一部分:布鲁氏菌病患者Th淋巴细胞亚群及相关因子免疫动态分析 |
2.4.1 样本采集 |
2.4.2 外周血单个核细胞(PBMC)分离制备 |
2.4.3 流式细胞术测定Th细胞亚群 |
2.4.4 微量样本多指标流式蛋白定量技术(Cytometric Bead Array,CBA)检测血清IFN-g、IL-17、TNF-α细胞因子水平 |
2.4.5 酶联免疫吸附试验(ELISA)方法测样本血清中IL-22 的浓度 |
第二部分:布病患者T淋巴细胞、单核细胞(MO cells)和自然杀伤细胞(NK cells)转录组表达和免疫细胞相互作用的分析 |
2.4.6 实时定量聚合酶链反应(q PCR)检测 |
2.4.7 RNA测序(RNA-seq)及差异基因表达分析 |
2.5 统计学方法 |
第3章 研究结果 |
第一部分:布鲁氏菌病患者Th淋巴细胞亚群及相关因子、趋化因子受体的免疫动态分析 |
3.1 布病患者的一般情况和临床资料 |
3.1.1 布病患者组和健康对照组的一般情况 |
3.1.2 布病患者组和健康对照组的临床资料 |
3.2 布病患者外周血Th1,Th17,Th22淋巴细胞亚群的表达情况 |
3.2.1 布病患者外周血各淋巴细胞亚群的表达 |
3.2.2 布病患者组与健康对照组外周血各淋巴细胞亚群表达情况的差异 |
3.2.3 布病患者治疗前和治疗后外周血淋巴细胞亚群表达频率的变化趋势 |
3.2.4 Th1、Th17和Th22淋巴细胞亚群分布的相关性 |
3.2.5 非重症组、重症组患者与健康对照组外周血淋巴细胞亚群表达频率的差异 |
3.2.6 根据布病患者靶器官损伤情况,分析Th1、Th17和Th22淋巴细胞亚群的分布 |
3.2.7 小结 |
3.3 布病患者外周血细胞因子IFN-g、IL-17A和IL-22水平,以及其与临床指标的相关性分析 |
3.3.1 布病患者外周血细胞因子IFN-g、IL-17A和IL-22水平 |
3.3.2 布病患者组与健康对照组外周血清中细胞因子IL-10水平的差异 |
3.3.3 布病患者外周血细胞因子水平与临床指标的相关性 |
3.3.4 小结 |
3.4 布病患者外周血Th1、Th17、Th22细胞亚群的相关趋化因子及受体表达情况 |
3.4.1 布病患者Th1细胞亚群中趋化因子受体CXCR3的表达水平 |
3.4.2 布病患者组Th17细胞亚群中趋化因子受体CCR4、CCR6的表达水平 |
3.4.3 布病患者组Th22细胞亚群中趋化因子受体CCR4、CCR6和CCR10的表达水平 |
3.4.4 布病患者治疗前和治疗后外周血Th淋巴细胞亚群中趋化因子受体表达的变化趋势 |
3.4.5 根据细胞表面表达的趋化因子受体水平重新定义Th细胞亚群,验证各Th细胞亚群分布情况 |
3.4.6 Th1细胞亚群与Th2细胞亚群失衡 |
3.4.7 小结 |
第二部分:布病患者T淋巴细胞、单核细胞(MO cells)和自然杀伤细胞(NK cells)转录组表达和免疫细胞相互作用的分析 |
3.5 布病患者T淋巴细胞、单核细胞(MO cells)和自然杀伤细胞(NKcells)转录组表达谱的检测 |
3.5.1 mRNA的质量检测与控制 |
3.5.2 基因表达数据的筛选和质控 |
3.5.3 基因表达定量分析 |
3.5.4 差异表达基因分析 |
3.5.5 qPCR验证差异表达基因 |
3.5.6 布病患者T细胞和MO细胞差异表达基因相关性分析 |
3.5.7 小结 |
第4章 结论与创新点 |
4.1 结论 |
4.2 创新点 |
参考文献 |
附录 |
附件1 纳入布病患者确诊标准 |
附件2 患者靶器官损伤及分组情况 |
作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
致谢 |
(9)猪流行性腹泻病毒诱导派伊尔结内T细胞依赖性IgA+B细胞分化的机制研究(论文提纲范文)
摘要 |
abstract |
第一章 绪论 |
1.1 肠道黏膜免疫 |
1.1.1 黏膜免疫与分泌型IgA |
1.1.2 肠道相关淋巴组织与IgA应答 |
1.2 肠道IgA~+B细胞的免疫应答机制 |
1.2.1 IgA~+B细胞的产生机制 |
1.2.2 T细胞依赖与T细胞非依赖性IgA产生机制 |
1.2.3 TGF-β与 IgA免疫应答 |
1.2.4 IL-21与IgA免疫应答 |
1.3 滤泡辅助性T细胞 |
1.3.1 滤泡辅助性T细胞特征描述 |
1.3.2 滤泡辅助性T细胞的分化 |
1.3.3 滤泡辅助性T细胞与B细胞的相互作用 |
1.4 猪流行性腹泻与肠道黏膜免疫 |
1.4.1 猪流行性腹泻 |
1.4.2 猪肠道黏膜免疫 |
1.4.3 猪流行性腹泻与黏膜免疫 |
1.5 研究目的和意义 |
第二章 猪流行性腹泻病毒可诱导肠道IgA的产生 |
2.1 材料 |
2.1.1 实验动物 |
2.1.2 细胞株和病毒株 |
2.1.3 主要试剂及溶液配制 |
2.1.4 主要仪器及设备 |
2.2 方法 |
2.2.1 动物分组,感染及剖杀 |
2.2.2 肛拭子中PEDV拷贝数的检测 |
2.2.3 血清及肠道内容物中PEDV抗体水平的检测 |
2.2.4 淋巴细胞的分离和培养 |
2.2.5 荧光定量PCR |
2.3 结果 |
2.3.1 猪只通过口服途径感染了PEDV |
2.3.2 PEDV诱导了血清中抗体的产生 |
2.3.3 PEDV诱导了肠道中IgA抗体的产生 |
2.3.4 PEDV再刺激促进猪淋巴细胞中IL-21 的表达 |
2.4 讨论 |
第三章 猪IgA类别转换关键标志物PCR方法的建立 |
3.1 材料 |
3.1.1 实验动物 |
3.1.2 主要试剂 |
3.1.3 主要仪器设备 |
3.2 方法 |
3.2.1 猪GLTα,PSTα及 CTα引物设计与合成 |
3.2.2 PP结及肠系膜淋巴结RNA提取 |
3.2.3 cDNA样品的制备 |
3.2.4 猪GLTα,PSTα及 CTα的扩增 |
3.2.5 猪GLTα,PSTα及 CTα扩增产物的测序 |
3.2.6 猪GLTα、PSTα及 CTα扩增条件的优化 |
3.2.7 猪GLTα、PSTα及 CTα扩增方法的重复性验证 |
3.3 结果 |
3.3.1 猪GLTα、PSTα和 CTα转录本的PCR扩增结果 |
3.3.2 猪GLTα、PSTα和 CTα扩增产物的序列分析 |
3.3.3 猪GLTα、PSTα和 CTα扩增条件的优化 |
3.3.4 猪GLTα、PSTα和 CTα扩增方法具有良好的稳定性 |
3.4 讨论 |
第四章 IL-21 促进猪PP结内IgA产生的机制研究 |
4.1 材料 |
4.1.1 主要试剂及溶液配制 |
4.1.2 主要仪器及设备 |
4.2 方法 |
4.2.1 IgM+B淋巴细胞的分离 |
4.2.2 IgM+B淋巴细胞比例检测 |
4.2.3 IgM+B淋巴细胞的培养 |
4.2.4 细胞培养上清中IgA/IgM抗体含量的测定 |
4.2.5 细胞增殖试验 |
4.2.6 细胞凋亡试验 |
4.2.7 细胞GLTα、PSTα和 CTα表达量的检测 |
4.2.8 荧光定量PCR |
4.2.9 蛋白免疫印迹试验(Western-blotting) |
4.3 结果 |
4.3.1 IgM+B淋巴细胞的分离和纯度鉴定 |
4.3.2 IL-21 促进猪PP结和MLN中 IgM+B 细胞产生IgA |
4.3.3 IL-21 促进IgM+B 淋巴细胞的增殖 |
4.3.4 IL-21 抑制IgM+B 细胞的凋亡 |
4.3.5 IL-21 诱导IgM+B 淋巴细胞发生IgA类别转换 |
4.3.6 IL-21 促进猪脾脏B细胞内IgA的产生及IgA类别转换 |
4.3.7 IL-21 促进PP结 IgM+B 细胞分化为浆细胞 |
4.3.8 IL-21 激活B细胞中JAK-STAT信号通路 |
4.3.9 Solcitinib和 Fludarabine可以有效抑制JAK-STAT信号通路 |
4.3.10 JAK-STAT信号通路参与了B细胞的IgA类别转换 |
4.4 讨论 |
第五章 猪PP结内IL-21的来源分析 |
5.1 材料 |
5.1.1 主要抗体 |
5.1.2 主要仪器与设备 |
5.2 方法 |
5.2.1 猪CXCR5基因的克隆,测序及序列分析 |
5.2.2 兔抗猪CXCR5多克隆抗体的制备 |
5.2.3 兔抗猪CXCR5多克隆抗体的反应性和特异性验证 |
5.2.4 猪CXCR5在各类型淋巴细胞表面的分布 |
5.2.5 猪PP结各类Th细胞的分选 |
5.3 结果 |
5.3.1 猪CXCR5基因的克隆及序列分析 |
5.3.2 猪CXCR5跨膜情况预测结果 |
5.3.3 兔抗猪CXCR5多克隆抗体具有良好的的反应性和特异性 |
5.3.4 猪CXCR5主要表达在B淋巴细胞表面 |
5.3.5 猪Tfh细胞是PP结内产IL-21 的主要Th细胞类型 |
5.4 讨论 |
第六章 全文结论 |
参考文献 |
附录 A |
附录 B |
致谢 |
作者简介 |
(10)肺瘤平膏及其有效组分通过调控脂质代谢逆转肿瘤相关树突状细胞功能的机制研究(论文提纲范文)
摘要 |
ABSTRACT |
英文缩略词 |
第一部分: 文献综述 |
综述一: 中医药调节肿瘤免疫应答防治肿瘤的研究进展 |
1 先天性免疫调节 |
2 适应性免疫调节 |
3 小结 |
参考文献 |
综述二: 树突状细胞在肿瘤免疫和免疫治疗中的作用 |
1 树突状细胞亚群分类 |
2 肿瘤免疫中树突状细胞功能 |
3 肿瘤对树突状细胞功能的调节作用 |
4 肿瘤治疗中的树突状细胞功能 |
5 基于树突状细胞的肿瘤免疫疗法 |
6 抗肿瘤树突状细胞疫苗 |
7 小结 |
参考文献 |
综述三: 桔梗皂苷D的抗肿瘤作用机制研究进展 |
1 调控肿瘤细胞凋亡途径 |
2 调控肿瘤细胞自噬 |
3 调控肿瘤细胞增殖 |
4 抑制血管生成 |
5 抑制肿瘤的侵袭和转移 |
6 体内抗肿瘤调控 |
7 免疫调节及降脂活性 |
8 小结 |
参考文献 |
第二部分 实验研究 |
前言 |
实验一: 肿瘤相关树突状细胞的诱导培养 |
1 材料 |
2 实验方法 |
3 结果 |
4 讨论 |
实验二: 肺瘤平膏含药血清对肿瘤相关树突状脂质及功能的调节作用 |
1 材料 |
2 实验方法 |
3 结果 |
4 讨论 |
实验三: 毒胡萝卜素激活内质网应激对肿瘤相关树突状细胞中脂质含量和功能的影响 |
1 材料 |
2 实验方法 |
3 结果 |
4 讨论 |
实验四: 肺瘤平膏含药血清逆转毒胡萝卜素激活内质网应激对TDCs脂质及功能的影响 |
1 材料 |
2 实验方法 |
3 结果 |
4 讨论 |
实验五: 肺瘤平膏含药血清对肿瘤相关树突状细胞BiP-IRE1α-XBP1通路和PI3K-AKT-mTOR通路的影响 |
1 材料 |
2 实验方法 |
3 结果 |
4 讨论 |
实验六: 桔梗皂苷D对树突状细胞毒性和肿瘤细胞杀伤能力的研究 |
1 材料 |
2 实验方法 |
3 结果 |
4 讨论 |
实验七: 桔梗皂苷D对肿瘤相关树突状细胞脂质含量及功能的调节作用 |
1 材料 |
2 实验方法 |
3 结果 |
4 讨论 |
实验八: 桔梗皂苷D逆转毒胡萝卜素激活内质网应激对TDCs脂质含量和功能的影响 |
1 材料 |
2 实验方法 |
3 结果 |
4 讨论 |
实验九: 桔梗皂苷D对肿瘤相关树突状细胞BiP-IRE1α-XBP1通路和PI3K-AKT-mTOR通路的影响 |
1 材料 |
2 实验方法 |
3 结果 |
4 讨论 |
结语 |
致谢 |
个人简历 |
参考文献 |
附件 |
四、Th细胞的活化与树突状细胞(论文参考文献)
- [1]低氧影响小鼠实验性结肠炎发生发展的免疫学机制研究[D]. 纪巧荣. 青海大学, 2021(01)
- [2]调节性B细胞亚群与系统性红斑狼疮发病的关系及其机制研究[D]. 叶壮. 吉林大学, 2021(01)
- [3]四神丸调控树突状细胞活化治疗脾肾阳虚型结肠炎的作用机制研究[D]. 刘素萍. 江西中医药大学, 2021(01)
- [4]Th17细胞、Treg细胞及Breg细胞在儿童免疫性血小板减少症发病机制中的研究[D]. 闫彦睿. 新乡医学院, 2021(01)
- [5]转化生长因子-β2反义寡核苷酸的微生物疫苗及肿瘤疫苗的佐剂作用[D]. 涂丽裙. 吉林大学, 2020(03)
- [6]早期肺腺癌快速复发的基因芯片及免疫组库研究[D]. 刘杰. 中国人民解放军陆军军医大学, 2020(07)
- [7]树突状细胞NLRP3炎症小体及免疫失衡在急性髓系白血病作用和机制研究[D]. 刘芹芹. 山东大学, 2020(04)
- [8]布鲁氏菌病患者Th淋巴细胞亚群的免疫动态评估及抑制性受体对免疫功能的影响分析[D]. 徐光. 吉林大学, 2020(01)
- [9]猪流行性腹泻病毒诱导派伊尔结内T细胞依赖性IgA+B细胞分化的机制研究[D]. 刘果. 中国农业科学院, 2020(01)
- [10]肺瘤平膏及其有效组分通过调控脂质代谢逆转肿瘤相关树突状细胞功能的机制研究[D]. 张曦文. 中国中医科学院, 2020(01)
标签:树突状细胞论文; 白血病论文; 急性淋巴细胞性白血病论文; 细胞免疫论文; 细胞分化论文;