一、Curcumin inhibits Proliferation of K562 cells by downreguration of P210~(bcr/abl)-initiated Ras Signal Pathway and Cyclins（论文文献综述）
陈晓文[1]（2021）在《Skp2对慢性髓细胞白血病细胞增殖及其对伊马替尼敏感调控机制的研究》文中进行了进一步梳理研究背景:慢性髓细胞白血病（chronic myeloid leukemia,CML）是临床常见的血液系统恶性肿瘤,主要特征为骨髓造血生成大量未成熟的白细胞,其发病率高达新发成人白血病的20%。BCR-ABL融合基因目前被认为是CML发病的重要原因和基本特征,该融合基因表达可生成具备组成性酪氨酸激酶活性的BCR-ABL嵌合蛋白。在CML的临床治疗中,特异性BCR-ABL抑制剂,如酪氨酸激酶抑制剂（Tyrosine kinase inhibitors,TKI）可将患者生存率显着提高,已被临床广泛应用。伊马替尼是（IM）一种通过阻断BCR-ABL蛋白的非活性构象的TKI,首次应用于CML的治疗,疗效显着,毒性较低。但仍有大量CML患者对伊马替尼不敏感或通过多种细胞机制产生耐药性。因此,在CML进展过程中筛选出有效的治疗靶点是非常迫切的,这将有助于提高CML在TKI药物治疗中的效果。S期激酶相关蛋白2（S-phase kinase associated protein 2,Skp2）是由人Skp2基因编码的E3泛素连接酶。Skp2是一种C-Myc直接靶基因,在细胞周期进程的调控中起重要作用,多种恶性肿瘤中常发现有其表达上调。在血清缺乏的细胞中,Skp2过表达从而诱导细胞周期素A积累和p27磷酸化依赖性的降解从而促进细胞进入S期。Skp2还参与其他细胞周期调节蛋白的泛素化,包括细胞周期蛋白E和转录因子E2F1。目前国内外多项研究证实Skp2与许多实体肿瘤的化疗耐药性有关。如Skp2通过p27-CDKs-E2F1途径正向调节有丝分裂阻滞缺陷蛋白2（mitotic arrest deficient 2,MAD2）的表达,通过抑制Skp2可以增强肺癌细胞对紫杉醇的敏感性。但Skp2在CML中的发生和抗肿瘤耐药中的作用尚待明确。研究目的:比较CML患者与正常对照组外周血白细胞中Skp2的蛋白水平与m RNA水平。探究Skp2的异常表达在K562细胞中的作用机制:在K562细胞中稳定敲减和过表达Skp2基因,检测细胞数量变化和细胞的增殖能力变化。在K562细胞中分别敲减和过表达c AMP应答元件结合蛋白（CREB）基因,检测Skp2的m RNA水平。检测抑制PI3K/Akt-CREB-Skp2轴后K562细胞对伊马替尼的敏感性变化。研究方法:1.收集24例新诊断的CML患者（研究组）和7例健康体检者（对照组）外周血,对外周血样本进行白细胞分离。分别通过实时荧光定量PCR（q RT-PCR）和蛋白质印迹法（Western Blot）分析两组样本中Skp2的m RNA水平和蛋白水平。2.人CML细胞系K562在37℃,5%的CO2条件下用的RPMI 1640培养基（含10%胎牛血清）培养。构建基于PLK0.1的sh RNA-Skp2质粒,在K562细胞中稳定敲减Skp2,用Western Blot法检测稳定表达sh RNA-ctrl、sh RNA-skp2-1或sh RNA-skp2-2的K562细胞中Skp2蛋白水平,验证敲减Skp2基因的效果。通过细胞计数分析,比较K562细胞在Skp2稳定敲减和未敲减情况下的细胞增殖率,对稳定表达sh RNA-ctrl、sh RNA-skp2-1或sh RNA-skp2-2的K562细胞用Ed U染色及Hoechst 33342染色法观察细胞核,检测Ed U阳性细胞与Hoechst 33342阳性细胞的比值。在K562细胞中转染Flag-Skp2质粒,对过表达Skp2的K562细胞行Western Blot分析,采用细胞计数分析法测定过表达Skp2的K562细胞的细胞数变化,并用Ed U染色及Hoechst33342染色观察细胞形态,检测Ed U阳性细胞与Hoechst 33342阳性细胞之比。3.利用Jas PAR软件对编码Skp2基因的上游基因组序列进行分析,在Skp2启动子中发现一个潜在保守的CREB结合区（BR）。染色质免疫沉淀（Ch IP）分析证实CREB基因和Skp2启动子中CREB结合区（BR）的基因片段之间存在特异性结合。构建一系列含野生型CREB-BR（WT）PGL3荧光素酶报告质粒和缺失CREB-BR的突变型（MUT）PGL3荧光素酶报告质粒。将K562细胞与含有野生型或突变型Skp2启动子区的PGL3荧光素酶报告质粒以及Flag或Flag-CREB质粒共转染K562细胞,转染后取细胞溶解物,使用荧光素酶测定其转录活性,用Western Blot法验证CREB的过表达效果,同时通过q RT-PCR测定Skp2的m RNA水平。K562细胞与含有sh RNA-CREB基因或sh RNA-ctrl基因共转染,转染后行Western Blot法证实基因敲减效果,荧光素酶分析转录活性。用q RT-PCR测定CREB基因敲减前后K562细胞中Skp2 m RNA水平变化。4.用伊马替尼（1μmol/L）处理稳定表达sh RNA-ctrl、sh RNA-Akt、sh RNA-CREB或sh RNA-Skp2的K562细胞24 h,采用MTT比色法测定各组细胞活力,分别与sh RNA-ctrl组比较,通过三次实验得出相对细胞活力。用二甲基亚砜或磷脂酰肌醇3-激酶抑制剂Ly294002（10μmol/L）预处理K562细胞4 h,伊马替尼（1μmol/L）处理24 h,采用MTT比色法测定各组细胞活力,分别与对照组比较,通过三次实验得出相对细胞活力。用伊马替尼（1μmol/L）处理稳定表达sh RNA-ctrl、sh RNA-Akt、sh RNA-CREB或sh RNA-Skp2的K562细胞24 h,Western Blot分析caspase-3/7活性和PARP的裂解。K562细胞分别加用和不加Ly294002预处理再加用伊马替尼（1μmol/L）处理24 h,试剂盒检测caspase-3/7活性并用Western Blot分析PARP的裂解。研究结果:1.和健康对照组相比,Skp2在CML患者中异常表达。收集24例CML患者和7例健康体检者外周血白细胞,CML样本显示Skp2的m RNA水平及蛋白水平均较健康对照组显着上调。数据表明CML患者Skp2表达上调,Skp2蛋白水平与m RNA水平呈一致性改变。2.Skp2是K562细胞增殖的关键。在K562细胞中稳定敲减Skp2基因,与对照组细胞相比,敲减了Skp2的K562细胞的细胞数量显着减少。Ed U分析显示敲减Skp2的K562细胞增殖能力显着低于对照组细胞。3.Skp2过表达影响K562细胞的增殖。与敲减基因结果相反,通过过表达Skp2基因,K562细胞数量增加。与此相关,Skp2过表达导致K562细胞中Ed U阳性细胞百分比显着增加。4.Skp2通过CREB转录调控。利用Jas PAR软件对Skp2编码基因上游基因组序列进行分析,在Skp2启动子中发现一个潜在的CREB结合区（BR）。染色质免疫沉淀（Ch IP）分析显示,CREB能和Skp2基因中CREB结合区（BR）的基因片段特异性。构建一系列包含野生型CREB-BR（WT）PGL3荧光素酶报告质粒和缺失CREB-BR的突变型（MUT）PGL3荧光素酶报告质粒,将含有WT或MUT的Skp2启动子区以及Flag或Flag-CREB的质粒共转染K562细胞,野生型CREB-BR（WT）转录活性在过表达CREB后明显升高,但突变型质粒（MUT）和p GL3空载体转录活性未见明显升高。相反,野生型CREB-BR（WT）转录活性在稳定敲减CREB基因的K562细胞中降低,同样突变型构建体（MUT）和PGL3空载体均未显示转录活性的改变。5.CREB的稳定敲减导致K562细胞中Skp2 m RNA水平显着降低。鉴于CREB的转录活性是由其第133位丝氨酸磷酸化后被活化的,我们试图评估野生型的Flag-CREB和第133位丝氨酸被突变的Flag-CREB-Ser-133A对Skp2表达的影响。野生型的Flag-CREB能够上调Skp2的m RNA水平,但第133位丝氨酸被突变的Flag-CREB-Ser-133A对于Skp2的m RNA水平无明显的调控作用。以上结果提示,在K562细胞中Skp2的表达在转录水平受到CREB的调控。6.抑制PI3K/Akt-CREB-Skp2轴增加K562细胞对伊马替尼的敏感性。用伊马替尼处理（1μmol/L）CREB或Skp2稳定敲减的K562细胞并观察其存活率,CREB或Skp2稳定敲减的K562细胞在伊马替尼处理后表现出细胞活力的急剧下降。7.CREB或Skp2的敲减导致伊马替尼处理的K562细胞中caspase-3/7活性的显着增加。caspase-3/7的活化是对伊马替尼治疗敏感性的响应,CREB或Skp2稳定敲减的K562细胞在伊马替尼处理后与对照组细胞药物处理后相比,caspase-3/7的活化及PARP的裂解更明显。8.PI3K/Akt信号通路在关联CREB的激活及Skp2的表达中起到特定的作用。在K562细胞中稳定敲减Akt或使用LY294002来抑制PI3K/Akt通路,结果导致伊马替尼处理的K562细胞活力显着下降,Skp2蛋白水平降低,caspase-3/7活化及PARP裂解明显增强,说明K562细胞对伊马替尼更加敏感。结论:与健康对照者相比,初治CML患者外周血白细胞中Skp2高表达,并且Skp2高表达对CML细胞增殖至关重要。从机制上讲,在K562细胞中Skp2受PI3K/Akt-CREB信号通路的转录调控。此外,稳定敲减Skp2的表达或阻断PI3K/Akt-CREB通路可显着提高K562细胞对伊马替尼的敏感性。
刘燕君[2]（2020）在《SOS1调节慢性粒细胞白血病（CML）伊马替尼敏感性和不依赖于BCR-ABL1耐药性及其分子机制研究》文中认为研究背景:目前慢性粒细胞白血病（CML,chronic myeloid leukemia）临床治疗主要的难题就是耐药,尤其是不依赖于BCR-ABL1的耐药。前期研究发现SOS1（son of sevenless homolog 1）是mi R-181a的靶基因,并且经细胞系及临床病例筛查得出SOS1在CML中表达量较正常细胞/样本高,初步鉴定SOS1在CML中具有癌基因性质,但SOS1在CML中具体的作用机制及其与伊马替尼（imatinib）敏感性/耐药性的关系尚不清楚。研究目的:本课题致力于探索癌基因SOS1在CML中与imatinib药物敏感性与不依赖于BCR-ABL1耐药性的关系及其分子机制,为克服不依赖于BCR-ABL1的耐药提供新的潜在治疗靶点。研究方法:1.脂质体Lipofectamine TM 2000转染SOS1-si RNA#1/#2/#3到K562/KCL22/BV173细胞;Western Blot和q PCR验证筛选有效的SOS1-si RNA序列;2.利用SOS1质粒构建、嘌呤霉素筛选过表达SOS1蛋白的K562/KCL22细胞;Western Blot验证细胞内SOS1表达水平;3.CCK-8试剂检测SOS1对K562/KCL22细胞活力的影响;4.细胞周期检测试剂盒检测靶向抑制SOS1对K562/KCL22细胞周期的影响;5.软琼脂克隆形成实验（soft agar assay）检测SOS1对K562/KCL22细胞克隆形成能力的影响;6.Balb/c裸鼠皮下成瘤实验检测体内SOS1-si RNA对K562细胞增殖的影响;7.CCK-8试剂检测SOS1对K562/KCL22/KU812细胞对imatinib药物敏感性的影响;Soft agar assay检测SOS1对K562/KCL22细胞对imatinib药物敏感性的影响;8.293T-Flag-SOS1/293T-Flag-empty免疫沉淀（IP）产物,质谱检测并分析鉴定蛋白组分;9.RNA-seq检测与SOS1相互作用基因;q PCR/Western Blot验证细胞内SOS1与SLC22A4表达变化;10.HPLC检测SOS1对K562/KCL22细胞imatinib吸收影响;11.不断增加KCL22细胞imatinib培养浓度,构建不依赖于BCR-ABL1耐药细胞株KCL22-IMR;12.SOS1/Ras抑制剂BAY-293处理KCL22-IMR,CCK-8检测细胞活力,soft agar assay检测细胞克隆形成能力变化;13.Western Blot检测BAY-293处理后KCL22-IMR细胞中SLC22A4蛋白相对表达量变化;14.HPLC检测SOS1对KCL22-IMR细胞imatinib吸收影响;研究结果:1.SOS1-si RNA#3靶向抑制SOS1,降低了K562/KCL22细胞活性和细胞克隆形成能力,增强了细胞对imatinib的药物敏感性;2.SOS1过表达的K562/KCL22细胞株,WB验证SOS1表达量明显增多;3.过表达SOS1,增强了K562/KCL22细胞克隆形成能力,降低了细胞对imatinib的药物敏感性;4.靶向抑制SOS1,K562/KCL22细胞周期抑制在G0/G1期;5.Balb/c裸鼠皮下成瘤实验,K562-SOS1-si RNA#3组增殖能力较NC组明显降低;6.IP产物的质谱结果显示,与SOS1相互作用的蛋白一共有103个,其中包括SLC22A4,KEGG整合到多条信号通路包括PI3K-AKT信号通路;靶向抑制SOS1抑制了PI3K-AKT信号通路,促使P27增加,细胞周期抑制;7.RNA-seq检测表明,靶向抑制SOS1促进了K562/KCL22细胞中SLC22A4的表达;8.qPCR/Western Blot验证了K562/KCL22细胞中靶向抑制SOS1促进SLC22A4表达;9.HPLC检测到靶向抑制SOS1促进了K562/KCL22细胞对imatinib的吸收;10.构建的imatinib耐药株（KCL22-IMR）,能够耐受高达10μM的imatinib;11.SOS1/Ras抑制剂BAY-293,抑制了耐药株细胞活力及克隆形成能力;12.BAY-293促进了KCL22-IMR细胞中SLC22A4的表达;促进了KCL22-IMR细胞内imatinib含量;研究结论:1.SOS1在CML中具有癌基因性质,靶向抑制SOS1有效抑制了CML的恶性进展;2.SOS1通过负调控SLC22A4表达,影响CML对imatinib的药物敏感性和耐药性;3.BAY-293,可作为潜在治疗不依赖于BCR-ABL1耐药的抑制剂;
刘婷[3]（2020）在《雷公藤红素增强白血病多药耐药K562/ADR细胞对阿霉素敏感性的作用机制》文中指出目的:本研究通过研究雷公藤红素对人白血病多药耐药株K562/ADR细胞抗白血病作用及其增强K562/ADR细胞对阿霉素敏感性的机制,为探索白血病新的治疗药物提供实验数据。方法:体外培养人白血病细胞K562及其多药耐药株细胞K562/ADR,通过对K562和K562/ADR细胞进行mRNA测序,筛选差异表达的mRNAs;分别用不同浓度的阿霉素和雷公藤红素处理K562和K562/ADR细胞,48h后采用CCK-8实验检测细胞活力;通过流式细胞仪检测K562/ADR细胞凋亡;利用qRT-PCR与Western Blot检测凋亡相关基因Bcl-2和Bax的表达;通过流式细胞仪检测K562/ADR细胞周期;用雷公藤红素与阿霉素联用,48h后采用CCK-8实验检测K562/ADR细胞活力;用不同浓度的雷公藤红素处理K562/ADR细胞,检测其耐药相关基因表达与药物浓度的相关性。结果:1.RNA-Seq检测到差异表达的mRNAs中上调、下调的mRNAs分别有751个、1050个;用不同剂量的阿霉素处理K562和K562/ADR细胞,IC50值分别为:0.04和11.328μM,提示K562/ADR细胞对阿霉素耐药;而雷公藤红素对K562和K562/ADR细胞增殖有抑制作用,且均表现出剂量依赖性,随着雷公藤红素浓度的增加,K562和K562/ADR细胞活力均逐渐降低,雷公藤红素对K562和K562/ADR细胞作用48h的IC50浓度分别为1.91μM、2.72μM。2.雷公藤红素处理细胞48h后,与未经雷公藤红素处理的细胞相比,K562/ADR细胞凋亡比率明显升高;雷公藤红素抑制抗凋亡相关蛋白Bcl-2的表达,上调促凋亡相关蛋白Bax的表达。3.雷公藤红素处理细胞48h后,与未经处理的细胞相比,雷公藤红素可诱导细胞周期阻滞。4.不同浓度雷公藤红素与阿霉素联合处理48h后,与单独用药组相比,联合处理组K562/ADR细胞活力被明显抑制。5.雷公藤红素抑制ABCB1表达并呈现剂量依赖性,随着雷公藤红素浓度的增加,ABCB1的mRNA水平逐渐降低。结论:1.雷公藤红素可通过抑制细胞活力,促进细胞凋亡,诱导细胞周期阻滞,逆转白血病耐药,从而发挥抗K562/ADR细胞白血病治疗作用。2.雷公藤红素抗白血病作用可能与抑制ABCB1、Bcl-2,上调Bax表达,诱导白血病细胞凋亡密切相关。
李颖[4]（2019）在《Beclin-1过表达诱导的自噬对慢性粒细胞白血病Bcr-Abl的抑制作用及其分子机制研究》文中认为研究背景:慢性粒细胞白血病（Chronic myeloid leukemia,CML）是临床上常见的血液系统恶性肿瘤。酪氨酸激酶抑制剂（Tyrosine kinase inhibitor,TKI）作为一线CML治疗已经取得了显着的疗效,但是仍然有30%左右的患者因Bcr-Abl基因突变或Bcr-Abl不依赖途径出现耐药。近年来研究表明,有多种途径能使Bcr-Abl蛋白降解或抑制Bcr-Abl基因表达,而这些途径可能是治疗基因突变或耐药CML的新方法。已有研究证明,诱导自噬性死亡是CML治疗的新策略。我们前期研究结果显示携带自噬基因Beclin-1的溶瘤病毒感染CML,能通过诱导自噬性死亡显着增加溶瘤病毒对CML细胞的杀伤作用,但其能否杀伤CML耐药细胞和白血病干细胞及其分子机制有待进一步阐明。本课题通过二部分分别进行阐述,第一部分应用生物信息学分析,结合使用多种Beclin-1基因突变体,通过GST-Pull down、免疫共沉淀和Western blot等技术研究了 Becl in-1和Bcr-Abl的体外相互作用以及两种蛋白在细胞体内的相互作用;并观察了 K562细胞中Beclin-1过表达对Bcr-Abl启动子活性的影响,为进一步探索Beclin-1过表达诱导自噬性死亡对CML细胞的杀伤作用及下调Bcr-Abl的机制研究奠定了基础。第二部分通过慢病毒载体进一步研究在CML细胞和从CML急性变患者骨髓中分离出的CD34+CD38-细胞中过表达Beclin-1后,观察细胞生长、自噬相关基因的变化,以及Beclin-1过表达对Bcr-Abl的调控作用;应用自噬调控剂和ATG7、UVRAG基因siRNA研究了其对Bcr-Abl下调的影响;探讨了 Beclin-1过表达对Bcr-Abl与p62/SQSMT1共定位的影响。另外,在Bcr-Ab1 T315I突变的耐药细胞株——32D-p210-T315I细胞中过表达Beclin-1,观察细胞生长和自噬相关基因的变化,以及对Bcr-Abl的调控作用。第一部分 自噬基因Beclin-1与慢性粒细胞白血病Bcr-Abl融合基因相互作用的研究目的:分析和研究自噬基因Beclin-1和Bcr-Abl融合基因的相互作用。方法:采用生物信息学方法分析两种基因是否存在直接或间接的相互作用;通过GST-Pull down实验和免疫共沉淀、Western blot等技术研究了 Beclin-1和Bcr-Abl的体外和在细胞体内的相互作用;后续进一步通过双荧光素酶活性试验明确Becl in-1过表达在K562细胞中对Bcr-Abl启动子活性的影响。结果:1.根据生物信息学的预测结果,我们可以看到Beclin-1和抗凋亡蛋白Bcl-2具有直接的相互作用。在中可信度情况下,Beclin-1可能通过Bcl-2与Bcr-Abl具有相互作用。2.GST-Pull down实验发现Beclin-1的C端450-300和450-250氨基酸缺失影响了 Beclin-1与GST或GST-Bcr-Abl的结合,提示Beclin-1和Bcr-Abl的相互作用的结构位于C末端150个氨基酸的区域内。3.免疫共沉淀实验结果表明Beclin-1的C端150氨基酸缺失蛋白（Beclin-1△C150）不能沉淀Bcr-Abl蛋白,而C端100氨基酸缺失蛋白（Beclin-1△C100）能沉淀Bcr-Abl蛋白,进一步证实Beclin-1蛋白与Bcr-Abl融合蛋白相互作用的位置处于C端100-150氨基酸残基内。4.双荧光素酶活性试验发现,共转染Beclin-1-K562细胞中双荧光素酶活性明显降低,表明Beclin-1过表达能显着抑制Bcr-Abl启动子的活性。结论:尽管通过STRING数据库进行生物信息学分析显示,并没有现有数据提示自噬基因Beclin-1与白血病融合基因Bcr-Abl有直接的相互作用关系,但是本研究通过GST-Pull down实验和免疫共沉淀实验证实Beclin-1和Bcr-Abl可能有直接的相互作用关系,其C端100-150氨基酸残基内可能是与Bcr-Abl的结合区域。双荧光素酶活检检测实验显示Beclin-1在K562细胞中过表达抑制Bcr-Abl的转录活性。本研究结果与以往文献中的研究均提示自噬和自噬基因Beclin-1与CML有密切关系,靶向自噬途径可能是治疗CML的新策略。第二部分 Beclin-1过表达诱导CML细胞自噬性死亡及其分子机制研究目的:分析和研究自噬基因Beclin-1过表达对CML细胞自噬的分子机制。方法:1.在K562细胞中用慢病毒过表达Beclin-1,检测其对Bcr-Abl蛋白表达的影响,以及明确是否涉及自噬通路。2.应用扫描电镜和蛋白印迹实验,研究自噬抑制剂3-MA和蛋白酶体抑制剂epoxomicin（Epo）在Beclin-1过表达后对自噬产生的影响。3.应用自噬调控剂和ATG7、UVRAG基因siRNA研究其对Bcr-Abl蛋白调控的影响。4.通过Western blot方法,探讨了 Beclin-1过表达对Bcr-Abl与p62/SQSMT1共定位的影响。5.应用MTT法检测Beclin-1过表达,分别联合3-MA或Epo对K562细胞生长的调节作用。6.在32D-p210-T315I细胞及T315I突变阳性CML患者原代细胞中过表达Beclin-1后,通过MTT、集落培养及Western blot等方法,探讨过表达Beclin-1是否诱导耐药细胞自噬并对生长及集落形成的影响,以及对Bcr-Abl蛋白的调控作用。7.从CML急性变患者骨髓中分离出CD34+CD38-的细胞,应用集落培养法及蛋白印迹法明确Beclin-1过表达对CML干细胞的影响。结果:1.在K562细胞中,Beclin-1过表达并不激活凋亡通路Caspase-3和PAPR。应用Caspase抑制剂未能逆转Beclin-1过表达对Bcr-Abl的抑制作用,说明Beclin-1过表达导致的Bcr-Abl下调与细胞凋亡和Caspase信号通路无关。2.自噬抑制剂3-MA能逆转Beclin-1诱导的自噬;蛋白酶体抑制剂Epo则显着增加Beclin-1过表达诱导自噬。但是,无论是3-MA或是Epo对Beclin-1过表达导致的Bcr-Abl蛋白下调均无明显影响。Western blot实验还显示K562细胞过表达Beclin-1会导致自噬相关基因ATG7和UVRAG表达的上调。3.通过对自噬基因ATG7和UVRAG的siRNA筛选,显示ATG7和UVRAG的干扰均能明显逆转Beclin-1过表达诱导的细胞自噬,表现为LC3-II表达抑制;同时,两种基因的干扰也能部分逆转Bcr-Abl蛋白的下调。4.我们的实验结果显示Beclin-1过表达时,Bcr-Ab1在K562细胞内与p62/SQSTM的共定位增加;应用Cathesin B抑制剂CA074时,与对照组相比,细胞核周围Bcr-Abl与p62/SQSTM的共定位减少;提示Bcr-Abl的降解可能与p62/SQSTM使得Bcr-Abl定位到自溶酶体,随后在蛋白酶Cathesin B作用下导致蛋白降解有关。5.通过Beclin-1过表达或分别联合自噬抑制剂3-MA、蛋白酶体抑制剂Epo对K562细胞生长抑制作用的观察,发现Beclin-1过表达对CML细胞有生长抑制作用。Epo促进自噬联合Beclin-1过表达诱导自噬能显着抑制CML细胞生长。6.在32D-p210-T315I细胞株中过表达Beclin-1后,通过MTT发现过表达Beclin-I后细胞生长受抑。集落培养法检测发现,在T315I突变CML原代细胞过表达Beclin-1后,集落生成减少。通过Western blot方法检测,自噬相关基因LC3II表达增加,诱导自噬发生,同时p-Bcr-Abl蛋白表达水平下降。7.应用集落培养法检测Beclin-1过表达对CFU-GM集落的影响,结果显示Beclin-1过表达的CD34+CD38-细胞组中,CFU-GM集落数显着降低,提示Beclin-1抑制CML干细胞的粒系集落形成。我们应用Western blot分析了 Beclin-1过表达对CD34+CD38-细胞Bcr-Abl及其信号通路蛋白的影响。显示,Beclin-1过表达时ATG7和UVRAG上调、Bcr-Abl蛋白表达明显受到抑制;另一方面,LC3-II显着增加,P62表达减少,提示CML干细胞发生自噬。结论:我们的研究证明CML敏感株K562过表达Beclin-1能抑制Bcr-Abl的表达,其机制可能与Beclin-1过表达导致ATG7上调、Bcr-Abl与p62/SQSTM的共定位增加从而使得Bcr-Abl蛋白降解有关。Beclin-1过表达能抑制耐药细胞32D-p210-T315I的生长,诱导自噬的发生,同时对Bcr-Abl蛋白降解也有一定的作用,提示T315I突变的细胞中过表达Beclin-1可能通过诱导自噬性死亡达到克服耐药的作用。Beclin-1过表达也能抑制CD34+CD38-细胞体外CFU-GM集落形成,提示诱导自噬性死亡可能是治疗CML、清除Bcr-Abl的CML白血病干细胞的一种新方法。Beclin-1过表达导致Bcr-Abl的下调与自噬依赖的Bcr-Abl蛋白降解有关。在CML白血病干细胞中尚需进行更进一步的深入研究。
鲍静[5]（2019）在《MiR-141-5p靶向RAB32在慢性粒细胞白血病中的作用与机制研究》文中研究指明慢性粒细胞白血病（Chronic myeloid leukemia,CML）是一种以髓系前体克隆扩增为特征的恶性骨髓增生性肿瘤,是研究最广泛的肿瘤之一。CML的细胞遗传学特征是费城染色体（Ph）,由t（9;22）（q34.1;q11.21）易位产生,包括位于9号染色体长臂上的Abelson白血病病毒（CABL）致癌基因和位于22号染色体长臂上的断点簇区域（BCR）重组导致融合基因的形成,即所谓的致癌基因BCR-ABL1。伊马替尼是首个用于CML治疗的BCR-ABL酪氨酸激酶抑制剂（TKI）,因其高效和特定的作用机制而被广泛用于治疗CML。但随着广泛应用,副作用也随之出现,并且1/5的CML患者出现了耐药。因此,深入探讨其可能的发病机制,寻求新的治疗方法显得尤为迫切。已证实非编码RNA在肿瘤的发生发展中具有重要作用,作为非编码RNA中的一种,微小RNA（microRNA,miRNA）是广泛表达于原核和真核细胞内的一类小分子非编码RNA（22个核苷酸左右）,通过与靶基因mRNA的3’untranslation region（3’-UTR）特异性相互作用来调控基因表达,参与机体多种病理生理过程（分化、增殖、生长、迁移、存活等）,发挥重要作用。miR-141是miR-200家族成员之一,主要参与上皮-间充质转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）、增殖、迁移、侵袭、耐药等多种细胞过程。Edurne San等发现hsa-miR-141在耐药的CML患者中表达降低。课题组前期预实验中也发现miR-141-5p在初治CML患者和K562细胞株中显着低表达,在健康对照和CML患者治疗后表达上调,然而关于miR-141-5p在CML中生物学效应的认识仍不够深入。生物信息学软件预测miR-141-5p可靶向RAB32。RAB32是小型GTPases Ras超家族成员,调控多种细胞类型的细胞内膜转运事件。RAB32的高表达缩短了神经突长度,改变了线粒体形态,加速了人原代神经元和细胞系的凋亡/坏死。在CML中,miR-141-5p能否通过靶向RAB32对慢性粒细胞白血病细胞生物学产生影响,以及相关机制尚不清楚。本论文首次通过体内和体外实验观察miR-141-5p在CML中的表达和作用,并进一步探讨其可能的作用机制,为CML的诊断提供新的线索,为CML临床治疗寻找新的靶点。主要研究内容概括如下:1.MiR-141-3p和miR-141-5p在CML患者和CML K562细胞中的表达情况实验首先检测新诊断CML患者、健康人骨髓标本、K562、K562/G细胞和CD34+细胞中miR-141-3p和miR-141-5p的表达情况。q-PCR证实miR-141-3p和5p在CML患者、K562和K562/G细胞中存在低表达现象,且miR-141-5p低表达更为显着。18例新诊断的CML患者接受TKI治疗后,通过回访发现,14例患者一年后BCR-ABL拷贝数明显下降,4例CML患者未出现显着下降。q-PCR再次检测miR-141-3p和5p在治疗后三个月CML患者中的表达水平,发现两者的表达水平较治疗前均有显着上调。提示低表达的miR-141可能在CML的发生、发展中发挥作用。2.MiR-141-5p在CML K562细胞株中的生物学效应鉴于miR-141-5p在CML患者中低表达更为显着,故进一步选取miR-141-5p作为研究对象,用阳离子脂质体法在K562细胞中分别转染miR-141-5p inhibitor&negative control和miR-141-5p mimics&negative control,下调或上调miR-141-5p的表达,Western blotting和q-PCR检测K562细胞中相关基因的表达情况,PI法染色后用流式细胞仪检测转染后细胞周期变化,Annexin V/PI法检测K562细胞株的凋亡情况。实验结果发现,转染miR-141-5p inhibitor后显着抑制了K562细胞中miR-141-5p的表达,同时K562细胞中c-Myc、Cyclin D1、MMP-3、MMP-9蛋白和mRNA表达水平显着增高,K562细胞的S期和G2/M期比例增高,提示miR-141-5p的低表达能够增强K562细胞的增殖、迁移能力;而转染miR-141-5p mimics后则显着上调K562细胞中miR-141-5p的表达,c-Myc、Cyclin D1、MMP-3、MMP-9蛋白和mRNA表达水平显着降低,cleaved caspase-3蛋白表达水平上调,S期和G2/M期的细胞比例降低,细胞凋亡比例显着增加,提示过表达miR-141-5p能显着抑制K562细胞的增殖、迁移能力,促进细胞的凋亡。3.MiR-141-5p对裸鼠成瘤能力的影响构建稳定表达miR-141-5p mimics negative control&mimics的K562细胞株,成功建成CML裸鼠移植瘤模型,观察并测量移植瘤的体积和重量。动物实验结果显示,与体内细胞的生长结果一致,miR-141-5p mimics组的肿瘤生长速度、体积和重量均明显低于对照组,提示miR-141-5p可能在CML中发挥抑癌基因的作用。4.MiR-141-5p靶向RAB32在CML中的机制研究MiRanda、Targetscan等软件预测,双荧光素酶报告基因法证实RAB32是miR-141-5p的直接靶基因。为探讨miR-141-5p靶向RAB32的作用机制,实验进一步研究了miR-141-5p对K562细胞RAB32表达的调控作用。Western blotting、q-PCR检测结果证实抑制或过表达miR-141-5p,RAB32蛋白和mRNA水平会出现相应的升高或降低。进一步分析miR-141-5p与RAB32表达水平在CML患者中的相关性,结果同样显示低表达miR-141-5p的CML患者中RAB32蛋白和mRNA呈现高水平;反之,高过表达miR-141-5p的健康对照和CML治疗后患者中RAB32蛋白和mRNA呈现相对低表达。提示miR-141-5p能够调控CML中RAB32的表达。使用RAB32 siRNA沉默RAB32表达后,能够抑制K562细胞的增殖、迁移能力,促进细胞凋亡。miR-141-5p mimics和空白质粒共转染进K562细胞,结果发现过表达miR-141-5p后,能够显着抑制K562细胞增殖、迁移,促进细胞凋亡,而同时共转染RAB32过表达质粒（RAB32-N1）不能改变miR-141-5p mimics对K562细胞的增殖、迁移和凋亡的影响。提示miR-141-5p可能通过靶向RAB32在CML中发挥作用。
陈亨[6]（2016）在《HIF-1α及下游VEGF对CML细胞增殖的影响及T315I突变CML的协同治疗策略》文中指出第一部分缺氧状态下HIF-1α对慢性髓细胞白血病细胞增殖作用的研究目的本实验通过采集慢性髓细胞白血病病人骨髓标本和健康志愿者骨髓标本,检测HIF-1α的表达水平,了解病人骨髓中HIF-1αm RNA表达水平与健康志愿者间的差异。并尝试分析HIF-1α基因对慢性髓细胞白血病细胞增殖作用的影响和可能的作用机制。方法通过实时定量RT-PCR方法检测慢性髓细胞白血病病人和相对正常病人骨髓标本中HIF-1α的m RNA表达水平差异。通过RT-PCR法确认K562细胞系中HIF-1α被Si RNA沉默。通过CCK-8法测定沉默HIF-1α后的K562细胞系的增殖和集落形成能力。通过RT-PCR法检测沉默HIF-1α后的K562细胞系中p21、p53的m RNA水平,通过westernblot法检测沉默HIF-1α后的K562细胞系中p21、p53蛋白的表达水平。结果1慢性髓细胞白血病病人骨髓中HIF-1αm RNA的表达水平显着高于对照组,存在显着的统计学意义（P<0.05）。2沉默K562细胞中的HIF-1α能显着抑制K562细胞系的增殖能力,存在显着的统计学意义（P<0.05）。3沉默K562细胞中的HIF-1α能显着抑制K562细胞系的集落形成能力,存在显着的统计学意义（P<0.05）。4通过沉默K562细胞系的HIF-1α基因,该细胞系中p21的m RNA和蛋白表达被显着抑制,而p53的m RNA和蛋白表达未受影响。结论1慢性髓细胞白血病病人骨髓中HIF-1α的表达水平显着高于正常人。2 HIF-1α通过上调p21的表达可以促进慢性髓细胞白血病细胞的增殖。第二部分缺氧状态下VEGF对慢性髓细胞白血病细胞增殖作用的研究目的探讨慢性髓细胞白血病（chronic myeloid leukemia,CML）患者血清中血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）的表达水平及其对细胞增殖的影响。方法采用酶联免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）定量检测12例CML患者（7例慢性期,5例急变期）血清VEGF水平,体外高、低表达VEGF,利用RT-PCR法检测VEGF转染K562细胞后VEGF m RNA水平,并观察转染后对K562细胞增殖的影响。结果1血清VEGF在慢性髓细胞白血病患者组中的水平为115.8±32.72（ng/L）,正常对照组的水平为391.95±91.21（ng/L）,差异有统计学意义（P<0.05）。上述结果表明VEGF在CML患者组中表达较高。2检测慢性髓细胞白血病不同临床分期患者的血清VEGF水平,慢性髓细胞白血病慢性期患者的血清VEGF水平为267.4±58.89（ng/L）,慢性髓细胞白血病急变期患者的血清VEGF水平为473±51.12（ng/L）。结果显示慢性髓细胞白血病慢性期VEGF水平显着低于急变期患者,差异有统计学意义（P<0.05）。3与对照组相比,K562细胞转染反义核苷酸后,VEGF m RNA水平显着降低,差异具有统计学意义（P<0.01）。同时反义核苷酸转染入K562细胞后,随着培养时间的延长,细胞增殖速度与对照组相比明显减慢,差异具有统计学意义（P<0.05）,而转染正义核苷酸组,细胞生长速度与对照组比,无显着性差异。提示了低表达VEGF表达水平可以抑制K562细胞的增殖。4在转染反义核苷酸组的细胞中加入外源性的VEGF165后,能部分抵消反义核苷酸抑制K562细胞生长的作用,差异有统计学意义（P<0.05）。进一步提示VEGF对细胞增殖具有促进作用。结论1 VEGF能促进慢性髓细胞白血病细胞系K562细胞的增殖。2 VEGF能帮助监测慢性髓细胞白血病的疗效并预测预后。第三部分T315I突变的慢性髓细胞白血病协同治疗的策略目的设计LBH589+ATO、LBH589+17-AAG、17-AAG+ATO、LBH589+Vx-680四个实验组,将这四组药物两两联合分析其对Ba/F3-P210-T315I的治疗效果并分析它们与单药相比的协同效应。方法采用CCK-8法检测LBH589、ATO、17-AAG、Vx-680单药及LBH589+ATO、LBH589+17-AAG、17-AAG+ATO、LBH589+Vx-680四组联合用药对Ba/F3-P210-T315I、Ba/F3-P210细胞系的增殖抑制作用。通过流式细胞术应用AnnexinⅤ-PI试剂盒检测单药及联合用药对Ba/F3-P210-T315I、Ba/F3-P210细胞系的促凋亡作用。通过westernblot法检测LBH589作用于Ba/F3-P210-T315I细胞系后Aurora激酶的表达水平。结果1 LBH589,ATO,17-AAG,Vx-680单独使用对Ba/F3-P210-T315I细胞均有增殖抑制效应,但是Vx-680的增殖抑制效应最为明显,且抑制率随着药物浓度的增加成指数增长,ATO次之。但四种药物的IC50浓度不同,分别为:LBH589（12 nmol/L）,ATO（260 nmol/L）,17-AAG（80 nmol/L）,Vx-680（48 nmol/L）。2四种药物对Ba/F3-P210细胞也具有增殖抑制效应,但是Vx-680的抑制效率最为明显,且四种药物的IC50浓度也不同,分别为:LBH589（24 nmol/L）,ATO（480nmol/L）,17-AAG（60 nmol/L）,Vx-680（32 nmol/L）。3 LBH589+ATO、LBH589+17-AAG、17-AAG+ATO、LBH589+Vx-680四组联合用药对Ba/F3-P210-T315I细胞系的增殖抑制作用为随着IC50浓度的增加,不同的药物组合体现了不同的抑制效率,其中LBH589+Vx-680的组合增殖抑制作用最佳。4通过Annexin V-PI试剂盒染色及流式细胞仪分析发现,LBH589+Vx-680的促凋亡效率最为明显,余次为LBH589+ATO>ATO+17-AAG>LBH589+17-AAG。5 IC50浓度的LBH589作用于Ba/F3-P210-T315I细胞后Aurora A激酶的表达显着减少,而Aurora B激酶的表达无明显变化。结论1 LBH589、ATO、17-AAG、Vx-680单独使用对Ba/F3-P210-T315I、Ba/F3-P210细胞均有增殖抑制效应。2 LBH589+ATO、LBH589+17-AAG、17-AAG+ATO、LBH589+Vx-680四组联合用药中,LBH589+Vx-680对Ba/F3-P210-T315I细胞的增殖抑制和促凋亡效应最好。3 LBH589+Vx-680对Ba/F3-P210-T315I细胞的增殖抑制和促凋亡效应可能是通过抑制Aurora A激酶实现的。
黄睿[7]（2015）在《EPS8参与髓系白血病生物学过程及其机制的研究》文中研究说明髓系白血病是成人常见的白血病类型,包括急性髓系白血病（AML）和慢性粒细胞白血病（CML）。AML是一个异质性疾病,原癌基因的突变、染色体异常发生率高。AML的治疗主要分为两个阶段,第一阶段为诱导治疗,常用阿糖胞苷联合蒽环类抗生素。第二阶段为缓解后治疗,采用联合化疗或造血干细胞移植。过去的三十年,65岁以下的年轻AML的生存率得到一定的改善,主要源于支持治疗的改善,使得患者能耐受联合化疗以及移植,从而获得长期生存,但是超过三分之一的患者会出现复发。老年白血病患者由于难以耐受化疗及移植,治疗效果欠佳,在过去的几十年中长期生存无明显改善,5年的总生存不到10%。难治复发及老年患者是AML的治疗难点,需要探讨新的治疗。分子靶向治疗由于其特异性,具有高效低毒的特点,成为近年来肿瘤治疗研究的热点。突变的FLT3抑制剂、ABT-199、IDH抑制剂等正在进行临床试验,初步显示其抗白血病的优势。虽然在AML靶向治疗方面,已经有了一些研究进展,但由于AML的患者具有较大的异质性,需要寻找更多的靶点,对AML患者进行个体化治疗。而对于CML的治疗,靶向药物伊马替尼及其二代、三代酪氨酸酶抑制剂（TKI）已经取得巨大的成功,但是仍然有20-51%的CML患者对TKI耐药。TKI耐药的原因众多,包括Abl酪氨酸激酶区域的点突变、BCR/ABL基因扩增或过表达、ATP药泵表达增高、SRC家族激酶活性异常增高、干细胞耐药、骨髓微环境介导耐药、表观遗传学介导的耐药等。TKI耐药是CML治疗的难题,探讨TKI以外的其他治疗有助于克服TKI耐药。表皮生长因子底物8（EPS8）是一个表达在细胞浆的接头蛋白。EPS8是EGFR等受体型和非受体型酪氨酸激酶的底物,其结构从N端到C端分别包括磷酸化酪氨酸结合蛋白域、SH3以及SAM-PNT域,可以与其他蛋白组成复合物,传递信号。研究表明 EPS8 可分别与 Abil、RN-tre、Shc、Shb、Dvl-1、IRSp53 等蛋白结合,组成复合物传递信号,参与细胞骨架的重塑、增殖、凋亡、粘附、迁移、受体内化等生理过程。近年来的研究发现EPS8还参与恶性肿瘤的发展、侵袭转移。多项研究表明EPS8在鳞癌、宫颈癌、卵巢癌、肺癌、神经胶质瘤等恶性肿瘤中高表达,并与侵袭、预后相关,被认为是一个原癌基因。然而,EPS8在血液肿瘤的研究较少,EPS8是否参与白血病的生物学过程尚不清楚。我们前期研究发现AML患者骨髓EPS8 mRNA较正常人骨髓表达增高,与对化疗的反应相关,但其参与白血病生物学过程的机制尚不清楚。本研究分三个部分探讨了 EPS8在髓系白血病生物学过程中的作用及其机制:Bcr-abl+细胞系及CML患者EPS8表达情况;过表达EPS8对髓系白血病细胞生物学功能的影响;沉默EPS8对髓系白血病生物学功能的影响。结果发现在初发CML患者骨髓EPS8 mRNA表达高于正常对照,治疗后缓解的CML患者骨髓EPS8 mRNA水平低于初发CML患者。过表达EPS8使髓系白血病细胞增殖加快、凋亡减少、粘附迁移能力增加、对药物敏感性下降,PI3K/AKT、RAS/ERK、JAK2/STAT5信号通路激活,而沉默EPS8有相反的作用。本研究证实了 EPS8参与髓系白血病生物学过程,提示EPS8可作为髓系白血病治疗的靶点之一。第一章Bcr-abl+细胞系及CML患者EPS8表达情况目的探讨EPS8在Bcr-abl+细胞系及CML患者骨髓单个核细胞的表达方法:采用Q-RT-PCR方法对2013-2015年南方医科大学珠江医院血液科CML患者骨髓标本及广州金域医学检验中心CML RNA标本共98例及非白血病骨髓标本11例进行检测EPS8基因mRNA表达。98例CML患者中,慢性期58例,加速期11例,急变期21例,治疗后血液学缓解8例。EPS8与内参比值以2-ΔΔCt表示。采用western blot方法对CML细胞株KBM5、MEG01、K562、小鼠abl+温度敏感B淋巴细胞株S4C2-1、S9、小鼠32D-p210-野生型、32D-p210-T315I细胞株检测EPS8蛋白的表达。结果:1.CML不同分期EPS8与内参比值中位数分别为慢性期4.12（0.76-13.2）,加速期 3.25（1.77-9.01）,急变期 4.12（2.11-9.41）,治疗后血液学缓解 1.46（0.39-1.79）,正常对照 1.00（0.90-1.24）。采用非参数分析的多样本秩和检验进行统计学分析。慢性期、加速期、急变期、治疗后血液学缓解及正常对照的平均秩次分别为58.16、64.14、63.48、32.62、29.32,总体有统计学差异（P=0.006）。慢性期EPS8表达高于治疗后血液学缓解组、正常对照组,有统计学差异（P值分别为0.047及0.029）,加速期EPS8表达高于治疗后血液学缓解组、正常对照组,有统计学差异（P值分别为0.010及0.001）,急变期EPS8表达高于治疗后血液学缓解组、正常对照组,有统计学差异（P值分别为0.005及0.000）。2.对三株人CML细胞株KBM5、MEG01、K562分析EPS8蛋白表达,发现MEG01表达低,KMB5及K562表达高。发生恶性转化的稳定转染小鼠温度敏感Abl病毒的B淋巴细胞株S4C2-1的EPS8蛋白水平高于亲代未恶性转化细胞S9。转染了突变型BCR/ABL-T315I的TKI耐药小鼠髓系细胞株32D-p210-T315I 的 EPS8 表达高于野生型 32D-p210-wt。结论:初发CML患者骨髓EPS8 mRNA高于正常对照,治疗后骨髓缓解的CML患者EPS8表达水平下降。恶性转化细胞S4的EPS8蛋白水平高于亲代未转化细胞SP9,TKI耐药的32D-p210-T315I细胞EPS8蛋白水平高于32D-p210-wt,提示EPS8参与CML的生物学过程。第二章过表达Eps8对髓系白血病细胞生物功能的作用及其机制研究目的:探讨过表达Eps8对髓系白血病细胞生物学功能的作用及其机制。方法:构建pLVX-hEPS8-Puro及pLVX-AcGFP1-N1慢病毒载体,转染到293T细胞包装表达hEPS8及GFP的慢病毒,感染HL60细胞并用嘌呤霉素筛选,建立稳定转染EPS8的HL60细胞株HL60-EPS8及其对照细胞株HL60-GFP。采用CCK8检测HL60-EPS8细胞株及对照细胞、亲代细胞的增殖。用Annexin-APC/7-AAD染色后流式细胞仪检测细胞的凋亡。用PI对细胞染色后流式检测细胞周期。将细胞铺在包被了 fibronectin的培养板上,1.5小时后光学显微镜下观察粘附板底的细胞,并用CCK8检测粘附细胞的OD值。用Transwell小室检测细胞的迁移能力。用荧光标记的鬼笔环肽检测细胞的F-actin。将柔红霉素、阿糖胞苷在不同浓度、不同时间处理细胞,CCK8检测细胞的存活率。采用 western blot 检测细胞信号通路的蛋白 p-AKT、p-ERK、p-STAT5、p-PP2Ac。结果:1.成功构建过表达EPS8的HL60-EPS8细胞株,mRNA水平EPS8表达为对照细胞HL60-GFP细胞株的52.09倍,蛋白水平EPS8表达为对照细胞HL60-GFP细胞株的10.62倍。2.24 小时 HL-60 OD 值为 0.44±0,HL60-GFP 为 0.44±0.01,HL60-EPS8 为0.47±0,不同组间有差异（F=31.864,P=0.001）。HL60-EPS8 与 HL60 及HL60-EPS8与HL60-GFP之间比较差异均有显着性意义。（P均<0.01）。第48 小时 HL-60 OD 值为 0.62±0.01,HL60-GFP 为 0.62±0.01,HL60-EPS8 为0.67±0.01。不同组间有差异（F=18.827,P=0.003）,HL60-EPS8 与 HL60 及HL60-EPS8与HL60-GFP之间比较差异均有显着性意义（P均<0.01）。72小时 HL-60 OD 值为 0.86±0.01,HL60-GFP 为 0.87±0.01,HL60-EPS8 为1.01±0.03。不同组间有差异（welch=28.388,P=0.008）。HL60-EPS8 与 HL60及HL60-EPS8与HL60-GFP之间比较差异均有显着性意义（P均<0.05）。3.细胞在包被fibronetin的培养板上培养1.5小时,光学显微镜下观察到HL60-EPS8数量多于HL60-GFP及HL60。CCK8计数显示HL60细胞粘附在 96 孔板细胞 OD 值为 0.43±0.05,HL60-GFP 为 0.51±0.06,HL60-EPS8为0.69±0.07。三组细胞粘附在fiberonectin的细胞OD值有显着性差异（F=28.432,P=0.000）。HL60-EPS8 组粘附细胞 OD 值与 HL60、HL60-GFP组相比,差异均有显着性意义（P均<0.001）。4.采用 annexin V/7-AAD 双染法检测凋亡,HL60、HL60-GFP、HL60-EPS8 的早期凋亡细胞比例分别为3.31±0.21%、3.7±0.2%、2.43±0.06%。三组细胞的早期凋亡比例有显着性差异（F=43.712,P=0.000）。HL60-EPS8早期凋亡比例与HL60、HL60-GFP组相比,差异均有显着性意义（P均<0.01）。HL60、HL60-GFP、HL60-EPS8 的晚期凋亡细胞比例分别为 1.13±0.09%、1.04±0.13%、1.01±0.07%,三组细胞的晚期凋亡比例无显着性差异（F=1.098,P=0.392）。HL60、HL60-GFP、HL60-EPS8细胞的总凋亡比例分别为4.44±0.28%、4.74±0.26%、3.44±0.03%。三组细胞的总凋亡比例有显着性差异（Welch=44.730,P=0.008）。HL60-EPS8 总凋亡比例与 HL60、HL60-GFP相比,差异均有显着性（P<0.05）。5.PI染色测定细胞周期,发现HL60、HL60-GFP、HL60-EPS8细胞S比例分别为 48.39±0.87%、55.44±0.25%、60.57±0.87%。三组细胞 S 期比例之间差异有显着性（F=213.519,P=0.000）。三组细胞多重组间比较,发现三组细胞S期比例差异均有显着性（P均<0.05）。6.Transwell小室检测迁移能力,在光学显微镜下观察到HL60-EPS8细胞从上室迁移到下室细胞明显多于HL60、HL60-GFP细胞。HL60、HL60-GFP、HL60-EPS8 下室细胞的 OD 值分别为 0.99±0.01,0.96±0.02,1.23±0.02,三组迁徙细胞OD值差异有显着性（F=544.573,P=0.000）。HL60-EPS8组迁移细胞OD值与HL60、HL60-GFP相比,差异均有显着性（P均<0.001）。7.用荧光标记的鬼笔环肽对F-actin染色,在共聚焦显微镜下观察HL60、HL60-GFP、HL60-EPS8细胞F-actin分布情况,三组细胞无明显差异。8.用不同浓度柔红霉素分别处理HL60-GFP、HL60-EPS8细胞24小时、48小时、72小时。24小时,在15nM、30 nM、60nM、120 nM浓度的柔红霉素作用下HL60-EPS8存活率均高于HL60-GFP组,差异有显着性（t-7.120,P=0.002;t=-6.664,P=0.003;t=-34.689,P=0.000,t=-19.724,P=0.000）。48小时,在15nM、30 nM、60nM、120 nM浓度的柔红霉素作用下HL60-EPS8存活率均高于HL60-GFP组,差异有显着性。（t=-25.216,P=0.000;t=-69.148,P=0.000;t=-158.408,P=0.000,t=-16.612,P=0.000）。72 小时,在 15nM、30nM、60nM浓度HL60-EPS8细胞存活率均高于HL60-GFP,在各浓度均有统计学意义（t=-50.289,P=0.000;t=-38.240,P=0.000;t=8.316,P=0.001）。用阿糖胞苷分别处理HL60-GFP、HL60-EPS8细胞株,比较不同浓度（0、250nM、500nM、1000nM）,不同时间点（48小时及72小时）与不用药细胞相比的存活率。48小时在250nM、500nM、1000nM浓度细胞存活率进行分析,HL60-EPS8细胞存活率在各浓度均高于HL60-GFP,差异具有显着性（t=-8.268,P=0.000;t=-7.714,P=0.000,t=-7.408,P=0.000）。72 小时在 250nM、500nM、1000nM浓度细胞存活率进行分析,HL60-EPS8细胞存活率在各浓度均高于 HL60-GFP,差异具有显着性（t=-10.447,P=0.000;t=-11.632,P=0.000,t=-15.908,P=0.000）。9.信号通路蛋白分子检测提示HL60-EPS8细胞的p-ERK、p-AKT、p-STAT5高于HL60-GFP,而p-PP2Ac水平低于对照细胞。结论:过表达EPS8后HL60的增殖加快,凋亡减少,粘附能力增加,迁移能力增加,对化疗药物的敏感性下降,p-ERK、p-AKT、p-STAT5水平升高。EPS8可能通过调控RAS/ERK、PI3K/AKT、JAK2/STAT5信号通路调控细胞生物学功能。第三部分沉默EPS8对髓系白血病细胞生物学功能的作用及其机制研究目的探讨沉默EPS8对髓系白血病细胞生物学功能的作用及其机制研究方法构建4个shRNA-EPS8质粒载体,分别转染到293T细胞,包装沉默EPS8的慢病毒。将慢病毒感染K562,选择沉默EPS8效率最高的病毒继续用嘌呤霉素筛选,构建稳定沉默EPS8的K562细胞株K562-shRNA-EPS8及对照细胞株K562-GFP。采用MTT方法检测K562-shRNA-EPS8及对照细胞24小时、48小时及72小时增殖。采用Annexin V-APC/7-AAD染色,流式检测K562-shRNA-EPS8及对照细胞的凋亡。用PI对K562-shRNA-EPS8及对照细胞染色,流式检测细胞周期。提取K562-shRNA-EPS8及对照细胞总蛋白,采用western blot 方法检测 p-AKT、p-ERK、p-PP2Ac、p-STAT5、PTEN。结果1.设计4条沉默EPS8的序列,分别连接入慢病毒载体,进行PCR测序,测序结果提示连接在载体上的序列和目的序列一致。2.将慢病毒感染K562细胞,三天后在荧光显微镜下观察感染率在70%以上。细胞经扩增及嘌呤霉素筛选后,Q-RT-PCR检测抑制效率。4个慢病毒干扰EPS8 效率分别为 58.03%、14.6%、13.67%、74.93%,western blot 验证在蛋白水平序列4干扰EPS8最显着,选取序列4慢病毒感染的K562细胞为功能实验用的稳定转染株。3.MTT检测K562-shRNA-EPS8细胞在24小时、48小时、72小时的OD值。结果发现24小时K562、K562-GFP、K562-shRNA-EPS8细胞OD值分别为0.61±0.01、0.58±0.02、0.56±0.02,发现三组之间差异有显着性（F=5.328,P=0.030）。K562-shRNA-EPS8细胞与K562-GFP细胞相比,均值差异无显着性（P>0.05）。48 小时 K562、K562-GFP、K562-shRNA-EPS8 细胞 OD 值分别为 0.90±0.02、0.87±0.03、0.79±0.02。三组均数差异有显着性（F=23.073,P=0.000）,发现K562-shRNA-EPS8细胞与K562-GFP细胞相比,均值差异有显着性（P<0.05）。72 小时 K562、K562-GFP、K562-shRNA-EPS8 细胞 OD值分别为1.19±0.08、1.13±0.07、0.99±0.11。三组均值差异具有显着性（F=5.377,P=0.029）。K562-shRNA-EPS8 细胞与 K562-GFP 细胞相比,OD值差异有显着性（P<0.05）。4.用 Annexin V-APC 及 7-AAD 对 K562、K562-GFP、K562-shRNA-EPS8 细胞进行染色后,流式检测细胞凋亡。结果发现K562、K562-GFP、K562-shRNA-EPS8 细胞早期凋亡分别为 2.66±0.14%,6.25±0.10%,14.27±0.06%;三组早期凋亡率差异有显着性（F=9506,P=0.000）。K562-shRNA-EPS8组和K562、K562-GFP组相比,差异均有显着性（P均<0.001）。K562、K562-GFP、K562-shRNA-EPS8 细胞晚期凋亡率为1.19±0.06%、2.18±0.17%、6.45±0.08%,三组之间晚期凋亡率差异有显着性（F=1859,P=0.000）。K562-shRNA-EPS8 组和 K562、K562-GFP 组相比,晚期凋亡率差异均有显着性（P均<0.001）。K562、K562-GFP、K562-shRNA-EPS8细胞总凋亡率为3.85±0.20%、8.43±0.11%、20.72±0.13%。三组之间总凋亡率差异有显着性（F=9912,P=0.000）。K562-shRNA-EPS8 组和 K562、K562-GFP组相比,总凋亡率差异均有显着性（P均<0.001）。5.用PI对K562、K562-GFP、K562-SHRNA-EPS8细胞进行染色,流式检测细胞周期显示K562、K562-GFP、K562-SHRNA-EPS8细胞的G1期细胞比例为47.78±0.48%、48.04±0.66%、54.85±0.45%,三组均值差异有显着性（F=163.847,P=0.000）,K562-shRNA-EPS8 与 K562、K562-GFP 相比,差异均有显着性（P均<0.001）。6.将细胞加入包被fibronectin的96孔板,培养1.5小时,PBS洗2遍,光学显微镜下观察粘附板底的细胞,观察到粘附在fibronectin的K562-shRNA-EPS8细胞比K562、K562-GFP细胞数量减少。CCK8计数显示K562细胞粘附在96 孔板细胞OD值为 0.48±0.05,K562-GFP 为 0.46±0.29,K562-shRNA-EPS8为0.35±0.06。三组细胞粘附在fiberonectin的细胞OD值有显着性差异（F=12.060,P=0.001）。K562-shRNA-EPS8 组粘附细胞 OD 值与 K562、K562-GFP组相比,差异均有显着性意义（P均<0.01）。7.采用transwell小室法检测细胞的迁移能力,经过在显微镜下对K562、K562-GFP、K562-SHRNA-EPS8 组的下室细胞进行观察,发现K562-shRNA-EPS8下室细胞明显比其他两组对照细胞数量减少。CCK8法对下室细胞进行定量分析提示K562、K562-GFP、K562-shRNA-EPS8下室细胞OD值分别为0.14±0.00,0.14±0.00,0.10±0.00。三组迁徙细胞OD值差异有显着性（F=208.245,P=0.000）。K562-shRNA-EPS8 组迁移细胞 OD 值与 K562、K562-GFP相比,差异均有显着性（P均<0.001）。8.用伊马替尼分别处理K562-GFP、K562-shRNA-EPS8细胞株,结果发现48小时在1.2μM、1.6μM、2.0μM的浓度,K562-shRNA-EPS8细胞存活率低于K562-GFP,差异均有显着性（t=3.441,P=0.03;t=12.093,P=0.000;t=11.078,P=0.000）。72 小时在 0.8μM、1.2μM、1.6μM、2.0μM 的浓度,K562-shRNA-EPS8细胞存活率低于K562-GFP,差异均有显着性（t=17.079,P=0.000;t=5.204,P=0.029;t=34.692,P=0.000;t=23.603,P=0.000）。用柔红霉素分别处理K562-GFP、K562-shRNA-EPS8 细胞株,48 小时在 0.05μM、0.1μM、0.15μM的浓度,K562-shRNA-EPS8细胞存活率低于K562-GFP,差异均有显着性（t=17.802,P=0.000;t=15.563,P=0.000;t=5.665,P=0.001）。72 小时在0.025μM、0.05μM、0.075μM、0.1μM 的浓度,K562-shRNA-EPS8 细胞存活率低于 K562-GFP,差异均有显着性（t=6.736,P=0.001;t=7.857,P=0.000;t=8.617,P=0.000;t=4.638,P=0.004）。9.提取 K562、K562-GFP、K562-SHRNA-EPS8 细胞的蛋白,检测 p-ERK、p-AKT、p-STAT5、PTEN的表达变化,结果发现K562的EPS8沉默后导致p-ERK、p-AKT、p-STAT5 水平下降,而PTEN的水平升高。并且,BCR/ABL磷酸化水平下降,磷酸化PP2Ac水平升高。结论成功构建了干扰EPS8的K562-shRNA-EPS8稳定转染株及对照细胞株K562-GFP。K562-shRNA-EPS8细胞的增殖低于对照细胞,早期凋亡及晚期凋亡均较对照细胞增加,细胞周期阻滞在G1,p-ERK、p-AKT、p-STAT5水平下降,而PTEN的水平升高。沉默EPS8可能通过影响RAS/ERK、PI3K/AKT、JAK2/STAT5信号通路影响K562细胞的增殖、凋亡、细胞周期。EPS8有望成为克服CML耐药的靶点,为CML克服耐药的个体化治疗提供新思路。
夏德雨[8]（2014）在《P15INK4b慢病毒感染联合Bcr-abl siRNA及STI571对慢性粒细胞白血病K562细胞的实验研究》文中进行了进一步梳理慢性粒细胞性白血病（chronic myeloid leukemia.CML）是一种起源于多能干细胞异常克隆的恶性增殖性疾病,约占白血病总发病率的15%,多见于老年人。绝大多数CML患者白血病细胞中具有费城染色体（Ph染色体）,它是有9号染色体长臂3区4带和22号染色体长臂1区1带相互易位融合而成,使位于9号染色体上的c-abl1原癌基因在第二外显子的5’端断裂,与22号染色体的M-Bcr基因第2或第3外显子的3’端结合,形成Bcr-abl融合基因,该基因编码P210蛋白,具有持续而强烈的酪氨酸激酶活性,可使粒细胞发生恶性增殖。基于Bcr-abl融合基因在慢性粒细胞性白血病中的重要病理意义,诺华制药公司于2001成功开发Bcr-abl特异性抑制剂--STI571用于CML的治疗,成为第一个靶向治疗药物。STI571的应用使原来CML的5年生存率由20%提升至90%,被称为是CML治疗史上的里程碑。然而,随后8年随访研究发现约16%的患者因药效降低停止服用STI571,有6%的患者由于不良反应而停止用药。随着STI571在CML治疗中的大量应用,其耐药性的问题已愈发明显,尤其是Bcr-abl基因突变位点的增多,出现了越来越多STI571治愈无效的CML患者。因此,寻找抑制效能更强或Bcr-abl以外的新靶点是当前cml治疗研究的一项前沿课题。最近的研究表明cml的治疗需在抑制bcr-abl的基础上,同时联合其它新发现或确认的靶点进行联合治疗,可显着提高cml的治愈率。p15ink4b是细胞周期蛋白激酶抑制剂ink4家族的一员,又被称作cdkn2b和mts2,它位于人类9号染色体,通常与p16ink4a和p14arf一起发生改变。p16ink4a和p15ink4b都可通过抑制cdk4/6,使细胞停滞于g1期。在血液病中,p16ink4a和p15ink4b表达降低通常是由于外界原因使基因发生甲基化所导致。而且,p15ink4b是唯一在mds和aml中发生甲基化的ink4家族成员,提示它在粒细胞疾病中的具有特异性。临床研究显示50-60%的骨髓异常增殖综合症患者和70-80%急性粒细胞性白血病患者都会发生p15ink4b的甲基化改变,提示我们p15ink4b可能参与了白血病的病理过程。p15ink4b的生物学活性研究表明它具有以下3方面的特性:1.p15ink4b在体内具有肿瘤抑制因子的作用,逆转录病毒引起的髓性单核粒细胞性白血病存在明显的p15ink4b基因5’cpg岛甲基化改变,而当p15ink4b缺失被重新构建时,粒细胞增殖情况得到显着抑制。2.p15ink4b显示可以促进造血干细胞向红细胞的分化,抑制其向粒细胞的分化。3.p15ink4b在促进树突细胞成熟中的作用,增强免疫监督作用。上述三种生物学活性均表明p15ink4b可能成为治疗cml的潜在靶点。基于上述理论基础,本研究旨在观察p15ink4b与bcr-abl抑制联合应用是否可提高cml的治疗效率。为了实现这一目的,我们首先构建了p15ink4b慢病毒表达载体,通过rt-pcr方法从人外周单个核细胞中扩增p15ink4b基因,经纯化回收后连接于pcdh-cmv-mcs-ef1-copgfp载体上构建p15ink4b慢病毒表达载体。然后对p15ink4b基因进行慢病毒包装,制备p15ink4b的病毒颗粒感染k562细胞,使其稳定表达p15ink4b基因。其次,构建bcr-ablsirna,采用荧光素酶基因（基因序号m15077,394414）作为非特异性对照,将bcr-ablsirna转染k562细胞抑制p210bcr-abl的表达。同时,结合对sti571的研究,通过排列组合的方式,观察sti571,p15ink4b慢病毒感染和bcr-ablsirna转染联合作用后对k562细胞增殖、细胞周期及细胞凋亡等的影响,为指导cml的治疗提供新的理论基础。1.p15ink4b慢病毒载体构建及病毒滴度测定p15ink4b慢病毒表达载体经慢病毒包装后,经逐孔稀释法测定病毒的滴度为2×108u/ml。p15ink4b慢病毒感染可显着抑制k562细胞增殖,阻滞细胞周期,诱导细胞凋亡。2.bcr-abl特异性sirna可显着抑制k562细胞增殖,使细胞阻滞于g0/g1期,且具有明显的诱导凋亡的作用;本研究发现bcr-ablsirna转染可显着抑制k562细胞内p210bcr-abl蛋白的表达,转染48h时,抑制率约为85%。细胞增殖实验显示,bcr-ablsirna转染可在24-96h内显着抑制k562细胞的增殖,在48h时,可显着阻滞细胞周期,使处于g1期的细胞比例明显增加,并且可诱导细胞凋亡的出现。3.p15ink4b慢病毒感染联合bcr-balsirna或sti571对k562细胞增殖抑制作用明显加强细胞增殖实验表明,p15ink4b慢病毒感染,bcr-ablsirna转染或sti571单独应用均可显着抑制k562细胞的增殖率,且呈现明显的时间依赖性。p15ink4b慢病毒感染+bcr-abl抑制抑制效率显着高于两者单独应用;p15ink4b感染+sti571抑制效率显着高于两者单独应用,bcr-abl抑制+sti571抑制抑制效率显着高于两者单独应用,上述结果提示我们p15ink4b慢病毒感染联合bcr-abl抑制可显着提升对k562细胞增殖的抑制率。4.p15ink4b慢病毒感染联合bcr-balsirna或sti571对k562细胞周期的影响流式细胞术检测结果显示,p15ink4b慢病毒感染可显着提高g1期细胞比率,降低s期细胞比率,表明p15ink4b表达可延缓dna复制。p15ink4b表达与bcr-abl抑制或sti571联合应用可显着增加处于g1期的细胞比率,提示p15ink4b与bcr-abl抑制或sti571联合应用可显着抑制dna的复制,降低细胞增殖速率。机制分析显示与单独治疗组相比,联合治疗组可显着抑制cyclind1和cdk4的表达,上述结果提示我们,联合治疗可显着抑制细胞周期依赖蛋白或激酶的表达,从而发挥阻滞细胞周期的作用。5.p15ink4b联合bcr-balsirna或sti571对k562凋亡的影响流式细胞术检测结果显示,与空载体组相比,p15ink4b慢病毒感染可显着提高细胞凋亡率,表现为annexin-v阳性细胞比率的增加。bcr-ablsirna转染和sti571亦有相似的作用。P15INK4b与Bcr-abl抑制或STI571联合应用可显着增加细胞凋亡率,提示P15INK4b与Bcr-abl抑制或STI571联合应用可显着促进K562细胞凋亡。机制分析显示,联合治疗组可显着提升Bax/Bcl-2的比值。结论:酪氨酸激酶抑制剂在CML的治疗中发挥了重要的作用,尤其是STI571的问世,大大提高了CML患者的生存时间和生存率。但是,随着STI571的大规模使用,STI571耐药性的问题凸显,这就要求我们在抑制Bcr-abl的同时,探寻新的治疗靶点以提高CML的治疗效果。P15INK4b作为经典的肿瘤抑制因子,具有抑制细胞周期蛋白激酶的功效。我们的研究显示,与单独应用Bcr-abl siRNA转染、STI571治疗或P15INK4b慢病毒转染相比,联合应用P15INK4b慢病毒转染与Bcr-abl及STI571可显着抑制K562细胞的增殖,增加细胞凋亡率,提示我们联合应用P15INK4b慢病毒感染与Bcr-abl siRNA及STI571可能具有提高CML治愈率的潜能,P15INK4b具有成为Bcr-abl以外治疗CML的潜在靶点的可能性。
余靖[9]（2011）在《姜黄素及其衍生物C086抑制人白血病细胞增殖与阻断Hsp90伴侣功能的关系》文中研究表明Hsp90作为分子伴侣,其已确定的客户蛋白超过200个。由于它的许多客户蛋白是细胞增殖信号通路中的重要分子,与肿瘤密切相关,Hsp90已经成为抗肿瘤药物的很有前景的靶点。姜黄素是一种黄色的多酚化合物,能够阻断多条信号通路而抑制肿瘤的持续生长、侵袭、血管生长和肿瘤转移等多种生物学行为。姜黄素调控的多个分子靶点,如Bcr/Abl、EGFR、Src、Erb-B2、VEGF和端粒酶也是Hsp90的客户蛋白。本课题组前期研究首次报道,姜黄素抑制K562细胞增殖与下调p210Bcr/Abl有关。姜黄素在使Hsp90/p23与p210Bcr/Abl结合减少,引发p210Bcr/Abl的快速降解的同时,Hsp70/p60Hop与p210bcr/abl的结合增加,这个特征与Hsp90的N端抑制剂GA很相似。提示Cur下调p210bcr/abl蛋白含量是通过干扰Hsp90的分子伴侣功能实现的。然而姜黄素生物利用度低,限制了其临床应用。人们尝试多种方法试图提高姜黄素的生物利用度。本实验室新合成了姜黄素衍生物C086。本实验试图探讨姜黄素及其衍生物C086对人白血病细胞增殖的影响及其与Hsp90分子伴侣功能的关系。第一部分姜黄素衍生物C086对人白血病细胞增殖的抑制作用目的:研究姜黄素衍生物C086抑制人白血病细胞增殖和诱导凋亡的作用及其机制。方法:⑴MTT法检测C086对细胞增殖的影响;⑵瑞氏-吉姆萨染色观察C086对细胞形态的影响;⑶AO-EB染色观察C086对细胞凋亡影响;⑷免疫荧光检测细胞Bcr/Abl蛋白表达的改变;⑸分光光度法检测Caspase 3和Caspase 9的活性;⑹免疫印迹分析检测细胞Bcr/Abl, Erk1/2, p-Erk, Akt, p-Akt, PKC, Raf, C-myc, Src, p-Src, Bcl-2, Bax, Fas, Fasl, Caspase3, Caspase9和p53蛋白表达量;⑺联苯胺染色法检测C086对K562细胞红系分化的影响。结果:⑴C086可抑制K562、HL-60和HL60（Bcr/Abl）细胞增殖,且活性较Cur明显增强;⑵C086可下调K562、HL-60和HL60（Bcr/Abl）细胞中p-Erk、p-Akt、Pkc、Raf、C-myc、p-Src蛋白含量;⑶C086可下调K562和HL60（Bcr/Abl）细胞中Bcr/Abl蛋白含量;⑷C086可下调K562、HL-60和HL60（Bcr/Abl）细胞中Bcl-2蛋白含量,上调Bax含量;⑸C086诱导K562细胞凋亡,增强细胞中Caspase3和Caspase9活性,上调细胞中Fas、Fasl、Caspase3、Caspase9以及p53蛋白含量;⑹C086诱导K562细胞向成熟红系细胞分化。第二部分姜黄素及其衍生物C086对白血病细胞中Hsp90分子伴侣功能的影响目的:研究姜黄素及其衍生物C086对白血病细胞中Hsp90分子伴侣功能的影响。方法:⑴免疫印迹分析检测细胞中Hsp90、Hsp70、p23和p60Hop蛋白含量的变化;⑵免疫组化检测细胞中Hsp70表达的改变;⑶Realtime PCR检测药物对细胞中HSP90和HSP70基因mRNA水平的影响;⑷免疫共沉淀检测药物对细胞中Bcr/Abl/Hsp90/Hsp70/p23/p60Hop蛋白结合状态的影响;⑸荧光光谱实验研究药物与异源表达的Hsp90和NHsp90的相互作用;⑹Piper Phosphate Assay Kit检测药物对细胞中Hsp90的ATPase活性的影响。结果:⑴Cur和C086可以上调K562、HL60和HL60（Bcr/Abl）细胞中Hsp70含量,对细胞中Hsp90、p23和p60HOP含量无明显影响,作用趋势与GA一致;C086可以下调Hsp90含量;⑵C086在mRNA水平上调K562细胞中Hsp70含量,下调K562细胞中Hsp90含量;⑶Cur和C086可使K562、HL60和HL60（Bcr/Abl）细胞中与Hsp90结合的Hsp70增多,与Hsp90结合的p23减少,与Hsp90结合的p60HOP不变;⑷Cur和C086可使K562和HL60（Bcr/Abl）细胞中与Bcr/Abl结合的Hsp70增多,与Bcr/Abl结合的Hsp90、p23减少,与Bcr/Abl结合的p60HOP不变;⑸Cur和C086与异源表达的Hsp90和NHsp90相互作用;⑹Cur抑制Hsp90的ATPase活性。第三部分姜黄素衍生物C086对K562细胞裸鼠异种移植瘤的作用及相关机制研究目的:我们建立了K562细胞裸鼠异种移植瘤模型,将在体外研究的基础上继续研究姜黄素衍生物C086在体内是否也产生抗癌作用,并探索其体内作用机制。方法:⑴皮下注射K562细胞,建立K562细胞裸鼠异种移植瘤模型;⑵将荷瘤裸鼠随机分为四组,分别是生理盐水阴性对照组、C086低剂量组（50 mg/kg）、C086中剂量组（100 mg/kg）和C086高剂量组（200 mg/kg）,每组6只裸鼠;⑶观察成瘤情况,比较肿瘤体积;⑷称量离体瘤块质量、计算抑瘤率;⑸摘除眼球取血检测肝肾功能和血电解质;⑹HE染色光镜下观察肿瘤组织的形态结构;⑺免疫荧光检测肿瘤组织Bcr/Abl蛋白表达;⑻免疫印迹检测肿瘤组织中Erk1/2, p-Erk, C-myc, Hsp70和Hsp90的蛋白含量。结果:⑴高剂量C086可以抑制K562细胞裸鼠异种移植瘤的生长,抑瘤率为44.2%;⑵C086对裸鼠肝肾功能以及电解质代谢没有造成不利影响;⑶C086下调K562细胞裸鼠异种移植瘤中Bcr/Abl、Erk1/2、p-Erk、C-myc和Hsp90蛋白含量,上调Hsp70蛋白含量。结论:本研究首次证明姜黄素衍生物C086抑制人白血病细胞增殖。姜黄素和C086抑制肿瘤细胞增殖的机制可能与阻断Hsp90的分子伴侣功能有关。C086也可以抑制K562裸鼠异种移植瘤的生长。
李艳,李晓燕,王琳,田征,饶青,贾海蓉,王慧君,王敏,秘营昌[10]（2010）在《Wt1基因与Ph+白血病细胞系K562的生物学特性》文中指出Wt1基因是与造血调控、白血病发生及治疗预后密切相关的双功能基因,在急性髓系白血病及慢性粒细胞白血病进展期呈高表达,且与预后呈负相关,已用于临床微量残留病的监测。WT1蛋白不同亚细胞定位发挥不同生物学功能。本研究旨在探讨Ph+白血病细胞系K562中wt1 mRNA及蛋白的表达与定位,wt1抑制剂——姜黄素（curcumin）对K562细胞的增殖及细胞周期的影响及wt1在白血病发生发展中的相关作用机制。采用MTT法检测细胞增殖情况;流式细胞术分析细胞周期改变;免疫荧光技术及Western blot观察WT1蛋白的亚细胞定位及药物处理后表达水平的变化;实时定量PCR法观察药物处理后wt1及bcr/ablp210转录本水平的变化。结果表明,wt1 mRNA及蛋白在K562细胞高表达,姜黄素及格列卫均能降低wt1 mRNA及蛋白的表达水平,抑制细胞增殖;姜黄素使K562细胞停滞于G2/M期,而格列卫使其停滞于G0/G1期。结论:wt1基因表达改变可以影响Ph阳性细胞—K562的生长、增殖,调控wt1表达有可能成为Ph阳性白血病的新的治疗策略。
二、Curcumin inhibits Proliferation of K562 cells by downreguration of P210~(bcr/abl)-initiated Ras Signal Pathway and Cyclins（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、Curcumin inhibits Proliferation of K562 cells by downreguration of P210~(bcr/abl)-initiated Ras Signal Pathway and Cyclins（论文提纲范文）
（1）Skp2对慢性髓细胞白血病细胞增殖及其对伊马替尼敏感调控机制的研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 1.前言 |
| 2.材料和方法 |
| 3.结果 |
| 4.讨论 |
| 5.结论 |
| 6.参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 综述 Skp-2 在恶性肿瘤发生机制中的作用 |
| 参考文献 |
（2）SOS1调节慢性粒细胞白血病（CML）伊马替尼敏感性和不依赖于BCR-ABL1耐药性及其分子机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 1.慢性粒细胞白血病 |
| 2.TKIs耐药 |
| 3.SOS1 |
| 4.RNA-seq技术 |
| 5.SLC22A4 |
| 6.研究假说与研究思路 |
| 7.技术路线 |
| 8.研究意义及创新之处 |
| 9.实验内容 |
| 第一部分 SOS1调控CML细胞生长及其分子机制研究 |
| 实验材料和方法 |
| 1.实验试剂 |
| 2.随机序列的RNA双链和SOS1-siRNA序列 |
| 3.细胞株 |
| 4.实验动物 |
| 5.主要试剂配制 |
| 6.主要仪器和材料 |
| 7.实验方法 |
| 8.统计学分析 |
| 实验结果 |
| 1.验证miR-181a的靶标SOS1 |
| 2.Ph+白血病细胞、正常人及CML病人外周血单核细胞中SOS1的相对表达量检测 |
| 3.SOS1有效siRNA序列筛选 |
| 4.SOS1对CML细胞增殖的影响 |
| 5.质谱检测SOS1相互作用蛋白及相关信号通路 |
| 讨论一 |
| 第二部分 SOS1调节CML细胞Imatinib药物敏感性及其分子机制的研究 |
| 实验材料及方法 |
| 1.主要试剂 |
| 2.主要试剂配制 |
| 3.主要仪器 |
| 4.细胞株 |
| 5.实验方法 |
| 实验结果 |
| 1.靶向抑制SOS1增强CML细胞对imatinib的药物敏感性 |
| 2.SOS1过表达降低CML细胞对imatinib的药物敏感性 |
| 3.RNA-seq检测靶向抑制SOS1对K562细胞基因组表达水平的影响 |
| 4.HPLC检测SOS1对CML细胞imatinib药物吸收的影响 |
| 讨论二 |
| 第三部分 SOS1调节不依赖于BCR-ABL1的imatinib耐药性研究 |
| 实验材料及方法 |
| 1.主要试剂 |
| 2.主要试剂配制 |
| 3.实验方法 |
| 实验结果 |
| 1.不依赖于BCR-ABL1激酶的Imatinib耐药株耐药性的验证 |
| 2.BAY-293克服不依赖于BCR-ABL1激酶的imatinib耐药 |
| 3.BAY-293调控SLC22A4克服不依赖于BCR-ABL1激酶的耐药 |
| 4.SOS1在CML中作用机制的总结 |
| 讨论三 |
| 结论 |
| 不足与展望 |
| 参考文献 |
| 在读期间的科研及学习成果 |
| 课题基金来源 |
| 致谢 |
（3）雷公藤红素增强白血病多药耐药K562/ADR细胞对阿霉素敏感性的作用机制（论文提纲范文）
| 基金项目 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩写词简表 |
| 前言 |
| 第一章 实验材料和方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 细胞系 |
| 1.1.2 实验试剂 |
| 1.1.3 主要实验仪器及耗材 |
| 1.1.4 qRT-PCR引物序列 |
| 1.1.5 主要试剂及其配制 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 细胞培养及传代 |
| 1.2.2 细胞冻存 |
| 1.2.3 细胞的复苏 |
| 1.2.4 细胞计数 |
| 1.2.5 实验分组 |
| 1.2.6 CCK-8检测细胞活性 |
| 1.2.7 流式检测细胞凋亡 |
| 1.2.8 流式检测细胞周期(PI) |
| 1.2.9 细胞总RNA提取 |
| 1.2.10 RNA逆转录 |
| 1.2.11 实时荧光定量PCR |
| 1.2.12 Western Blot检测蛋白表达 |
| 1.2.13 细胞mRNA测序 |
| 1.2.14 统计分析 |
| 第二章 实验结果 |
| 2.1 细胞mRNA测序结果差异表达 |
| 2.2 雷公藤红素显着抑制K562/ADR细胞的增殖 |
| 2.3 雷公藤红素诱导K562/ADR细胞凋亡 |
| 2.4 雷公藤红素诱导K562/ADR细胞凋亡相关蛋白的表达 |
| 2.5 雷公藤红素诱导K562/ADR细胞周期阻滞 |
| 2.6 雷公藤红素增强K562/ADR细胞对Dox的敏感性 |
| 2.7 雷公藤红素下调耐药基因ABCB1在K562/ADR细胞的表达 |
| 第三章 讨论 |
| 第四章 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的科研成果 |
| 致谢 |
（4）Beclin-1过表达诱导的自噬对慢性粒细胞白血病Bcr-Abl的抑制作用及其分子机制研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 缩略词表 |
| 计量单位 |
| 前言 |
| 第一部分 自噬基因Beclin-1与慢性粒细胞白血病Bcr-AbI融合基因蛋白相互作用的研究 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 实验材料和实验仪器 |
| 1.3 主要实验方法 |
| 1.4 实验结果 |
| 1.5 讨论 |
| 1.6 结论 |
| 第二部分 Beclin-1过表达诱导CML细胞自噬性死亡及其分子机制研究 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料及实验器材 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 作者简历及在学期间所取得的科研成果 |
（5）MiR-141-5p靶向RAB32在慢性粒细胞白血病中的作用与机制研究（论文提纲范文）
| 英文缩略词表(Abbreviations) |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1.前言 |
| 2.材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 主要细胞株 |
| 2.1.2 研究病例 |
| 2.1.3 健康对照 |
| 2.1.4 实验动物 |
| 2.1.5 主要试剂和耗材 |
| 2.1.6 实验仪器 |
| 2.1.7 主要试剂溶液的配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 单个核细胞的分离 |
| 2.2.2 细胞培养 |
| 2.2.3 总RNA的提取 |
| 2.2.4 q-PCR检测miR-141-5p的表达 |
| 2.2.5 细胞瞬时转染 |
| 2.2.6 K562 细胞总蛋白的提取 |
| 2.2.7 Western Blotting检测蛋白的表达 |
| 2.2.8 Q-RT-PCR检测K562 细胞增殖、迁移相关基因的mRNA水平变化 |
| 2.2.9 PI染色法细胞周期分析 |
| 2.2.10 Annexin-V-FITC细胞凋亡分析 |
| 2.2.11裸鼠成瘤实验 |
| 2.2.12 生物信息学分析 |
| 2.2.13 双荧光素酶报告基因检测 |
| 2.2.14 统计分析 |
| 3.结果 |
| 3.1 MiR-141-3p和miR-141-5p在 CML患者和CML K562 细胞中的表达情况 |
| 3.2 下调miR-141-5p表达在CML K562 细胞株中的作用 |
| 3.3 上调miR-141-5p表达在CML K562 细胞株中的作用 |
| 3.4 MiR-141-5p对 CML K562 细胞裸鼠成瘤能力的影响 |
| 3.5 RAB32是miR-141-5p的潜在功能性靶基因 |
| 3.6 miR-141-5p调控RAB32 的表达 |
| 3.7 CML患者中miR-141-5p水平与RAB32 表达水平相关性 |
| 3.8 下调RAB32 表达可抑制K562 细胞的增殖 |
| 3.9 miR-141-5p通过靶向RAB32 调控CML细胞的增殖和凋亡 |
| 4.讨论 |
| 5.结论 |
| 参考文献 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
| 综述 |
| 参考文献 |
（6）HIF-1α及下游VEGF对CML细胞增殖的影响及T315I突变CML的协同治疗策略（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一部分 缺氧状态下HIF-1Α对慢性髓细胞白血病细胞增殖作用的研究 |
| 1 序言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 研究对象 |
| 2.2 主要实验试剂和仪器 |
| 2.3 实验步骤 |
| 2.4 统计学分析及制图 |
| 3 结果 |
| 3.1 慢性髓细胞白血病(CML)病人骨髓中HIF-1α 的表达水平明显增高 |
| 3.2 通过SiRNA干扰的方法沉默K562细胞的HIF-1α 基因表达可以显着减慢K562细胞的增殖能力 |
| 3.3 通过SiRNA干扰的方法沉默K562细胞的HIF-1α 基因可以显着降低K562细胞的集落形成能力 |
| 3.4 通过SiRNA干扰的方法沉默K562细胞的HIF-1α 基因可以导致细胞周期蛋白p21蛋白表达的降低 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分 缺氧状态下VEGF对慢性髓细胞白血病细胞增殖作用的研究 |
| 1 序言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 研究对象 |
| 2.2 主要实验试剂和仪器 |
| 2.3 实验步骤 |
| 3 结果 |
| 3.1 慢性髓细胞白血病患者组与正常对照组血清VEGF水平检测 |
| 3.2 VEGF在慢性期和急变期的水平 |
| 3.3 低表达VEGF对K562细胞增殖水平的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第三部分 T315I突变的慢性髓细胞 白血病协同治疗的策略 |
| 1 序言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 研究对象 |
| 2.2 主要实验试剂和仪器 |
| 2.3 实验步骤 |
| 2.4 统计学分析及制图 |
| 3 结果 |
| 3.1 单独药物对Ba/F3-P210-T315I细胞的增殖抑制效应 |
| 3.2 单独药物对Ba/F3-P210细胞的增殖抑制效应 |
| 3.3 联合用药对Ba/F3-P210-T315I细胞的增殖抑制效应 |
| 3.4 IC50浓度的不同药物组合对Ba/F3-P210-T315I细胞的促凋亡效应 |
| 3.5 LBH589作用于Ba/F3-P210-T315I细胞后Aurora A、Aurora B激酶的表达情况 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 综述 1 缺氧环境下 HIF-1α 的作用及其与肿瘤的关系 |
| 参考文献 |
| 综述 2 慢性髓细胞白血病的耐药机制和治疗进展及其与骨髓微环境的关系 |
| 参考文献 |
| 英汉双解缩略词表 |
| 攻读学位期间发表文章情况 |
| 致谢 |
（7）EPS8参与髓系白血病生物学过程及其机制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一章 EPS8在慢性粒系白血病患者及BCR/ABL~+细胞株中的表达及意义 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 参考文献 |
| 第二章 过表达EPS8对髓系白血病细胞生物功能的作用及其机制研究 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 参考文献 |
| 第三章 沉默EPS8对髓系白血病细胞生物学功能的作用及其机制研究 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 缩略词中英文对照表 |
| 攻读学位期间发表论文 |
| 致谢 |
| 统计学证明 |
（8）P15INK4b慢病毒感染联合Bcr-abl siRNA及STI571对慢性粒细胞白血病K562细胞的实验研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 文献回顾 |
| 实验一 P15INK4b慢病毒表达载体的构建、包装及鉴定 |
| 前言 |
| 1.材料 |
| 2.方法 |
| 3.结果 |
| 4.讨论 |
| 5.小结 |
| 实验二 P15INK4b基因慢病毒包装 |
| 1.材料 |
| 2.方法 |
| 3.慢病毒滴度测定 |
| 4.结果 |
| 5.讨论 |
| 6.小结 |
| 实验三 P15INK4b慢病毒感染K562细胞 |
| 1.材料 |
| 2.方法 |
| 3.结果 |
| 4.讨论 |
| 5.小结 |
| 实验四 Bcr-abl siRNA的合成及效能鉴定 |
| 1.材料 |
| 2.方法 |
| 3.结果 |
| 4.讨论 |
| 5.小结 |
| 实验五 P15INK4b与Bcr-abl siRNA/STI571联合治疗对K562细胞的影响 |
| 1.材料 |
| 2.方法 |
| 3.结果 |
| 4.讨论 |
| 5.小结 |
| 参考文献 |
| 个人简历和研究成果 |
| 致谢 |
（9）姜黄素及其衍生物C086抑制人白血病细胞增殖与阻断Hsp90伴侣功能的关系（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 姜黄素衍生物 C086 对人白血病细胞增殖的抑制作用 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 细胞系 |
| 1.1.2 药品与主要试剂 |
| 1.1.3 主要仪器 |
| 1.1.4 主要试剂的配制 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 细胞培养 |
| 1.2.2 MTT 法检测药物对细胞增殖的影响 |
| 1.2.3 瑞氏-吉姆萨染色观察药物对细胞形态的影响 |
| 1.2.4 细胞收集、样品制备与蛋白定量 |
| 1.2.5 免疫印迹分析（Western blotting Analysis）检测细胞蛋白表达量 |
| 1.2.6 免疫荧光检测细胞Bcr/Abl 蛋白表达的改变 |
| 1.2.7 AO-EB 染色观察药物对细胞凋亡影响 |
| 1.2.8 分光光度法检测Caspase 3 和Caspase 9 的活性 |
| 1.2.9 联苯胺染色法检测药物对K562 细胞红系分化的影响 |
| 1.3 数据及图片处理 |
| 2 结果 |
| 2.1 MTT 法检测药物对白血病细胞增殖的影响 |
| 2.2 瑞氏-吉姆萨染色观察药物对细胞形态的影响 |
| 2.3 C086 对细胞增殖、凋亡相关信号分子表达的影响 |
| 2.3.1 免疫印迹分析检测C086 对细胞Erk_1、Erk_2、p-Erk、Akt、p-Akt、PKC、C-myc、Src 及p-Src 蛋白含量的影响 |
| 2.3.2 C086 对细胞Bcr/Abl 表达的影响 |
| 2.3.3 免疫印迹分析检测C086 对细胞Bcl-2 和 Bax 蛋白含量的影响 |
| 2.4 AO-EB 染色观察药物对K562 细胞凋亡影响 |
| 2.5 C086 对K562 细胞Caspase3、Caspase9 活性影响 |
| 2.5.1 分光光度法检测Caspase 3 和Caspase 9 的活性 |
| 2.5.2 免疫印迹分析检测C086 对K562 细胞Caspase 3 和Caspase 9 蛋白含量的影响 |
| 2.6 免疫印迹分析检测C086 对K562 细胞Fas 和Fasl 蛋白含量的影响 |
| 2.7 免疫印迹分析检测C086 对K562 细胞p53 蛋白含量的影响 |
| 2.8 联苯胺染色法检测C086 对K562 细胞红系分化的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二部分 姜黄素及其衍生物 C086 对白血病细胞中Hsp90 分子伴侣功能的影响 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 细胞系 |
| 1.1.2 菌种及质粒 |
| 1.1.3 药品与主要试剂 |
| 1.1.4 主要仪器 |
| 1.1.5 主要试剂的配制 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 细胞培养 |
| 1.2.2 免疫共沉淀 |
| 1.2.3 应用Piper Phosphate Assay Kit 检测药物对K562 细胞中Hsp90 的ATPase 活性的影响 |
| 1.2.4 免疫组化检测药物对细胞中Hsp70 表达的影响 |
| 1.2.5 Realtime PCR 检测药物对K562 细胞中HSP90 和HSP70 基因mRNA 水平影响 |
| 1.2.6 GST-Hsp90-His 的表达与纯化 |
| 1.2.7 Hsp90 N 端蛋白（NHsp90）表达与纯化 |
| 1.2.8 荧光光谱实验 |
| 1.3 数据及图片处理 |
| 2 结果 |
| 2.1 Cur 和C086 对白血病细胞中Hsp90、Hsp70、p23 和p60~(Hop) 蛋白的影响 |
| 2.1.1 免疫印迹分析检测Cur 和C086 对白血病细胞中Hsp90、Hsp70、p23 和p60~(Hop)蛋白含量的影响 |
| 2.1.2 免疫组化检测Cur 和C086 对白血病细胞中Hsp70 表达的影响 |
| 2.1.3 Realtime PCR 检测C086 对K562 细胞中HSP90 和HSP70 基因mRNA 水平影响 |
| 2.2 Cur 和C086 对白血病细胞中Bcr/Abl/Hsp90/Hsp70/p23/p60~(Hop) 蛋白结合的影响 |
| 2.2.1 Cur 和C086 对白血病细胞中Hsp90 与Hsp70/p23/p60~(Hop) 蛋白结合的影响 |
| 2.2.2 Cur 和C086 对白血病细胞中Bcrr/Abl 与 Hsp90/Hsp70/p23/p60~(Hop)蛋白结合的影响 |
| 2.3 Cur 和C086 与异源表达的Hsp90 和Hsp90 N 端蛋白（NHsp90）的相互作用 |
| 2.3.1 异源Hsp90 和NHsp90 的表达和纯化 |
| 2.3.2 Cur 和C086 对Hsp90 内源荧光的猝灭作用 |
| 2.3.3 Cur 对NHsp90 内源荧光的猝灭作用 |
| 2.4 药物对K562 细胞中Hsp90 的ATPase 活性的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三部分 姜黄素衍生物C086对K562细胞裸鼠异种移植瘤的作用及相关机制研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 细胞系 |
| 1.1.2 动物 |
| 1.1.3 主要药品试剂 |
| 1.1.4 主要仪器 |
| 1.1.5 主要试剂配制 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 细胞培养 |
| 1.2.2 裸鼠异种移植瘤模型的建立 |
| 1.2.3 实验分组及给药方案 |
| 1.2.4 标本收集 |
| 1.2.5 肝肾功能及电解质检测 |
| 1.2.6 肿瘤组织常规HE 染色 |
| 1.2.7 肿瘤组织冰冻切片 |
| 1.2.8 肿瘤组织免疫荧光检测Bcr/Abl 蛋白表达 |
| 1.2.9 免疫印迹分析检测肿瘤组织中蛋白表达 |
| 1.3 数据处理 |
| 2 结果 |
| 2.1 裸鼠生长及成瘤情况 |
| 2.2 C086 对K562 细胞裸鼠异种移植瘤生长的抑制作用 |
| 2.3 C086 对对荷瘤裸鼠肝肾功能及血电解质的影响 |
| 2.4 C086 对肿瘤组织形态结构的影响 |
| 2.5 免疫荧光检测C086 对肿瘤组织Bcr/Abl 蛋白表达的影响 |
| 2.6 免疫印迹检测C086 对肿瘤组织中的Erk_1、Erk_2、p-Erk 和 C-myc 蛋白表达的影响 |
| 2.7 免疫印迹检测C086 对肿瘤组织中的Hsp90 和Hsp70 蛋白表达的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
四、Curcumin inhibits Proliferation of K562 cells by downreguration of P210~(bcr/abl)-initiated Ras Signal Pathway and Cyclins（论文参考文献）
- [1]Skp2对慢性髓细胞白血病细胞增殖及其对伊马替尼敏感调控机制的研究[D]. 陈晓文. 安徽医科大学, 2021(01)
- [2]SOS1调节慢性粒细胞白血病（CML）伊马替尼敏感性和不依赖于BCR-ABL1耐药性及其分子机制研究[D]. 刘燕君. 暨南大学, 2020(03)
- [3]雷公藤红素增强白血病多药耐药K562/ADR细胞对阿霉素敏感性的作用机制[D]. 刘婷. 南华大学, 2020
- [4]Beclin-1过表达诱导的自噬对慢性粒细胞白血病Bcr-Abl的抑制作用及其分子机制研究[D]. 李颖. 浙江大学, 2019(03)
- [5]MiR-141-5p靶向RAB32在慢性粒细胞白血病中的作用与机制研究[D]. 鲍静. 安徽医科大学, 2019(07)
- [6]HIF-1α及下游VEGF对CML细胞增殖的影响及T315I突变CML的协同治疗策略[D]. 陈亨. 苏州大学, 2016(11)
- [7]EPS8参与髓系白血病生物学过程及其机制的研究[D]. 黄睿. 南方医科大学, 2015
- [8]P15INK4b慢病毒感染联合Bcr-abl siRNA及STI571对慢性粒细胞白血病K562细胞的实验研究[D]. 夏德雨. 第四军医大学, 2014(08)
- [9]姜黄素及其衍生物C086抑制人白血病细胞增殖与阻断Hsp90伴侣功能的关系[D]. 余靖. 福建医科大学, 2011(12)
- [10]Wt1基因与Ph+白血病细胞系K562的生物学特性[J]. 李艳,李晓燕,王琳,田征,饶青,贾海蓉,王慧君,王敏,秘营昌. 中国实验血液学杂志, 2010(03)
标签：细胞自噬论文; 急性淋巴细胞性白血病论文; 慢性粒细胞白血病论文; 急性髓性白血病论文; 显著性差异论文;