一、凝血酶诱导人类胚胎血管平滑肌细胞明胶酶分泌及活化（论文文献综述）
郑腾飞[1]（2021）在《DKK1在机械牵张力调节血管平滑肌细胞功能和血管重构中的作用及机制研究》文中进行了进一步梳理1 研究背景病理性的机械牵张力可导致心脏和血管重构,包括心肌肥大、心肌纤维化、心力衰竭、血管壁增厚和硬化以及动脉粥样硬化（atherosclerosis,AS）。血管中膜的血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells,VSMCs）在维持血管稳态中发挥重要作用,主要受到牵张力调控。病理性牵张力可以促使VSMCs从收缩表型向合成表型转换,表现为细胞增殖和迁移活性增强,收缩能力减弱以及细胞外基质分泌增加。然而,牵张力调节VSMCs功能的分子机制仍有待进一步阐明。机械牵张力调控平滑肌细胞基因表达及细胞功能需要将机械力转换为细胞内部信号,这个过程需要位于细胞膜表面及细胞内部的分子和细胞结构的介导。既往研究表明,初级纤毛、整合素、离子通道、钙黏蛋白以及近年报道的细胞核膜蛋白等参与了力学刺激向平滑肌细胞内部的信号转导。其中研究较为深入的是整合素家族,整合素β3亚基可介导病理性牵张力促平滑肌细胞增殖和表型转换的作用。Dickkopf-1（DKK1）是一种分泌型糖蛋白,是Dickkopf家族中最早被发现的成员。DKK1的经典作用是可阻断经典Wnt通路。除此之外,DKK1还可调控非β-连环蛋白（β-catenin）依赖的Wnt通路。另一方面,DKK1还可以结合细胞膜上的细胞骨架关联蛋白4（CKAP4）,激活PI3K/AKT通路发挥生物学作用。DKK1早期在肿瘤中研究得比较深入,目前已经有多项临床试验研究以DKK1作为肿瘤的治疗靶点。近年研究也证明DKK1在心血管疾病发生发展中发挥重要作用。DKK1参与动脉粥硬化发生发展的研究较为明确,本课题组既往研究发现DKK1介导病理性剪切力导致的AS。但其是否参与其他类型的血管重构及其可能机制研究相对较少,DKK1是否介导病理性牵张力导致的血管重构尚无报道。进一步揭示DKK1在心血管疾病发展中的作用及机制,对于研发和应用DKK1相关的抗肿瘤和心血管疾病的药物以及防治肿瘤治疗带来的心血管损害具有重要意义。2 研究目的（1）明确不同机械牵张力对血管平滑肌细胞DKK1表达的调控作用;（2）探讨DKK1在病理性牵张导致的血管重构中的作用。3 研究方法3.1 小鼠腹主动脉缩窄（AAC）模型的构建使用手术缝线在肾动脉以上水平部分结扎小鼠腹主动脉以构建病理性牵张力刺激的动物模型。3.2 构建平滑肌细胞特异性DKK1敲除小鼠将Dkk1flox/flox小鼠与SM22-Cre小鼠交配,F1代互相杂交得到Dkk1flox/floxSM22-Cre+小鼠,即为平滑肌细胞特异性DKK1敲除小鼠。该小鼠被命名为Dkk1SMKO小鼠。3.3 心率和血压测量小鼠的基线心率和血压使用自动血压分析系统通过鼠尾袖带法测量。AAC手术组和假手术组小鼠的血压用插入左颈动脉的Millar导管测量。3.4 超声心动图评价小鼠心功能使用Vevo 2100成像系统对小鼠进行超声心动图检查。异氟醚妥善麻醉后测量小鼠左心室分数缩短率（FS,%）和射血分数（EF,%）以评价收缩心脏功能,通过组织多普勒超声测量E/E’评价舒张功能。3.5 动物取材及病理组织学检测小鼠麻醉后心尖取血,分离血清,检测DKK1水平。取材小鼠心脏和主动脉全长。小鼠胸主动脉及心脏固定后石蜡包埋切片后行HE染色观察形态,免疫荧光染色检测小鼠胸主动脉及冠脉中DKK1、PCNA、α-SMA表达水平。3.6 蛋白质印迹法（Western Blot,WB）组织或HASMCs裂解后提取总蛋白,BCA法测定蛋白浓度后加入5×上样缓冲液,煮沸变性。按照蛋白总量10μg/孔上样,凝胶电泳后,应用电转法将蛋白转印到膜上。膜经过封闭后孵育一抗4℃过夜,次日充分洗膜3次,在室温下孵育二抗1小时。应用化学发光法检测蛋白信号,拍照,分析条带灰度值。3.7 平滑肌细胞培养原代人主动脉平滑肌细胞（HASMCs）使用SMCM培养基培养,选取4-6代进行细胞实验。采用组织贴块法提取小鼠原代主动脉平滑肌细胞,使用含10%血清的DMEM培养基培养,选用4-6代细胞进行实验。3.8 体外牵张力刺激使细胞生长于包被有Ⅰ型鼠尾胶原的Bioflex板底部,加载于FX5000-Tension系统中对细胞施加周期性机械牵张力刺激。生理性牵张力刺激:5%延伸幅度,1Hz（60次/分钟）;病理性牵张力刺激:18%延伸幅度,1Hz（60次/分钟）。3.9 小干扰RNA与转染利用lipo2000转染目的基因的siRNA和对照siRNA,依照实验分组给予刺激,转染48h后进行下一步实验。3.10 EdU细胞增殖实验按照试剂盒说明书操作,细胞上清中加入10μM的EdU溶液,孵育6小时后固定细胞,经通透化处理后加入配好的Apollo染色液避光染色30分钟,充分洗涤后,复染细胞核。荧光显微镜下观察、拍照。3.11 CCK-8细胞增殖实验细胞上清中加入CCK-8溶液,细胞培养箱内孵育2-3小时,随时观察上清颜色变化,使用酶标仪在450nm波长测定吸光度。3.12细胞周期检测使用细胞周期检测试剂盒检测细胞周期。将HASMCs用胰酶消化,离心并用预冷PBS洗涤细胞1次,使用预冷的70%乙醇在4℃下固定过夜。然后用PBS洗涤细胞两次,加入碘化丙啶在37℃下避光染色30分钟。过滤细胞并在流式细胞仪的FL2通道中进行分析。3.13 Transwell细胞迁移实验使用具有8μm孔径的24孔插件进行Transwell实验。上室中加入200μl含有2×104个VSMCs的无血清SMCM,下室中加入600μl的含10%血清的SMCM。6小时后,将穿透至膜底的细胞固定,用结晶紫染色,并在显微镜下拍照。3.14 ELISA细胞上清和小鼠血清应用人和小鼠DKK1的ELISA试剂盒检测DKK1浓度。3.15 统计分析数据以均数±标准误表示,以Prism 6软件行数据统计分析。所有数据经过正态性检验,符合正态分布的使用非配对t检验分析两样本间差异,单因素方差分析和双因素方差分析检测多个样本间差异,然后进行Turkey事后检验。不符合正态分布的使用非参数检验。P<0.05为有显着统计学差异。4 研究结果4.1 AAC术后小鼠动脉平滑肌细胞中的DKK1表达增加AAC小鼠的收缩压（SBP）和舒张压（DBP）明显高于假手术对照组。免疫荧光实验结果显示,与假手术对照组相比,AAC小鼠术后1周胸主动脉和冠状动脉的中膜中检测到DKK1蛋白水平显着增加。胸主动脉组织蛋白行Western blot分析显示,AAC小鼠中DKK1的相对蛋白表达水平明显增加。4.2 平滑肌细胞特异性DKK1敲除小鼠构建及验证荧光双标检测到动脉中膜平滑肌DKK1敲除效率满意。分别提取对照和Dkk1SMKO主动脉组织蛋白和原代主动脉平滑肌细胞,经Western blot分析显示DKK1敲除效果良好。Dkk1SMKO与对照组小鼠在体重、血压、心率方面均无显着差异。4.3 平滑肌细胞特异性敲除DKK1改善AAC导致的血管重构将Dkk1SMKO小鼠与同窝生Dkk1flox/flox对照小鼠构建AAC模型,并设置假手术对照。术后3周取材,石蜡切片HE染色显示与Dkk1flox/flox对照小鼠相比Dkk1SMKO小鼠AAC术后3周胸主动脉和冠状动脉动脉中膜增厚明显减轻（P<0.05）。与Dkk1flox/flox对照小鼠相比,Dkk1SMKO小鼠AAC术后3周胸主动脉和冠脉中PCNA表达量明显减少,α-SMA表达量明显增高（P<0.05）。平滑肌细胞特异性敲除DKK1对AAC术导致的小鼠心脏增大和心功能改变没有明显影响。4.4病理性牵张力刺激促进平滑肌细胞中DKK1表达用病理性牵张力（18%）处理HASMCs不同持续时间（0、3、6、12或24小时）,HASMCs和细胞上清液都表现出DKK1蛋白水平的时间依赖性增加,并在6小时差异到达统计学意义,而在5%循环拉伸下HASMCs的DKK1蛋白水平无明显变化。静止、生理性（5%）或病理性牵张力（18%）处理HASMCs持续6小时,DKK1的蛋白水平在病理性牵张力处理的细胞中显着升高（P<0.05）。后续研究DKK1表达变化实验选择6小时作为机械牵张力刺激持续时间。4.5 整合素亚基β3介导机械拉伸对DKK1的调节Western blot、ELISA和RT-qPCR分析表明,在病理性牵张力刺激下,用siRNA干扰整合素亚基β3（ITGB3）表达。与对照组相比,干扰ITGB3表达组的DKK1蛋白水平、mRNA水平和分泌水平均明显下调（P<0.05）。4.6 DKK1介导病理性牵张力刺激调控平滑肌细胞功能在HASMCs转染DKK1 siRNA或对照siRNA后,用生理性或病理性牵张力刺激HASMCs 24hr。EdU和CCK-8实验表明,18%的牵张力刺激显着促进了HASMCs的增殖,而干扰DKK1表达可部分逆转这一作用（P<0.05）。细胞周期分析发现,干扰DKK1表达使G0-G1期细胞明显增加,S期细胞明显减少（P<0.05）。同样,Transwell测定结果显示,DKK1 siRNA组迁移到下腔的细胞数量明显低于对照组（P<0.05）。提取细胞全蛋白行Western blot分析显示,与生理性牵张力处理相比,病理性牵张力上调了 PCNA的蛋白水平,下调了 α-SMA的蛋白水平（P<0.05）,干扰DKK1的表达可部分逆转这一作用。给予HASMCs外源性重组DKK1刺激促进了细胞的增殖和迁移,促进了 PCNA的表达,抑制了 α-SMA的表达（P<0.05）。5结论（1）人血管平滑肌细胞中DKK1表达受机械牵张力调控,病理性牵张力促进平滑肌细胞DKK1表达;（2）DKK1介导了机械牵张力调控血管平滑肌细胞的增殖和迁移功能;（3）平滑肌细胞敲除DKK1可减轻病理性牵张力导致的动脉中膜增厚,降低中膜平滑肌细胞增殖,改善中膜平滑肌细胞收缩表型的异常。1 研究背景Dickkopf-1（DKK1）蛋白,是一种分泌性糖蛋白。它最为人们熟知的作用是与Wnt分子竞争受体LRP5/6以及促进LRP5/6内吞降解进而拮抗经典Wnt/β-catenin通路。DKK1还能通过调控一些非β-catenin依赖的途径影影响细胞增殖、迁移、凋亡及炎症反应,如非经典Wnt通路等。DKK1还可与CKAP4结合,激活PI3K/AKT通路,促进肿瘤细胞增殖。因其在多种病理过程中的重要作用,DKK1成为一种有前景的药物开发靶点。在心血管疾病中,DKK1同样扮演重要角色,在内皮细胞功能失调以及动脉粥样硬化当中的作用已经得到证实。但是DKK1在平滑肌细胞功能失调和其他类型的血管重构中的作用仍有待研究。更加详细地阐明DKK1在心血管疾病中的作用及其机制对于指导靶向DKK1药物的开发和应用具有重要意义。在本研究第一部分,我们发现,敲除小鼠平滑肌中的DKK1可明显抑制病理牵张力所导致的血管重构。体外研究同样证实,干扰DKK1的表达可以显着抑制病理性牵张力导致的平滑肌细胞功能失调,包括增殖、迁移活性的增加以及收缩表型标记物的降低。然而,DKK1通过怎样的途径介导了机械牵张力调控平滑肌细胞的功能尚需进一步探讨。2研究目的（1）确定参与DKK1调控血管平滑肌功能的下游靶标;（2）揭示DKK1调控该靶标的信号通路和分子机制。3 研究方法3.1 细胞培养原代人主动脉平滑肌细胞（HASMCs）使用SMCM培养基培养,选取4-6代进行细胞实验。293T细胞和原代小鼠主动脉平滑肌细胞在DMEM培养基中培养。3.2 质粒构建与转染分别构建含有野生型UHRF1启动子区、突变型UHRF1启动子区的萤光素酶报告基因质粒（pGL3）:UHRF1-WT和UHRF1-MUT。构建PCDNA3.1-YAP过表达质粒质粒,空白载体质粒PCDNA3.1。质粒使用Lipofectamine3000转染试剂进行瞬时转染。3.3 小干扰RNA与转染利用lipo2000转染目的siRNA和对照siRNA,依照实验分组给予刺激,转染48h后进行下一步实验。3.4 实时定量 PCR（RT-qPCR）用试剂盒提取细胞的总RNA,反转录为cDNA后,使用SYBR Green进行RT-qPCR。采用2-ΔΔCT方法测定相对基因表达。CT值以甘油醛酸-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）为对照进行归一化。3.5 体外牵张刺激使细胞生长于包被有Ⅰ型鼠尾胶原的Bioflex板底部,于FX5000-Tension系统中对细胞施加牵张力刺激。生理性牵张刺激:1Hz（60个循环/分钟）,5%elongation;病理性牵张刺激:1Hz（60个循环/分钟）,18%elongation。3.6 EdU细胞增殖实验按照试剂盒说明书操作,细胞上清中加入10μM的EdU溶液,孵育6小时后固定细胞,经通透化处理后加入配好的Apollo染色液避光染色30分钟,充分洗涤后,使用Hoechst 33342染核,荧光显微镜下观察拍照。3.7 CCK-8细胞增殖实验细胞上清中加入CCK-8溶液,细胞培养箱内孵育2-3小时,待出现明显颜色变化后,在450nm波长处测定吸光度。3.8 Transwell 细胞迁移实验使用具有8μm孔径的24孔插件进行Transwell实验。将含有10%FBS的600μl SMCM培养基加入Transwell小室的下室,上室中加入200ul含有2×104个VSMCs无FBS的SMCM培养基加入上室。6小时后,将穿透至膜底的细胞固定,用结晶紫染色,并在显微镜下拍照。3.9 组织学检测新鲜组织在4%多聚甲醛中固定,石蜡包埋,切片。石蜡切片脱蜡至水。用免疫荧光染色法检测小鼠胸主动脉和冠状动脉中YAP的表达水平,用免疫组化染色法检测UHRF1的表达水平。3.10 蛋白质印迹法（Western Blot,WB）组织或HASMCs裂解后提取总蛋白,BCA法测定蛋白浓度后加入5×上样缓冲液,煮沸变性。按照蛋白总量10μg/孔上样,凝胶电泳后,应用电转法将蛋白转印到膜上。膜经过封闭后孵育一抗4℃过夜,次日充分洗膜3次,在室温下孵育二抗1小时。应用化学发光法检测蛋白信号,拍照,分析条带灰度值。3.11染色质免疫沉淀法用1%甲醛交联HASMCs,然后加入125mM甘氨酸。洗涤后,将细胞收集在离心管中,超声处理,用正常IgG、抗组蛋白H3、抗TEAD1和抗TEAD4抗体免疫沉淀,4℃过夜。洗脱和解交联后纯化DNA,并用覆盖UHRF1启动子特定区域的引物进行PCR分析。3.12萤光素酶报告基因检测将Renilla报告基因下游的野生型和突变型UHRF1-启动子克隆到PGL-3质粒中,并使用Lipofectamine 3000转染到YAP1过表达的293T细胞和对照293T细胞中。转染48小时后用双萤光素酶报告试剂盒分析荧光素酶活性。3.13统计分析数据以均数±标准误表示,以Prism 6软件行数据统计分析。所有数据经过正态性检验,符合正态分布的使用非配对t检验分析两样本间差异,单因素方差分析和双因素方差分析检测多个样本间差异,然后进行Turkey事后检验。不符合正态分布的使用非参数检验。P<0.05为有显着统计学差异。4研究结果4.1经典Wnt通路不参与DKK1在VSMCs中的作用用FH535对HASMCs进行预处理,不影响DKK1-siRNA转染导致的PCNA表达下调和α-SMA表达上调。EdU实验、CCK-8实验和Transwell实验也表明,用FH535预处理HASMCs不影响DKK1-siRNA转染导致的HASMCs细胞增殖和细胞迁移能力的下调。4.2 UHRF1的表达受DKK1调控UHRF1的蛋白水平在病理性牵张刺激下显着增加,而在生理性牵张刺激下无明显变化。在病理性牵张刺激下,通过转染siRNA干扰DKK1的表达后,UHRF1的mRNA和蛋白水平显着下调。此外,rhDKK1刺激显着增加HASMCs中UHRF1的表达。免疫组化和Western印迹分析显示,AAC增加了主动脉和冠状动脉中膜中UHRF1的表达,这种变化在Dkk1SMKO小鼠中明显减弱（P<0.05）。提取对照小鼠和Dkk1SMKO小鼠主动脉平滑肌细胞,体外培养后提取细胞全蛋白,发现敲除DKK1的小鼠主动脉平滑肌细胞中UHRF1蛋白水平显着降低。4.3 UHRF1介导了DKK1对HASMCs增殖和迁移功能的作用用siRNA干扰UHRF1 48小时后给予HASMCs以rhDKK1刺激的同时分别施加生理性牵张（5%）、病理性牵张（18%）刺激24小时。结果发现干扰UHRF1表达显着减弱了在rhDKK1刺激的HASMCs中观察到的细胞增殖和迁移的增加（P<0.05）。Western blot分析表明,干扰UHRF1表达后PCNA的蛋白水平明显下降,α-SMA的蛋白水平上升。4.4 DKK1 通过 YAP/TEAD 途径调控 UHRF1Western blot分析表明,病理性牵张减少了 YAP在Ser127处的磷酸化,干扰DKK1表达后,YAP的磷酸化增强（P<0.05）。用rhDKK1处理后,HASMCs中YAP在Ser127处的磷酸化也减少（P<0.05）。此外,免疫荧光结果证实DKK1敲除后明显降低了核YAP的定位。当用维替泊芬（VP）破坏YAP-TEAD的相互作用或用小干扰RNA干扰YAP在HASMCs中表达时,UHRF1的mRNA和蛋白水平明显下降（P<0.05）。Western blot分析显示,与假手术的小鼠主动脉相比,AAC小鼠主动脉表现出更高的YAP蛋白水平,敲除DKK1可以降低AAC诱导的YAP上调（P<0.05）。免疫荧光显示AAC增加了血管平滑肌细胞核中YAP阳性的比例。而在Dkk1SMKO小鼠中,这一比例显着降低。VP处理显着逆转了rhDKK1在HASMCs中的作用,导致HASMCs中UHRF1和PCNA表达减少,α-SMA表达增加。4.5 YAP/TEAD通路调控UHRF1表达的分子机制通过使用JASPAR数据库预测到TEAD蛋白家族成员可直接与UHRF1启动子区域结合。干扰TEAD1和TEAD4的表达,UHRF1 mRNA明显下调（P<0.05）。当同时敲除TEAD1和TEAD4时,UHRF1蛋白的减少比单独的siRNA处理更加明显（P<0.05）。此外,染色质免疫共沉淀（ChIP）实验表明,在UHRF1基因ATG上游275 bp和229 bp之间检测到TEAD1和TEAD4的富集。双萤光素酶实验数据证实,YAP过表达可显着激活野生型UHRF1启动子萤光素酶活性,而干扰TEAD1和TEAD4的表达可抑制这种激活（P<0.05）;YAP过表达可显着激活野生型UHRF1启动子萤光素酶活性,但不能激活结合位点突变的UHRF1启动子萤光素酶活性（P<0.05）。5结论（1）UHRF1参与DKK1对平滑肌细胞增殖和迁移功能的调控;（2）在机械牵张力刺激下,DKK1通过YAP/TEAD通路平滑肌细胞调控UHRF1的表达。
胡继盛[2]（2021）在《WDR1在血管平滑肌细胞中参与血管损伤后重构过程的作用研究》文中研究表明背景血管的损伤后重构在临床上是常见的血管病理生理学过程,然而该过程往往导致预后不良,比如动脉管腔狭窄,动脉移植后增生,介入手术后血管内膜增生等。血管损伤重构过程不能及时处理,这将间接性的导致心血管疾病以及心血管相关的他并发症的发生。常见的并发症有动脉粥样硬化,心肌梗塞,脑梗塞等。大量的低密度脂蛋白（low-density lipoproteins,LDL）逐渐积累到受损的血管内皮下空间中,被血管壁中的巨噬细胞和平滑肌细胞（Smooth muscle cells,SMCs）摄取,摄取了脂质的巨噬细胞和平滑肌细胞形成泡沫细胞并逐渐演变成动脉粥样硬化。由脂质介导的炎症诱导了平滑肌细胞的大量增殖并且迁移到血管内膜。血管平滑肌细胞（Vascular smooth muscle cells,VSMCs）是血管壁的主要细胞组成部分,在血管受到外力、炎症等刺激后,位于血管中层的平滑肌细胞快速的发生表型转换、增殖,然后向血管内膜迁移,导致内膜增生,这就是新生内膜的形成过程,但是该过程的分子机制仍不清楚。前人的研究表明,VSMCs的增殖和迁移在血管内膜形成过程中有着至关重要的作用。肌动蛋白细胞骨架作为细胞的支撑基础,参与了众多的细胞生物学过程,比如细胞运动,表型转换,细胞的增殖和迁移等。细胞骨架的重构决定着细胞的运动,增殖等一系列的生物学过程。由于聚合的肌动蛋白相对稳定,因此需要特定的肌动蛋白调节蛋白来辅助,并促进肌动蛋白丝的分解。肌动蛋白丝解聚的生理意义不仅在于能够去除旧的肌动蛋白丝,而且解聚后形成肌动蛋白单体还可以补充用于新一轮肌动蛋白组装的肌动蛋白单体库。因此,肌动蛋白组装和解聚的平衡对于细胞骨架尤为重要。肌动蛋白解聚因子（Actin depolymerizing factor,ADF/Cofilin）通过切断肌动蛋白丝并从肌丝上解离肌动蛋白单体来促进肌动蛋白解聚。尽管ADF/Cofilin通常积聚在肌动蛋白细胞骨架动态的亚细胞区域,但是仅ADF/Cofilin单独作用,特别是高浓度时,对驱动肌动蛋白丝的快速解聚并不是十分有效。因此,当需要肌动蛋白单体快速周转时,其他的解聚因子需要与ADF/Cofilin配合来达到肌动蛋白快速解聚的效果。肌动蛋白相互作用蛋白1（Actin interacting protein 1,AIP1）,也称为WD重复结构域1（WD repeat domain 1,WDR1）,即使ADF/Cofilin被肌动蛋白丝饱和,也能强烈增强肌动蛋白丝的分解。作为ADF/Cofilin的主要辅助因子,WDR1介导的肌动蛋白动力学不仅对细胞极性的形成有着重要的调节作用,而且在细胞的增殖和迁移过程有着不可或缺的作用。前人的研究表明,VSMCs的迁移和增殖在血管形成过程中扮演着至关重要的作用,但是WDR1作为细胞骨架解聚因子的辅助因子,其在VSMCs中介导血管重构的作用机制仍不清楚。信号转导和转录激活因子3（Signal Transducer and Activator of Transcription3,STAT3）是Janus激酶/信号转导和转录激活因子（JAK/STAT）信号通路的重要因子之一,涉及到炎症以及其他各种细胞生物学过程,例如细胞分裂和细胞增殖等。前人的研究表明在血管损伤后的第七天内,磷酸化形式STAT3的水平显着升高,这表明STAT3对于血管新生内膜的形成至关重要。血管损伤后,STAT3的活化与WDR1的表达呈正相关,但是在VSMCs中,STAT3是否参与WDR1的表达调控还未可知。STAT3的激活和核转运是其发挥转录作用的前提,有研究表明STAT3的核转运是Ran和Importinβ依赖性的。细胞骨架响应于细胞微环境的改变和机械性刺激对众多的细胞生物学过程均有影响。WDR1是细胞骨架重构的重要因子之一,有报道称,在乳腺癌细胞中,Wdr1的缺失影响Importinβ的表达。综合以上几点,STAT3可能会通过促进WDR1的转录进而促进血管内膜的形成,反过来WDR1介导的肌动蛋白动力学也会影响STAT3的核贩运,WDR1-STAT3形成反馈环共同调节血管损伤后重构。目的本研究从分子、细胞、动物水平探究WDR1在血管损伤后重构中的作用机制,并阐释STAT3与WDR1之间的相互作用对血管损伤后重构过程的影响,进一步完善血管损伤后重构的分子调控网络,为临床治疗外周血管疾病提供线索。方法第二章:本研究通过颈总动脉结扎的方式构建小鼠血管损伤模型,在损伤不同天数通过颈椎脱臼法处死小鼠并按照不同实验目的取材。通过免疫组化、RT-PCR、Western blot等生物学方法检测血管损伤不同天数的血管中Wdr1的表达。同时,通过Western blot和明胶酶谱实验分别检测了增殖标志物PCNA的表达和基质金属蛋白酶9的活性。第三章:通过Cre-Loxp系统构建Wdr1条件敲除小鼠,设计引物,通过PCR鉴定小鼠基因型。腹腔注射他莫昔芬（10 mg/kg/天）诱导敲除Wdr1,利用Western blot和RT-PCR分别从蛋白质和RNA水平检测Wdr1的表达。然后通过手术损伤颈总动脉,通过HE染色检测血管内膜增厚情况。在敲降Wdr1后,利用TUNEL检测细胞的凋亡情况,同时通过免疫荧光检测p-H3和SMA的表达。通过明胶酶谱实验检测Wdr1敲除后MMP9的活性。分离小鼠原代血管平滑肌细胞,体外加入4-OH他莫昔芬诱导原代细胞中Wdr1的敲除。检测细胞敲除效率以及凋亡后,再通过CCK8和划痕实验证实WDR1对平滑肌细胞增殖和迁移的影响。第四章:过表达WDR1,通过Transwell和CCK8实验进一步证实WDR1对平滑肌细胞迁移和增殖的影响。在损伤不同天数的血管中,通过Western blot检测STAT3的激活,证实STAT3与血管损伤修复间的联系。体外通过AngⅡ和IL-6处理平滑肌细胞模拟血管损伤过程,利用划痕实验和CCK8检测AngⅡ和IL-6处理后的增殖和迁移能力。通过Western bloting和RT-PCR检测不同细胞因子处理后的Wdr1的表达。在平滑肌细胞中敲降STAT3,用AG490处理平滑肌细胞,检测WDR1的表达情况,在敲降STAT3的基础上过表达WDR1,检测细胞的增殖和迁移能力。在敲降Wdr1的基础上过表达Cofilin,免疫荧光实验、CCK8、Western blot和划痕实验证实WDR1介导的肌动蛋白动力学与平滑肌细胞增殖与迁移之间的关系。最后,通过双荧光素酶报告基因实验和染色质免疫共沉淀证实STAT3直接靶向Wdr1的启动子。第五章:敲降和过表达Wdr1后检测STAT3的表达与活化情况,探究WDR1能否对STAT3的表达和活化有影响。通过核质分离证实WDR1对STAT3的核转移的影响,Western blot、核质分离实验探究与STAT3核转移相关因子Ntf2、importinβ、Importinα、Ran的表达和核质分布情况。通过Transwell和CCK8实验验证Ntf2、Importinβ过表达对平滑肌细胞增殖和迁移的影响。结果第二章:HE结果证实颈总动脉结扎可以有效诱导血管内膜增厚,并且免疫组化实验、Western blot和RT-PCR结果显示在损伤不同天数,Wdr1的表达呈现时间依赖性升高,在损伤第14天达到峰值、并且增殖标志物PCNA的表达也是呈时间依赖性升高。明胶酶谱实验结果提示在动脉损伤后MMP9的活性显着性提高。第三章:基因型鉴定结果显示Wdr1f/f;ERT2Cre小鼠成功构建。Western blot和RT-PCR结果显示,他莫西芬注射后能够成功诱导小鼠动脉细胞中Wdr1的敲除。进一步的研究结果表明,Wdr1的敲除有效抑制血管损伤后血管新生内膜的形成。免疫荧光和明胶酶谱实验表明,在Wdr1敲除后,动脉中的细胞增殖和迁移能力被显着抑制了。TUNEL实验结果表明Wdr1的敲除不影响细胞的凋亡。分离小鼠原代血管平滑肌细胞,Western blot和RT-PCR结果显示4-OH他莫西芬诱导后Wdr1成功敲除。划痕和CCK8实验结果显示Wdr1的敲除抑制了原代平滑肌细胞的增殖和迁移。第四章:Transwell实验和CCK8实验表明,过表达Wdr1增强了HAVSMCs细胞的增殖和迁移能力。在诱导增殖的HAVSMCs和损伤的血管中,Western blot结果显示STAT3的磷酸化水平显着升高。HAVSMCs中敲降STAT3可显着性抑制其增殖和迁移,并且通过JAK2的特异性抑制剂处理HAVSMCs也能得到相同结果。双荧光素酶报告基因实验和染色质免疫共沉淀结果提示STAT3通过靶向Wdr1来促进其转录的。Western blot和免疫荧光实验结果提示,肌动蛋白动力学是WDR1介导的平滑肌细胞增殖和迁移所必需的。第五章:Western blot结果提示WDR1的缺失并不影响STAT3的表达和激活。核质分离的结果显示,WDR1缺失抑制了活化的STAT3的核转移。进一步的Western blot和核质分离结果显示WDR1的缺失抑制了Importinβ的表达和Ran的核质分布,从而抑制活化的STAT3的核转移。结论血管损伤修复是一个复杂的生物学过程,受到多种因素的影响。各种转录因子,炎症因子等共同构成一个调控网络,参与血管新生内膜的形成。本研究本研究揭示了WDR1调控血管内膜形成的分子机制,主要是STAT3调控Wdr1的表达以及WDR1缺失对STAT3核转运影响的分子机制。STAT3在血流动力学改变和炎症因子刺激的作用下大量激活并转运入核参与血管内膜形成的分子调节过程。高表达Wdr1能够显着促进VSMCs的增殖和迁移,以此来促进血管新生内膜的形成。当抑制STAT3的激活时,Wdr1的表达显着下调,同时平滑肌细胞的增殖和迁移能力显着下降、血管内膜形成也被显着抑制了。随后的荧光素酶报告基因实验和染色质免疫共沉淀实验结果表明STAT3与Wdr1基因的启动子相结合并促进Wdr1的转录。反过来,WDR1的缺失抑制了核转运因子2（nuclear transport factor 2,NTF2）和Importinβ的表达,进而影响阻碍STAT3的核转运;同时,在敲降Wdr1的平滑肌细胞中,Ran的核质比显着下降,进一步说明WDR1对于STAT3的核转运至关重要。本研究以细胞骨架解聚因子WDR1为切入点,重点阐明了WDR1影响血管新生内膜形成的分子机制,为研究血管内膜增生发生发展的机制提供了新的见解,为临床上治疗术后血管内膜增生提供了线索。
阳帆[3]（2020）在《紫花牡荆素抑制胃癌细胞迁移与侵袭的机制研究》文中指出目的:紫花牡荆素能抑制多种肿瘤细胞的增殖,本研究旨在研究其对胃癌细胞迁移与侵袭的影响,并探讨其分子机制,从而为紫花牡荆素的抗肿瘤机制提供依据。方法:1)Casticin对胃癌细胞的影响体外培养AGS和NCI-N87细胞,加入不同浓度Casticin后进行CCK-8、克隆形成实验;Transwell小室及划痕实验检测细胞的侵袭能力及迁移能力;流式细胞仪、DAPI染色法检测细胞周期及细胞凋亡。qRT-PCR、WB检测MMP-2、9的表达,明胶酶谱检测其活性。2)Casticin抑制胃癌细胞迁移、侵袭的分子机制研究紫花牡荆素处理AGS和NCI-N87细胞后,qRT-PCR和WB检测其对RECK表达的影响,BSP实验检测Casticin对RECK甲基化状态的影响;siRECK、RECK-OV转染胃癌细胞后,qRT-PCR、WB检测MMP-2和MMP-9表达变化,以明确胃癌细胞中RECK与MMP-2、-9间的关系;PP2A抑制剂（LB-100）和PP2A激活剂（DES）处理胃癌细胞后,qRT-PCR、WB检测细胞中RECK、MMP-2和MMP-9的表达,BSP检测RECK甲基化状态变化。LB-100和DES处理胃癌细胞后,WB检测DNMT1,MEK和p-MEK表达,以明确PP2A活化/抑制引起RECK表达变化的信号通路。qRT-PCR、WB检测Casticin对PP2A、DNMT1、MEK和p-MEK表达的影响;此外采用PP2A抑制剂处理后用Casticin处理,并通过回复验证明确Casticin对PP2A表达及下游信号分子的影响。3)移植瘤裸鼠模型评价Casticin的抑癌效果分别AGS、NCI-N87细胞移植于裸鼠体内,给予不同浓度Casticin处理,并设置对照组,期间持续观察肿瘤体积变化;采用免疫组化染色、WB检测MMP-2/9、PP2A,RECK 的表达变化。结果:1)Casticin对胃癌细胞的影响通过CCK-8法、克隆形成实验、流式细胞术、DAPI染色、划痕实验、Transwell、qRT-PCR、WB和明胶谱实验的结果,发现不同浓度Casticin可以显着抑制胃癌细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭和MMP-2/9的表达及活性,且呈浓度依赖性;而对人胃平滑肌细胞影响较小。2)Casticin抑制胃癌细胞迁移、侵袭的分子机制qRT-PCR、WB和甲基化实验发现Casticin通过促进PP2A表达,进而抑制MEK活化和DNMT1的表达,削弱RECK甲基化并上调RECK表达,从而抑制MMP-2/9表达,最终使得细胞迁移和侵袭能力下降。3)利用胃癌裸鼠成瘤模型评价Casticin的抑癌效果Casticin处理后移植瘤体积明显小于对照组;免疫组化结果发现,Casticin处理后的肿瘤组织中MMP-2/9明显低表达,呈浓度依赖性;相反,PP2A和RECK的表达增高。WB检测发现Casticin处理后肿瘤组织中MMP-2/9蛋白表达量均有明显下调,PP2A,RECK蛋白表达量均有明显上调。结论:1)Casticin有效抑制胃癌细胞的增殖、侵袭与迁移;2)Casticin通过促进PP2A表达来抑制MEK活化和DNMT1表达,进而上调RECK表达,导致MMP-2/9的表达下降,最终抑制胃癌细胞侵袭和转移;3)Casticin可明显抑制移植瘤小鼠皮下瘤的生长,且Casticin处理后肿瘤组织中MMP-2/9明显低表达,同时促进了肿瘤组织中PP2A和RECK的表达。
李洋[4]（2020）在《NGAL和MMP-9/NGAL与症状性颈动脉粥样硬化及其作为他汀类药物治疗作用的血清学标记物研究》文中研究说明目的:中性粒细胞明胶酶的相关脂质运载蛋白（neutrophil gelatinase-associated lipocalin,NGAL）及其与基质金属蛋白酶9（matrix metalloproteinase 9,MMP-9）形成的复合物MMP-9/NGAL被报道参与心血管疾病的发病机制,且他汀类药物对动脉粥样硬化斑块具有稳定的作用。本研究通过检测血清中NGAL和MMP-9/NGAL复合物的水平,研究其与颈动脉粥样硬化斑块易损性之间的相关性,以及他汀类药物对血清中NGAL和MMP-9/NGAL复合物的影响,从而为颈动脉粥样硬化患者的治疗提供治疗靶点。方法:选择符合颈动脉粥样硬化的100例患者为研究对象。根据患者血清中NGAL和MMP-9/NGAL表达水平的均值将患者分为NGAL高表达组（n=56）和NGAL低表达组（n=44）,MMP-9/NGAL高表达组（n=59）和MMP-9/NGAL低表达组（n=41）,分别研究不同分组患者血清中NGAL、MMP-9/NGAL与临床指标的相关性。其次根据双功能超声检测将患者分为稳定斑块患者组（n=42）和不稳定斑块患者组（n=55）,通过酶联免疫吸附实验（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）比较不同斑块稳定性患者血清中NGAL和MMP-9/NGAL表达水平的变化,并通过绘制受试者工作特征曲线（receiver operating characteristic curve,ROC）评估NGAL和MMP-9/NGAL的表达水平对不稳定斑块患者的预测价值。此外根据血管造影将患者分为管腔狭窄程度<50%的轻度狭窄患者（n=48）和管腔狭窄≥50%且<100%的中重度狭窄患者（n=52）。通过ELISA实验比较不同管腔狭窄程度患者血清中NGAL和MMP-9/NGAL表达水平的变化,且通过ROC曲线评估其对中重度管腔狭窄患者的预测价值。最后根据患者有无接受他汀类药物治疗将患者分为未接受他汀类药物组（n=31）和接受他汀类药物组（n=69）,通过ELISA实验检测不同药物治疗组患者血清中NGAL和MMP-9/NGAL的表达水平,检测他汀类药物治疗对患者血清中NGAL和MMP-9/NGAL表达水平的影响。同时研究中还通过二元logistic回归评估患者血清中NGAL和MMP-9/NGAL与颈动脉狭窄症状表现及程度的相关性。结果:（1）颈动脉粥样硬化患者的总胆固醇、LDL-C、患者斑块的稳定性、颈动脉狭窄症状的有无及颈动脉狭窄程度在不同NGAL和MMP-9/NGAL表达水平的患者中存在差别（P<0.05）。（2）与不稳定斑块患者血清中NGAL和MMP-9/NGAL复合物的水平比斑块稳定性患者的表达水平升高（P<0.05）。（3）与轻度管腔狭窄患者相比,中重度管腔狭窄患者血清中NGAL和MMP-9/NGAL复合物的水平显着升高（P<0.05）。（4）患者血清中的NGAL和MMP-9/NGAL复合物的水平与颈动脉狭窄有无症状的表现呈显着正相关,并是其独立预后影响因子（P<0.05）。（5）血清NGAL和MMP-9/NGAL复合物的水平与颈动脉狭窄程度为显着的正相关性,可作为其独立的影响因子（P<0.05）。（6）血清NGAL和MMP-9/NGAL对不稳定斑块患者和中重度颈动脉狭窄患者具预测价值（P<0.05）。（7）他汀类药物治疗显着降低患者血清中的NGAL和MMP-9/NGAL的表达（P<0.05）。结论:血清中NGAL和MMP-9/NGAL复合物与颈动脉斑块易损性显着相关。他汀类药物可以通过降低颈动脉粥样硬化患者血清中的NGAL和MMP-9/NGAL复合物的水平促进颈动脉粥样硬化斑块的稳定性。
陶斯腾[5]（2020）在《三棱内酯B和姜黄素对动脉粥样硬化的影响及其作用机制的研究》文中指出动脉粥样硬化（Atherosclerosis,AS）是心脏病以及中风的主要症状,同时也是导致人类死亡的主要原因。动脉粥样硬化是脂质沉积和慢性血管炎症共同作用的结果。许多研究已经证明巨噬细胞与血管平滑肌细胞（VSMC）病变是动脉粥样硬化形成过程中的主要原因。其中血管平滑肌细胞在动脉粥样硬化斑块的发展过程中向内膜迁移并且出现炎症表型和增殖表型。血管平滑肌细胞可以通过吞噬脂质而转化为泡沫细胞,同时还会通过分泌炎性细胞因子来影响病灶内炎性发展,从而导致炎性斑块增殖。三棱内脂B（Sparstolonin B,SsnB）是一种从三棱科植物块茎中分离得到的含氧蒽类化合物。三棱科植物在中药中一直用于治疗炎症类性疾病。姜黄素（Curcumin,CUR）是从姜科以及天南星科一类的植物根茎中提取的一种二酮类有色物质。近年来,多项研究结果表明姜黄素对于许多疾病,尤其是炎症类疾病具有潜在的治疗作用。同时还有大量研究表明姜黄素在多种肿瘤中有一定的治疗作用。这些研究还发现姜黄素可以通过影响细胞核因子κB（NF-κB）的表达来调节细胞凋亡、细胞增殖等过程。但是两种中药是否可以联合作用于动脉粥样硬化,以及通过怎样的机制来发挥作用,目前还未见相关报道。综上所述,在本研究中,我们拟对三棱内酯B和姜黄素对动脉粥样硬化的影响及其作用机制进行研究。首先,我们连续使用高脂饲料饲喂ApoE-/-小鼠,同时连续腹腔注射血小板衍生因子（PDGF）与白介素17（IL-17）进一步刺激小鼠产生炎症反应,通过这种方式我们成功建立了ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化模型;其次,我们再对一部分动脉粥样硬化模型小鼠单独腹腔注射SsnB或CUR,对一部分动脉粥样硬化模型小鼠联合腹腔注射SsnB以及CUR。通过对小鼠体内与炎症相关因子的mRNA表达检测以及切片观察,我们发现单独使用SsnB或者CUR并不能明显改善模型小鼠的动脉粥样硬化症状,这两组中依然出现大量肌细胞异常增殖与迁移,而且红细胞渗出的情况并没有得到明显好转。而在联合注射SsnB与CUR之后,小鼠的动脉粥样硬化症状得到明显改善,之前增殖的动脉粥样硬化病灶明显有收缩迹象,而红细胞渗出的情况几乎消失。同时联合用药组中的CCL2、IL-6、MMP2、MMP9以及TNF-α这一类炎症因子的表达相对于模型组明显下降。为了进一步探索三棱内酯B和姜黄素对动脉粥样硬化影响的作用机制,我们又进行了如下的细胞实验:我们首先建立了细胞炎症模型,即使用血小板衍生因子（PDGF）与白介素17（IL-17）处理小鼠的血管平滑肌细胞以及巨噬细胞;其次,我们同样的再对细胞炎症模型单独以及联合使用SsnB以及CUR处理,通过检测加药后细胞中的相关炎症因子表达以及相关蛋白的表达改变。我们发现单独使用SsnB或者CUR对细胞模型中的炎症因子表达没有明显下调作用,而联合使用两种药物则明显起到了改善作用。其中单独使用SsnB处理细胞时,CCL2的基因表达相对于模型组变化不大,而其他炎症因子如IL-1β、IL-6、MMP2、MMP9以及TNF-α反而有所上升,白细胞介素（IL）和肿瘤坏死因子（TNF）能够增加白细胞的粘附,这类细胞因子表达下降说明动脉粥样硬化过程中巨噬细胞招募在下降,而能够介导稳定型动脉粥样硬化病变向不稳定表型的转化基质金属蛋白酶（MMP2与MMP9）的下降说明这种炎症趋于稳定。单独用CUR进行处理时我们发现虽然相对于模型组CUR能下调CCL2、IL-1β、IL-6、MMP2、MMP9以及TNF-α的表达,但是表达水平依然高于空白对照组。而在细胞通路水平上,单独使用SsnB或CUR对激活的P38、P50、P65蛋白（磷酸化蛋白）作用不明显。而联合使用CUR与SsnB实验组中我们发现该组中相关P-P38、P-P50、P-P65等蛋白相对模型组以及空白对照组都下降明显。P38MAPK、NF-κB通路、ERK通路在动脉粥样硬化的发生发展和转移过程中起重要作用,这一类磷酸化蛋白表达的下降充分说明了CUR与SsnB联合作用对抑制动脉粥样硬化病变有明显作用。这一结果说明SsnB与CUR的联合添加可以抑制动脉粥样硬化的发生,并且是通过P38MAPK、NF-κB通路以及ERK通路信号通路发挥作用。
薛芸[6]（2020）在《白藜芦醇抑制ox-LDL诱导血小板TLR4/MMPs表达及减轻增龄小鼠血管损伤作用的分子机制研究》文中进行了进一步梳理研究背景:由动脉粥样硬化（Atherosclerosis,AS）引起的心血管疾病（cardiovasculardisease,CVD）是导致老年人和包括糖尿病在内的代谢性疾病患者死亡的主要原因。炎症是AS的主要病理改变,氧化型低密度脂蛋白（oxidized low-density lipoprotein,ox-LDL）是AS的危险因素,衰老则是促进动脉粥样硬化进程的直接相关危险因素。在AS炎症过程中基质金属蛋白酶（Matrix metalloproteinases,MMPs）被高度激活,激活的MMPs可以降解胶原蛋白、弹性蛋白和其他细胞外分子,可能导致动脉壁老化、高血压和动脉粥样硬化。然而,血小板释放MMPs的机制尚不清楚。白藜芦醇是一种天然多酚产物,具有抗炎、抗氧化和抑制血小板功能等作用,而其具体的抗AS的分子机制仍有待进一步深入研究。目的:1、探讨白藜芦醇对ox-LDL激活的血小板Toll样受体4（Toll-like receptor4,TLR4）以及MMP3和MMP9的影响及其潜在的分子机制。2、探讨白藜芦醇对ox-LDL刺激血小板络氨酸激酶Syk以及炎症小体NLRP3活化的影响。3、探讨白藜芦醇对高脂喂养增龄小鼠血浆MMP3和MMP9含量的变化及主动脉TLR4、MMP3、MMP9表达和血管结构变化的影响,为白藜芦醇改善增龄、高脂饮食这两个危险因素促进AS进展相关的防治研究以及临床应用提供理论依据。研究方法:1、血小板分离和处理:健康人静脉血洗涤纯化获得血小板,分别孵育白藜芦醇（1μM、10μM 和 100 μM）,TLR4 抑制剂 CLI-095（0.1 μM、0.3 μM 和 1 μM）,Syk 抑制剂R788（10nM、30nM、100nM）,NLRP3 抑制剂 MCC950（1 nM、10nM、100 nM）10分钟,之后加入0.1 mg/ml ox-LDL或5μg/ml LPS刺激10分钟。2、动物模型建立:8周龄和52周龄的雄性C57BL/6J分为三组进行实验,对照组进食普通饲料,每天灌胃生理盐水一次;高脂组小鼠进食含有21%的脂肪和1.25%的胆固醇的高脂饮食,每天灌胃生理盐水一次;高脂加白藜芦醇组小鼠进食含有21%的脂肪和1.25%的胆固醇的高脂饮食,每天灌胃一次白藜芦醇（22.4mg/kg）（分散于生理盐水中）,各组处理时间均为12周。3、Western blot 方法:检测 TLR4、MMP3 和 MMP9、脾酪氨酸激酶（Spleen tyrosine kinase,Syk）磷酸化、核苷酸结合域富含亮氨酸重复蛋白3（nucleotide-binding domain leucine rich repeat containing protein 3,NLRP3）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1（Cysteine-requiring Aspartate Protease-1,caspase-1）、白介素-1β（Interleukin-1β,IL-1β）、p53和p21的蛋白表达。4、免疫荧光法:检测白藜芦醇对ox-LDL诱导的血小板活化时形态改变和caspase-1在细胞内表达和分布。5、流式细胞仪:检测白藜芦醇对ox-LDL诱导血小板TLR4的表达。6、酶联免疫吸附实验（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）:检测 MMP3、MMP9和IL-1β血小板分泌和小鼠血浆含量。7、生化学方法;检测小鼠血脂四项,低密度脂蛋白-胆固醇（low-densitylipoprotein cholesterol,LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（high-density lipoprotein cholesterol,HDL-C）、总胆固醇（total cholesterol,TC）和甘油三酯（triglyceride,TG）采用全自动生化分析仪检测。8、免疫组化染色:检测主动脉血管组织MMP3和MMP9的表达。9、衰老相关 β 半乳糖苷酶（senescence-associated β-galactosidase,SA-β-gal）染色:检测主动脉血管组织衰老细胞。10、天狼星红染色:检测血管胶原成份。结果:1、白藜芦醇（100 μM）抑制了 ox-LDL活化的血小板中TLR4的表达,减少了 ox-LDL刺激血小板在纤维蛋白原上的粘附和伪足伸出Western blot和流式细胞术分析TLR4表达结果显示,白藜芦醇预处理抑制了 ox-LDL刺激血小板增加的TLR4表达。免疫荧光显示ox-LDL处理使血小板粘附呈现为伪足伸出以及血小板铺展。而白藜芦醇预处理使血小板恢复接近正常水平。2、白藜芦醇抑制MMP3和MMP9表达与阻止TLR4活化相关白藜芦醇（100 μM）抑制了 ox-LDL刺激的血小板中MMP3和MMP9的表达和分泌;TLR4抑制剂CLI-095（1 μM）抑制了由ox-LDL或TLR4特异性激活剂LPS刺激的血小板MMP3和MMP9表达和分泌;较低浓度的白藜芦醇和CLI-095协同抑制ox-LDL和LPS激活的血小板中MMP3和MMP9的表达。3、白藜芦醇通过抑制Syk/NLRP3活化减少MMP3/MMP9的表达和分泌白藜芦醇处理抑制了 ox-LDL和LPS刺激的Syk磷酸化和NLRP3、Caspase-1和IL-1β的表达。Syk抑制剂R788抑制了 ox-LDL刺激的血小板中MMP3、MMP9、NLRP3、Caspase-1和IL-1β的表达。较低浓度的白藜芦醇和R788协同抑制ox-LDL和 LPS 激活的血小板中 MMP3、MMP9、NLRP3、Caspase-1 和 IL-1 β的表达。NLRP3抑制剂MCC950也同样抑制了 ox-LDL刺激的血小板中MMP3、MMP9、Caspase-1和IL-1β的表达,较低浓度的白藜芦醇和MCC950协同抑制ox-LDL和LPS激活的血小板中MMP3、MMP9、Caspase-1和IL-1β的表达。这表明Syk和NLRP3分子之间存在相互作用。免疫共沉淀结果发现,ox-LDL刺激血小板活化时二者呈结合状态,而白藜芦醇处理逆转了这一现象。4、白藜芦醇对增龄高脂小鼠的血管保护作用白藜芦醇降低了高脂饮食小鼠的血脂LDL-C、TG和TC水平,降低了血浆MMP3、MMP9和IL-1β含量。对血管炎症蛋白水平分析表明白藜芦醇干预减少了血管组织TLR4、MMP3和MMP9的表达。SA-β-Gal染色发现,与单纯高脂饮食对照组比较,白藜芦醇干预减少了 52周龄高脂饮食小鼠的血管衰老细胞数量。天狼星染色表明白藜芦醇干预减少了 52周龄高脂饮食小鼠的血管组织胶原成分的降解。结论:1、白藜芦醇能够抑制ox-LDL刺激血小板TLR4活化以及MMP3和MMP9表达和分泌,分子机制与抑制TLR4/Syk/NLRP3通路活化相关。2、白藜芦醇能够抑制ox-LDL刺激血小板NLRP3炎症小体的活化,降低IL-1β的胞外释放。3、白藜芦醇干预改善了高脂饮食喂养的增龄小鼠血管胶原结构紊乱,弹力纤维断裂的病变,降低了小鼠主动脉血管TLR4、MMP3和MMP9表达,减少了血管壁衰老细胞的表达数量,对增龄高脂饮食引起的血管损伤具有保护作用。
哈略[7]（2020）在《艾灸及艾烟改善动脉粥样硬化的细胞自噬机制研究》文中研究表明背景:动脉粥样硬化（Atherosclerosis,AS）是多种心脑血管疾病的主要病理基础,是一种以粥样斑块为显着特征的慢性病理过程,在中医理论上属于“痰”、“瘀”的范畴,属于艾灸疗法的适应症范围。艾灸疗法改善AS的临床及机制研究已有大量报道,为艾灸抗AS的安全性和有效性提供了一定的科学依据。现代研究证明,艾灸可以通过改善AS过程中的脂质代谢、炎症反应、氧化应激、血小板活化以及内皮细胞功能多个方面,起到多靶点治疗AS的作用。艾烟是艾灸起效的重要因素之一,课题组前期研究也证明了艾烟在抗AS中不可替代的作用。细胞自噬是机体中的一项重要促存活机制,与AS各种发病机制均有深入的联系,也是近年来抗AS治疗中新的靶点和焦点。学者们认为自噬不足及过度自噬都会对AS的病理进程产生不利影响,这一现象反映了中医理论中阴阳平衡、对立统一的理念,同时自噬在微观层面上改善能量代谢、清除病理产物的作用与气的“气化”和“驱邪外出”等功能具有高度一致性。因此,已有不少学者着手研究中医药疗法调控自噬,改善心血管疾病的机制,并且取得了一定的成果。针刺、艾灸调控自噬防治心血管疾病的研究已有报道,但直接观察艾灸调控自噬对AS的研究还亟待开展。文献报道及课题组前期研究发现,艾灸对自噬通路及相关自噬蛋白展现出确切的调控作用,课题组预实验结果也体现了艾灸对AS过程中自噬的确切调控作用。基于上述基础,我们提出假说,艾灸及艾烟可以通过调控AS过程中的自噬功能,来实现防治AS的作用。目的:观察艾灸及艾烟两种干预手段对AS动物模型的影响,从病理改变、脂质代谢、斑块稳定性等方面探讨艾灸及艾烟防治AS的效应,然后通过对自噬特异性、自噬信号通路及凋亡水平等方面指标观察,从自噬角度探讨艾灸防治AS的作用机制。方法:54只8周龄ApoE载脂蛋白基因敲除小鼠按照随机数字表方法随机分为三组:模型组、艾灸组和艾烟组。18只同龄C57BL/6小鼠作为空白对照。艾灸组小鼠每日抓取,固定,予以艾灸膻中穴治疗,每次20 min,每日1次,每周6次,共干预12周。艾烟组小鼠每日接受固定浓度的艾烟暴露。模型组和空白组每日抓取固定,但不予任何干预。采用血液生化方法检测血脂四项（TC、TG、HDL、LDL）,采用Elisa法检测VLDL、ApoA1及ox-LDL,分别使用油红“O”和HE染色法观察主动脉病理切片。采用Masson染色法处理主动脉切片,计算ELA、CA、CD68、FCT、Ⅵ等斑块稳定性指标。采用免疫组化法检测主动脉内TNF-α、P38MAPK、NF-κB蛋白表达,采用Elisa法检测主动脉内MMP-2、MMP-9、TIMP-1。使用透射电镜观察血管内皮自噬小体数目,使用 Western blot 法检测小鼠主动脉 P62、Beclin-1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Atg5、Atg12 蛋白表达,使用免疫荧光法检测小鼠主动脉及肝脏P62、Beclin-1、LC3-Ⅱ表达。使用Western blot法及RT-PCR方法观察自噬信号通路p-Akt、Akt、p-mTOR、mTOR、PI3K在蛋白及mRNA水平上的的表达,使用Western blot法检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Caspase-3表达。结果:1.AS病理进程及血脂水平模型组小鼠经过12周高脂喂养,体内存在较为明显的AS病变（血脂紊乱,AS斑块形成）;与空白组相比,小鼠血清TC（P<0.01）、TG（P<0.01）、LDL（P<0.01）、VLDL（P<0.01）显着升高,载脂蛋白ApoA1（P<0.05）及HDL（P<0.01）含量显着下降。以上AS常规指标结果提示本次研究AS模型建立成功。相比于模型组,经过12周的干预治疗,艾灸组小鼠体内AS病理改变减轻（血脂紊乱减轻、主动脉斑块缩小、内皮损伤改善）;艾灸组小鼠血清TC（P<0.01）、TG（P<0.01）、LDL（P<0.05）、VLDL（P<0.01）显着下降,载脂蛋白ApoA1及HDL含量有升高趋势,但无显着差异（P>0.05）。艾烟组小鼠体内AS病理改变减轻（血脂紊乱减轻、主动脉斑块缩小、内皮损伤改善）;艾烟组小鼠血清 TC（P<0.05）、TG（P<0.05）、VLDL（P<0.05）显着下降,LDL含量有下降趋势,但无显着差异（P>0.05）。载脂蛋白ApoA1及HDL含量有升高趋势,但无显着差异（P>0.05）。2.斑块稳定性相比于模型组,经过12周的干预治疗,艾灸组小鼠体内CA（P<0.01）、FCT（P<0.01）水平显着升高,ELA（P<0.01）水平显着下降,斑块易损指数Ⅵ（P<0.05）显着降低;炎症因子 TNF-α（P<0.05）、NF-κB（P<0.05）、MMP-9（P<0.05）、MMP-2（P<0.05）水平显着下降,TIMP-1（P<0.05）水平显着升高。艾烟组小鼠体内CA（P<0.01）、FCT（P<0.01）水平显着升高,ELA（P<0.01）水平显着下降,易损斑块指数Ⅵ（P<0.05）显着降低;炎症因子TNF-α（P<0.05）、MMP-9（P<0.05）、MMP-2（P<0.05）水平显着下降,TIMP-1水平升高但无统计学差异（P>0.05）。3.自噬特异性相比于模型组,经过12周的干预治疗,电镜下艾灸组小鼠主动脉内皮自噬小体及自噬溶酶体显着增多。Western blot显示艾灸组小鼠主动脉促自噬蛋白Beclin-1（P<0.01）、LC3-Ⅱ/LC-Ⅰ比值（P<0.01）、Atg12（P<0.05）显着升高,Atg5表现出升高趋势,但无统计学差异（P>0.05）;自噬抑制蛋白P62（P<0.01）显着降低。免疫荧光显示艾灸组小鼠主动脉Beclin-1（P<0.05）、LC3-Ⅱ（P<0.05）表达显着增强。艾灸组小鼠肝脏内Beclin-1（P<0.05）、LC3-Ⅱ（P<0.05）显着升高,P62 表达无显着差异（P>0.05）。相比于模型组,经过12周的干预治疗,电镜下艾烟组小鼠主动脉内皮细胞自噬小体及自噬溶酶体显着增多。Western blot显示艾烟组小鼠主动脉促自噬蛋白Beclin-1（P<0.01）、LC3-Ⅱ/LC-Ⅰ 比值（P<0.05）、Atg12（P<0.05）显着升高,Atg5 表现出升高趋势,但无统计学差异（P>0.05）;自噬抑制蛋白P62（P<0.01）显着降低。免疫荧光显示艾烟组小鼠主动脉Beclin-1（P<0.05）、LC3-Ⅱ（P<0.05）表达显着增强。艾烟组小鼠肝脏内Beclin-1、LC3-Ⅱ、P62表达与模型组无显着差异（P>0.05）。4.PI3K/Akt/mTOR 信号通路结果显示,相比于模型组,经过12周的干预治疗,艾灸组小鼠主动脉内p-Akt/Akt比值（P<0.01）、p-mTOR/mTOR/比值（P<0.01）显着下降,PI3K相对表达量无显着差异（P>0.05）。相比于模型组,经过12周的干预治疗,艾烟组小鼠主动脉内p-mTOR/mTOR/比值（P<0.01）显着下降、p-Akt/Akt比值有下降趋势,但无显着差异（P>0.05）,PI3K相对表达量无显着差异（P>0.05）。RT-PCR结果显示,相比于模型组,艾灸组小鼠mTOR mRNA及AktmRNA含量显着下降（P<0.05）。相比于模型组,艾烟组小鼠mTOR mRNA含量显着下降（P<0.05）,AktmRNA有下降趋势,但无统计学差异（P>0.05）。5.细胞凋亡蛋白相比于模型组,经过12周的干预治疗,艾灸组小鼠主动脉内Bcl-2蛋白含量显着升高（P<0.05）,Caspase-3蛋白含量显着下降（P<0.05）。相比于模型组,经过12周的干预治疗,艾烟组小鼠主动脉内Caspase-3蛋白含量显着下降（P<0.05）,Bcl-2蛋白含量有升高趋势,但无统计学差异（P>0.05）。结论:1.艾灸和艾烟都可以改善AS小鼠体内病理进展,减轻炎症反应,纠正血脂紊乱,增强斑块稳定性。2.艾灸和艾烟都可以上调AS小鼠体内自噬水平,艾灸改善自噬是艾灸防治AS的全新靶点。3.艾灸及艾烟可通过抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路中的相关活性分子,从而提升细胞内自噬水平,起到延缓AS病理进程,改善斑块稳定性的作用。4.艾灸及艾烟通过上调Bcl-2、下调Caspase-3蛋白表达,抑制细胞凋亡,展现出一定的调控自噬/凋亡平衡的作用。5.艾灸和艾烟的调节作用基本一致,在调控血脂方面艾灸干预的效果优于艾烟干预。
朱璞玉[8]（2020）在《从粘多糖代谢探讨胸痹（冠心病）痰浊病机》文中认为研究目的及背景细胞外基质（extracellular matrix,ECM）中的糖胺聚糖（glycosaminoglycan,GAG）和蛋白聚糖（proteoglycan,PG）,因其“潴留”致病因子在内的多种功能,能很好地诠释中医“痰”重浊粘滞等特性,是研究“痰”证致病机理的很好的切入点;尤其是硫酸软骨素（chondroitin sulfate,CS）/硫酸皮肤素（dermatan sulfate,DS）类 P G,作为广泛存在于外基质ECM中的生物大分子,在冠心病中发挥了重要的致病作用。很多文献对病理和生理状态下的主动脉壁进行了 GAG和PG水平的研究。本文也通过G AG为切入点探求冠心病患者痰证和非痰证之间所存在的差异及其可能机制。方法患者来自广东省中医院大学城分院心内血管一科。在整体血样检测方面,分别Elisa法检测冠心病痰证和非痰证患者血清中的转化生长因子（transforming growth factor-beta 1,TGF-β1）含量,q-PCR 法测定白细胞CD44v6表达,western blot验证白细胞CD44表达。提取冠心病痰证和非痰证患者血清和血细胞的GAG,及患者血清作用小鼠主动脉血管平滑肌细胞（mouse aorta vascular smooth muscle cell,MOVAS）培养后上清液的GAG;分别用硫酸苯酚法、硫酸咔唑法、醋酸纤维膜电泳法测定GAG含量。提取氧化低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein,oxLDL）造模,中药单体贝母素乙、橙皮苷、桔梗皂苷D,干预细胞培养后上清液的GAG,用硫酸咔唑法测定GAG含量。阿利新蓝染色法测定糖胺聚糖GAG分泌的时间规律;凝集素检测法测定24h、48h糖胺聚糖GAG种类,Western Blot法测定蛋白聚糖PG种类;提取TGF-β 1依赖Smad通路抑制剂SB525334、和PI3K通路抑制剂wortmannin（针对PI3K）、MK2206（针对Akt）干预的血清作用细胞培养后上清液的GAG,用硫酸咔咗法测定GAG含量,western blot验证血小板结合蛋白基序（TSP）的解聚蛋白样金属蛋白酶4（A Disintegrin and Metalloproteinase with Thrombospondin motifs,ADAMTS4）和多能蛋白聚糖（versican）经金属蛋白酶ADAMTS1/4作用的酶解片段。成纤维生长因子-糖胺聚糖-成纤维生长因子受体（basic fibroblast growth factor-glycosaminoglycan-fibroblast growth factor receptor,bFGF-GAG-FGFR）三元复合物法测定MOVAS增殖率,western blot验证磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（Phosphoinositide 3-kinase/serine-threonine kinase,PI3K/Akt）下游核因子（nuclear factor kappaB,NF-κB）和水解酶成纤维细胞激活蛋白（fibroblast activation protein,FAP）表达。结果冠心病痰证和非痰证患者血清中的GAG无统计学差异;与非痰证相比,相近血糖水平的痰证患者血清作用于MOVAS后,上清液中的GAG增高;在oxLDL造模组GAG增高,三种中药单体皆将GAG含量降至接近正常对照组。血清干预细胞培养24h,非痰证组和正常对照组上清液中的GAG含量开始升高,血清干预细胞培养48h,非痰证组和正常对照组上清液中的GAG含量开始回落,痰证组上清液中的GAG含量开始升高并超过非痰证组和正常对照组。增高的GAG主要是软骨素CS,相应的CSPG是多能蛋白聚糖versican和双糖链蛋白聚糖biglycan;与非痰证相比,痰证患者血清中TGF-β 1含量增高;单独TGF-β 1与痰证血清作用于MOVAS的趋势相同。抑制Smad通路和PI3K/Akt通路都能减少GAG的分泌;但在抑制Smad通路后,痰证GAG含量增高的效应仍存在,而在抑制PI3K通路后,痰证GAG增高的效应消除了;金属蛋白酶ADAMTS4和酶解片段的表达在痰证组中升高表明TGF-β1通过下调CSPG的降解酶使得痰证组GAG含量高于非痰证组。与非痰证组相比,痰证组三元复合物、核因子NF-κB p65亚基和成纤维激活蛋白FAP在血清作用的MOVAS升高,表明痰证血清可以诱导MOVAS增殖、外基质ECM重塑和招募炎症反应。在痰证患者血液样本中也检测到白细胞表面抗原CD44和CD44v6的增高。结论冠心病痰证患者血清中升高的TGF-β1,可能通过激活血管平滑肌细胞的SMAD通路和PI3K/Akt通路引起GAG-CSPG类versican和biglycan升高,并通过下调金属蛋白酶等如ADAPMTS4来抑制这些CSPG的降解来引起GAG-PG在动脉壁的蓄积。化痰类中药可逆转oxLDL引起的GAG蓄积。PI3K/Akt是细胞增殖（尤其是肿瘤发生）的重要通路,通过不同的下游信号可引起1、血管平滑肌细胞的增殖2、基质水解酶如成纤维激活蛋白FAP所代表的基质重塑3、核因子NF-kB所招募的炎症反应。4、痰证患者血液中的白细胞CD44（尤其是CD44v6）的升高也证明痰证患者血液中的白细胞通过表面抗原CD44与血管壁外基质中的versican结合浸润到病灶。
曾志刚[9]（2019）在《IGF-1和MGF干预对巨噬细胞剔除所致骨骼肌再生受损的影响及其作用机制研究》文中进行了进一步梳理目的:骨骼肌损伤是运动医学中最常见的损伤之一。我们之前的研究发现,巨噬细胞剔除导致挫伤骨骼肌中胰岛素样生长因子1（IGF-1）、机械生长因子（MGF）的下调和肌肉再生受损。据此我们假设,注射IGF-1或MGF可能至少部分地改善巨噬细胞剔除导致的肌肉修复受损。因此,我们探讨了注射IGF-1或MGF是否在改善受损肌肉的修复中起重要作用。方法:在C57BL/6小鼠的腓肠肌中建立了IGF-1或MGF注射的肌肉挫伤和巨噬细胞剔除的动物模型。将小鼠随机分为4组:（1）挫伤与安慰剂处理组（C组）,（2）挫伤与巨噬细胞剔除处理组（CD组）,（3）挫伤、巨噬细胞剔除与IGF-1处理组（CDI组）,（4）挫伤、巨噬细胞剔除与MGF处理组（CDM组）。在C、CD、CDI和CDM组中,除第0天（非挫伤小鼠）外,每组小鼠均产生腓肠肌双侧挫伤,并分别在挫伤前（Con）和挫伤后第1、3、7、14天取样。在巨噬细胞剔除和IGF-1或MGF注射后对挫伤的肌肉进行综合的组织形态学和遗传学分析,在挫伤骨骼肌中检测骨骼肌再生（HE染色）、纤维化（masson染色）、巨噬细胞及其亚群表面标志物、炎性细胞因子、趋化因子、肌源性调节因子（MRFs）、血管生成调节因子、氧化应激因子和基质金属蛋白酶（MMP）的表达（实时定量PCR和免疫荧光染色）。结果:1含氯膦酸盐的脂质体对受损骨骼肌巨噬细胞标志物的影响。与单纯肌肉挫伤后相比,巨噬细胞剔除后的巨噬细胞总数（F4/80）明显受到抑制（ρ<0.01）。这些结果表明巨噬细胞有效剔除了。2注射IGF-1未改善挫伤肌肉中巨噬细胞剔除所致的再生肌纤维减少和纤维化加重。巨噬细胞剔除后损伤14天的挫伤肌肉中再生肌纤维的总数目、总面积和总直径比单纯肌肉挫伤后的再生肌纤维显着减少（ρ<0.05）,注射IGF-1后受损的肌肉再生没有改善（ρ>0.05）。再者,巨噬细胞剔除引起肌肉挫伤后纤维化明显增加（ρ<0.05）,而增加的纤维化没有通过IGF-1注射得以改善（ρ>0.05）。3注射IGF-1未能促进巨噬细胞剔除后巨噬细胞之间的协调,从而未改善挫伤肌肉的再生和修复。通过注射IGF-1,挫伤后的细胞免疫反应得到了改善,巨噬细胞总数（F4/80）、促炎巨噬细胞（CD68）、抗炎巨噬细胞（CD163和CD206）有一定程度的显着增加（ρ<0.05）。在修复后期,注射IGF-1后的巨噬细胞总数（F4/80）高于单纯肌肉挫伤和巨噬细胞剔除后的巨噬细胞总数（F4/80）（ρ<0.05）,而注射IGF-1后的CD68和CD206巨噬细胞的水平仅高于单纯肌肉挫伤后的水平（ρ<0.05）,CD163巨噬细胞水平低于单纯肌肉挫伤后的水平（ρ<0.01）。4注射IGF-1未能改善巨噬细胞剔除所致的挫伤肌肉延迟修复（其表现为MRFs增加,特别是修复后期）。与单纯肌肉挫伤后的表达水平相比,在巨噬细胞剔除后的不同时间点,MyoD,Myf5,myogenin和Myf6的表达水平显着增加（ρ<0.05）,在注射IGF-1后14d,MyoD和myogenin的表达也显着增加（ρ<0.001）。5注射IGF-1部分改善了巨噬细胞剔除所致的血管生成调节因子的抑制,但未能改善挫伤肌肉的再生受损。与单纯肌肉挫伤后相比,在巨噬细胞剔除后修复的初始阶段HIF-1α和VEGF的表达增加（ρ<0.01）,在巨噬细胞剔除后的所有修复阶段Angpt-1的表达均低于单纯肌肉挫伤后的表达（ρ<0.01）。与巨噬细胞剔除后相比,注射IGF-1后各修复阶段HIF-1α的表达均显着降低（ρ<0.05）,VEGF在修复后期和Angpt-1在所有修复阶段的表达显着增加（ρ<0.001）。然而,注射IGF-1后修复后期HIF-1α、VEGF和Angpt-1的表达均低于单纯肌肉挫伤后的表达（ρ<0.001）。6注射MGF对巨噬细胞剔除后肌纤维再生无保护作用,但减轻挫伤骨骼肌的纤维化。巨噬细胞剔除显着降低了损伤14天后再生肌纤维的总直径、总数量和总面积（ρ<0.01）。然而,注射MGF对再生肌纤维的直径、数量和面积没有影响（ρ>0.05）。再者,与损伤后14天的单纯肌肉挫伤组纤维化比较,巨噬细胞剔除组的骨骼肌纤维化显着增加（ρ<0.01）。然而,与损伤后14天的巨噬细胞剔除组纤维化面积比较,注射MGF后纤维化面积显着降低（ρ<0.05）。同时,在损伤后1天和3天,注射MGF后I型和III型胶原蛋白水平明显低于巨噬细胞剔除后的水平（ρ<0.01）。7注射MGF不影响巨噬细胞剔除后挫伤骨骼肌中卫星细胞的功能状态。巨噬细胞剔除不影响MyoD的表达（ρ>0.05）,但在肌肉损伤后3天显着降低Myogenin的表达（p<0.01）。然而,注射MGF并不影响巨噬细胞剔除后受损骨骼肌中MyoD和Myogenin的表达（ρ>0.05）。8注射MGF不影响巨噬细胞剔除后挫伤骨骼肌巨噬细胞标志物的表达,但降低炎性细胞因子和趋化因子的表达。与巨噬细胞剔除相比,注射MGF后挫伤骨骼肌的巨噬细胞标记物表达无明显变化（ρ>0.05）。在骨骼肌损伤后3天,巨噬细胞剔除使促炎细胞因子（TNF-α,IL-1β和TGF-β）的水平显着高于单纯肌肉挫伤（ρ<0.05）。相反,与巨噬细胞剔除相比,注射MGF导致损伤后TNF-α,IFN-γ,IL-1β和TGF-β水平显着降低（ρ<0.05）。再者,巨噬细胞剔除显着增加趋化因子（CCL2、CCL5和CXCR4）的表达（ρ<0.05）。然而,注射MGF显着降低巨噬细胞剔除后受损肌肉组织三种趋化因子（CCL2,CCL5和CXCR4）的表达（ρ<0.05）。9注射MGF降低巨噬细胞剔除后挫伤骨骼肌中gp91phox的表达。与巨噬细胞剔除比较,注射MGF显着降低了伤后3天gp91phox的表达（ρ<0.01）。10注射MGF降低巨噬细胞剔除后挫伤骨骼肌中基质金属蛋白酶的表达。巨噬细胞剔除导致损伤骨骼肌中MMP-1,MMP-2,MMP-9,MMP-10和MMP-14水平比单纯肌肉挫伤显着升高（ρ<0.05）。与巨噬细胞剔除比较,注射MGF在损伤后第3天显着抑制其增加（ρ<0.01）。结论:通过上述研究结果得出以下结论:（1）在巨噬细胞持续剔除的情况下,注射IGF-1可以促进巨噬细胞亚群（CD206）和VEGF、Angpt-1的表达的部分恢复。（2）IGF-1注射并不能完全弥补巨噬细胞在肌肉再生相关调节因子、肌源性调节因子和血管生成调节因子中的重要作用。因此,外源性补充IGF-1并不能改善由巨噬细胞剔除引起的小鼠挫伤骨骼肌的再生和修复受损。（3）注射MGF可部分改善由巨噬细胞剔除导致的小鼠骨骼肌再生受损和纤维化。（4）注射MGF降低了巨噬细胞剔除后挫伤骨骼肌炎性细胞因子、趋化因子、基质金属蛋白酶和gp91phox的表达,有利于减少挫伤骨骼肌的纤维化。
曹菲[10]（2019）在《维甲酸诱导心肌致密化不全的基础研究》文中研究说明心肌致密化不全（non-compaction of ventricular myocardium,NVM）又称之为心室肌小梁过多、海绵状心肌,是一种特殊类型的心肌病,由薄而致密的心外膜下心肌层和增厚的非致密的心内膜下心肌层的双层心肌构成,且非致密化心内膜下心肌层表面可见多个显着突起的肌小梁和小梁间深凹的隐窝与心室腔相通并有血流进出。本文第一章对NVM的命名、流行病学、分类、病因和发病机制、病理解剖学、病理生理学和临床表现、临床诊断与鉴别诊断、治疗及其预后等国内外研究进展进行系统性综述。因NVM具有发病率高、病因不明、无有效治疗方法,死亡率高及预后差等特点,故通过建立NVM动物模型揭示其发病机制具有重要科学价值和临床价值。本课题主要针对维甲酸（retinoic acid,RA）诱导NVM小鼠模型并进行相关基础研究。研究内容分为三部分:1.探讨如何运用RA诱导孕鼠子代建立NVM小鼠模型;2.在成功建立NVM小鼠模型后,运用等重同位素多标签相对定量蛋白质组学（tandem mass tag,TMT）检测NVM心脏组织差异蛋白;3.运用平行反应监测（parallel reaction monitoring,PRM）技术对NVM差异蛋白进行验证和定量分析,进而发现潜在的与NVM发生相关蛋白,为后续蛋白功能验证、探索NVM相关发病机制以及潜在治疗靶点的可能性提供研究基础。第一部分:根据前期关于精确浓度RA与正常胚胎心肌致密化发育过程密切相关的研究报告,提出了采用过量RA干扰孕鼠胚胎心肌致密化过程而诱导孕鼠子代建立NVM模型的假设。本研究在孕鼠怀孕第8.5天给予全反式维甲酸（all-trans retinoic acid,ATRA）70mg/kg诱导孕鼠胎儿NVM。组织病理学证实RA干预组孕鼠子代表现出典型的NVM病理学特征。研究中进一步发现与对照组相比,RA干预组孕鼠子代平均体重明显减低,显示统计学显着差异（P<0.0001）。给予ATRA10天后母鼠平均体重较给药前明显下降,表现出显着的统计学差异（P<0.0001）。结论:过量的ATRA可诱导孕鼠子代建立NVM幼鼠模型,并提示过量的ATRA可能参与母鼠及其子代能量代谢过程。该动物模型为下一步TMT相对定量蛋白质组学检测NVM心脏组织建立基础。第二部分:在RA诱导孕鼠子代建立NVM幼鼠模型后,运用TMT相对定量蛋白质组学技术开展RA诱导NVM的基础研究。在RA干预组（RA）与空白对照组（Control）进行差异表达蛋白筛选,发现差异蛋白68个;在RA干预组（RA）与DMSO对照组（DMSO）进行差异表达蛋白筛选,发现差异蛋白48个。经过基因本体（Gene Ontology,GO）功能注释和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG）通路富集分析发现,RA与两个对照组的共同差异表达蛋白及其通路主要表现在能量代谢和凝血功能方面。结论:根据已有大量此类蛋白功能相关研究,初步推测RA诱导孕鼠子代NVM与能量代谢异常相关的可能性较大,而NVM心室内血栓形成与凝血功能异常相关的可能性较大,其具体致病机制尚待进一步研究。第三部分:在TMT相对定量蛋白质组学检测NVM心脏组织进行差异表达蛋白筛选和分析之后,运用PRM技术对差异蛋白进行验证和定量分析。分别对Control、DMSO以及RA三组中9例幼鼠心脏样品中6种差异蛋白激肽原1（kininogen-1,KNG1）、α1抗胰蛋白酶（alpha-1-antitrypsin,A1AT）、载脂蛋白 A1（apolipoproteinA-I,ApoAI）、β2 糖蛋白 1（beta-2-glycoprotein1,β2GP1）、微管蛋白β4a 链（tubulinbeta-4Achain,TUBB4A）、水通道蛋白4（aquaporin-4,AQP4）的 12条肽段进行PRM定量分析,结果表明:这6种蛋白的表达与TMT检测的相对定量结果一致,存在显着差异。对这6种蛋白的结构、功能及所在相关通路以及与NVM可能的相关性进行分析总结,将为后续NVM相关蛋白功能验证,了解NVM相关发病机制及靶向治疗提供进一步的研究方向。
二、凝血酶诱导人类胚胎血管平滑肌细胞明胶酶分泌及活化（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、凝血酶诱导人类胚胎血管平滑肌细胞明胶酶分泌及活化（论文提纲范文）
（1）DKK1在机械牵张力调节血管平滑肌细胞功能和血管重构中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 论文Ⅰ 平滑肌细胞DKK1基因敲除对病理性牵张力所致小鼠血管重构的影响 |
| 中文摘要Ⅰ |
| 英文摘要Ⅰ |
| 符号说明Ⅰ |
| 前言 |
| 0. 研究目的 |
| 1. 材料和方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 4. 结论 |
| 附表 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 论文Ⅱ DKK1介导的机械牵张力调控平滑肌细胞增殖和迁移功能的机制研究 |
| 中文摘要Ⅱ |
| 英文摘要Ⅱ |
| 符号说明Ⅱ |
| 前言 |
| 0. 研究目的 |
| 1. 材料和方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 4. 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表的论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 英文论文Ⅰ |
| 英文论文Ⅱ |
（2）WDR1在血管平滑肌细胞中参与血管损伤后重构过程的作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 肌动蛋白概述 |
| 1.2 WDR1的结构和actin切割 |
| 1.3 WDR1的生物学功能 |
| 1.3.1 WDR1与癌症 |
| 1.3.2 WDR1与内皮发育 |
| 1.3.3 WDR1与肌节组装 |
| 1.3.4 WDR1与血液疾病 |
| 1.4 本课题研究内容 |
| 1.4.1 血管损伤模型构建 |
| 1.4.2 探究血管损伤与WDR1的相关性 |
| 1.4.3 体外证实WDR1对平滑肌细胞的影响 |
| 1.4.4 STAT3与WDR1相互调控的分子机制 |
| 1.5 研究意义 |
| 第二章 WDR1在血管损伤模型中的表达分析 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料和方法 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 实验方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 成功构建颈动脉损伤的小鼠模型 |
| 2.3.2 颈动脉结扎后Wdr1表达水平呈时间依赖性增高 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 结论 |
| 第三章 Wdr1的缺失抑制血管新生内膜的形成 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料和方法 |
| 3.2.1 材料 |
| 3.2.2 实验方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 成功构建Wdr1条件性敲除小鼠 |
| 3.3.2 Wdr1条件性敲除抑制了血管内膜的增厚 |
| 3.3.3 敲除Wdr1抑制平滑肌细胞的增殖和迁移 |
| 3.3.4 原代血管平滑肌细胞敲降Wdr1抑制细胞的增殖和迁移 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 结论 |
| 第四章 STAT3直接调控Wdr1的转录来促进平滑肌细胞的增殖和迁移 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料和方法 |
| 4.2.1 材料 |
| 4.2.2 实验方法 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 WDR1促进平滑肌细胞的增殖和迁移 |
| 4.3.2 活化的STAT3参与动脉损伤修复过程 |
| 4.3.3 STAT3 的激活是WDR1介导的平滑肌细胞的增殖和迁移所必需 |
| 4.3.4 WDR1促进平滑肌细胞的增殖和迁移需要ADF/Cofilin介导的肌动蛋白动力学的参与 |
| 4.3.5 STAT3直接结合Wdr1的启动子调节其转录活性 |
| 4.3.6 体内抑制JAK2/STAT3途径可降低Wdr1的表达和新内膜形成 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 结论 |
| 第五章 Wdr1的缺失抑制STAT3的核转移 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料和方法 |
| 5.2.1 材料 |
| 5.2.2 实验方法 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 HAVSMCs中Wdr1的缺失不影响STAT3 的表达和活化 |
| 5.3.2 WDR1介导pSTAT3的核转移 |
| 5.3.3 WDR1通过调控Importinβ的表达和Ran的核质分布来影响p STAT3 的核 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 结论 |
| 第六章 结论与展望 |
| 6.1 研究结论 |
| 6.2 研究内容的创新与应用 |
| 6.3 本研究中的不足以及下一步的工作展望 |
| 参考文献 |
| 附录1 攻读博士学位期间取得的科研成果 |
| 附录2 攻读博士学位期间参加的科研项目 |
| 致谢 |
（3）紫花牡荆素抑制胃癌细胞迁移与侵袭的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 Casticin对胃癌发展的影响 |
| 1.1 绪论 |
| 1.1.1 胃癌 |
| 1.1.2 胃癌的发生与转移 |
| 1.1.3 紫花牡荆素(Casticin) |
| 1.2 主要实验材料 |
| 1.2.1 细胞株 |
| 1.2.2 主要实验试剂 |
| 1.2.3 主要实验仪器 |
| 1.2.4 药物配制 |
| 1.3 主要实验方法 |
| 1.3.1 CCK-8检测 |
| 1.3.2 细胞克隆检测 |
| 1.3.3 DAPI染色检测 |
| 1.3.4 FITC-Annexin V/PI染色检测 |
| 1.3.5 细胞周期检测 |
| 1.3.6 细胞划痕检测 |
| 1.3.7 Transwell侵袭实验 |
| 1.3.8 qRT-PCR检测Casticin对MMP-2/9表达的影响 |
| 1.3.9 Western blotting检测Casticin对MMP-2/9蛋白表达的影响 |
| 1.3.10 明胶酶谱检测Casticin对MMP-2/9活性的影响 |
| 1.3.11 统计与分析 |
| 1.4 实验结果 |
| 1.4.1 Casticin抑制胃癌细胞增殖 |
| 1.4.2 Casticin抑制胃癌细胞克隆形成 |
| 1.4.3 Casticin诱导胃癌细胞凋亡 |
| 1.4.4 Casticin诱导胃癌细胞周期阻滞 |
| 1.4.5 Casticin抑制胃癌细胞迁移 |
| 1.4.6 Casticin抑制胃癌细胞侵袭 |
| 1.4.7 不同浓度Casticin抑制胃癌细胞MMP-2/9 mRNA表达 |
| 1.4.8 不同浓度Casticin抑制胃癌细胞MMP-2/9蛋白表达 |
| 1.4.9 不同浓度Casticin抑制胃癌细胞MMP-2/9活性 |
| 1.5 讨论 |
| 1.6 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第二章 Casticin通过下调MMP-2/9的表达抑制胃癌细胞侵袭转移的分子机制 |
| 2.1 绪论 |
| 2.1.1 基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinases,MMPs) |
| 2.1.2 MMPs和RECK的关系 |
| 2.1.3 DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase 1,DNMT1) |
| 2.1.4 蛋白磷酸酶2A (Protein Phosphatase 2A,PP2A) |
| 2.1.5 丝裂原活化的细胞外信号调节激酶(Mitogen-activated extracellularsignal-regulated kinase,MEK) |
| 2.2 主要实验材料 |
| 2.2.1 细胞培养 |
| 2.2.2 实验试剂 |
| 2.2.3 实验仪器 |
| 2.2.4 药物配制 |
| 2.3 主要实验方法 |
| 2.3.1 si-RECK瞬时转染 |
| 2.3.2 过表达RECK瞬时转染 |
| 2.3.3 Western blotting检测 |
| 2.3.4 qRT-PCR检测 |
| 2.3.5 BSP检测基因启动子甲基化状态 |
| 2.3.6 统计与分析 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 Casticin通过消除胃癌细胞中RECK甲基化抑制MMP-2/9表达 |
| 2.4.2 PP2A表达增强可削弱RECK甲基化状态,进而促进RECK表达 |
| 2.4.3 Casticin通过促进PP2A的表达来抑制MEK活化和DNMT1的表达,进而抑制MMP-2/9表达 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第三章 利用胃癌裸鼠成瘤模型评价Casticin的抑癌效果 |
| 3.1 绪论 |
| 3.1.1 肿瘤 |
| 3.1.2 胃癌 |
| 3.1.3 Casticin的抗肿瘤作用 |
| 3.2 主要实验材料 |
| 3.2.1 细胞株 |
| 3.2.2 试剂 |
| 3.2.3 仪器 |
| 3.3 主要实验方法 |
| 3.3.1 皮下成瘤 |
| 3.3.2 免疫组化检测 |
| 3.3.3 Western blotting检测 |
| 3.3.4 统计与分析 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 Casticin对体内胃癌肿瘤的抑制作用 |
| 3.4.2 Casticin可增强移植瘤小鼠体内PP2A/RECK的表达,抑制MMP-2/9表达 |
| 3.4.3 Casticin可增强移植瘤小鼠体内PP2A/RECK蛋白表达,抑制MMP-2/9蛋白表达 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 本章小结 |
| 参考文献 |
| 综述 RECK基因与侵袭性癌的发展 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表的学术论文与取得的其它研究成果 |
| 致谢 |
（4）NGAL和MMP-9/NGAL与症状性颈动脉粥样硬化及其作为他汀类药物治疗作用的血清学标记物研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 1 研究对象 |
| 2 实验材料 |
| 3 实验方法 |
| 4 统计学分析 |
| 结果 |
| 1 血清NGAL和 MMP-9/NGAL与患者临床指标的相关性分析 |
| 2 血清NGAL和 MMP-9/NGAL在颈动脉斑块患者中的表达情况 |
| 3 血清NAGL和 MMP-9/NGAL对不稳定斑块患者的预测价值 |
| 4 血清NGAL和 MMP-9/NGAL在管腔狭窄患者中的表达情况 |
| 5 血清NAGL和 MMP-9/NGAL对中重度管腔狭窄患者的预测价值 |
| 6 血清NGAL和 MMP-9/NGAL与颈动脉狭窄症状表现及程度的关系 |
| 7 他汀类药物治疗对患者血清中NGAL和 MMP-9/NGAL水平的影响 |
| 讨论 |
| 1 NGAL |
| 2 MMP-9/NGAL复合物 |
| 3 斑块稳定性 |
| 4 颈动脉狭窄 |
| 5 他汀类药物及其他药物治疗 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 缩略词表 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 致谢 |
（5）三棱内酯B和姜黄素对动脉粥样硬化的影响及其作用机制的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 动脉粥样硬化中的炎症研究 |
| 1.1 动脉粥样硬化中的炎症研究 |
| 1.1.1 动脉粥样硬化的病理过程 |
| 1.1.2 炎症在动脉粥样硬化中的作用 |
| 1.1.3 血管平滑肌细胞在动脉粥样硬化过程中的作用 |
| 1.1.4 巨噬细胞在动脉粥样硬化过程中的作用 |
| 1.2 动脉粥样硬化炎症发展中的标志物 |
| 1.3 动脉粥样硬化相关的炎症信号通路 |
| 第二章 三棱内酯B和姜黄素的研究进展 |
| 2.1 三棱内脂B的研究进展 |
| 2.2 姜黄素的研究进展 |
| 第三章 三棱内酯B和姜黄素对于动脉粥样硬化的研究进展 |
| 3.1 SsnB的抗炎症作用的研究进展 |
| 3.2 CUR 的抗炎症作用的研究进展 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 SsnB和CUR对ApoE-/-小鼠炎症模型的作用 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二章 SsnB与 CUR对小鼠VSMC与巨噬细胞炎症的作用 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 导师简介 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（6）白藜芦醇抑制ox-LDL诱导血小板TLR4/MMPs表达及减轻增龄小鼠血管损伤作用的分子机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分: 白藜芦醇对ox-LDL刺激血小板TLR4介导炎症反应的影响及分子机制研究 |
| 一、引言 |
| 二、材料和方法 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 主要试剂 |
| 1.2 主要仪器 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 统计学方法 |
| 三、实验结果 |
| 1. 白藜芦醇对ox-LDL刺激的血小板spreading的影响 |
| 2. 白藜芦醇对ox-LDL诱导的血小板TLR4表达的影响 |
| 3. 白藜芦醇对ox-LDL刺激的血小板MMP3表达和分泌的影响 |
| 4. 白藜芦醇对ox-LDL刺激的血小板MMP9表达和分泌的影响 |
| 5. TLR4抑制剂(CLI095)对MMP3、MMP9表达的影响 |
| 6. 白藜芦醇对ox-LDL或LPS诱导的血小板Syk磷酸化的影响 |
| 7. Syk抑制剂R788对ox-LDL或LPS诱导血小板MMP3和MMP9的影响 |
| 8. 白藜芦醇对ox-LDL或LPS刺激的血小板NLRP3/caspase-1/IL-1β表达的影响 |
| 9. MCC950 (NLRP3抑制剂)对ox-LDL或LPS刺激的血小板caspase-1和IL-1β表达的影响 |
| 10. 白藜芦醇和MCC950联合处理对ox-LDL或LPS刺激的血小板caspase-1 和IL-1β表达的影响 |
| 11. MCC950对ox-LDL或LPS刺激的血小板MMP3和MMP9表达的影响 |
| 12. R788对ox-LDL或LPS诱导的血小板NLRP3/caspase-1/IL-1β表达的影响 |
| 13. 白藜芦醇和R788联合处理对ox-LDL或LPS刺激的血小板NLRP3/caspase-1/IL-1β表达的影响 |
| 14. 白藜芦醇对ox-LDL诱导活化血小板中Syk/NLRP3和TLR4的结合影响 |
| 15. 白藜芦醇对ox-LDL或LPS刺激的血小板p21和p53表达的影响 |
| 四、讨论 |
| 五、结论 |
| 第二部分: 白藜芦醇对增龄小鼠血管的保护作用 |
| 一、引言 |
| 二、材料与方法 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 主要试剂 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 实验动物 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 统计学方法 |
| 三、实验结果 |
| 1. 白藜芦醇对52周龄高脂饮食小鼠血脂水平的影响 |
| 2. 白藜芦醇对8周和52周龄高脂饮食小鼠血管衰老细胞的影响 |
| 3. 白藜芦醇对8周和52周龄高脂饮食小鼠MMP3和MMP9表达以及IL-1β含量的影响 |
| 4. 白藜芦醇对8周和52周龄高脂饮食小鼠主动脉根部MMP3和MMP9表达的影响 |
| 5. 白藜芦醇对8周和52周龄高脂饮食小鼠主动脉根部胶原的影响 |
| 四、讨论 |
| 五、结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 TLR4 promotes inflammatory immune response and triggers pyroptosis via NLRP3 activation in atherosclerosis |
| References |
| 附录 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（7）艾灸及艾烟改善动脉粥样硬化的细胞自噬机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一部分 文献综述 |
| 综述一 细胞自噬在动脉粥样硬化发病机制中的作用研究进展 |
| 参考文献 |
| 综述二 艾灸疗法防治高脂血症并动脉粥样硬化症的研究进展 |
| 参考文献 |
| 综述三 中医药疗法调控自噬机制防治心血管疾病的研究进展 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 第二部分 实验研究 |
| 第一章 艾灸及艾烟对APOE~(-/-)小鼠AS斑块、血脂及一般状况的实验研究 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第二章 艾灸及艾烟对APOE~(-/-)小鼠AS斑块稳定性的实验研究 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第三章 艾灸及艾烟对APOE~(-/-)小鼠自噬特异性的实验研究 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第四章 艾灸及艾烟调控APOE~(-/-)小鼠自噬信号通路及细胞凋亡的实验研究 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 讨论 |
| 1. 动物模型的选择 |
| 2. 艾灸疗法改善AS过程中自噬水平的作用机制 |
| 3. 艾灸改善自噬调控AS斑块稳定性的作用机制 |
| 4. 艾燃烧生成物的生物效应 |
| 结语 |
| 创新与展望 |
| 创新点 |
| 研究不足与未来研究方向 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在学期间主要研究成果 |
（8）从粘多糖代谢探讨胸痹（冠心病）痰浊病机（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一章 文献研究 |
| 1.1 综述糖复合物的结构和生物功能 |
| 1.1.1 聚糖的构象 |
| 1.1.2 聚糖的功能 |
| 1.1.3 N-连接糖基化 |
| 1.1.4 0-连接糖基化 |
| 1.1.5 凝集素 |
| 1.1.6 糖鞘脂 |
| 参考文献 |
| 1.2 综述 细胞外基质和冠状动脉粥样硬化的病理联系 |
| 1.2.1 AS退行性变与外基质ECM |
| 1.2.2 动脉血管壁外基质ECM与AS |
| 1.2.3 AS血管平滑肌增殖与外基质ECM |
| 1.2.4 血管壁外基质ECM蛋白与AS |
| 1.2.5 AS血管损伤修复与外基质ECM |
| 1.2.6 AS蛋白水解酶与外基质ECM |
| 1.2.7 AS细胞因子与ECM |
| 参考文献 |
| 1.3 综述 中医痰证与冠心病 |
| 1.3.1 痰的生成 |
| 1.3.2 痰证的致病特点及对应的西医疾病范畴 |
| 1.3.3 冠状动脉粥样硬化与痰证的关系 |
| 1.3.4 痰证的体征特点 |
| 1.3.5 中医痰证论治和药物单体的选择 |
| 参考文献 |
| 第二章 实验和临床研究 |
| 2.1 实验准备 |
| 2.1.1 患者的选取和排除 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.1.3 实验仪器 |
| 2.1.4 实验试剂配制 |
| 2.2 痰证血清促进平滑肌细胞GAG分泌 |
| 2.2.1 实验方法 |
| 2.2.2 结果 |
| 2.2.3 讨论 |
| 2.3 痰证血清促进平滑肌细胞GAG分泌现象的机制 |
| 2.3.1 GAG分泌的时间规律和种类 |
| 2.3.2 结果 |
| 2.3.3 讨论 |
| 2.3.4 相关的细胞因子及信号通路 |
| 2.3.5 结果 |
| 2.3.6 讨论 |
| 2.4 痰证血清促进平滑肌细胞分泌GAG的病理效应 |
| 2.4.1 痰证血清促平滑肌细胞增殖 |
| 2.4.2 痰证血清促基质重塑 |
| 2.4.3 痰证血清促慢性炎症 |
| 2.4.4 讨论 |
| 参考文献 |
| 创新点 |
| 附录 |
| 在校期间发表论文情况 |
| 致谢 |
| 广州中医药大学研究生学位论文统计学审核证明 |
（9）IGF-1和MGF干预对巨噬细胞剔除所致骨骼肌再生受损的影响及其作用机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 论文总体设计 |
| 第一部分 IGF-1或MGF和巨噬细胞介导的损伤骨骼肌再生的关系研究综述 |
| 1 前言 |
| 2 巨噬细胞及其亚群和损伤骨骼肌的再生与修复 |
| 2.1 在肌再生中巨噬细胞和骨骼肌肌源性调节因子 |
| 2.2 在肌再生中巨噬细胞和骨骼肌肌再生调节因子 |
| 2.3 在肌再生中巨噬细胞和骨骼肌炎症性细胞因子 |
| 2.4 在肌再生中巨噬细胞和骨骼肌趋化因子 |
| 2.5 在肌再生中巨噬细胞和骨骼肌血管再生调节因子 |
| 2.6 在肌再生中巨噬细胞和骨骼肌基质金属蛋白酶 |
| 2.7 在肌再生中巨噬细胞和骨骼肌氧化应激因子 |
| 3 IGF-1和损伤骨骼肌的再生与修复 |
| 3.1 在肌再生中IGF-1和骨骼肌肌源性调节因子 |
| 3.2 在肌再生中IGF-1和巨噬细胞及其亚群 |
| 3.3 在肌再生中IGF-1和骨骼肌炎症性细胞因子 |
| 3.4 在肌再生中IGF-1和骨骼肌趋化因子 |
| 3.5 在肌再生中IGF-1和骨骼肌血管再生调节因子 |
| 3.6 在肌再生中IGF-1和骨骼肌基质金属蛋白酶 |
| 4 MGF和损伤骨骼肌的再生与修复 |
| 4.1 在肌再生中MGF和骨骼肌肌源性调节因子 |
| 4.2 在肌再生中MGF和巨噬细胞及其亚群 |
| 4.3 在肌再生中MGF和骨骼肌炎症性细胞因子 |
| 4.4 在肌再生中MGF和骨骼肌血管再生调节因子 |
| 4.5 在肌再生中MGF和骨骼肌基质金属蛋白酶 |
| 第二部分 注射IGF-1未改善巨噬细胞剔除所致的骨骼肌再生受损的影响及其作用机制研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 动物 |
| 2.2 实验设计 |
| 2.3 骨骼肌挫伤动物模型 |
| 2.4 脂质体注射 |
| 2.5 IGF-1注射 |
| 2.6 肌肉再生和纤维化的组织形态学评价 |
| 2.7 免疫荧光染色 |
| 2.8 RNA分离与逆转录聚合酶链反应(RT-PCR) |
| 2.9 实时定量PCR(Rt-qPCR) |
| 2.10 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 注射IGF-1对巨噬细胞剔除后挫伤骨骼肌肌再生的影响 |
| 3.2 注射IGF-1对巨噬细胞剔除后挫伤骨骼肌纤维化的影响 |
| 3.3 注射IGF-1对巨噬细胞剔除后挫伤骨骼肌巨噬细胞及其亚型的影响 |
| 3.4 注射IGF-1对巨噬细胞剔除后挫伤骨骼肌肌源性调节因子的影响 |
| 3.5 注射IGF-1对巨噬细胞剔除后挫伤骨骼肌血管生成调节因子的影响 |
| 4 讨论 |
| 4.1 注射IGF-1未改善挫伤肌肉中巨噬细胞剔除所致的再生肌纤维减少 |
| 4.2 注射 IGF-1 未能改善由巨噬细胞剔除引起的挫伤肌肉的延迟修复(其取决于MRFs 增加),特别是在修复的后期 |
| 4.3 注射 IGF-1 未改善挫伤肌肉中巨噬细胞剔除所致的肌肉纤维化加重 |
| 4.4 注射 IGF-1 未能促进巨噬细胞剔除后巨噬细胞亚群之间的协调,从而未改善挫伤肌肉的再生和修复 |
| 4.5 注射IGF-1部分改善了巨噬细胞剔除诱导的血管生成调节因子的抑制,但不能改善挫伤肌肉受损的再生和修复 |
| 5 结论 |
| 第三部分 注射 MGF 对巨噬细胞剔除所致的骨骼肌再生受损的影响及其作用机制研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 动物 |
| 2.2 骨骼肌挫伤模型 |
| 2.3 巨噬细胞剔除 |
| 2.4 MGF处理 |
| 2.5 HE染色 |
| 2.6 Masson三色染色 |
| 2.7 免疫荧光染色 |
| 2.8 RNA提取,cDNA合成和实时聚合酶链式反应(PCR) |
| 2.9 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 注射MGF对巨噬细胞剔除后挫伤骨骼肌肌再生的影响 |
| 3.2 注射MGF对巨噬细胞剔除后挫伤骨骼肌纤维化的影响 |
| 3.3 注射MGF对巨噬细胞剔除后挫伤骨骼肌卫星细胞功能状态的影响 |
| 3.4 注射MGF对巨噬细胞剔除后挫伤骨骼肌巨噬细胞标志物的影响 |
| 3.5 注射MGF对巨噬细胞剔除后挫伤骨骼肌炎性细胞因子的影响 |
| 3.6 注射MGF对巨噬细胞剔除后挫伤骨骼肌趋化因子的影响 |
| 3.7 注射MGF对巨噬细胞剔除后挫伤骨骼肌基质金属蛋白酶的影响 |
| 3.8 注射MGF对巨噬细胞剔除后挫伤骨骼肌gp91phox的影响 |
| 4 讨论 |
| 4.1 注射MGF对巨噬细胞剔除后肌纤维再生无改善作用,但能减轻巨噬细胞剔除后挫伤骨骼肌的纤维化 |
| 4.2 注射MGF不影响巨噬细胞剔除后挫伤骨骼肌卫星细胞的功能状态 |
| 4.3 注射MGF不影响巨噬细胞剔除后挫伤骨骼肌巨噬细胞标志物的表达 |
| 4.4 注射MGF降低巨噬细胞剔除后挫伤骨骼肌炎性细胞因子的表达 |
| 4.5 注射MGF降低巨噬细胞剔除后挫伤骨骼肌趋化因子的表达 |
| 4.6 注射MGF降低巨噬细胞剔除后挫伤骨骼肌基质金属蛋白酶的表达 |
| 4.7 注射MGF降低巨噬细胞剔除后挫伤骨骼肌gp91phox的表达 |
| 5 结论 |
| 全文总结 |
| 缩略词表 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士期间科研与发表论文情况 |
（10）维甲酸诱导心肌致密化不全的基础研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 心肌致密化不全的研究背景与意义 |
| 1.1.1 心肌致密化不全的研究背景 |
| 1.1.2 维甲酸在心肌发育中关键的生理病理机制 |
| 1.1.3 心肌致密化不全基础研究的意义 |
| 1.2 心肌致密化不全的国内外研究历史与现状 |
| 1.2.1 心肌致密化不全的发现和命名 |
| 1.2.2 心肌致密化不全的流行病学调查 |
| 1.2.3 心肌致密化不全的分类 |
| 1.2.4 心肌致密化不全的病因和发病机制 |
| 1.2.5 心肌致密化不全的病理解剖学 |
| 1.2.6 心肌致密化不全的病理生理学和临床表现 |
| 1.2.7 心肌致密化不全的临床诊断与鉴别诊断 |
| 1.2.7.1 心肌致密化不全的临床诊断 |
| 1.2.7.2 心肌致密化不全的鉴别诊断 |
| 1.2.8 心肌致密化不全的治疗 |
| 1.2.9 心肌致密化不全的疗效与预后 |
| 1.2.10 心肌致密化不全的动物模型研究现状 |
| 1.2.11 心肌致密化不全基础和临床研究存在的问题 |
| 1.2.12 心肌致密化不全的基础和临床研究展望 |
| 1.3 本文的主要贡献与创新 |
| 1.4 本论文的主要研究内容 |
| 第二章 建立心肌致密化不全动物模型 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 主要实验试剂和仪器 |
| 2.2.2 实验小鼠 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 心肌致密化不全小鼠模型给药前准备 |
| 2.3.2 心肌致密化不全小鼠模型药物干预 |
| 2.3.3 心肌致密化不全小鼠模型组织收集和组织病理学染色 |
| 2.3.4 幼鼠心脏组织诊断标准与显微镜下观察 |
| 2.3.5 心肌致密化不全小鼠模型实验数据统计学分析 |
| 2.4 心肌致密化不全小鼠模型实验结果与分析 |
| 2.4.1 小鼠合笼后交配情况统计与分析 |
| 2.4.2 小鼠合笼后交配后怀孕情况统计与分析 |
| 2.4.3 RA干预组与对照组孕鼠生产情况统计与分析 |
| 2.4.4 RA干预组与对照组出生幼鼠体重统计与分析 |
| 2.4.5 RA干预组与对照组母鼠体重统计与分析 |
| 2.4.6 心肌致密化不全心脏病理学结果与分析 |
| 2.5 心肌致密化不全小鼠模型建立技术路线 |
| 2.6 本章讨论和结论 |
| 2.7 本章小结 |
| 第三章 TMT相对定量蛋白质组学检测心肌致密化不全相关蛋白 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 主要试剂 |
| 3.2.2 实验小鼠 |
| 3.2.3 心肌致密化不全小鼠模型药物干预前准备 |
| 3.2.4 心肌致密化不全小鼠模型药物干预 |
| 3.2.5 心肌致密化不全小鼠模型心脏组织样品收集 |
| 3.2.5.1 RA干预组与对照组孕鼠及剖腹后幼鼠情况统计与分析 |
| 3.2.5.2 RA干预组与对照组幼鼠心脏组织样品收集与保存 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 蛋白质提取和肽段酶解 |
| 3.3.2 小鼠心脏组织样品TMT标记 |
| 3.3.2.1 样品蛋白组TMT分析预实验 |
| 3.3.2.2 蛋白组TMT分析正式实验 |
| 3.3.3 肽段分级 |
| 3.3.4 液相色谱串联质谱法数据采集 |
| 3.3.5 蛋白质鉴定和定量分析 |
| 3.3.6 生物信息学分析 |
| 3.3.6.1 GO功能注释 |
| 3.3.6.2 KEGG通路注释 |
| 3.3.6.3 GO注释和KEGG注释的富集分析 |
| 3.3.6.4 蛋白质聚类分析 |
| 3.3.6.5 蛋白质相互作用网络分析 |
| 3.4 TMT定量蛋白质组学检测心肌致密化不全相关蛋白结果分析 |
| 3.4.1 主要结果和结论 |
| 3.4.2 实验和生物信息学分析结果 |
| 3.4.2.1 蛋白质鉴定结果汇总 |
| 3.4.2.2 差异表达蛋白质筛选 |
| 3.4.2.3 差异表达蛋白质聚类分析 |
| 3.4.2.4 差异表达蛋白质GO功能富集分析 |
| 3.4.2.5 差异表达蛋白质KEGG通路富集分析 |
| 3.4.2.6 蛋白质相互作用网络分析 |
| 3.5 附件 |
| 3.5.1 质量控制 |
| 3.5.1.1 肽段离子质量偏差分布 |
| 3.5.1.2 肽段离子得分分布 |
| 3.5.1.3 蛋白质丰度比分布 |
| 3.5.2 鉴定蛋白质和肽段特性 |
| 3.5.2.1 蛋白质相对分子质量分布 |
| 3.5.2.2 蛋白质等电点分布 |
| 3.5.2.3 肽段序列长度分布 |
| 3.5.2.4 肽段序列覆盖度 |
| 3.5.2.5 鉴定肽段数量分布 |
| 3.5.3 数据库介绍 |
| 3.5.3.1 NR数据库 |
| 3.5.3.2 UniProt数据库 |
| 3.5.3.3 GO数据库 |
| 3.5.3.4 KEGG通路数据库 |
| 3.5.3.5 STRING数据库 |
| 3.6 TMT相对定量蛋白质组学检测NVM心脏组织技术路线 |
| 3.7 实验结果和讨论 |
| 3.7.1 能量代谢讨论 |
| 3.7.2 凝血功能讨论 |
| 3.8 本章小结 |
| 第四章 PRM技术验证和定量分析心肌致密化不全差异蛋白 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 项目样品基本信息 |
| 4.2.2 实验仪器 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 蛋白提取 |
| 4.3.2 蛋白酶解 |
| 4.3.3 液相色谱平行反应监测质谱定量分析 |
| 4.3.3.1 高效液相色谱分析 |
| 4.3.3.2 高分辨平行反应监测质谱定量分析 |
| 4.4 实验结果与分析 |
| 4.4.1 目标肽段PRM检测结果分析 |
| 4.4.2 差异蛋白表达量分析 |
| 4.4.3 实验结果与结论 |
| 4.5 差异蛋白结构及功能的讨论及分析 |
| 4.5.1 激肽原1结构与功能 |
| 4.5.2 α1抗胰蛋白酶结构与功能 |
| 4.5.3 载脂蛋白AI结构与功能 |
| 4.5.4 β2糖蛋白1结构与功能 |
| 4.5.5 微管蛋白β4α链结构与功能 |
| 4.5.6 通道蛋白4结构与功能 |
| 4.6 本章小结 |
| 第五章 全文总结与展望 |
| 5.1 全文总结 |
| 5.2 后续工作展望 |
| 5.2.1 针对本实验不足的补充研究 |
| 5.2.2 针对本研究后续的工作展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间取得的成果 |
四、凝血酶诱导人类胚胎血管平滑肌细胞明胶酶分泌及活化（论文参考文献）
- [1]DKK1在机械牵张力调节血管平滑肌细胞功能和血管重构中的作用及机制研究[D]. 郑腾飞. 山东大学, 2021(11)
- [2]WDR1在血管平滑肌细胞中参与血管损伤后重构过程的作用研究[D]. 胡继盛. 武汉科技大学, 2021(12)
- [3]紫花牡荆素抑制胃癌细胞迁移与侵袭的机制研究[D]. 阳帆. 南方医科大学, 2020(06)
- [4]NGAL和MMP-9/NGAL与症状性颈动脉粥样硬化及其作为他汀类药物治疗作用的血清学标记物研究[D]. 李洋. 青岛大学, 2020(01)
- [5]三棱内酯B和姜黄素对动脉粥样硬化的影响及其作用机制的研究[D]. 陶斯腾. 吉林大学, 2020(08)
- [6]白藜芦醇抑制ox-LDL诱导血小板TLR4/MMPs表达及减轻增龄小鼠血管损伤作用的分子机制研究[D]. 薛芸. 北京协和医学院, 2020(05)
- [7]艾灸及艾烟改善动脉粥样硬化的细胞自噬机制研究[D]. 哈略. 北京中医药大学, 2020(04)
- [8]从粘多糖代谢探讨胸痹（冠心病）痰浊病机[D]. 朱璞玉. 广州中医药大学, 2020(06)
- [9]IGF-1和MGF干预对巨噬细胞剔除所致骨骼肌再生受损的影响及其作用机制研究[D]. 曾志刚. 上海体育学院, 2019
- [10]维甲酸诱导心肌致密化不全的基础研究[D]. 曹菲. 电子科技大学, 2019(04)