一、结核分支杆菌临床株环丙沙星最低抑菌浓度和GyrA序列测定(论文文献综述)
罗晶晶[1](2018)在《贝达喹啉、德拉马尼和氯法齐明对非结核分枝杆菌体外抑菌活性的测定》文中认为目的:测定非结核分枝杆菌(Non-tuberculosis mycobacteria,NTM)标准株和临床分离株对贝达喹啉(Bedaquiline,Bdq)、德拉马尼(Delamanid,Dlm)和氯法齐明(Clofazimine,Cfz)三种抗结核药物的体外敏感性,并分析耐药基因突变与表型耐药的相关性。方法:本研究共检测了45种NTM标准菌株,205株NTM临床分离株。所有临床分离株均采用同源基因序列比对方法鉴定至种水平。菌株对Bdq、Dlm和Cfz的敏感性采用微孔板梯度稀释法检测最低抑菌浓度(Minimum inhibitory concentration,MIC)。对耐药菌株进行Mar R基因和Atp E基因序列测定,分别分析其与Cfz和Bdq耐药的相关性。结果:应用同源基因序列比对法进行菌种鉴定,205株NTM临床分离株包括:35株胞内分枝杆菌,40株脓肿分枝杆菌,33株偶然分枝杆菌,22株鸟分枝杆菌,45株堪萨斯分枝杆菌,10株戈登分枝杆菌,20株其他少见分枝杆菌。药敏实验结果显示,Bdq对慢生长分枝杆菌(Slowly growing non-tuberculous mycobacteria,SGM)标准株表现出很强的抑菌活性,其中13株MIC<1μg/m L,仅2株≥2μg/m L;Bdq对快生长分枝杆菌(Rapid growing non-tuberculous mycobacteria,RGM)标准株也有较强的抑菌作用,30株RGM中有26株MIC≤1μg/m L,仅4株MIC≥2μg/m L。Dlm对SGM标准株的抑菌活性具有明显的菌种差异,15株SGM中8株分枝杆菌MIC<0.25μg/m L,6株MIC≥32μg/m L,1株MIC=2;但Dlm对RGM标准株的抑菌活性较弱,30株RGM中,24株MIC≥32μg/m L,仅3株MIC<1μg/m L。Cfz对SGM标准株表现出很强的抑菌活性,15株SGM中,14株MIC<1μg/m L,仅1株MIC>8μg/m L;而Cfz对RGM标准株的抑菌活性存在明显的菌种差异性,30株RGM中有18株MIC<1μg/m L,3株MIC≥4μg/m L。不同分枝杆菌菌种对Bdq的耐药率如下:胞内分枝杆菌11.43%(4/35);偶然分枝杆菌9.09%(3/33);脓肿分枝杆菌20.00%(8/40);鸟分枝杆菌0%(0/22);堪萨斯分枝杆菌2.22%(1/45);戈登分枝杆菌20.00%(2/10)。不同分枝杆菌菌种对Cfz的耐药率如下:胞内分枝杆菌48.57%(17/35);偶然分枝杆菌87.88%(29/33);脓肿分枝杆菌90.00%(36/40);鸟分枝杆菌22.73%(5/22);萨斯分枝杆菌4.44%(2/45);戈登分枝杆菌30.00%(3/10)。不同分枝杆菌菌种对Dlm的耐药率如下:胞内分枝杆菌91.43%(32/35);偶然分枝杆菌100%(33/33);脓肿分枝杆菌92.50%(37/40);鸟分枝杆菌68.18%(15/22);堪萨斯分枝杆菌13.33%(6/45);戈登分枝杆菌40%(4/10)。依据MIC50和MIC90值比较,Bdq<Cfz<Dlm。测序分析Mar R基因发现17株胞内分枝杆菌耐药株中,2株存在氨基酸突变(Asp92Glu、Ala153Pro),14株存在同义突变,1株无突变。5株鸟分枝杆菌耐药株中,1株存在同义突变,2株存在氨基酸突变(Asp127Asn),2株无突变。分析Atp E基因发现,15株对Bdq耐药的胞内分枝杆菌、偶然分枝杆菌和脓肿分枝杆菌均不存在Atp E基因突变。结论:本研究中,Bdq具有最好的体外活性,其对大部分NTM临床株具有较好的抑制作用;Cfz对SGM表现出良好的抑菌活性,Dlm对SGM的抑菌活性较RGM好,对大多数RGM抑菌活性较差。根据MIC值分布范围,本研究初步定义了堪萨斯分枝杆菌、鸟分枝杆菌和胞内分枝杆菌对Cfz的流行病学临界值(ECOFF值)分别为0.5μg/m L,1μg/m L和2μg/m L,为设立药敏试验临界值标准提供了依据。生物信息学分析提示Bdq和Cfz耐药分子机制均与Rv0678同源基因突变有关。
刘晓强[2](2012)在《宠物源大肠杆菌对氟喹诺酮类药物的多药耐药机制研究》文中指出致病性大肠杆菌是引起人和宠物尿道感染的主要病原菌之一,氟喹诺酮类药物,特别是恩诺沙星常用于犬、猫尿道感染的治疗。然而随着氟喹诺酮类药物的广泛应用,耐药性也随之增加。大肠杆菌对氟喹诺酮类药物的耐药性的发生通常呈逐步演变并常常表现为多药耐药。多药耐药性的流行会危害人和动物健康,再者,由于人类经常与小动物亲密频繁地接触,犬、猫等身上的耐药菌因此可传给人类,又可引起严重的公共卫生问题。为了进一步探讨大肠杆菌对氟喹诺酮类药物产生多药耐药性的机制,本研究分析探讨了不同代的氟喹诺酮类药物对大肠杆菌的抗菌活性,并系统研究了细菌对氟喹诺酮类药物的耐药机制,旨在为临床控制大肠杆菌多药耐药性提供理论依据。具体获得以下结果:1.喹诺酮类药物对犬、猫尿道大肠杆菌的体外抗菌活性。体外抗菌活性试验研究了11种喹诺酮类药物(分别代表四代:萘啶酸为第一代;恩诺沙星、环丙沙星、氧氟沙星和左氧氟沙星为第二代;奥比沙星和麻保沙星为第三代;加替沙星、普拉多沙星和莫西沙星为第四代)对犬、猫尿道大肠杆菌的体外效能和效力。效能评价指标包括最小抑菌浓度(MIC)和最小防突变浓度(MPC,不包括对喹诺酮类耐药的菌株)。效力评价指标包括相对敏感性,即每个药物的敏感性折点(MICBP-S)与每个药物的MIC的比值(MICBP-S﹕MIC),相对耐药性,即MIC与耐药性折点的比值(MIC﹕MICBP-R)以及突变选择窗(MSW),即MPC与MIC的比值(MPC﹕MIC)。以恩诺沙星作为参照菌,对于恩诺沙星敏感菌,第四代氟喹诺酮类药物和环丙沙星的MIC50和MIC90最小,而萘啶酸、恩诺沙星和奥比沙星的MIC50和MIC90最大(P=0.006)。普拉多沙星的MPC最小(0.29±0.16μg/mL)而氧氟沙星的MPC浓度最大(1.56±0.53μg/mL)(P=0.006)。MSW对于普拉多沙星最小(54.79±30.45)而环丙沙星的最大(152.29±76.04)(P=0.0024)。相对敏感性(MICBP-S﹕MIC)对于普拉多沙星最高(190.1±0.61)而对萘啶酸的敏感性最低(5.33±0.52)(P=0.025)。对于氟喹诺酮类敏感菌,相对耐药性(MIC﹕MICBP-R)可以替代MPC来评估药物的耐药性。此外,本研究98.76%的菌株对于受试喹诺酮类药物具有交叉耐药性。对氟喹诺酮类药物的体外杀菌曲线特点的研究表明,受试的氟喹诺酮类药物均呈现了浓度依赖的特征。2.不同耐药表型大肠杆菌的DNA回旋酶和拓扑异构酶IV的基因突变及质粒流行情况。以恩诺沙星为参照药物,可以发现,DNA促旋酶和拓扑异构酶IV突变数量能够以渐近的方式与MICs水平联系起来。没有gyrB基因突变被发现。且在NDR或SDR菌株未检测到gyrA、parC和parE基因突变。gyrA基因的单个突变(Ser83Leu)会降低细菌对氟喹诺酮类药物的敏感性,此后,随着突变数目的增加,大肠杆菌开始出现耐药性,耐药水平从低水平(恩诺沙星MICs4-16μg/ml)到高水平(恩诺沙星MICs≥128μg/ml)。这些发现证实DNA促旋酶的突变是氟喹诺酮类引起犬、猫尿道大肠杆菌多药耐药菌发生耐药的必要步骤。qnrS和aac(6’)-Ib-cr在泛耐药(PDR)菌株普遍出现(62%),表明这两种质粒介导的耐药基因在多药耐药菌和高水平耐药菌的形成过程中发挥了作用。进化分析研究表明52株细菌中的31株属于系统进化群D群物,15株属于B1群,3株属于B2群,3株属于A群。未发现系统进化群与耐药机制之间的规律性关系。由于受试菌株样本数的数量有限,本次研究未发现ST131克隆株的存在。3.不同耐药表型大肠杆菌的外排泵基因acrB及调节因子的表达大肠杆菌的主要外排泵acrB在不同耐药表型中的表达结果显示,acrB基因在所有受试菌株均有表达,其中在ENRR-MDR菌株中的表达量最大,接下来依次为ENRS-MDR、SDR和NDR菌株。acrB基因在NDR和SDR菌株未出现过量表达,而在20/27株ENRR-MDR菌株以及6/11株ENRS-MDR菌株过量表达。NDR或SDR菌株中的acrB基因表达水平无显着性差异(P>0.05),而差异在ENRS-MDR菌株开始增加(P=0.073),其表达量在所有的恩诺沙星敏感菌和ENRR-MDR有极显着差异(P<0.001)。此外,acrB基因表达量在高水平、中度、低水平耐药菌和氟喹诺酮类敏感菌之间具有显着性差异(P=0.014)。对于大多数多药耐药菌(MDR),acrB基因的表达随着耐药表型的严重性而增加,换句话说,MDR表型越严重,即耐药的种类越多,则acrB基因表达量会更高。对于marA基因,其在6株ENRR-MDR菌株和3株ENRS-MDR菌株中表达增加,包括两株acrB表达增加和1株SoxS表达量提高的ENRS-MDR菌株。此外,SoxS在3株ENRR-MDR菌过量表达,且与acrB的过量表达相关。膜孔蛋白ompF基因在8株细菌中表达量增加,而在44株中的表达量下降,包括24株ENRR-MDR菌株和20株ENRS-MDR菌株。4.不同氟喹诺酮类药物对外排泵表达的影响qRT-PCR结果显示四种外排泵在ENRS-MDR菌株和ENRR-MDR菌株中均有表达,其中以emrE和acrB的表达相对明显。各外排泵在ENRR-MDR菌株中的表达量高于ENRS-MDR菌株。细菌在氟喹诺酮类药物压力下,四种外排泵的表达量显着升高。在ENRS-MDR菌株,emrE外排泵表达量增加了1.12-5.4倍,acrB外排泵基因表达量提高了1.23-3.60倍,macB基因表达提高了1.40-6.58倍,cmr基因表达量增加了1.52-5.91倍。对于ENRR-MDR菌株,四种相应的外排泵基因表达量分别增加1.22-5.87倍、1.04-2.94倍、1.34-6.29倍和1.47-5.77倍。不同的氟喹诺酮类药物压力对外排泵基因表达的影响也有差异,其中以恩诺沙星最为明显,接下来依次为环丙沙星、奥比沙星、麻保沙星、莫西沙星、加替沙星和普拉多沙星。这种规律基本和这几种氟喹诺酮类药物对大肠杆菌的抗菌活性的强弱相一致。另外,四种外排泵基因在大肠杆菌中的表达也有差异,其中以emrE的表达最为显着,其次为acrB基因表达> macB基因表达> cmr基因表达。我们的研究首次证明,和其它几个受试外排泵相比较,emrE基因的表量增加最多。细菌和低剂量的氟喹诺酮类药物接触会引起外排泵的迅速而明显地升高。表明日常使用氟喹诺酮类药物治疗犬、猫尿道感染应慎重。5.体外诱导宠物源大肠杆菌对普拉多沙星的耐药性及机制采用体外浓度递增法可诱导犬、猫尿道大肠杆菌对普拉多沙星、环丙沙星和麻保沙星产生耐药性,耐药性产生的快慢依次为环丙沙星、麻保沙星和普拉多沙星。和环丙沙星和麻保沙星一样,普拉多沙星诱导的耐药菌首先在gyrA基因发生突变,此后随着MIC的升高,靶基因突变的数目也逐渐在增多。另外,分别有4个由环丙沙星和麻保沙星诱导的耐药突变株的SoxS发生Ala12Ser突变,而该突变在普拉多沙星诱导的耐药株中未检测到。acrB基因在所有诱导的耐药菌株均有不同程度的过量表达,且在环丙沙星和麻保沙星诱导的耐药株中的表达高于普拉多沙星所诱导的耐药株中的表达。另外,acrB基因的表达随MIC的升高和多药耐药的程度的增加而增加。结论:普拉多沙星所引起的犬、猫尿道大肠杆菌多药耐药性主要由靶基因点突变和外排泵过量表达组合所导致。
温华成[3](2012)在《黄颡鱼源嗜水气单胞菌的分离鉴定及对三种氟喹诺酮类药物和氟苯尼考的耐药性研究》文中提出嗜水气单胞菌是一种能引起鱼类等水产动物败血症、危害性极大、可造成水产养殖业重大经济损失的病原菌。喹诺酮类药物、氟苯尼考因具价格低、广谱高效、副作用小等特点而成为近年来水产常用的治疗药物。但近几年来也看到不少如大肠杆菌、链球菌、杀鲑气单胞菌、嗜水气单胞菌等菌株对氟喹诺类酮药物的耐药性在日益增强的报道。嗜水气单胞菌作为淡水渔业危害极大的病原菌,了解其对三种喹诺酮类药物和氟苯尼考的耐药分子机制,对水产养殖业的可持续发展和科学用药,建立实验室耐药模式菌等均有重大的意义。本试验从广西永福、梧州、桂平3个养殖区域12批次的黄颡鱼病样中共分离鉴定到细菌30株,其中16株为嗜水气单胞菌,占已鉴定菌株总数的53.33%,说明嗜水气单胞菌是黄颡鱼病害中检出率较高的细菌,在这16株嗜水气单胞菌中,有12株为β型溶血,4株不溶血。对这16株嗜水气单胞菌进行了致病性感染试验,结果显示,除了YF13这株非溶血株无致病性外,其余15菌株均为致病性菌株,但致病菌株间的致病力存在一定差异。K-B纸片法药敏结果显示,15株黄颡鱼源嗜水气单胞菌对19种药物敏感率分别为OXA (6.7%)、AMP(0.0%)、FOR (86.7%)、CEF (46.6%)、ROC (100%)、 STR (87.6%)、GEN (100%)、SXT (40.0%)、NEO (93.3%)、SUL (73.3%)、 NOV (6.7%)、NOR (100%)、ENR (100%)、LEV (100%)、ENO (60.0%)、 OFL (100%)、CEF (80.0%)、FLR (93.3%)、SAR (93.3%);微量稀释法试验结果:15株菌株除一株对SAR中介外,其余为敏感,15株菌株对ENR、OFL敏感,所测8株菌对FLR敏感。对3种喹诺酮类药物和氟苯尼考进行耐药性的获得速率试验结果显示,嗜水气单胞菌经3种喹诺酮类药物和氟苯尼考耐药诱导后,均获得很高的耐药性,其中采于梧州、桂平的菌株对SAR耐药率较永福的总体要低,梧州株为256倍,桂平株均低于256倍,永福株获得速率最小为512倍,最大的为2048倍,且大部分永福菌株获得速率均大于512倍;采集于梧州、桂平的菌株对ENR耐药率较永福的总体要低,梧州株低于128倍,桂平株低于512倍,永福株获得耐药率最小为32倍,最大为2048倍,且大部分永福菌株增大512倍;采集于梧州、桂平的菌株对OFL耐药率较永福的总体要低,梧州株低于512倍,桂平株低于512倍,永福株获得耐药率最小为128倍,最大为2048倍,且大部分永福菌株增大1024倍;所测菌株对FLR均获得了稳定的耐药性,但相对喹诺酮类药物增幅普遍不大,获得的速率最大的是GP35,为512倍,最小的是WZ02和GP32,为16倍,此外,耐药突变株还存在对同类药物较高的耐药性,对不同类药物也存在一定的交叉耐药性。耐药突变株耐药性的遗传稳定性试验结果显示,15株菌株除了YF04菌株对ENR、OFL药物的耐药性呈现逐渐减弱的趋势,分别从20μg/ml、160μg/ml降低为10μg/ml、80μg/ml,其余菌株对SAR、ENR、OFL、FLR均保持稳定的耐药遗传性;耐药突变株的保存条件探讨试验结果显示,耐药突变株基本表现出对SAR、ENR、OFL、FLR药物的耐药性呈现减弱的趋势,但变化幅度较小,其中对SAR、ENR、OFL降低的倍数最大为4倍,对FLR药物降低的倍数最小为8倍。说明大部分耐药突变株均保持比较稳定的耐药遗传性,为建立未来耐药模式菌株提供了基础。对4株临床分离株和6株喹诺酮耐药突变株的gyrA和parC基因的QRDR区进行PCR扩增、克隆和测序,并采用NCBI、DNAstar、DNAman分析软件分析。结果显示,gyrA基因:桂平临床分离株GP31和GP35之间同源性为100%,GP31和GP35菌株与永福的临床分离株YF04、YF11同源性为98.8%;永福临床分离株YF04、YF11之间的同源性为99%,耐药突变株之间的同源性为100%。parC基因:桂平的临床分离的敏感株GP31和GP35之间的同源性达为100%,GP31和GP35菌株与永福临床分离株YF04和YF11之间的同源性分别为97.1%和96.9%;永福临床分离株YF04与YF11之间的同源性为96.9%,耐药突变株之间的同源性为100%。序列分析表明,相对临床分离敏感株,耐药突变株的gyrA、parC基因的QRDR区各有1个氨基酸突变位点,其中gyrA基因上第83位点发生了突变,为Ser→Ile, parC基因上第87位点发生了突变,为Ser→Ile, gyrA基因Ser83突变且parC基因Ser87突变与菌株的耐药存在一定的关系。
陈品[4](2011)在《副猪嗜血杆菌耐药性分子机制研究》文中研究指明副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis, HPS)是猪上呼吸道的一种常在菌或条件致病菌,1910年K.Glasser首先发现并报道该病原,该菌感染猪后可引发多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎。近年来,由副猪嗜血杆菌所引起的革拉瑟氏病已成为影响养猪业发展的一种重要细菌性疾病。发病后及时采用抗生素进行治疗可显着降低动物死亡率,同时在生产过程中适当添加抗生素也可在一定程度上降低该病的发生率。但随着大量抗菌药特别是广谱抗菌药在养猪业中的广泛使用,细菌对抗菌药物的耐药性问题日趋突出,与此同时也有研究资料表明亚抑制浓度的抗生素可以影响细菌的代谢过程而改变细菌的毒力或细菌对环境的适应能力等。本研究围绕副猪嗜血杆菌对喹诺酮类药物的耐药机理、耐药质粒的分布情况及其与亚抑制浓度氟苯尼考相互作用进行研究,以了解副猪嗜血杆菌耐药情况、耐药机理及亚抑制浓度氟苯尼考对其转录谱的影响,为合理使用抗菌药物提供理论基础,主要研究内容、方法及结果如下:1.副猪嗜血杆菌耐喹诺酮类药物的机制研究副猪嗜血杆菌血清型众多,免疫预防往往因为疫苗交叉保护力低而致免疫失败,抗生素治疗便成为控制革拉瑟氏病的主要手段和措施。氟喹诺酮类药物因具有抗菌谱广、杀菌力强等优点而在养猪生产过程中得到广泛应用。研究表明细菌对喹诺酮类药产生耐药性主要通过编码旋转酶和拓扑异构酶的基因gyrA和parC发生突变而引起,同时也存在由质粒qnr及外排泵所介导的耐药。目前国外已围绕副猪嗜血杆菌的药物敏感性及耐药性等问题进行了大量研究,但国内的相关研究相对较少。本研究首先采用特异性16S rRNA PCR方法对临床分离株进行鉴定,确认分离株是副猪嗜血杆菌后测定菌株对萘啶酸、环丙沙星和恩诺沙星的敏感性,然后用特异性PCR扩增副猪嗜血杆菌标准菌株和MIC值较高的临床分离株的gyrA和parC基因的喹诺酮耐药决定区(QRDR)并进行测序。采用Blast法对测序结果进行分析,包括副猪嗜血杆菌标准血清型间的比对及耐药株与敏感株之间的比对。在测MIC的同时添加外排泵抑制剂苯丙氨酸-精氨酸-β-萘酰胺以检测是否存在由外排泵介导的细菌对喹诺酮类药物的耐药性,同时还设计特异性引物以扩增质粒qnr以检测是否存在由质粒所介导的细菌对喹诺酮类药物的耐药性。研究结果表明,副猪嗜血杆菌标准血清型的QRDR序列间具有高度的保守性,未发现有差异基因。而耐药株的gyrA和parC的QRDR区域存在数量不等、位置各异的突变位点,其中GyrA以83位和87位的突变为主,发生突变的主要方式为ser-83-phe和ser-83-tyr,asp-87-asn、asp-87-gly和asp-87-tyr。而ParC以73位和77位为主;GyrA的突变在副猪嗜血杆菌耐喹诺酮类药物的机理中占主导作用,而ParC的突变仅起次要作用,往往发生于GyrA突变之后。在所用的临床分离株中未发现由质粒和外排泵所介导的细菌对喹诺酮类药物的耐药性。研究结果可以为制定副猪嗜血杆菌对喹诺酮类药物的敏感性判定标准提供理论依据。2.副猪嗜血杆菌耐药质粒的提取及功能分析常见的耐药因子达数百种之多,其中部分耐药因子可通过染色体突变产生并可以垂直传播,部分耐药因子由质粒等可移动元件所介导,能够水平传播。目前CLSI尚未确定各种抗菌药物对副猪嗜血杆菌耐药性的判定标准,因此不能仅仅依据各种药物对副猪嗜血杆菌的MIC值大小确定菌株是否耐药,若直接用PCR等方法去检测耐药因子则效率较低。本研究通过从副猪嗜血杆菌临床分离株提取耐药质粒,以了解副猪嗜血杆菌临床分离株耐药质粒的流行情况及可能的耐药情况。本研究用Qiagen公司质粒小提试剂盒对156株副猪嗜血杆菌临床分离株进行质粒提取,所获得的质粒先用合适的内切酶进行酶切,再与相应的载体连接后转化感受态细胞,挑阳性重组子进行测序、注释,进而获得质粒分离菌株的耐药情况。本研究仅在1株临床分离株(A67)中分离出质粒,其大小约为4.2kb。内切酶Sau3AI可以将所分离出的质粒进行有效切割,获得大小分别为2.7kb和1.5kb的片段,将小片段与经内切酶BamHI进行酶切后的pUC19载体进行连接,连接产物成功转化BL21感受态细胞,挑选阳性重组子送上海生工生物有限公司用M13正、反向引物对插入序列进行测序。再根据所测得的小片段的碱基序列设计引物,以所提质粒为模板进行测序,直至测通。用DNAstar软件对测序所获得的序列进行拼接并删除重复序列,得到一闭合环状的质粒DNA,其大小为4248bp,其中主要包含有mobA、mobB和mobC等移动因子和sul2及strA两种耐药因子,质粒序列已保存至GenBank(No. FJ670543)。对含有耐药质粒的菌株进行了链霉素和磺胺甲基异恶唑的药物敏感性试验,其MIC值大小分别为128和512μg/mL。所提取的质粒可以成功转化至多杀性巴氏杆菌,转化菌对上述两种药物也产生耐药性。研究结果表明,该质粒可以介导副猪嗜血杆菌对链霉素和磺胺类药物产生耐药性。3.亚抑制浓度氟苯尼考对副猪嗜血杆菌转录谱的影响研究不同浓度的抗生素对细菌会产生不同的作用,高浓度抗生素对细菌产生抑制或杀灭作用,而低浓度抗生素不但不能抑制或杀灭细菌,而且有可能作为一种信号物质对细菌的代谢过程进行调节,进而影响细菌的毒力和适应性等特性。本研究选用我国养猪生产中广泛使用的广谱抗生素——氟苯尼考作为研究对象,探讨亚抑制浓度氟苯尼考对副猪嗜血杆菌转录谱的影响。根据GenBank所公布的副猪嗜血杆菌SH0165株全序列(CP001321)设计探针,由Agilent公司进行芯片的设计与制作。将副猪嗜血杆菌临床分离株SH0165株分别于添加亚抑制浓度氟苯尼考(0.25μg/mL)和不添加药物的条件下培养16h,分别提取mRNA用于后续的芯片研究,每个处理组设3个生物学重复。以mRNA进行反转录获得cDNA及cRNA,并对cRNA进行荧光标记,点校进行检测而获得差异表达基因,用实时荧光定量PCR对差异表达基因进行验证。经亚抑制浓度氟苯尼考作用后,副猪嗜血杆菌的转录谱较对照组发生较明显的改变,共有163个基因表达水平变化在1.5倍(p<0.05)以上,其中96个基因表达上调,另外67个基因表达下调。表达上调的基因主要包括参与碳水化合物代谢、铁离子摄取与利用、潜在毒力因子神经氨酸酶等,这些基因的表达上调可以增强细菌对环境的适应能力,同时也可能改变菌株的潜在毒力。而作为主要抑制蛋白质合成的抗生素,亚抑制浓度氟苯尼考对蛋白质合成的相关基因的抑制作用却很轻微。本研究结果表明,临床上使用低剂量抗生素预防呼吸道细菌性感染时有必要考虑药物对细菌生理生化活动的影响,特别是要注意在抗生素的作用下细菌的毒力及适应性方面的改变。
游思湘[5](2011)在《中药抑制剂血清药理学研究及对相关基因影响》文中提出本文以耐药机制清楚的金黄色葡萄球菌为试验菌,探讨复方黄连注射剂的体外耐药抑制作用和含药血清的药理作用与抑菌能力,同时探讨复方黄连注射剂对诱导耐药金葡菌的DNA旋转酶亚单位A基因(gyrA基因)序列的影响,初步从分子水平探讨复方黄连注射剂的耐药抑制分子机理,为复方黄连注射剂及中药耐药抑制剂的开发应用提供一定的研究基础。本研究的第一部分是确定6株乳源性耐药金葡菌的耐药谱和耐药性,建立耐药菌株库,探讨复方黄连注射剂的体外耐药抑制作用。同时通过质粒消除试验,初步了解复方黄连注射剂的耐药分子基础,为后续试验奠定基础。试验结果表明,6株乳源性耐药金葡菌对氧氟沙星、诺氟沙星、阿莫西林、头孢噻吩、环丙沙星等抗菌药均具有抗药性,为多重耐药株。通过采用不同浓度梯度的诺氟沙星、环丙沙星、阿莫西林、头孢噻吩逐级诱导建立了耐各种水平药物的耐药菌株库。挖孔法、药敏纸片法试验结果表明:复方黄连注射剂可显着提高耐药金葡菌对氟喹诺酮类药物的敏感性,具有耐药抑制作用。质粒消除试验表明,耐药金葡菌的耐药性与质粒无关。本研究的第二部分是通过对流动相的组成、柱温、保留时间、紫外检测波长等多因素考核和筛选,建立反相高效液相色谱法测定复方黄连注射剂和含药血清中盐酸小檗碱浓度的方法,并通过血药浓度的测定,进行血清药理学研究,初步了解复方黄连注射剂的体内药效作用。复方黄连注射剂含药血清药理学研究结果表明:复方黄连注射剂含药血清对耐药性金葡菌具有明显的耐药抑制作用,对S1~S5的MIC为0.125μg/ml,对Sa6为0.25μg/ml.抑菌圈直径在14-17mm之间,说明盐酸小檗碱是复方黄连注射剂中起抗菌作用的主要成分。本研究的第三部分是探讨金葡菌对氟喹诺酮类耐药与gyrA基因序列突变的关系及复方黄连注射剂对诱导耐药金葡菌gyrA基因序列的影响。gyrA基因序列突变和氨基酸序列突变分析表明:细菌的耐药性程度越高,碱基突变和氨基酸突变率增加。本试验结果表明:gyrA基因32、43和125等碱基多位点突变,可导致金葡菌对诺氟沙星产生耐药;251和295位碱基突变,则会导致其高水平耐药。经复方黄连注射剂处理的耐药金葡菌gyrA基因序列发生了251位碱基C→T和295位碱基A→G的回复突变作用;氨基酸序列发生了84位缬氨酸→丝氨酸、99位氨基酸谷氨酸→赖氨酸的回复突变作用,因此耐药金葡菌对诺氟沙星敏感性大大提高,产生耐药抑制作用。
夏强[6](2011)在《中国结核分枝杆菌临床分离株二线抗结核药物耐药性的初步研究》文中认为目的:评价BACTEC MGIT 960法检测一线、二线抗结核药物敏感性的效果;初步分析结核分枝杆菌喹诺酮类药物耐药株gyr基因突变特点,探讨耐药表型与gyr基因突变的关系;用间隔区寡核苷酸分型(Spacer oligonucleotide typing,Spoligotyping)对结核分枝杆菌临床分离株进行基因分型,分析北京家族菌株与喹诺酮类药物耐药的相关性。材料和方法:1 214株结核分枝杆菌临床分离株是从中国疾病预防与控制中心传染病所结核病实验室/传染病预防控制国家重点实验室结核病组保存的结核分枝杆菌菌株库中抽取。2分别采用“世界卫生组织/国际防痨与肺部疾病联合会”推荐的比例法及世界卫生组织推荐的BACTEC MGIT 960方法,对所选菌株进行一线抗结核药物异烟肼(Isoniazid, INH)、利福平(Rifampicin, RFP)、链霉素(Streptomycin, SM)和乙胺丁醇(Ethambutol, EMB);二线抗结核药物卷曲霉素(Capreomycin, CPM)、卡那霉素(Kanamycin, KAN)、氧氟沙星(Ofloxacin ,OFLX)、乙硫异烟胺(EthionamideETH)敏感性试验,综合比较分析两种方法的结果,进行验证、评估。3采用直接测序法检测结核分枝杆菌耐药相关基因gyrA、gyrB的突变情况并分析基因突变与耐药表型及结核分枝杆菌北京基因型的关系。结果:1用BACTEC MGIT 960法与L-J固体比例法对214株结核分枝杆菌临床分离株进行药物敏感性检测,异烟肼、利福平、链霉素、乙胺丁醇、卷曲霉素、卡那霉素、氧氟沙星和乙硫异烟胺的符合率分别97.7%(209/214)、94.4%(202/214)、95.3%(204/214)、83.1%(178/214)、96.0%(205/214)、94.9%(203/214)、97.7%(209/214)和85.5%(183/214)。BACTEC MGIT 960法进行一线抗结核药物药敏试验所需时间平均8.07天,较L-J固体比例法26.27天提前18.20天,二线抗结核药物药敏试验所需时间平均为7.75天,较L-J固体比例法25.92天提前18.17天。两者间的差异具有显着统计学意义。2 214株结核分枝杆菌临床分离株中有59株对氧氟沙星耐药,其中50株为MDR-TB合并氧氟沙星耐药。耐药株中有41株gyr基因发生突变,突变率为69.5%,其中40株为MDR-TB合并氧氟沙星耐药。40株为gyrA基因突变,突变位点包括90,91和94位氨基酸;5株为gyrB基因突变,突变位点为500,506,534和539位氨基酸,4株为gyrA和gyrB基因共同突变。3 214株结核分枝杆菌临床分离株中,北京基因型和非北京基因型菌株对二线药物氧氟沙星的耐药率分别为40.21%和34.48%,两者间的差异无统计学意义(X2=0.23, P>0.05);gyrA基因的90、91、94氨基酸位点突变在结核分枝杆菌北京基因型与非北京基因型间的发生率分别为17.95%、7.69%、41.03%和10%、10%、35%,差异无统计学意义(X2=0.43、0.18、0.67,P>0.05)。结论:1 BACTEC MGIT 960药敏方法与传统L-J固体比例法对于一线抗结核药物异烟肼、利福平和链霉素;二线药物卷曲霉素、卡那霉素和氧氟沙星的药敏检测结果具有较好的一致性,但乙胺丁醇和乙硫异烟胺的药敏检测结果一致性较低,还需进一步研究。2 BACTEC MGIT 960法所需的检测时间较短,有利于耐药结核病人的早期诊断和治疗。3结核分枝杆菌喹诺酮类药物的耐药主要与gyr基因突变有关,gyrA基因突变是gyr基因突变的主要形式。其中94、90、91位氨基酸突变特异性较高,可作为喹诺酮耐药标志,为进行喹诺酮类药物耐药的快速检测和监测提供了良好基础。4从常规耐药和gyr基因突变检测结果显示北京型MTB菌株与喹诺酮类药物耐药及耐药基因突变无明显的相关性。
邵丽丽[7](2010)在《沙眼衣原体抗菌素耐药及治疗失败的评估》文中认为目的探讨对泌尿生殖道沙眼衣原体临床株进行多次传代培养的意义;检测本地区近年来泌尿生殖道沙眼衣原体对大环内酯类、四环素类、喹诺酮类抗菌素的体外药物敏感性;筛查耐药株,并从基因水平上探讨其耐药机制;评价药敏结果与临床疗效的相关性,评估抗菌素耐药与临床治疗失败。方法培养McCoy细胞至孔板中,置于37℃、5%CO2温箱中孵育,18~24h后生长至致密单层后,接种沙眼衣原体标准株和临床株,培养48~72h后,用卢戈氏碘液染色鉴定培养结果,凡是培养阴性的标本继续传代培养至五代。为评估多次传代后培养法的敏感性,选用沙眼衣原体内源性质粒基因片段为引物,PCR扩增检测沙眼衣原体;42株阳性标本传代培养至感染率达90%以上,收集标本进行9种常用抗菌素的药敏试验。核酸扩增临床分离株的omp1基因并用AluⅠ、MspⅠ双酶切进行基因分型。PCR方法扩增检测四环素耐药质粒tetM基因;同时用RT-PCR, PCR方法分别扩增与大环内酯类耐药相关的23S核蛋白体RNA基因、核糖体蛋白基因L4,通过产物测序检测基因突变;限制性片段分析(RFLP)检测gyrA喹诺酮耐药决定区(Quinolone-Resistance Determining Region, QRDR)常见的基因点突变。统计方法:试验结果采用卡方检验和Spearman相关性分析,确定检验水准a=0.05,应用SPSS16.0统计软件计算卡方值、相关系数,确定P值,P<0.05即有统计学意义。结果299例样本中细胞培养法共检测到104株阳性标本,阳性率为34.78%。初次培养(原代)阳性率5.69%,传代一次后(二代)阳性率为20.07%,传代两次后(三代)阳性率为33.44%,传代三次后(四代)阳性率为34.78%,传代四次后(五代)阳性率仍为34.78%。前三代随着传代,阳性例数及阳性率明显增加,而四代、五代基本上处于稳定趋势。PCR扩增检测结果除了24例培养法检测阴性而PCR法检测为阳性的标本外,余与细胞培养法完全一致。临床标本细胞培养检测结果与临床疗效之间存在关联性(χ2=8.242,P=0.004<0.05),差异有统计学意义。临床治疗成功的标本更易于细胞培养,治疗失败的标本不易于细胞培养检测,随着多次传代培养,阳性率明显增加。药敏MIC(单位均为mg/L)结果分别为红霉素:0.5~2,克拉霉素:0.008~0.032,阿奇霉素:0.125~0.5,四环素:0.157~0.625,多西环素:0.063~0.125,米诺环素:0.032~0.128,左氧氟沙星:0.5~1,莫西沙星:0.06~0.12,司帕沙星:0.064~0.128,其中发现2株红霉素耐药株(MIC值:2mg/L),其23s rRNA基因有C2452A、T2611C的突变(大肠杆菌序列编号),红霉素耐药株及敏感株L4基因均发现脯氨酸113(CCG)→亮氨酸(CTG)、脯氨酸156(CCC)→丙氨酸(GCC)两个位点的突变(GenBank NC000117.1),25株临床分离株中检测到tetM基因,未发现gyrA-QRDR基因中Ser83→Ile点突变。将42株临床分离株进行基因分型,结果发现1株为D型,余均为E型。结论传代培养可以明显提高临床株沙眼衣原体的检出率,盲传一次的检验标准有一定的漏诊率,临床株应传代培养至三代,其培养的成功将为实验室开展该病原体的致病机理、免疫机制、体外药物敏感性检测、耐药机制和保护性疫苗等方面的研究奠定基础。随着时间的推移,抗菌素的敏感性呈不同程度的下降,克拉霉素体外抗沙眼衣原体活性最强。米诺环素,司帕沙星、莫西沙星等均有较强的抗沙眼衣原体感染活性,但其MIC值较以往文献报道增高。C2452A、T2611C的突变导致红霉素低水平耐药,L4基因的点突变可能与红霉素耐药无关,tetM基因阳性率(59.2%)较高,表明体内对四环素敏感性普遍降低。喹诺酮类实验室突变株可能在临床株中并不常见。沙眼衣原体对抗菌素的耐药机制有待进一步研究。E型为沙眼衣原体的优势基因型。以细胞培养法为基础的体外药敏试验与临床疗效之间存在差异。临床治疗失败影响培养结果,沙眼衣原体抗菌素耐药可引起临床治疗失败,需要扩大样本量,建立多中心研究进一步证实。
仲崇岳[8](2009)在《鸭疫里默氏杆菌基因分型及耐药机理的研究》文中进行了进一步梳理鸭疫里默氏杆菌(R.anatipestifer)是引起水禽细菌性疾病的主要病原之一。目前公认的血清型众多,各血清型之间很少有交叉保护作用,虽然疫苗的效果很显着,但受血清型的局限,R.anatipestifer感染还是很难得到控制,所以实际生产中使用大量的化学药物对鸭疫里默氏杆菌病进行治疗。但是到目前为止,关于R.anatipestifer耐药机理的文献有限,因此本论文根据目前我国用药的现状,对分离自我国不同地区和时间的R.anatipestifer的耐药性、基因型和耐药机理进行了系统的研究,报告如下:1.为了研究分离自我国RA临床株的耐药性和耐药变迁规律有,采用K-B纸片法对1998-2005年分离的224株RA对9大类36种常用药物的耐药性进行了检测,使用WHONET 5.3软件对结果进行分析。结果表明RA临床株对氨曲南、头孢吡肟、青霉素G、苯唑西林、头孢他啶和复方新诺明耐药率最高,分别高达87.8%、64.3%、86.9%、88.6%、75.9%和79.2%,而对阿米卡星、头孢哌酮、亚胺培南和新霉素的敏感率最高,依次为85.1%、70.6%、95%和61.8%,耐药率低于10%。比较耐药谱发现R.anatipestifer耐药谱以10~29种药物为主,即呈现泛耐药现象。比较耐药率变化规律发现除氨曲南、大观霉素、头孢哌酮和哌拉西林外,RA临床株对其它药物耐药率并无规律可寻,这可能是由于各地区血清型和用药习惯不同造成分离的RA耐药性不同有关,因此在用药前应先进行药物筛选。2.抽取72株耐β-内酰胺类药物的菌株,建立快速脉冲电泳分型方法,经限制性内切酶SmaⅠ酶切,将R.anatipestifer基因组切成6-19条带。以80%相似性为界将多重耐药菌株分为60个脉冲电泳型,与耐药谱型相比两者没有相关性。本实验建立的快速样品处理方法,可以将菌体蛋白消化时间缩短为1.5h,从菌体沉淀到获得脉冲电泳图片整个过程可以在30h之内完成,经重复性实验,证明该方法快速稳定,重复性好,解决了使用脉冲电泳方法在R.anatipestifer流行病学和遗传学的研究中出现的耗时长的确定。3.通过对R.anatipestifer携带1、2和3型整合子检测和sul1、sul2和sul3基因检测,结果表明,共检测出4种结构的1型整合子:aadAl1-qacE△1-sul1(17株),dhffⅠ-aadA2-qacE△1-sul1(1株),sul(29株)和非典型整合子(2株),1型整合子携带率为61.11%,有5株同时携带2种1型整合子,其中4株同时携带aadAl1-qacE△1-sul1和sul1,1株同时携带dhfrⅠ-aadA2-qacE△1-sul1和sul1,所有的菌株均未检测到2型和3型整合子。通过sul基因检测发现,有53株RA携带sul基因,其中50株只携带sul1基因,2株同时携带sul1和sul2基因,1株只携带sul2基因,所有的菌株均未检测到sul3基因,sul基因携带率为73.61%,这与RA临床株对磺胺类药物耐药率为88.89%相接近,因此可以推断携带sul基因是RA临床株耐磺胺类药物药主要原因之一。通过整合子检测得出25%的RA临床株携带aadA基因,耐药泵表型检测得出65.28%的菌株携带有耐药泵,比较CCCP作用前后RA对链霉素MIC值的变化得出RA对氨基糖苷类药物的耐药性主要由整合子携带aadA基因和耐药泵共同作用引起。4.经PCR检测,四环素耐药基因tetC携带率为16.67%,其中1株同时也携带tetA基因;tetM基因携带率为11.11%,其中1株同时也携带tetC基因。将K-B纸片法和MIC实验结果对比发现在耐药率上相差很大,可能是由于所采用的判断标准不适于R.anatipestifer,通过建立荧光染料定量RT-PCR法对R.anatipestifer四环素耐药基因mRNA水平的研究和MIC实验结果,认为R.anatipestifer对四环素类药物的抗药性与携带tet基因有关,但是也存在其它的耐药机制。5.选取5株氧氟沙星耐药株,通过CCCP耐药泵表型检测,左氧氟沙星和新喹诺酮药物CO-06NF诱导,抽提外膜蛋白和全菌蛋白电泳,SSCP对GyrA基因诱导前后突变检测,结果显示5株菌有4株携带耐药泵,对诱导成功的1株菌株外膜蛋白和全菌蛋白进行SDS-PAGE电泳后发现,左氧氟沙星诱导耐药株外膜蛋白内有变化,CO-06NF诱导耐药株在接近21KD处的一条蛋白质条带表达量明显增加,全菌蛋白电泳发现,左氧氟沙星诱导耐药株和CO-06NF诱导耐药株在45KD处有一条共同条带表达量高于诱导前。而SSCP电泳检测GyrA基因发现诱导前后没有变化,这株细菌耐药泵检测为阳性,因此由结果推测R.anatipestifer对喹诺同类药物的耐药主要由耐药泵引起,而且最先发生突变耐药基因可能不是GyrA基因。6.72株临床株对苯唑西林、青霉素G和头孢吡肟耐药率分别为100%、97.22%和95.83%,对头孢噻肟的耐药率也达到70.83%,MIC检测结果与纸片法检测结果相一致。加入CCCP后,RA对苯唑西林、青霉素G、头孢噻肟和头孢吡肟的耐药率依次下降为91.67%、55.56%%、21.97%和44.44%,MIC值最低可降至处理前的1/2048。而β-内酰胺酶表型和基因型检测均为阴性,说明不存在β-内酰胺酶耐药机制,而耐药泵介导耐药是R.anatipestifer主要原因之一,通过头孢吡肟诱导试验,和外膜蛋白电泳发现在14.4~20KD和45KD处各有两条条带发生缺失。诱导株加入CCCP后,MIC值只下降为原来一半,说明可能这株诱导株对头孢吡肟的耐药性是由膜通透性降低引起,因此R.anatipestifer耐药株存在耐药泵出机制,推测也存在膜通透性降低引起的耐药机制。
苑青艳[9](2009)在《猪链球菌对氟喹诺酮类药物耐药性与耐药基因的研究》文中提出猪的链球菌病是由多种溶血性链球菌引起的一种多型性疫病,已成为现代养猪业生产经济损失重要的疫病之一。最常见的致病类型为血清型2型,人感染猪链球菌主要引起脑膜炎、败血症等严重疾患。根据近些年来的报道,猪链球菌对氟喹诺类酮药物的耐药性也在日益增强。氟喹诺酮类药物的作用机制是抑制细菌拓扑异构酶Ⅱ及拓扑异构酶Ⅳ的活性,导致细菌无法正常分裂而死亡。目前报道的猪链球菌对氟喹诺酮类药物的耐药机制是靶位改变和外排增强。氟喹诺酮类药物作用靶位拓扑异构酶Ⅳ由ParC及ParE组成,分别由parC、parE基因编码。DNA旋转酶为三磷酸腺苷能量依赖性Ⅱ类拓扑异构酶,由两对亚单位GyrA和GyrB组成,分别由gyrA、gyrB基因编码。突变点位多发生于ParC及GyrA的67和106残基间这一狭窄区域,因此该区域被称作gyrA及parC基因的喹诺酮耐药决定区(Quinolone resistance determining region,QRDR)。目前国内还未见对猪链球菌parC、gyrA基因点突变与耐药性的相关报道。本研究将对东北地区分离的耐氟喹诺酮类药物猪链球菌的gyrA、parC基因的点突变及氨基酸突变进行研究,阐明gyrA、parC基因的点突变及氨基酸突变与耐药水平的关系,为预防猪链球菌耐药性提供科学的理论基础。利用东北地区不同猪场健康猪及发病猪的鼻腔棉拭子为样品,利用生化试验、兰氏分群的方法分离出100株猪链球菌并对其进行致病性试验;通过纸片扩散法和微量稀释法测定猪链球菌对九种常用的抗菌药物以及11种氟喹诺酮类药物的敏感性;通过PCR方法扩增28株猪链球菌氟喹诺酮类药物耐药株的parC和gyrA基因的QRDR区并测序分析。猪链球菌生化试验的结果表明:马尿酸盐和高盐肉汤均为100%阴性,棉籽糖和菊糖57%为阴性,甘露醇和乳糖98%为阳性,山梨醇90%为阳性,七叶苷、水杨苷和蕈糖均为100%阳性;兰氏分群98%为D群;猪链球菌对氯霉素、庆大霉素、红霉素、青霉素G、复方新诺明、氨苄青霉素、苯唑青霉素、环丙沙星、四环素的耐药率分别为69%、75%、96%、82%、91%、98%、100%、48%、97%;对乳酸环丙沙星、甲磺酸加替沙星、盐酸沙拉沙星、盐酸左氧氟沙星、盐酸洛美沙星、氧氟沙星、氟罗沙星、乳酸诺氟沙星、恩诺沙星、双氟沙星、培氟沙星耐药率分别为:48%、45%、51%、34%、85%、30%、86%、69%、35%、53%、75%。parC和gyrA基因扩增测序结果为:28株猪链球菌的同源性分别为89.3%和91.6%,parC和gyrA基因与网上发布的标准序列的同源性为74%和80%,突变位点多发生在parC基因核苷酸33264位点和gyrA基因核苷酸的57369位点;有18株耐药菌发生了parC基因的S80→I突变,其中的11株高度耐药菌(MIC均≥32μg/ml)发生了gyrA基因的S81→I、F或Y的突变。当菌株对环丙沙星的MIC值≤1μg/ml时,parC和gyrA基因的QRDR区均未检测出突变,而当MIC≥2μg/ml时,parC基因发生了S80→I的突变,同时发生gyrA基因Ser81突变的菌株,耐药水平很高;耐药基因的扩增和测序分析发现的低水平氟喹诺酮类耐药是由于拓扑异构酶Ⅳ改变引起,而高水平耐药是由拓扑异构酶Ⅳ、DNA旋转酶共同改变引起的。突变位点越多,耐药性越强。
李少英[10](2008)在《奶牛源性双歧杆菌和乳杆菌的分离鉴定及耐药性研究》文中指出为了筛选性能优良且对机体有益的耐药性双歧杆菌和乳杆菌,扩大双歧杆菌、乳杆菌的应用范围,本研究采用乳酸菌鉴别培养基和微生物厌氧培养技术从呼和浩特地区两个牧场25头乳犊牛粪便中分离到49株双歧杆菌属和乳杆菌属的细菌,并采用纸片法对分离菌进行了药物敏感性试验。结果显示:49株菌对所选12种抗菌药均有不同程度的耐性,其中,49株菌全部对甲硝唑耐药;45株菌对氨基糖苷类耐药;37株菌对喹喏酮类耐药;对四环素类、氯霉素类、红霉素类的耐药菌株分别为:10株、10株和19株。对其中7株耐药性较强的菌株进行形态、生理生化特性鉴定及16SrRNA序列分析,证明7株菌为:3株植物乳杆菌、2株链双歧杆菌、2株豚双歧杆菌。采用试管二倍稀释法及杯碟法对这7株耐药菌进一步进行试验后发现,7株菌对12种抗菌药同时具有不同程度的耐药性。其中,3株植物乳杆菌除1株菌对四环素、左氧氟沙星中度敏感外,对其它抗菌药均有耐药性;2株豚双歧杆菌中除1株菌对氯霉素中度敏感外,对其它抗菌药均有耐药性;2株链双歧杆菌除对四环素中度敏感、其中1株对氨苄西林敏感外,对其它抗菌药均有耐药性。试验菌株均对甲硝唑和氨基糖苷类抗菌药表现出较为一致的耐性。在对7株菌进行喹喏酮类耐药机制的研究时发现,采用琼脂凝胶电泳技术检测其质粒,7株菌内均未提取出质粒;采用荧光分光光度法,用2,4-二硝基酚作为抑制剂证明6株菌内存在药物主动外排系统;采用PCR技术和gyrA的QRDR序列分析表明,试验菌株有DNA旋转酶gyrA基因的突变。结论:从未使用过抗菌药的乳犊牛粪便中分离到49株双歧杆菌和乳杆菌属的菌株,这些菌株对12种抗菌药均有不同程度的耐药性,其中对甲硝唑的耐药率达到100%;对氨基糖苷类的耐药率达87.8%以上;对四环素类、氯霉素类、红霉素类的耐药率在20.4%-38.8%之间;对喹喏酮类的耐药率在70%以上。对喹喏酮类药物产生耐药与质粒介导无关,而与其存在主动外排系统以及DNA旋转酶gyrA基因突变有关。
二、结核分支杆菌临床株环丙沙星最低抑菌浓度和GyrA序列测定(论文开题报告)
(1)论文研究背景及目的
此处内容要求:
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景,再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题,并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例:
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
(2)本文研究方法
调查法:该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法:用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法:通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法:通过调查文献来获得资料,从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法:依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法:对研究对象进行“质”的方面的研究,这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法:通过具体的数字,使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法:运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法:这是社会科学用来分析社会现象的一种方法,从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法:通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、结核分支杆菌临床株环丙沙星最低抑菌浓度和GyrA序列测定(论文提纲范文)
(1)贝达喹啉、德拉马尼和氯法齐明对非结核分枝杆菌体外抑菌活性的测定(论文提纲范文)
缩略词 中文摘要 Abstract 前言 菌株来源 技术路线 第一部分 菌种鉴定与药物敏感性测定 |
1.实验材料 |
1.1 主要仪器设备 |
1.2 主要试剂 |
1.3 药物 |
1.4 实验中各种溶液及培养基的配制 |
2.结果 |
3.讨论 第二部分 基因突变与耐药的相关性分析 |
1.材料方法 |
1.1 主要仪器设备 |
1.2 主要试剂 |
1.3 实验中溶液及培养基的配制 |
1.4 实验方法 |
2.结果 |
2.1 AtpE基因比对结果 |
2.2 MarR基因比对结果 |
3.讨论 综合结论 参考文献 非结核分枝杆菌药敏试验及其研究进展 |
参考文献 致谢 攻读学位期间发表文章情况 个人简历 |
(2)宠物源大肠杆菌对氟喹诺酮类药物的多药耐药机制研究(论文提纲范文)
摘要 |
ABSTRACT |
第一章 文献综述 |
1.1 大肠杆菌流行性及耐药现状 |
1.1.1 大肠杆菌的流行性 |
1.1.2 大肠杆菌的耐药现状 |
1.2 抗菌药物的作用机制及病原微生物对抗菌药物的耐药机制 |
1.2.1 抗菌药物作用机制 |
1.2.2 细菌对抗菌药物耐药机制 |
1.3 大肠杆菌对氟喹诺酮类药物耐药现状及耐药机制 |
1.3.1 氟喹诺酮类药物的发展概况 |
1.3.2 宠物源大肠杆菌对氟喹诺酮类药物的耐药机制研究进展 |
试验研究部分 |
第二章 喹诺酮类药物对宠源大肠杆菌的体外抗菌活性的研究 |
2.1 引言 |
2.2 材料与方法 |
2.2.1 材料 |
2.2.2 方法 |
2.3 结果 |
2.3.1 不同耐药谱大肠杆菌对不同代的喹诺酮类药物敏感性 |
2.3.2 各喹诺酮类药物对大肠杆菌的最小防突变浓度 |
2.3.3 各喹诺酮类药物对体外效力比较 |
2.3.4 氟喹诺酮类药物对大肠杆菌的体外杀菌曲线测定结果 |
2.4 讨论 |
2.5 小结 |
第三章 不同耐药表型大肠杆菌的 DNA 回旋酶和拓扑异构酶 IV 的基因突变及质粒流行情况研究 |
3.1 引言 |
3.2 材料与方法 |
3.2.1 材料 |
3.2.2 方法 |
3.3 结果 |
3.3.1 体外抗菌活性分析及外排泵抑制剂对其的影响 |
3.3.2 大肠杆菌系统进化群分析 |
3.3.3 大肠杆菌 ST131 克隆株的筛选结果 |
3.3.4 质粒的 PCR 扩增结果 |
3.3.5 DNA 促旋酶和拓扑异构酶 IV 的基因 PCR 扩增结果 |
3.4 讨论 |
3.5 小结 |
第四章 不同耐药表型大肠杆菌的外排泵基因及调节因子的表达,以及不同氟喹诺酮类药物对外排泵表达的影响 |
4.1 引言 |
4.2 材料与方法 |
4.2.1 材料 |
4.2.2 方法 |
4.3 结果 |
4.3.1 外排泵基因相关调节因子的表达 |
4.3.2 氟喹诺酮类药物压力下四种外排泵表达的变化 |
4.4 讨论 |
4.5 小结 |
第五章 体外诱导宠物源大肠杆菌对普拉多沙星的耐药性及机制研究 |
5.1 引言 |
5.2 材料与方法 |
5.2.1 材料 |
5.2.2 方法 |
5.3 结果 |
5.3.1 环丙沙星、麻保沙星和普拉多沙星诱导的大肠杆菌耐药菌株 |
5.3.2 耐药菌株的靶基因 gyrA、parC 和多药耐药性调控基因 SoxS 突变分析 |
5.3.3 耐药菌株的 acrB 外排泵基因表达 |
5.4 讨论 |
5.5 小结 |
结论 |
本研究的创新点 |
进一步研究内容 |
参考文献 |
致谢 |
作者简介 |
(3)黄颡鱼源嗜水气单胞菌的分离鉴定及对三种氟喹诺酮类药物和氟苯尼考的耐药性研究(论文提纲范文)
摘要 |
ABSTRACT |
缩略词表 |
目录 |
第一章 文献综述 |
1.1 黄颡鱼及其主要病害 |
1.2 嗜水气单胞菌及其致病性的研究概况 |
1.2.1 嗜水气单胞菌简介 |
1.2.2 嗜水气单胞菌引起的水产动物疾病 |
1.3 关于氟喹诺酮类药物 |
1.3.1 分类 |
1.3.2 药动学特征 |
1.4 嗜水气单胞菌对氟喹诺酮耐药现状 |
1.5 细菌对氟喹诺酮类药物的耐药机制 |
1.5.1 改变药物作用的靶位点 |
1.5.2 控制细菌主动外排系统调控基因改变 |
1.5.3 细菌细胞壁通透性改变 |
1.5.4 耐药质粒 |
1.5.5 嗜水气单胞菌对氟喹诺酮耐药机制 |
1.6 氟苯尼考的使用与耐药关系 |
1.7 耐药性的检测方法 |
1.8 解决细菌耐药性问题的主要方法 |
1.8.1 开发对耐药菌敏感的新型药物 |
1.8.2 药物的科学、合理应用 |
1.9 本试验研究目的与意义 |
第二章 广西黄颡鱼源致病性嗜水气单胞菌分离与鉴定 |
2.1 试验材料 |
2.1.1 病样来源 |
2.1.2 健康黄颡鱼 |
2.1.3 主要培养基与试剂 |
2.2 试验方法 |
2.2.1 临床症状观察 |
2.2.2 细菌分离与纯化 |
2.2.3 细菌的鉴定 |
2.2.4 人工感染试验 |
2.3 试验结果 |
2.3.1 临床症状观察结果 |
2.3.2 细菌分离结果 |
2.3.3 细菌的生理生化鉴定 |
2.3.4 人工感染试验结果 |
2.4 讨论 |
第三章 致病性嗜水气单胞菌耐药性测定 |
3.1 试验材料 |
3.1.1 供试菌株及其来源 |
3.1.2 供试药物与药敏纸片 |
3.1.3 培养基 |
3.2 试验方法 |
3.2.1 药敏纸片法测定致病性嗜水气单胞菌耐药性 |
3.2.2 菌株最低抑菌浓度(MIC)的测定 |
3.3 药敏试验结果 |
3.3.1 药敏试验结果 |
3.3.2 MIC试验结果 |
3.4 讨论 |
3.4.1 关于19种抗菌药物对嗜水气单胞菌的药敏结果 |
3.4.2 嗜水气单胞菌耐药性判断标准 |
第四章 嗜水气单胞菌对三种氟喹诺酮类药物和氟苯尼考耐药性获得速率研究 |
4.1 试验材料 |
4.2 试验方法 |
4.2.1 临床分离株耐药性获得速率测定 |
4.2.2 耐药突变株耐药遗传稳定性 |
4.2.3 耐药突变株的保存条件探索 |
4.2.4 耐药突变株交叉耐药试验 |
4.3 试验结果与分析 |
4.3.1 临床分离株耐药性获得速率 |
4.3.2 耐药突变株耐药性的遗传稳定性 |
4.3.3 耐药菌的保存条件探讨结果 |
4.3.4 耐氟喹诺酮类药突变株对同类氟喹诺酮类和氟苯尼考药物的交叉耐药 |
4.4 讨论 |
4.4.1 关于菌株耐药性获得速率与耐药突变株耐药的遗传稳定性 |
4.4.2 关于耐药突变株的保存条件 |
4.4.3 关于耐药突变株对药物的交叉耐药性 |
第五章 嗜水气单胞菌gyrA、parC氟喹诺酮类抗性决定区扩增与分析 |
5.1 试验材料 |
5.1.1 菌株 |
5.1.2 克隆载体 |
5.1.3 主要酶 |
5.1.4 试剂盒 |
5.1.5 其它试剂与培养基 |
5.1.6 感受态细胞制备 |
5.1.7 主要仪器 |
5.2 试验方法 |
5.2.1 技术路线 |
5.2.2 试验方法 |
5.3 试验结果与分析 |
5.3.1 gyrA、parC氟喹诺酮抗性决定区的PCR扩增结果 |
5.3.2 重组质粒的酶切鉴定、菌液PCR鉴定结果 |
5.3.3 嗜水气单胞菌gyrA、parC基因的系列结果 |
5.3.4 序列同源性比较分析 |
5.3.5 gyrA基因和ParC基因的QRDR的系列测序结果 |
5.4 讨论 |
5.4.1 gyrA和parC喹诺酮抗性决定区突变分析 |
5.4.2 gyrA、parC基因突变与耐药性的关系 |
第六章 结论 |
参考文献 |
附录 |
致谢 |
攻读硕士期间发表的学术论文 |
(4)副猪嗜血杆菌耐药性分子机制研究(论文提纲范文)
目录 |
摘要 |
Abstract |
缩略语表(abbreviation) |
第一章 文献综述 |
1.1 副猪嗜血杆菌研究进展 |
1.1.1 病原学 |
1.1.2 流行病学 |
1.1.3 临床症状和病理变化 |
1.1.4 诊断 |
1.1.5 毒力及相关毒力因子 |
1.1.6 防治方法 |
1.2 细菌耐药性研究进展 |
1.2.1 耐药性产生的机理 |
1.2.2 耐药性的进化过程 |
1.2.3 耐药性的预测方法 |
1.2.4 防止耐药性发生的措施 |
1.3 副猪嗜血杆菌耐药性研究进展 |
1.3.1 副猪嗜血杆菌耐药性研究进展 |
1.3.2 巴斯德氏菌科其他细菌耐药性研究进展 |
第二章 副猪嗜血杆菌耐喹诺酮类药物的机制研究 |
2.1 前言 |
2.1.1 研究现状 |
2.1.2 作用机理 |
2.1.3 细菌耐喹诺酮类药物的机理 |
2.1.4 喹诺酮类药物在养猪生产过程中的应用情况 |
2.1.5 研究内容与意义 |
2.2 材料与方法 |
2.2.1 菌株 |
2.2.2 培养基的配制 |
2.2.3 药物及试剂 |
2.2.4 主要仪器设备 |
2.2.5 药物敏感性检测 |
2.2.6 模板制备 |
2.2.7 引物设计及PCR扩增 |
2.2.8 QRDR序列测定 |
2.3 结果 |
2.3.1 MIC、MPC及MSW值 |
2.3.2 QRDR序列 |
2.3.3 QRDR突变位点 |
2.3.4 qnr质粒扩增结果 |
2.4 讨论 |
2.4.1 HPS临床分离株对喹诺酮类药物的耐药性分析 |
2.4.2 QRDR序列分析 |
2.4.3 质粒介导的耐药性 |
2.4.4 氟喹诺酮类药物的应用策略 |
小结 |
第三章 副猪嗜血杆菌耐药质粒的提取及功能分析 |
3.1 前言 |
3.2 材料与方法 |
3.2.1 菌株 |
3.2.2 培养基 |
3.2.3 所用试液及试剂 |
3.2.4 主要仪器设备 |
3.2.5 模板的制备及质粒的提取 |
3.2.6 感受态细胞的制备 |
3.2.7 质粒的酶切及连接、转化与鉴定 |
3.2.8 质粒的测序、拼接、序列分析及注释 |
3.2.9 菌株MIC值的测定 |
3.3 结果 |
3.3.1 质粒提取、酶切、连接及转化 |
3.3.2 测序结果及基因解析 |
3.3.3 药物敏感性试验结果 |
3.3.4 质粒的移动性 |
3.4 讨论 |
3.4.1 质粒的提取及测序 |
3.4.2 质粒的功能分析 |
3.4.3 质粒在耐药性进化过程中的作用 |
小结 |
第四章 亚抑制浓度氟苯尼考对副猪嗜血杆菌转录谱的影响研究 |
4.1 前言 |
4.2 材料与方法 |
4.2.1 菌株与药物 |
4.2.2 化学试剂 |
4.2.3 溶液与培养基 |
4.2.4 主要仪器设备 |
4.2.5 试验方法 |
4.3 结果 |
4.3.1 PCR探针设计及纯化 |
4.3.2 氟苯尼考抗菌活性检测 |
4.3.3 mRNA的提取及纯度检查 |
4.3.4 差异表达基因聚类分析 |
4.3.5 差异表达基因分析 |
4.3.6 差异表达基因的实时定量PCR验证 |
4.4 讨论 |
4.4.1 芯片设计 |
4.4.2 药物浓度和作用时间的选择 |
4.4.3 差异表达基因功能分析 |
4.4.4 细菌代谢与耐药性的关系 |
小结 |
全文创新性总结 |
参考文献 |
致谢 |
攻读博士学位期间发表的文章 |
附录1 |
附录2 |
(5)中药抑制剂血清药理学研究及对相关基因影响(论文提纲范文)
摘要 |
Abstract |
第一章 综述 |
1 国内外研究现状 |
1.1 细菌耐药性机制研究 |
1.2 耐药抑制剂研究进展 |
1.3 中药耐药抑制剂研究 |
1.4 中药血清药理学研究 |
1.5 金黄色葡萄球菌gyrA基因突变与耐药性的关系 |
2 研究目的和意义 |
第二章 中药耐药抑制剂的体外耐药抑制作用研究 |
1 材料与方法 |
1.1 材料 |
1.2 方法 |
2 结果与分析 |
2.1 药敏试验结果 |
2.2 金黄色葡萄球菌诱导性耐药株的建立 |
2.3 复方黄连注射剂的体外抑菌试验 |
2.4 复方黄连注射剂的体外耐药抑制试验 |
2.5 耐药性金黄色葡萄球菌质粒消除试验结果 |
3 讨论 |
3.1 耐药性检测 |
3.2 影响药敏试验的因素 |
3.3 耐药株的诱导 |
3.4 复方黄连注射剂的耐药抑制剂作用 |
3.5 质粒的消除 |
4 结论 |
第三章 中药耐药抑制剂血清药理学研究 |
1 材料与方法 |
1.1 材料 |
1.2 方法 |
2 试验结果 |
2.1 标准曲线的建立 |
2.2 复方黄连注射剂高效液相色谱测定结果 |
2.3 复方黄连注射剂含药血清高效液相色谱测定结果 |
2.4 复方黄连注射剂含药血清MIC测定结果 |
2.5 复方黄连注射剂含药血清抑菌圈直径测定结果 |
3 讨论 |
3.1 高效液相色谱条件的优化与建立 |
3.2 血清药理学研究 |
3.3 含药血清的处理 |
3.4 复方黄连注射剂含药血清的抑菌作用 |
4 结论 |
第四章 gyrA基因突变与细菌耐药的关系及中药耐药抑制剂的影响 |
1 材料与方法 |
1.1 试验材料 |
1.2 试验方法 |
2 试验结果 |
2.1 耐药菌的诱导结果 |
2.2 PCR引物设计 |
2.3 PCR条件的筛选与建立 |
2.4 复方黄连注射剂处理后PCR电泳结果 |
2.5 标准株、诱导耐药株和复方黄连注射剂处理的耐药株gyrA基因序列测定结果 |
2.6 标准株、诱导耐药株和复方黄连注射剂处理耐药株gyrA基因氨基酸序列及突变分析结果 |
3 讨论 |
3.1 引物对PCR的影响 |
3.2 模板对PCR的影响 |
3.3 gyrA基因序列突变与细菌耐药性的关系 |
3.4 gyrA基因氨基酸突变与DNA旋转酶活性的关系 |
3.5 gyrA基因氨基酸突变与细菌耐药性的关系 |
3.6 复方黄连注射剂对gyrA基因碱基突变与氨基酸突变的影响 |
4 结论 |
结论 |
参考文献 |
致谢 |
作者简介 |
(6)中国结核分枝杆菌临床分离株二线抗结核药物耐药性的初步研究(论文提纲范文)
Abbreviation (缩略词) |
中文摘要 |
ABSTRACT |
前言 |
第一部分 BACTEC MGIT 960 法对二线抗结核药物检测效果评价 |
材料与方法 |
结果 |
讨论 |
结论 |
第二部分 喹诺酮药物耐药基因gyrA、gyrB 突变特征分析 |
材料与方法 |
结果 |
讨论 |
结论 |
参考文献 |
已发文章 |
文献综述 |
参考文献 |
致谢 |
(7)沙眼衣原体抗菌素耐药及治疗失败的评估(论文提纲范文)
中文摘要 |
Abstract |
缩略语/符号说明 |
前言 |
研究现状、成果 |
研究目的、方法 |
一、沙眼衣原体多次传代培养与药物敏感性试验 |
1.1 材料和方法 |
1.1.1 材料 |
1.1.2 方法 |
1.2 结果 |
1.2.1 McCoy细胞的形态学观察 |
1.2.2 沙眼衣原体感染McCoy细胞的检测 |
1.2.3 沙眼衣原体临床株传代培养结果 |
1.2.4 PCR扩增检测结果 |
1.2.5 多次传代培养法检测沙眼衣原体感染敏感性的评价 |
1.2.6 临床标本细胞培养检测结果与临床治疗效果相关性分析 |
1.2.7 临床标本内源性质粒PCR检测结果与临床治疗效果相关性分析 |
1.2.8 药敏试验结果 |
1.3 讨论 |
1.3.1 沙眼衣原体传代培养讨论 |
1.3.2 沙眼衣原体体外药敏实验讨论 |
1.4 小结 |
二、沙眼衣原体耐药机制与基因分型的研究 |
2.1 材料和方法 |
2.1.1 材料 |
2.1.2 方法 |
2.2 结果 |
2.2.1 耐药基因检测结果 |
2.2.2 基因分型结果 |
2.3 讨论 |
2.3.1 沙眼衣原体抗菌素耐药机制讨论 |
2.3.2 沙眼衣原体基因分型讨论 |
2.4 小结 |
结论 |
参考文献 |
发表论文和参加科研情况说明 |
综述 |
沙眼衣原体体外药敏试验的测定及耐药机制的研究进展 |
综述参考文献 |
致谢 |
(8)鸭疫里默氏杆菌基因分型及耐药机理的研究(论文提纲范文)
本论文的创新性研究工作 |
中文摘要 |
英文摘要 |
缩略词 |
第一部分 文献综述 |
第一章 脉冲电泳基因分型研究进展 |
第二章 鸭疫里默氏杆菌研究进展 |
第三章 细菌耐药机理的研究进展 |
第二部分 实验研究 |
第四章 鸭疫里默氏杆菌分离、鉴定及耐药现状分析 |
1 材料 |
2 方法 |
3 结果 |
4 讨论 |
5 小结 |
第五章 鸭疫里默氏杆菌脉冲电泳快速分型方法的建立及泛耐药株分子流行病学研究 |
1 材料 |
2 方法 |
3 结果 |
4 讨论 |
5 小结 |
第六章 鸭疫里默氏杆菌临床泛耐药株1、2、3型整合子分布及可变区结构与细菌耐药相关性的究 |
1 材料 |
2 方法 |
3 结果 |
4 讨论 |
5 小结 |
第七章 鸭疫里默氏杆菌四环素类药物耐药机理的研究 |
1 材料 |
2 方法 |
3 结果 |
4 讨论 |
5 小结 |
第八章 临床泛耐药株对氟喹诺酮类耐药机理的探讨及喹诺酮新药体外抗菌活性的研究 |
1 材料 |
2 方法 |
3 结果 |
4 讨论 |
5 小结 |
第九章 临床泛耐药株对β-内酰胺类药物耐药机理的探讨 |
1 材料 |
2 方法 |
3 结果 |
4 讨论 |
5 小结 |
结论 |
参考文献 |
附录 |
致谢 |
作者简介 |
(9)猪链球菌对氟喹诺酮类药物耐药性与耐药基因的研究(论文提纲范文)
摘要 |
ABSTRACT |
1 引言 |
1.1 猪链球菌简介 |
1.2 喹诺酮类药物 |
1.2.1 喹诺酮药物的分类 |
1.2.2 药动学特征 |
1.2.3 抗菌谱及作用机制 |
1.2.4 氟喹诺酮类药物耐药抑制剂 |
1.3 猪链球菌对氟喹诺酮类药物耐药现状 |
1.3.1 猪链球菌对氟喹诺酮类药物耐药国外研究进展 |
1.3.2 猪链球菌对氟喹诺酮类药物耐药国内研究进展 |
1.3.3 氟喹诺酮类药物的使用与细菌耐药性之间的关系 |
1.4 细菌对喹诺酮类抗菌药物耐药机制 |
1.4.1 靶位改变引起的耐药 |
1.4.2 主动外排系统 |
1.4.3 细菌外膜的屏障作用 |
1.4.4 质粒介导的耐药机制 |
1.4.5 猪链球菌对喹诺酮类药物耐药机制 |
1.5 解决耐药性问题的对策 |
1.5.1 开发对耐药菌有作用的新型药物 |
1.5.2 合理用药 |
1.6 本研究的目的和意义 |
2 材料和方法 |
2.1 材料 |
2.1.1 菌株 |
2.1.2 仪器设备 |
2.1.3 试剂 |
2.1.4 实验动物 |
2.2 方法 |
2.2.1 猪链球菌分离、鉴定 |
2.2.2 猪链球菌耐药菌株的筛选 |
2.2.3 氟喹诺酮耐药基因的扩增 |
2.2.4 PCR 产物的回收、克隆和测序 |
2.2.5 序列分析和绘制基因进化树 |
3 结果 |
3.1 猪链球菌的分离鉴定 |
3.1.1 生长特性和培养特性 |
3.1.2 生化试验 |
3.1.3 兰氏分群 |
3.1.4 致病性试验 |
3.2 猪链球菌耐药菌株的筛选 |
3.2.1 对九种常用抗菌药物的药物敏感性试验 |
3.2.2 纸片扩散法测定猪链球菌对常用氟喹诺酮类药物的敏感性 |
3.2.3 微量稀释法测定猪链球菌对常用氟喹诺酮药物的敏感性 |
3.3 氟喹诺酮耐药基因的扩增 |
3.4 耐药基因的测序结果分析 |
3.4.1 parC 基因的序列分析 |
3.4.2 gyrA 基因的序列分析 |
3.5 耐药基因突变位点与耐药性的关系 |
3.6 耐药基因的同源性分析 |
3.6.1 parC 基因的同源性分析 |
3.6.2 gyrA 基因的同源性分析 |
4 讨论 |
4.1 猪链球菌的分离鉴定 |
4.1.1 生长和培养特性 |
4.1.2 生化试验 |
4.1.3 兰氏分群 |
4.1.4 致病性试验 |
4.2 猪链球菌耐药菌株的筛选 |
4.2.1 对常用抗菌药物的药物敏感性试验 |
4.2.2 猪链球菌对常用氟喹诺酮药物的敏感性 |
4.3 氟喹诺酮耐药基因的扩增 |
4.3.1 特异性parC 和gyrA 引物的设计 |
4.3.2 猪链球菌全基因组的提取 |
4.3.3 PCR 方法扩增耐药基因 |
4.3.4 PCR 产物的克隆和测序 |
4.3.5 耐药基因和耐药性的相关性 |
结论 |
致谢 |
参考文献 |
攻读硕士期间发表的学术论文 |
(10)奶牛源性双歧杆菌和乳杆菌的分离鉴定及耐药性研究(论文提纲范文)
摘要 |
Abstract |
第一章 引言 |
1 双歧杆菌和乳杆菌分类鉴定研究进展 |
1.1 双歧杆菌和乳杆菌在乳酸菌分类体系中的位置 |
1.2 双歧杆菌和乳杆菌的形态及结构 |
1.3 双歧杆菌和乳杆菌的生长条件及生化特性 |
1.4 双歧杆菌和乳杆菌的分布特点 |
1.5 双歧杆菌和乳杆菌鉴定技术 |
1.5.1 染色和显微镜技术 |
1.5.2 分离培养技术 |
1.5.3 生理生化鉴定技术 |
1.5.4 分子生物学鉴定技术 |
2 双歧杆菌和乳杆菌的主要生理作用 |
2.1 营养作用 |
2.1.1 提高蛋白质的可消化性 |
2.1.2 提供婴幼儿神经系统发育所需的半乳糖 |
2.1.3 提高钙、磷等矿物质的利用率 |
2.1.4 维护肠内B 族维生素的稳定性 |
2.2 保健和疾病预防作用 |
2.2.1 维持肠道菌群生态平衡,抑制病原菌的生长繁殖 |
2.2.2 降低胆固醇的含量,防治心血管疾病 |
2.2.3 分解乳糖,治疗乳糖消化不耐症 |
2.2.4 激活免疫系统,抵抗感染 |
2.2.5 延缓细胞衰老,促进延年益寿 |
2.2.6 清除体内致病物质,防治肿瘤 |
3 双歧杆菌和乳杆菌制品的研究进展 |
3.1 双歧杆菌制品 |
3.1.1 以双歧杆菌活菌为主的制品 |
3.1.2 以双歧杆菌促进因子为主的保健食品 |
3.1.3 双歧杆菌和双歧因子配合的合生元制剂 |
3.2 乳杆菌制品 |
3.2.1 乳杆菌食品 |
3.2.2 乳杆菌保健品 |
4 双歧杆菌和乳杆菌的耐药性研究进展 |
4.1 耐药谱的研究进展 |
4.2 耐药方式和机理的研究进展 |
4.2.1 主动外排系统介导的耐药性研究 |
4.2.2 多重耐药转运系统介导的耐药性研究 |
4.2.3 膜通透性改变诱导的耐药性研究 |
4.2.4 酶介导的耐药性研究 |
4.2.5 靶位改变产生的耐药性研究 |
4.2.6 质粒介导的耐药性研究 |
4.3 对氟喹诺酮类抗菌药产生耐药性的研究进展 |
4.3.1 氟喹诺酮类抗菌药 |
4.3.2 拓扑异构酶基因突变介导的耐药机制 |
4.3.3 主动外排系统介导的耐药机制 |
4.4 几种耐药基因检测技术概述 |
4.4.1 荧光 PCR 检测点突变 |
4.4.2 SYBY GREEN I 结合熔解曲线分析点突变 |
4.4.3 荧光共振能量转移结合探针熔解曲线分析点突变 |
4.4.4 反向限制性位点突变分析 |
4.4.5 基因芯片技术 |
4.4.6 等位基因特异性扩增技术 |
4.4.7 PCR-ELISA 结合测序检测点突变 |
5 课题方案设计 |
6 课题研究的目的与意义 |
第二章 奶牛源性双歧杆菌和乳杆菌的分离鉴定及生物学特性研究 |
1 材料 |
1.1 样品来源 |
1.2 质控菌株 |
1.3 培养基 |
1.4 实验动物 |
1.5 试剂与药品 |
1.6 PCR 引物 |
1.7 溶液配制 |
1.8 仪器设备 |
2 方法 |
2.1 乳犊牛粪便的采集 |
2.2 试验菌株的筛选 |
2.3 双歧杆菌和植物乳杆菌试验菌株的分离纯化及保存 |
2.4 试验菌株形态、生化鉴定及特性研究 |
2.4.1 常规鉴定试验 |
2.4.2 细胞壁成份分析 |
2.4.3 乳酸和醋酸的气相色谱法色谱分析 |
2.5 试验菌株的其它生物学特性研究 |
2.5.1 试验菌株的生长特性 |
2.5.2 试验菌株耐胆盐试验 |
2.5.3 试验菌株对人工胃液和人工肠液耐受性试验 |
2.5.4 试验菌株毒性实验 |
2.6 试验菌株 PCR 鉴定 |
2.6.1 不同引物的PCR 条件 |
2.6.2 菌种制备及DNA 的提取 |
2.6.3 PCR 扩增 |
2.6.4 PCR 产物电泳检测 |
2.7 试验菌株165RRNA 序列分析 |
2.7.1 试验菌株的总DNA 的提取 |
2.7.2 试验菌株165RDNA 序列测定及序列分析 |
3 结果 |
3.1 双歧杆菌和乳杆菌的分离 |
3.2 试验菌株形态、生化及生物学特性鉴定结果 |
3.2.1 试验菌株菌体形态及菌落形态观察 |
3.2.2 试验菌株属的鉴定 |
3.2.3 试验菌株种的鉴定 |
3.3 其它生物学特性试验 |
3.3.1 生长特性研究结果 |
3.3.2 耐人工胃液和肠液的试验结果 |
3.3.3 试验菌株毒性实验结果 |
3.4 PCR 鉴定 |
3.5 16SRRNA 序列分析 |
4 讨论 |
4.1 关于试验菌株生化鉴定 |
4.2 关于试验菌株的分子生物学鉴定 |
5 小结 |
第三章 奶牛源性双歧杆菌和乳杆菌的耐药性研究 |
1 材料 |
1.1 试验菌株与对照菌株 |
1.2 试剂与抗菌药品 |
1.3 培养基 |
1.4 供试菌液的制备 |
1.5 抗菌药物原液的配制 |
1.6 仪器设备 |
1.7 数据处理 |
2 方法 |
2.1 分离菌株对12 种抗菌药的耐药性试验 |
2.2 对喹诺酮类药物耐药试验菌株的筛选 |
3 结果 |
3.1 分离菌株对12 种抗菌药的耐药性 |
3.1.1 12 种抗菌药对分离菌株的抑菌直径 |
3.1.2 分离菌株对12 种抗菌药的敏感性 |
3.1.3 分离菌株对12 种抗菌药的耐药率 |
3.1.4 不同浓度的抗菌药对试验菌株的抑菌直径 |
3.1.5 试验菌株的耐药程度 |
3.2 试验菌株对3 种氟喹诺酮类药物的耐药性 |
3.2.1 3 种喹诺酮类对试验菌株的最小抑菌浓度 |
3.2.2 3 种喹诺酮类对试验菌株的抑菌直径 |
4 讨论 |
4.1 试验菌株对12 种抗菌药的耐药性分析 |
4.2 试验菌株对3 种氟喹诺酮类药物的耐药性分析 |
5 小结 |
第四章 奶牛源性双歧杆菌和乳杆菌对氟喹诺酮类耐药机理的研究 |
1 材料 |
1.1 试验菌株与对照菌株 |
1.2 抗菌药品 |
1.3 试剂 |
1.4 溶液配制 |
1.5 主要仪器设备 |
1.6 数据处理 |
2 方法 |
2.1 试验菌株的质粒研究 |
2.1.1 试验菌株质粒的提取 |
2.1.2 试验菌株质粒的琼脂糖凝胶电泳 |
2.2 耐氟喹诺酮类试验菌株主动外排系统的测定试验 |
2.3 耐氟喹诺酮类试验菌株Ⅱ型拓扑异构酶QRDR 基因突变的测定试验 |
2.3.1 供试菌液的制备 |
2.3.2 试验菌株DNA 的提取 |
2.3.3 试验菌株DNA 旋转酶gyrA 基因QRDR 突变的测定 |
3 结果 |
3.1 质粒提取结果 |
3.2 主动外排系统证实试验结果 |
3.3 试验菌株DNA 旋转酶gyrA 基因QRDR 的测定 |
3.3.1 试验菌株DNA 旋转酶gyrA 基因片段的PCR 产物电泳结果 |
3.3.2 试验菌株gyrA 基因QRDR 的测序结果 |
3.3.3 试验菌株与相关菌株gyrA 基因QRDR 特征比较结果 |
4 讨论 |
4.1 关于试验菌株的耐药质粒 |
4.2 关于试验菌株主动外排系统确证试验 |
4.3 关于耐氟喹诺酮类药物试验菌株gyrA 基因QRDR 突变分析 |
5 小结 |
第五章 全文讨论 |
第六章 全文结论 |
主要创新之处 |
致谢 |
参考文献 |
附录 |
附录1 试验菌株对小鼠重要器官组织形态学的影响 |
附录2 牛津杯法使用的抗生素及药物敏感性标准 |
附录3 试验菌株16SRDNA 的序列 |
作者简介 |
四、结核分支杆菌临床株环丙沙星最低抑菌浓度和GyrA序列测定(论文参考文献)
- [1]贝达喹啉、德拉马尼和氯法齐明对非结核分枝杆菌体外抑菌活性的测定[D]. 罗晶晶. 北京市结核病胸部肿瘤研究所, 2018(04)
- [2]宠物源大肠杆菌对氟喹诺酮类药物的多药耐药机制研究[D]. 刘晓强. 西北农林科技大学, 2012(06)
- [3]黄颡鱼源嗜水气单胞菌的分离鉴定及对三种氟喹诺酮类药物和氟苯尼考的耐药性研究[D]. 温华成. 广西大学, 2012(04)
- [4]副猪嗜血杆菌耐药性分子机制研究[D]. 陈品. 华中农业大学, 2011(12)
- [5]中药抑制剂血清药理学研究及对相关基因影响[D]. 游思湘. 湖南农业大学, 2011(04)
- [6]中国结核分枝杆菌临床分离株二线抗结核药物耐药性的初步研究[D]. 夏强. 南华大学, 2011(12)
- [7]沙眼衣原体抗菌素耐药及治疗失败的评估[D]. 邵丽丽. 天津医科大学, 2010(03)
- [8]鸭疫里默氏杆菌基因分型及耐药机理的研究[D]. 仲崇岳. 四川农业大学, 2009(07)
- [9]猪链球菌对氟喹诺酮类药物耐药性与耐药基因的研究[D]. 苑青艳. 东北农业大学, 2009(03)
- [10]奶牛源性双歧杆菌和乳杆菌的分离鉴定及耐药性研究[D]. 李少英. 内蒙古农业大学, 2008(11)