一、耐热AKP在高GC含量细菌染色体杂交方法中的应用（论文文献综述）
王荻[1]（2021）在《虹鳟源鲁氏耶尔森菌主要生物学特性及减毒活疫苗研究》文中研究指明鲁氏耶尔森菌（Yersinia ruckeri）是肠炎红嘴病（enteric redmouth diseases,ERM）的病原,主要感染鲑科鱼类并引起患病鱼体表出血、肠炎等临床症状。近年来,ERM在国内外养殖虹鳟（Oncorhynchus mykiss）中均有大规模爆发,严重制约虹鳟养殖产业的绿色健康发展。抗菌药物的使用仍是防治ERM的主要手段之一,然而细菌多重耐药性和食品安全等问题使得药物的治疗效果和应用受到越来越多的限制,因此研究新型疫苗对预防该病发生具有重要意义。鲁氏耶尔森菌感染宿主范围和地理分布广泛,在我国已从西伯利亚鲟（Acipenser baerii）、黄颡（Pelteobagrus fulvidraco）、鲢鱼（Hypophthalmichthys molitrix）、鳙鱼（Aristichthys nobilis）等养殖鱼类中分离到该菌,而对虹鳟源鲁氏耶尔森菌的研究报道较少。鲁氏耶尔森菌的毒力受其生物被膜、温度及周围环境中的铁元素含量等多种因素影响,但其分泌的细胞外毒素——溶血素（hemolysin,yhl）仍是其最主要的致病因子之一。本研究旨在探索虹鳟源鲁氏耶尔森菌YR01株的生物学特性,建立q PCR分子检测技术用于临床快速诊断;构建动物感染模型,结合转录组测序结果,评价鲁氏耶尔森菌对虹鳟的致病性及虹鳟抗感染应答;针对鲁氏耶尔森菌的溶血素基因进行功能验证并构建基因突变株,评价其作为减毒活疫苗候选株的可行性,以期为ERM的免疫防控技术研究提供理论依据和指导。患病虹鳟来自青海省某冷水鱼养殖场,其临床症状表现为摄食及游泳行为异常,体色发黑,眼球外突,口腔及鳍基部出血;剖检可见血性腹水、肝脾肿大及严重肠炎。无菌条件下从患病鱼肝脏和脾脏取样划线培养获得一株优势菌株,命名为YR01。人工感染试验表明,YR01株对虹鳟幼鱼具有较强的致病性,致死率可高达90%,患病鱼临床症状与自然发病一致;经计算YR01株对虹鳟幼鱼的半致死浓度(LD50)约为6.5×107CFU/m L。组织病理观察表明,感染YR01株的虹鳟肝、脾、肾、肠等组织均出现不同程度的病变。YR01株为革兰阴性菌,在TSA平板上形成表面光滑、边缘整齐、微黏、稍微隆起的直径2 mm左右的乳白色菌落。透射电镜观察发现YR01株的每个细胞有6-8条周生鞭毛,大小约为0.7μm×（1.8-2.7）μm。经Biolog系统及16S r RNA基因序列比对分析,将YR01株鉴定为鲁氏耶尔森菌。为快速和定量检测鲁氏耶尔森菌,本研究根据rup A基因设计一对特异性引物YRI-F/R,建立了鲁氏耶尔森菌的q PCR检测方法。结果表明,所设计的引物特异性良好,可特异性扩增鲁氏耶尔森菌rup A基因;检测方法灵敏度较高,最低检测限为60 copy/μL。此外,本研究构建了鲁氏耶尔森菌感染虹鳟的病理模型,通过腹腔注射方式对12 g左右的虹鳟幼鱼接种100μL浓度为2.0×107CFU/m L菌悬液可成功造模,该模型中供试虹鳟的临床症状明显且组内差距较小,病症发展时间及情况适中,更适用于后期致病机理研究。为探讨虹鳟和鲁氏耶尔森氏菌互作机制,本研究采用高通量测序技术测定了鲁氏耶尔森菌感染虹鳟24 h后脾脏的转录组。结果显示,共获得147 927 000个读长序列,84.81%-85.99%的数据可与虹鳟参考基因组数据完全匹配。在鲁氏菌感染组共鉴定出2498个差异表达基因（DEGs）,其中有2083个（83.39%）基因呈上调表达趋势,415个（16.61%）基因呈下调表达趋势。GO注释表明,这些DEGs分别注释到23个生物学过程（BPs）、19个细胞组分（CCs）和16个分子功能（MFs）。KEGG分析结果表明,这些DEGs在NLR、TLR、RLR、细胞因子受体相互作用等多个信号通路中富集。进一步筛选到78个免疫应答相关的DEGs,其中74个上调表达DEGs主要分布于20条KEGG免疫相关通路中,富集DEGs最多的前三条通路分别为NLR信号通路（31个基因）、RLR信号通路（35个基因）和TLR信号通路（51个基因）。随机选取IL-1β、IL-8、TNF、NOD1、HSP90、CCR9、CARD9和TLR8a2等8个DEGs进行RT-q PCR验证,提示转录组测序与RT-q PCR结果基本一致,表明转录组分析可靠准确。为进一步探讨鲁氏耶尔森菌毒力因子溶血素yhl基因的特性,将yhl基因分段截短表达并验证原核表达产物对RTG-2细胞的毒性。结果表明,YR01株yhl基因四个片段的原核表达产物（yhl-A1/A2/A3/B）对细胞增殖均有一定抑制作用,其抑制率分别达到30.77%、26.92%、15.38%和53.84%。接种72 h后,yhl-B可诱导RTG-2细胞IL-2和IL-1β基因显着上调表达,分别为对照的7.6倍和4.2倍。接种yhl-A1/A2/A3的RTG-2细胞生长基本正常,未见明显病变;而接种yhl-B的RTG-2细胞出现变圆、脱落现象,在紧密生长的细胞中形成大量空斑,空斑边缘可见细胞互相牵连呈葡萄状。采用G-DOC和λRed同源重组系统敲除了YR01株的yhl-B基因,成功构建YR01-△yhl B突变株,进而分析其生物学特性和致病性。结果显示,YR01-△yhl B株的菌落形态、理化特性及生长特性与野生株相比无明显差异;药敏特性发生变化,YR01-△yhl B株对恩诺沙星、头孢哌酮、链霉素和红霉素的耐药性增强,而对卡那霉素、阿米卡星和呋喃妥因的敏感性增强。YR01株全菌悬液接种RTG-2细胞引起的病变程度明显高于YR01-△yhl B株;两株菌的培养上清对RTG-2细胞无明显毒性,但可引起细胞中免疫相关基因IL-β的上调表达。靶动物毒性评估结果表明,YR01株和YR01-△yhl B株对虹鳟幼鱼均有一定毒性,且YR01株毒性远高于YR01-△yhl B株;突变株和野生株均可引起受试虹鳟脾脏内免疫相关基因的上调表达。以YR01-△yhl B株腹腔注射免疫虹鳟幼鱼28 d后,其对虹鳟的相对保护率（RPS）约为66.7%。本研究通过对虹鳟源鲁氏耶尔森菌YR01株的病原学分析,确定了菌株基本生物学特性;建立的q PCR快速检测技术为临床快速诊断提供依据;构建了虹鳟ERM病理模型,鉴定到多个参与虹鳟抵御鲁氏耶尔森菌感染的差异表达基因;构建了YR01-△yhl B突变株,注射免疫可诱导虹鳟产生较好的免疫应答,对虹鳟幼鱼具有一定的免疫保护作用。研究结果对于虹鳟ERM的免疫防控技术研发具有重要意义。
尚玉婷[2]（2021）在《沙门氏菌全基因组数据库构建及其分子靶标挖掘与应用研究》文中指出沙门氏菌是常见的食源性致病菌之一,血清型是该菌危害性判定和临床治疗的重要依据。根据抗原结构的差异,沙门氏菌可分为50多个血清群,2600多种血清型,复杂多样的血清型增加了传统检测和防控方法的难度。以核酸为基础的分子生物学检测方法以其快速、准确、简便的特点,逐渐成为可取代传统检测方法最具潜力的检测技术之一。而检测分子靶标的特异性和数量是建立沙门氏菌血清分型快速检测技术的瓶颈。本论文针对目前食品来源的沙门氏菌未有系统基因组学研究,各血清型基因组数据未充分发掘等问题,首先基于前期构建的全国食品微生物安全风险识别数据库和菌种资源库,利用二代测序技术和生物信息学方法,对食源性沙门氏菌基因组进行全面的分析,构建沙门氏菌全基因组数据库。在此基础上,采用泛基因组分析和PCR验证相结合的方式,系统挖掘了沙门氏菌属、血清群和血清型的特异性检测新靶标,并建立多种新型快速检测体系;通过功能预测、基因敲除、功能验证和转录组学探讨了沙门氏菌属特异性靶标基因的生物学功能和代谢调控网络;利用生物学特性和全基因组分析,从环境土壤中筛选出了一株针对沙门氏菌不同血清型的新型噬菌体,并初步应用于食品中沙门氏菌的污染防控。主要研究内容和结果如下:（1）沙门氏菌全基因组数据库的构建获得我国食品样品中351株沙门氏菌全基因组序列,包括8个血清群和44种血清型。对其基因组特征全面解析,包括泛基因组分析、遗传进化分析、毒力和耐药基因携带情况等方面,从而了解其基因组特性。研究表明,沙门氏菌为闭合型泛基因组,其泛基因数量为29241个,其中核心基因1418个,不同血清型之间具有一定程度的聚类性;大部分菌株携带毒力岛1和毒力岛2相关基因,且不同血清群之间携带毒力基因相似度极高;血清群B和血清群E中London和Meleagridis血清型携带的耐药基因较多,血清群F、M、Q携带的耐药基因较少,且血清群内不同血清型携带的耐药基因比较相似。（2）沙门氏菌属靶标及环介导等温扩增技术（Loop Mediated Isothermal Amplification,LAMP）检测体系挖掘得到13个沙门氏菌属靶标（靶标mla B、group＿25736和group＿28248主要针对包含邦戈尔沙门氏菌在内的沙门氏菌,靶标ssa Q、yhh A、ssa H、ssa P、cit X＿2、ssa O、ssc B、ssa S、ssa G和ssa T主要针对肠道沙门氏菌）,并以ssa Q基因构建LAMP检测体系。该检测体系特异性良好,可准确识别多种沙门氏菌血清型,与非沙门氏菌之间不存在交叉反应,检测限为2.1×101CFU/m L,灵敏度较高,可实现对食品样品中沙门氏菌的快速鉴定。（3）沙门氏菌血清群靶标及多重PCR（Multiplex Polymerase Chain Reaction,m PCR）检测体系挖掘得到常见血清群B、C1、C2、D和E靶标各1个B-rfb J、C1-9679、C2-pim B、D-rfb J和E-28255。进一步与最常见血清型Enteritidis和Typhimurium靶标相结合,构建3个m PCR检测体系,可实现对食品样品中常见血清群和血清型沙门氏菌的同时检测,节省了检测时间和成本。（4）沙门氏菌血清型靶标及链置换LAMP量子点荧光微球免疫层析试纸条体系构建挖掘得到15种血清型新靶标64个,包括血清群B中的Typhimurium、Derby、Indiana和Agona,血清群D中的Enteritidis,血清群C1中Rissen、Braenderup、Infantis和Virchow,血清群C2中的Hadar和Albany,血清群E中的Weltevreden、London、Meleagridis和Senftenberg。靶标具有良好的特异性和较高的灵敏度,成功应用于食品样品检测过程中。以S.Typhimurium靶标构建链置换LAMP量子点荧光微球免疫层析试纸条,其检测的特异性良好,裸视LOD为103CFU/m L,比Au NPs标记的免疫层析试纸条灵敏度提高了10倍。在102～107CFU/m L之间具有良好的线性关系,R2为0.969,理论计算出的LOD为10-1CFU/m L。在饮用水、橙汁、生菜和鸡肉中的裸视LOD分别为103、104、104和105CFU/m L。样品添加回收,回收率在85%～110%的范围内,相对标准偏差低于7.8%。（5）沙门氏菌毒力岛2相关属靶标基因功能的探讨绝大部分新靶标基因功能预测为假定蛋白,其中7个属靶标为毒力岛2相关基因,构建毒力岛2基因ssa G、ssa H、ssa O、ssa P、ssa Q、ssa T和ssc B突变株,与野生株相比,各突变株在显色培养基上的显色、生长性能和总蛋白表达能力无变化,生物膜形成能力存在一定的差异,突变株的细胞黏附性（除△ssa Q）,入侵性,增殖性和毒性均减弱,转录组分析发现大部分差异表达基因被富集到菌体鞭毛,菌毛,核糖体合成等过程中,与细菌的运动性和趋化性密切相关。说明这7个基因直接或间接的影响细菌的运动性和趋化性,从而更好的发挥其毒性。（6）新型沙门氏菌噬菌体的分离和应用筛选出针对不同血清型的新型沙门氏菌噬菌体vB＿Sal P＿TR2,属于短尾噬菌体,可裂解Albany、Corvallis、Newport、Kottbus和Istanbul五种血清型;该噬菌体对一定范围的p H值和温度具有耐受性,潜伏期时间相对较短,不携带任何毒力或抗生素耐药基因;在体外纯培养物和食品基质中,能抑制一定数量沙门氏菌的增殖。综上,本论文构建了沙门氏菌全基因组数据库,并在此基础上,进行了分子检测靶标的系统性挖掘,毒力岛2相关基因功能的初步研究和新型噬菌体的分离与应用,为沙门氏菌的快速检测,致病机制的深入研究和生物学高效防控等领域的快速发展奠定基础。
余泽辉[3]（2018）在《拟态弧菌SCCF01株的全基因组解析及基因缺失株的构建与生物学特性的研究》文中进行了进一步梳理拟态弧菌（Vibrio mimicus）是一种重要的水生动物病原菌,与霍乱弧菌（Vibrio cholera）亲缘关系最近,曾被误认为是同种病原,可致人类急性霍乱样腹泻或痢疾样腹泻,给公共卫生安全也带来严重威胁。拟态弧菌作为严重危害淡水鲇形目鱼类的新发现病原菌,其感染具有病程短和死亡率高的流行特征,给我国淡水鲇养殖造成严重的经济损失。免疫预防或成为防控该病最为有效手段,基因缺失减毒疫苗被认为是鱼类疫苗开发的重要发展方向,而构建基因缺失减毒疫苗的前提是对拟缺失靶基因功能的明确。目前,对鲇源拟态弧菌的基因组学及其致病相关的功能基因尚不完全清楚。为此,本研究以鲇源拟态弧菌强毒株（SCCF01菌株）为研究对象,进行全基因组测序和比较基因组分析,并在了解基因组遗传信息的基础上,采用Natural transformation技术构建三种毒力基因的缺失株,通过比较缺失株和野生株生物学特性,以深入揭示缺失靶基因功能,以期为基因缺失减毒疫苗的研发奠定理论基础。论文中具体研究结果如下:1.拟态弧菌SCCF01菌株全基因组测序注释及组分分析提取SCCF01菌株的基因组DNA,在DNA样品的完整性、纯度和浓度质控检测合格的基础上,构建DNA测序文库,采用PacBio RS II测序平台进行测序。下机数据进行Denovo组装,获得了两个完整的环状染色体基因组序列。两个染色体序列的长度分别3,213,040 bp和1,270,975 bp,GC含量46.61%和45.88%,获得NCBI登录号分别为:CP016383（1号染色体）和CP016384（2号染色体）。随后,利用COG、GO、KEGG、ARDB和VFDB等数据库对两个基因组序列进行功能基因、耐药基因和毒力基因注释,并绘制基因组圈图。通过功能基因注释获得SCCF01菌株各个基因的功能、分类和代谢途径等相关信息,基因组圈图展示SCCF01菌株的基因组特征,耐药基因数据库注释共发现20个耐药相关的基因,毒力数据库注释获得SCCF01菌株基因组中粘附素、鞭毛系统、外毒素和分泌系统等毒力基因信息。最后,使用Prodigal、barrnap、tRNAscan-SE、RepeatMasker、IslandViewer和PHAST等软件进行基因组组成分析,预测显示SCCF01菌株的基因组中共含有31个rRNA和106个tRNA,并获得基因组中的重复序列、基因岛和前噬菌体的相关预测信息。2.拟态弧菌SCCF01菌株比较基因组学分析为解析SCCF01菌株的进化来源和变异情况,对SCCF01菌株与其他拟态弧菌进行共线性比较分析、基因家族分析、SNP注释和系统进化分析。共线性分析获得SCCF01菌株基因组与拟态弧菌典型株（ATCC33654和ATCC33655）全基因组的线性关系,但无法判断亲缘关系;基因家族分析预测拟态弧菌SCCF01菌株可能的进化方向为:临床菌株→环境菌株→SCCF01菌株;SNP注释和系统进化分析结果显示SCCF01菌株与环境菌株具有更近的亲缘关系;因此结合基因家族分析、SNP注释和系统进化分析的结果推测SCCF01菌株可能来源于环境菌株。另外,对拟态弧菌进行种属差异整体比较,获得SCCF01菌株在种属间的整体差异列表;Core-Pan基因分析获得了SCCF01菌株与其他拟态弧菌的共有和特有基因关系;SV检测和Indel检测获得了SCCF01菌株与其他拟态弧菌基因组DNA结构变异情况。最后,基于基因组对常见弧菌构建系统发育树,结果显示SCCF01菌株与拟态弧菌的标准株聚为一簇,进一步在基因组水平证实SCCF01菌株属拟态弧菌。3.拟态弧菌SCCF01菌株基因缺失株的构建与鉴定基于全基因组序列采用Natural transformation技术分别对溶血素基因、II型分泌系统（Type 2 Secretory System,T2SS）基因簇和两个TonB系统进行重组缺失,分别获得三种毒力基因（簇）缺失的重组株;随后利用PCP20质粒对重组株中的抗性基因筛选标记进行剔除,获得对应的缺失株。进一步使用PCR技术、第一代测序技术、RT-PCR技术对构建的重组株和缺失株进行基因水平和转录水平的鉴定。PCR鉴定结果显示所有重组株和缺失株中的靶基因均被敲除,所有重组株中的抗性基因均被PCP20质粒剔除获得对应的缺失株,FRT位点检测结果显示引物扩增出缺失株的目的条带大小正确,所有缺失株均不含有PCP20质粒的残留;第一代测序技术结果表明缺失株的上下游同源臂均能与野生株匹配且缺失靶基因已被敲除;对缺失靶基因RT-PCR结果表明缺失株在RNA转录水平不含有缺失靶基因,且缺失靶基因的上下游开放阅读框基因的均能正常转录。最后,通过对缺失株进行传代培养（共50代）证实缺失株能在传代过程中稳定遗传。上述结果从基因和转录水平证实SCCF01菌株T2SS基因簇、溶血素基因和两个TonB系统的基因缺失株被构建成功。4.拟态弧菌SCCF01菌株基因缺失株的表型特征研究将构建成功的T2SS基因簇、溶血素基因和两个TonB系统的缺失株与野生株进行表型特征比较。结果显示,三种毒力基因（簇）缺失后菌体形态和生理生化特性未发生明显变化,但其在Luria-Bertani琼脂和TCBS琼脂上的菌落形成大小和被膜生成率均极显着低于野生株（P<0.01）。T2SS基因簇缺失后其在液体培养基的生长速率、自聚集能力和对EPC细胞的粘附能力均极显着低于野生株（P<0.01）;但溶血素基因和两个TonB系统缺失后生长速率、自聚集能力和对EPC细胞的粘附能力与野生株差异却不显着（P>0.05）。T2SS基因簇和TonB系统缺失菌株在软琼脂的运动能力极显着低于野生株（P<0.01）。将不同浓度的缺失株和野生株浸泡感染黄颡鱼,考察各基因（簇）在致病中的作用。结果显示,溶血素基因缺失后半数致死量(Lethal Dose 50%,LD50)与野生株无明显差异,但T2SS基因簇和TonB系统缺失后LD50明显升高,减毒倍数分别为307.26（缺失T2SS基因簇）、26.61（缺失TonB1系统）、81.75（缺失TonB2系统）和141.25（缺失TonB1系统和TonB2系统）。最后将T2SS和两个TonB系统进行联合基因缺失后进行致病性试验,结果显示联合基因缺失株LD50值为4.46E+07,减毒倍数高达668.34倍。5.T2SS对分泌蛋白、自然感受现象及TonB系统对铁利用的影响研究为进一步揭示拟态弧菌T2SS基因簇与TonB系统的功能,分别开展T2SS基因簇缺失后对蛋白分泌和介导自然转化现象影响及TonB系统对铁利用影响的研究。研究结果表明,T2SS基因簇缺失后,分泌的胞外蛋白位于15-25kDa（4条）、35-50kDa（1条）和50-70kDa（1条）间,蛋白含量均相较于野生株降低,此外分泌的胞外产物蛋白酶活性、卵磷脂酶活性和几丁质酶活性均显着低于野生株（P<0.05）;对缺失株的自然转化效率分析结果表明,T2SS基因簇缺失后不能形成自然感受态摄取外源DNA进行基因水平转移。TonB系统对铁利用的影响研究结果表明,对TonB系统缺失后对Fe2+、Fe3+和乳铁蛋白的摄取与野生株差异不明显,但对TonB1系统缺失后将显着降低对血红蛋白和血红素的摄取能力;2,2’-Dipyridyl敏感试验结果表明对TonB1系统或TonB2系统任何一个系统缺失后均能增加对菌株2,2’-Dipyridyl的敏感性。本章结合第五章表型特征研究进一步揭示了II型分泌性系统和TonB系统基因缺失后的减毒机制。综上,本论文通过第三代测序技术对拟态弧菌SCCF01菌株进行全基因组测序和分析;随后基于全基因组序列选择缺失靶基因和设计打靶载体引物,利用Natural transformation技术构建SCCF01菌株的II型分泌系统基因簇、溶血素基因和两个TonB系统基因的缺失株,并对其鉴定;最后通过比较野生株和缺失株的生物学特性验证是否减毒和揭示其减毒机制。SCCF01菌株全基因序列、缺失株的成功构建以及生物特性的研究将为基因缺失弱毒疫苗的研制提供物质基础与理论依据。
李超[4]（2016）在《微生物发酵生产D-乳酸的研究》文中研究表明D-乳酸作为一种重要的平台化合物,被广泛应用于食品、制药、化妆品等行业。近来对D-乳酸需求量的增加主要是聚D-乳酸可改善以PLA制造产品的机械性能、耐热性和抗水解能力。较L-乳酸来说,D-乳酸生产技术相对落后,因而D-乳酸生产成本比L-乳酸高3～5倍。本文探讨了改造蓝细菌和耐热芽孢杆菌来开发高产、高效的D-乳酸生产菌株,并从甲基化的角度对产乳酸耐热芽孢杆菌的环境嗜热机制进行了研究。构建蓝藻工程菌转化CO2来生产化合物越来越受到关注,然而与细菌偏好利用NADH为辅酶不同,蓝细菌对NADPH的使用偏好阻碍了异源氧化还原酶的应用。本节首先将来自保加利亚乳杆菌ATCC11842中的D-乳酸脱氢酶改造为以主要依赖NADPH。然后将突变酶基因进行密码子优化,并整合至Synechococcus elongates PCC7942染色体中,所获工程菌株D-乳酸的合成速率提高至少3.6倍。向上述突变株中引入乳酸外排泵和向培养基中通入CO2均可提高D-乳酸合成。最终应用上述组合策略实现了D-乳酸合成速率的大幅提升。高温发酵具有多重优势,如最小化污染,提高原料转化速率及降低设备能耗。本节首先挖掘到一独特的嗜热D-乳酸脱氢酶,然后将其引入天然产2,3-丁二醇的耐热地衣芽孢杆菌中。由于引入酶和宿主乳酸外排泵的协作产生了一个“陷阱点”,继而形成“碳流陷阱”效应,使得碳流大量（>90%）流向D-乳酸的合成并不可逆地向胞外运转。最优条件发酵后,D-乳酸产量可达226.6 g/L。此外,实验评估了使用玉米浆干粉（CSP）为唯一氮源生产D-乳酸的情况。为进一步降低成本,实验减少CSP用量并采用响应面法优化获得一组更加廉价发酵培养基,最终可获135.4 g/L D-乳酸。耐热凝结芽孢杆菌也是乳酸生产的菌种,但因其缺乏有效的遗传操作体系而在改造为宿主细胞的应用中受到极大的限制。本节从DNA甲基化的视角对该菌的环境耐热机制进行了探讨,使用单分子实时测序法测定了两株凝结芽孢杆菌的甲基化组。分析甲基化基因功能群和高甲基化区域表明,两株菌在高、低温度下均存在巨大差异。进一步分析甲基化修饰的DNA基序发现,??型m4C甲基转移酶可能在菌株对热环境的适应中起主要作用。另对菌株进行转录组测序和q PCR验证发现了在高温时转录水平明显上调的甲基转移酶基因。因此,该研究拓宽了对DNA甲基化生理功能的新认识。
魏雪新[5]（2016）在《盐渍环境中优势菌群分析及分离菌株Q1UT、Q1RT和BZ1T的多相分类研究》文中进行了进一步梳理本文介绍了细菌分类学研究的概况和盐单胞菌属、噬嘌呤菌属及芽胞杆菌属的分类学研究进展。对采自中国内蒙和青海土样中的细菌进行了选择性分离研究,对分离得到的细菌分离株进行了16S rRNA基因序列测定,并进行优势菌群分析和多相分类研究。本文首先使用不同的选择性培养基对土样中的细菌进行了分离,然后对分离株进行基于16S rRNA基因序列的系统发育分析,从而获取可培养细菌的多样性信息。基于16S rRNA基因序列的系统发育分析表明,盐渍环境中可培养的细菌种群多样性非常丰富,40个代表菌株分属于细菌域的3个门（厚壁菌门、放线菌门、变形菌门）、12个科、15个属。其中多数菌株属于厚壁菌门（Firmicutes）,优势属为芽胞杆菌属（Bacillus）（17株,占总菌株的42.5%）。三株编号为Q1UT,Q1RT和BZ1T的细菌与其亲缘关系最近种的序列相似性分别为98.34%、97.95%、98.28%,初步确定为新种,并对其进行多相分类研究。研究结果表明,菌株Q1UT为革兰氏阴性好氧杆菌,菌落颜色为土黄色,生长NaCl浓度范围为0-20%（w/v）（最适7.5%）,生长温度范围为2-37℃（最适30-33℃）,生长pH范围为6.0-9.0（最适7.0）;主要的呼吸醌类型为Q-9;菌株Q1RT为革兰氏阴性菌,菌落颜色为乳白色,生长NaCl浓度范围为0-9%（w/v）（最适2.5%）,生长温度范围为2-38℃（最适30℃）,生长pH范围为5.0-9.0（最适8.0）;菌株BZ1T为革兰氏阳性好氧杆菌,菌落颜色为土黄色,生长NaCl浓度范围为0-5.5%（w/v）（最适0.5%）,生长温度范围为6-40℃（最适30-33℃）,生长pH范围为6.0-9.0（最适7.0）;主要的呼吸醌类型为MK-7;主要的脂肪酸成分为iso-C15:0、anteiso-C15:0和iso-C14:0;极性脂成分为双磷脂酰甘油、磷脂酰甘油和磷脂酰乙醇胺。综合形态学特征、生理生化特性、化学分类和分子分类的多相分类研究结果,均支持三个菌株为新种,菌株Q1UT命名为泥色盐单胞菌（Halomonas lutescens sp.nov.）,菌株Q1RT命名为微白噬嘌呤菌（Prolinoborus albatus sp.nov.）,菌株BZ1T命名为扁平芽胞杆菌（Bacillus depressus sp.nov.）。
刘璨颖[6]（2014）在《猪源肠外致病性大肠杆菌比较基因组学和亚单位疫苗的研究》文中研究表明大肠杆菌（Escherichia coli, E. coli）是研究得最为广泛的模式菌,按照致病性特点,可以分为共生型E. coli、肠内致病性E. coli （Intraintestinal pathogenic E. coli, InPEC）和肠外致病性E. coli （Extraintestinal pathogenic E. coli, ExPEC）。ExPEC有一些特异的毒力特点能使其定殖并侵袭宿主肠外组织,引发一系列感染,如尿道感染、脑膜炎、败血症、呼吸道感染、肺炎、心内膜炎和骨髓炎等。近几年来,猪群疫病的多发和易发,成为阻碍我国养猪业发展的主要因素。本实验室2004年以来从全国发病猪场内患病猪肠外组织中分离了1000多株E. coli,经过进一步流行病学分析,结果显示,猪源ExPEC已严重威胁到我国养猪业的发展。但是目前国内外针对ExPEC类菌株的研究主要集中于人源和禽源ExPEC,对于猪源ExPEC感染不够重视,对该类致病菌的研究报道非常少。并且目前也没有猪源ExPEC完整的全基因组序列问世。此外,E. coli的血清型众多,且分离出的猪源ExPEC菌株常伴有高耐药性,给猪源ExPEC感染的防控带来了挑战。因此,本实验室利用第二代测序技术首次得到了猪源ExPEC强弱毒株的完整全基因组序列,分析了其毒力因子,研究其生物学特性并阐述其强致病性的原因。此外,选择了两个保守的外膜蛋白OmpC和OmpF,作为猪源ExPEC感染的候选亚单位疫苗进行研究分析。具体研究内容包括：1.猪源ExPEC强毒株PCN033和弱毒株PCN061全基因组测序及分析从本实验室临床分离的猪源ExPEC菌株中,以小鼠为模型,筛选出强毒株PCN033和弱毒株PCN061,采用第二代测序技术454测序,在国际上首次得到猪源ExPEC全基因组序列。完成测序的PCN033基因组由一个长度为4,987,958bp的染色体和三个长度分别为3,319bp,4,086bp和161,511bp的质粒组成；PCN061基因组由一个长度为4,603,777bp的染色体和六个长度分别为2,014bp,5,754bp,6,222bp,34,692bp,103,644bp和145,722bp的质粒组成。我们对PCN033和PCN061基因组进行了较为详尽的基因注释,系统的对基因功能进行分类和比较,预测假基因,分析基因组基本元件,包括基因组岛、前噬菌体区域和插入序列等。将PCN033、PCN061和共生型E. coli HS基因组所编码的蛋白质序列进行BLASTP （?）（?）对,其中强毒株PCN033特异的编码序列有1056个。依据所选取的56株埃希氏菌中所拥有的325个核心基因,构建进化树,结果显示PCN033和PCN061菌株在大肠杆菌中的进化位置分别跟InPEC UMN042和共生型HS菌株最近。2.强弱毒株的比较基因组学分析通过比较PCN033和PCN061的基因序列,发现PCN033特异的序列主要是水平转移DNAs,其中前噬菌体区域约占50%。在这些特异性的序列中,还包括许多编码毒力因子的相关基因,如黏附素、脂多糖、荚膜多糖、铁离子摄取与转运系统、分泌系统以及与代谢有关的基因。此外,PCN033菌株含有一个潜在的毒力质粒PCN033p3,该质粒含有许多典型的ExPEC毒力因子。我们将两株菌株在以上几个方面的差异进行了具体的分析,归纳总结了这两株菌毒力差异的基因型基础。3.强弱毒株生物学特性的比较分析我们以BALB/c小鼠为模型,测定了强弱毒株的LD50分别为3.4×105和2.3×107CFU g-1,并且强毒株PCN033在小鼠血液中的繁殖能力显着强于弱毒株PCN061。此外,感染PCN033菌株的小鼠脑组织的病理切片显示出明显的脑膜炎病变。依据上述分析的基因型差异结果,我们鉴证了相应的生物表型差异,包括鞭毛、运动性、生物被膜以及代谢能力。结果显示,强毒株相比于弱毒株,能够形成周身鞭毛,具有较强的运动性,形成生物被膜的能力较弱,能够代谢较多的糖类,如蔗糖和棉籽糖。强弱毒株生物学特性的比较分析,从生物表型方面解释了其毒力差异的原因。4. ExPEC外膜蛋白OmpC和OmpF免疫原性的研究本实验室挑选了猪源ExPEC中两个保守的外膜蛋白OmpC和OmpF,进行克隆和原核表达来分析其免疫原性。纯化的重组蛋白OmpC和OmpF在腹腔免疫小鼠后,产生了较强的免疫球蛋白（immunoglobulin G, IgG）抗体反应,包括IgG1和IgG2a亚类,其中诱导的IgG1水平较高。免疫了OmpC和OmpF的小鼠,在感染了2.5×107CFU （5×LD50）强毒株ExPEC PCN033后,保护率分别达到了62.5%和87.5%。此外,抗OmpC和抗OmpF的血清均能调节补体依赖性的调理吞噬。进化分析的结果显示,基因ompC广泛的存在于所有研究的E. coli菌株中,而基因ompF在部分E. coli菌株中发生了突变。进一步的选择分析显示,基因ompC可能承受强免疫压力。我们的实验和进化分析结果显示,OmpC可能成为猪源ExPEC感染的候选疫苗。
戴剑漉[7]（2014）在《埃莎霉素产生菌的分子育种及其分类的初步鉴定》文中研究指明必特螺旋霉素（BT）是利用基因工程技术,将来源于耐热链霉菌的异戊酰基转移酶基因（ist）克隆至螺旋霉素产生菌染色体,所获得的基因工程菌的发酵产物,目前BT已完成临床试验研究,进入新药生产注册申报阶段,必特螺旋霉素是个多组分抗生素,是以异戊酰螺旋霉素（简称埃莎霉素）Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三个组分为主成分,还含有其他酰化螺旋霉素的小组分。研究表明,BT与埃莎霉素Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三个单组分的抗菌活性没有显着差异。因此,埃莎霉素的单一组分可能与BT多组分具有同样的抗菌效果。构建埃莎霉素霉素单组分（IA-Ⅰ）产生菌对简化生产工艺、质量控制及制剂改良均有重要的社会和经济意义。本实验室利用基因阻断技术,已构建了只产生埃莎霉素Ⅰ组分的菌种WSJ-2。但是,该菌种发酵单位很低,不利于进行规模化生产。已知来源于碳霉素（16元大环内酯抗生素）产生菌耐热链霉菌的异戊酰基转移酶基因ist与调节基因acyB2连锁,调节基因的存在可以激活ist基因的表达；只有含有完整ist和acyB2调节基因才能在变铅青链霉菌表达ist的活性,但是,迄今为止没有异源转入ist和acyB2基因可以直接提高抗生素产量或单组分含量的报道。本研究的目的是利用ist-acyB2连锁基因,同时采用基因稳定整合表达系统,对WSJ-2实施分子育种,以提高产生菌埃莎霉素Ⅰ组分的含量及产量。我们首先构建了含有4”-异戊酰基转移酶基因ist和耐热链霉菌调节基因acyB2连锁片段的重组质粒pSET152-ia,然后将其导入到埃莎霉素Ⅰ产生菌WSJ-2中,通过pSET152载体上attp附着位点整合到WSJ-2的染色体上,获得了新的埃莎霉素Ⅰ组分产生菌WSJ-IA。在一定发酵条件下,WSJ-IA发酵产量比原株WSJ-2提高4.14倍,产生埃莎霉素Ⅰ组分含量比原株提高3.47倍。所获得的新的埃莎霉素Ⅰ组分产生菌WSJ-IA在不加药条件下连续传代,抗性表达稳定,其发酵产量及组分含量基本稳定。本研究结果表明,耐热链霉菌ist-acyB2连锁基因可以明显提高埃莎霉素Ⅰ的组分含量和发酵产量,同时,所获得的WSJ-IA产生菌在为今后将BT开发为单组分有效新抗生素中的应用及探讨ist外源基因在螺旋霉素宿主菌中的调控机制奠定基础。必特螺旋霉素（BT,原名生技霉素）是利用基因工程技术研制的以4”位异戊酰螺旋霉素Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、为主要成分的酰化螺旋霉素。埃莎霉素（异戊酰螺旋霉素）Ⅰ是在BT基础上利用基因工程技术创制的BT中单一组分的抗生素。本研究第一部分利用调节基因acyB2激活异戊酰基转移酶（ist）基因表达的特点,将ist与调节基因acyB2连锁导入埃莎霉素Ⅰ产生菌,获得埃莎霉素Ⅰ单组分的高含量及高产量菌株WSJ-IA。由于WSJ-IA在今后开发为单组分有效新抗生素中具明显的潜在能力。BT及埃莎霉素Ⅰ产生菌在构建中经过多次染色体基因工程及诱变改造,为了考察菌种的遗传稳定性,并在今后生产中有效地保护生产菌种,有必要对它及其出发菌株-螺旋霉素产生菌在分类中的地位给予确定。链霉菌分类学研究是当今的研究热点,近年以链霉菌种属16S rRNA序列保守性作为分子分类学标志的研究发展迅速,但是,已证明仅用16S rRNA序列作为分类标志,许多种属之间的关系仍然不清楚,因此,选用多个看家基因保守序列作为分子标志,可以比较清楚的确定链霉菌的种属地位。本研究对WSJ-IA及BT原株-螺旋霉素产生菌Streptomyces spiramyceticus F21进行了初步鉴定。从形态学、培养和生理生化特征、细胞壁化学组成、16S rRNA基因序列、5个看家基因（atpD、gyrB、rpoB、recA和trpB）蛋白分析和系统发育树构建等方面对该菌株及其原株进行了鉴定。结果表明两株菌在形态培养特征、生理生化特征、细胞壁化学组成、16S rRNA基因序列和5个看家基因蛋白水平基本一致,在系统发育树分析中同处在一个分支中。而在16S rRNA基因序列和5个看家基因蛋白水平在系统发育上它们均与已知相近菌株处于不同的分支上,并且不同基因与之相近菌株各有不同,相似菌株中无一报道产生螺旋霉素。说明Streptomyces spiramyceticus F21可能是一个产生螺旋霉素的链霉菌新种,16S rRNA基因序列和5个看家基因蛋白序列分析可以作为埃莎霉素Ⅰ基因工程菌生产过程中进行鉴别的分子标志。同时,本研究为在长期大规模生产中应用分子标志考察链霉菌基因工程菌株的遗传稳定性提供了依据。
杨求华[8]（2012）在《养殖鳗鲡致病性气单胞菌的分离与鉴定》文中提出本文主要研究养殖患病鳗鲡的致病性气单胞菌。从患病鳗鲡的病灶分离得到试验菌株，选择生理生化指标具有明显差异的气单胞菌进行攻毒感染试验。以致病性的气单胞菌为研究对象，利用Biolog自动微生物鉴定系统和基因序列分析方法对这些菌株进行准确的菌种分类和鉴定，同时分析这些菌株对抗生素药物的敏感性。主要结果如下：1．对9批养殖患病鳗鲡细菌性疾病的病原进行了研究，从患病鳗鲡肝脏和肾脏等部位共分离得到56株菌，经生化试剂盒鉴定筛选了其中5株气单胞菌菌用于攻毒感染试验，结果表明有3株可明显引起注射鳗鲡发病和死亡，这些致病菌被初步鉴定为兽生气单胞菌、波波夫气单胞菌和异嗜糖气单胞菌。2．以5株新分离的致病性气单胞菌和27株试验室保存的未鉴定至种的致病性气单胞菌为材料，采用Biolog自动微生物鉴定系统对这些菌株进行鉴定。实验结果显示：32株气单胞菌分为5个种，包括有21株嗜水气单胞菌，7株维氏气单胞菌，1株豚鼠气单胞菌，2株简达气单胞菌和1株兽生气单胞菌。其中25株的鉴定值可信度较高，可能性大于80%，另外7株的鉴定可能性值较低，包括有2株嗜水气单胞菌B50和B65（可能性分别为0.582和0.732），3株维氏气单胞菌B41、B67和B73（可能性分别为0.617、0.201和0.300），1株简达气单胞菌B21（可能性为0.461）和1株兽生气单胞菌B53（可能性为0.740）。3．采用16S rRNA、cpn60、rpoB、gyrB和dnaJ五个基因的序列分析方法对32株致病性气单胞菌进行鉴定。结果显示：32株气单胞菌分为4个种：嗜水气单胞菌21株、维氏气单胞菌7株、豚鼠气单胞菌2株和简达气单胞菌2株。功能基因cpn60和dnaJ对气单胞菌的聚类分析中，其平均遗传距离分别为0.082和0.089，明显高于其余三个基因，可考虑作为鉴定鳗鲡致病性气单胞菌的重要依据。4．以12类（30种）抗生素药物研究32株致病性气单胞菌对药物的敏感性。实验结果表明，庆大霉素、阿米卡星、头孢他啶、头孢噻肟、卡那霉素、洛美沙星、呋喃妥因、哌拉西林、左氧氟沙星、壮观霉素、链霉素、阿奇霉素、氟哌酸、头孢曲松、强力霉素、头孢呋辛等19种药物对大部分致病性气单胞菌敏感；而新生霉素、头孢克罗、头孢拉定、头孢唑林、头孢噻吩、利福平、复方新诺明、氨苄西林、乙酰螺旋霉素、羧苄青霉素、青霉素等11种药物对大部分菌株表现为耐药。5．本研究采用Biolog自动微生物鉴定系统和基因序列分析方法对32株分离于养殖患病鳗鲡的致病性气单胞菌进行鉴定。实验结果显示这两种方法具有较高的一致性，32株气单胞菌包括嗜水气单胞菌、维氏气单胞菌、豚鼠气单胞菌和简达气单胞菌。其中，嗜水气单胞菌和维氏气单胞菌是养殖鳗鲡的主要致病菌之一，并且首次从养殖患病鳗鲡体内分离得到致病性简达气单胞菌。
季华员[9]（2011）在《猪产肠毒素型大肠杆菌F41受体基因的精细定位与鉴别》文中进行了进一步梳理产肠毒素大肠杆菌（enterotoxigenic Escherichia coli ETEC）是引发新生及断奶仔猪腹泻和水肿的主要致病菌。ETEC主要存在五种血清型,包括F4、F41、F5、F6和F18。ETEC F41作为其中的一种血清型,是引起仔猪腹泻的重要病原菌之一,其通过表面表达的黏附素与猪小肠上皮细胞的特异性受体结合,释放肠毒素进而引起大量电解质和水渗入肠腔,从而导致仔猪腹泻。本课题组前期利用183个微卫星标记在大规模白色杜洛克×二花脸资源家系群体中开展全基因组扫描,将ETECF41受体基因初步定位在猪4号染色体SW2509和S0301标记间约6.04 Mb的区域。在此基础上,本研究通过在SSC4 QTL目标区域增加7个微卫星标记,对其在同一资源群体（包括816个F2个体及所有Fo与F1个体）中开展基因分型,进一步将ETEC F41受体基因精细定位至标记SW2509至KVL2754之间约2.42 Mb的区域,为鉴别ETEC F41受体目的基因奠定了良好的工作基础。在所定位的2.42 Mb目标区域中,采用比较基因组学分析,揭示该区域目前存在21个基因,从中选取6个可能的位置候选基因（包括ST3GAL1、TMEM71、ASAP1、NDRG1、ZFAT、KCNQ3基因）通过半定量RT-PCR检测其在猪空肠组织中的表达,结果表明这6个基因在空肠中均表达。进一步结合ETEC F41受体的理化特性选择ST3p-半乳糖α-2,3唾液酸转移酶1（ST3GAL1）基因作为ETEC F41受体的重要位置候选基因加以研究。采用5’RACE和3’RACE技术,分离了ST3GAL1基因全长1637 bp的cDNA序列,其中开放阅读框（Open Reading Frame, ORF）为1032 bp,编码343个氨基酸。通过比较测序法在ST3GAL1基因内共鉴别到62个多态位点,其中2个错义突变（ST3GAL1 c.284T>A和ST3GAL1 c.661A>G）,11个同义突变,49个内含子上的突变。采用PCR-RFLP和PCR-SNaPshot方法对ST3GAL1 c.284T>A（位于第1外显子）、c.477C>T（位于第2外显子）及c.661A>G（位于第3外显子）等3个多态位点在白色杜洛克×二花脸资源家系所有个体中进行多态性检测。传递不平衡检测表明除c.477C>T位点外,另两个多态位点的等位基因及所有单倍型均与ETEC F41的易感性呈极显着相关（P<0.01）。为此,本实验选择两个强关联的SNPs位点（ST3GAL1c.284T>A及c.661A>G）进一步在287头中、西方猪种远缘群体中开展遗传多态性分析,采用Case Control力法分析,结果表明ST3GAL1 c.284T>A及c.661A>G两个多态位点在中、西方猪种远缘群体中与ETEC F41黏附表型关联性均不显着。由此提示ST3GAL1基因与ETECF41黏附表型的关联性可能存在群体异质性,另外ST3GAL1基因可能不是目的基因而仅是与目的基因处于一定连锁不平衡状态的一个标记位点。为了获得更高的基因定位精度,本研究采用猪全基因组高通量60K SNP芯片对白色杜洛克×二花脸资源群体开展全基因组关联分析（Genome-wide association study, G WAS）,以精细定位ETEC F41受体基因位点。GWAS结果显示,与ETEC F41黏附表型具有最显着关联的SNP位点为H3GA0011673 C>T（P=1.09E-09）,与其临近的两个多态位点为ASGA0017715 T>C和ASGA0017733 C>T。进一步对这三个多态位点在287头中、西方猪种中采用PCR-SNaPshot方法进行多态性检测,结果表明仅ASGA0017733 C>T多态位点在西方猪种中与ETEC F41黏附表型显着关联。由此提示,ASGA0017733 C>T位点可能是与目的基因处于连锁不平衡的一个重要标记,这为进一步开展位置候选基因研究奠定良好的基础。ASGA0017733 C>T位点位于ZFAT基因第3内含子上,结合受体生理生化分析,本实验选择ZFAT （zinc finger and AT hook domain containing）作为ETEC F41受体位置候选基因进一步深入研究。采用RACE技术分离得到长4108 bp的猪ZFAT cDNA序列,开放阅读框（ORF）长3393 bp,编码1130个氨基酸。通过比较测序在ZFAT基因编码区鉴别到c.60C>T、c.630A>C、c.660T>C、c.1077T>C、c.1416T>C、c.2337T>C及c.2935G>C共7个多态位点,其中1个为错义突变,6个为同义突变。采用PCR-SNaPshot技术检测这7个多态位点在中、西方猪种远缘群体287个个体中的多态性。连锁不平衡（Linkage Disequilibrium, LD）分析表明大多数SNP位点均存在不同程度的连锁不平衡,但在西方猪种中的LD程度高于中国地方猪种。关联性分析表明：在中国地方猪种中仅2337T>C位点与ETEC F41黏附表型显着相关（P<0.05）；而在西方猪种中,除c.630A>C和c.660T>C位点与ETEC F41黏附表型相关性不显着外,其余5个多态位点与ETEC F41黏附表型显着相关（P<0.05）,表明这些多态位点可能位于ETEC F41受体基因之中或与其处于连锁不平衡状态,这些结果为ETECF41受体基因的精细定位提供了重要的分子标记。本研究不仅证实了与ETEC F41侵染相关的主效QTL位于猪4号染色体上,而且进一步将目标区域缩小至标记SW2509-KVL2754（5.56 Mb-7.98 Mb）间,为最终确定ETEC F41受体目的基因及其因果突变奠定了重要的前期工作基础。通过对位置候选基因ST3GAL1和ZFAT基因的克隆及多态性分析,鉴别到的与ETEC F41黏附表型显着相关的位点为利用标记辅助选择（MAS）开展抗ETEC F41腹泻病分子遗传育种提供了很好的分子标记。
潘康成[10]（2009）在《产酶芽孢杆菌的筛选、鉴定及对肉鸡的微生态效应研究》文中研究说明本文对实验室分离保存的芽孢杆菌进行产酶活性筛选,并对筛选得到的一株产酶活性高的芽孢杆菌进行序列分析鉴定,研究其对雄性小鼠的生殖系统安全16S rDNA性、采用实时荧光定量检测在肉鸡肠道中消长规律、PCR （RT-qPCR）和ERIC-PCRPCR-DGGE检测肉鸡口服该菌悬液后肠道菌群多样性,然后制成活菌制剂观察其对肉鸡生长性能、肌肉品质、肠道菌群、消化酶活性和免疫功能的影响。结果如下：1.采用平板培养法对10株芽孢杆菌产蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶活性进行初选,然后采用比色法测定芽孢杆菌发酵培养液酶活性进行复选。筛选出产酶活性较高的芽孢杆菌Pab02菌株。根据细菌的16SrDNA序列两端的保守性设计通用引物,提取菌株的基因组DNA,对菌株的16SrDNA的进行PCR扩增,并对扩增得到的目标片段进行测序,将测序结果与NCBI上已知菌种的16SrDNA序列进行同源性比较和构建系统发育进化树进行分析,结合细菌形态特征、生理生化特性,最终确定芽孢杆菌Pab02为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。2.为了评价该菌的安全性,选用72只昆明系雄性小鼠,随机分成6组。药物对照组,每只小鼠按20 mg/kg体重经口灌喂环磷酰胺,1次/d,连续5d,诱导小鼠产生生殖毒性；药物对照组和空白对照组小鼠饲喂不含任何益生菌和抗生素的日粮,芽孢杆菌Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组和Ⅳ组分别饲喂含有105,106,107CFU/g和108CFU/g的饲料。饲喂至30d时,每组随机剖杀6只,检测小鼠睾丸、附睾重,精子畸形、精子活力,睾丸组织中MDA含量和SOD活性,精子顶体酶活力,血清睾酮（T）含量,并通过组织切片观察雄性小鼠睾丸的组织结构。结果显示,芽孢杆菌Pab02对小鼠体重、小鼠睾丸和附睾重均有明显的增重效果；芽孢杆菌Pab02可提高小鼠精子活率,对精子畸形的减少没有明显的作用；芽孢杆菌Pab02可降低小鼠翠丸组织中MDA含量,提高睾丸组织中SOD活性、精子顶体酶活力和血清睾酮的含量,芽孢杆菌Pab02对小鼠的睾丸组织结构有一定的改善作用。结果表明,芽孢杆菌Pab02对雄性小鼠是安全的,没有造成生殖毒性,对雄性小鼠生殖功能有一定的促进作用。3.芽孢杆菌Pab02菌悬液按2ml/kg体重（109CFU/ml）灌喂28日龄的肉鸡,2次/d,连续3d后,收集肠道内容物,采用RT-qPCR检测肠道内容物中芽孢杆菌的数量。结果,对照组（灌喂等量的PBS液）肉鸡肠道内芽孢杆菌数在5.37-6.10logCopies/g之间,当连续口服芽孢杆菌Pab02菌悬液后,十二指肠内的芽孢杆菌数量从12h到第4d显着高于对照组,第5d后恢复到对照组水平；空肠、回肠和直肠从12h到第5d显着高于对照组,第6d后恢复到对照组水平。盲肠内的芽孢杆菌数量在36h和60h时显着高于对照组。结果表明,芽孢杆菌在对照组肉鸡肠道中的数量较少,芽孢杆菌Pab02作为微生态制剂饲喂动物,须长期投服或间断时间不超过3d。4.芽孢杆菌Pab02菌悬液连续灌喂28日龄肉仔鸡3d后（2次/d）,收集停喂3d的肠道内容物,采用ERIC-PCR／PCR-DGGE方法分析电泳指纹图谱条带数及相似性指数,以及对DGGE特异性条带回收、测序分析其肠道菌群。结果显示,两种方法都证明肉鸡口服芽孢杆菌Pab02后各肠段的条带数及特征性条带均明显多于对照组,说明芽孢杆菌Pab02具有提高肉鸡肠道菌群多样性和种群密度；通过对电泳指纹图谱条带的聚类分析,两种检测方法显示肉鸡肠道菌群结构的多样性变化规律相似,两组肉鸡肠道细菌之间存在着种群的差异性,但两组之间肠道总菌群的相似性系数为53.2%,存在着较高的相似性,说明该年龄段的肉鸡肠道微生物种群存在着一定的稳定性；尽管两种检测方法检测结果存在着一定的相似性,但从电泳指纹图谱和统计条带数量分析,PCR-DGGE明显优于ERIC-PCR;通过刘DGGE图谱上出现的7条共同条带和8条试验组条带进行回收鉴定,结果表明,肉鸡在4周龄到5周龄的肉鸡肠道中主要以乳酸菌为主要菌群,饲喂芽孢杆菌Pab02后能提高肉鸡肠道菌群的丰度和种群密度。5.利用芽孢杆菌Pab02制成活菌制剂后饲喂肉鸡,观察其对肉鸡生长性能、肌肉品质、肠道菌群、消化酶活性及免疫功能的影响。空白对照组饲喂基础日粮,抗生素对照组在日粮中添加0.05%的硫酸新霉素制剂,Pab02组在日粮中添加0.1%的芽孢杆菌Pab02制剂。饲喂至6周龄时,与空白对照组相比,芽孢杆菌Pab02提高了肉鸡的末期体重、净增重和日增重（P<0.05）,但比抗生素组低（P>0.05）；对采食量和饲料转化率没有影响（P>0.05）;Pab02组肉鸡胴体品质的各项指标与两对照组相比,显着提高了腿肌率（P<0.05）,其余各项指标无明显差异（P>0.05）;Pab02组鸡肌肉中的蛋白含量显着高于两对照组（P<0.05）；肌肉中的氨基酸总量和鲜味氨基酸含量极显着高于两对照组（P<0.01）,必须氨基酸量极显着高于抗生素组（P<0.01）；在6周龄时,芽孢杆菌Pab02可以提高肠道中乳酸菌的数量,减少大肠杆菌和总需氧菌数量,在盲肠段中表现差异显着（P<0.05）；在4周龄和6周龄时,芽孢杆菌Pab02组肠道淀粉酶和蛋白酶活性均显着或极显着高于两对照组（P<0.05或P<0.01）,芽孢杆菌Pab02可促进免疫器官的发育,提高血清对新城疫病毒的抗体效价,提高6周龄时的血清IgG含量（P<0.01）。结果表明该菌制成的微生态制剂可以在肉鸡饲养整个期间替代抗生素添加剂。
二、耐热AKP在高GC含量细菌染色体杂交方法中的应用（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、耐热AKP在高GC含量细菌染色体杂交方法中的应用（论文提纲范文）
（1）虹鳟源鲁氏耶尔森菌主要生物学特性及减毒活疫苗研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 引言 |
| 1.1 虹鳟肠炎红嘴病(ERM) |
| 1.1.1 虹鳟养殖概况及ERM危害 |
| 1.1.2 ERM流行发生规律 |
| 1.1.3 ERM临床症状、病理变化及诊断方法 |
| 1.1.4 ERM的病原特性 |
| 1.2 鲁氏耶尔森菌致病机制 |
| 1.2.1 致病机制研究方法 |
| 1.2.2 不良环境生存能力 |
| 1.2.3 生物被膜系统 |
| 1.2.4 铁元素的获取与利用 |
| 1.2.5 细胞外毒素 |
| 1.2.6 血清型与毒力关系 |
| 1.2.7 毒力基因的表达调控 |
| 1.3 鲁氏耶尔森菌溶血素基因 |
| 1.3.1 溶血素命名及分类 |
| 1.3.2 溶血素致病机制 |
| 1.3.3 鲁氏菌溶血素基因研究进展 |
| 1.4 同源重组技术 |
| 1.4.1 RecA系统同源重组法 |
| 1.4.2 Red系统同源重组法 |
| 1.4.3 基于自杀载体的同源重组法 |
| 1.4.4 基于温敏型质粒的同源重组法 |
| 1.4.5 CRISPR/Cas系统介导的基因编辑法 |
| 1.5 ERM免疫防控 |
| 1.6 研究目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验菌株、实验动物及细胞系 |
| 2.1.2 重组表达载体及质粒 |
| 2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.1.4 主要试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 鲁氏耶尔森菌的分离鉴定和致病性研究 |
| 2.2.2 鲁氏耶尔森菌q PCR快速检测方法的建立 |
| 2.2.3 虹鳟ERM病理模型 |
| 2.2.4 鲁氏耶尔森菌感染虹鳟后脾脏转录组表达分析 |
| 2.2.5 YR01株溶血素基因毒力片段筛选 |
| 2.2.6 YR01株yhl B基因突变株YR01-△yhl B的构建 |
| 2.2.7 YR01-△yhl B株的生长及理化特性分析 |
| 2.2.8 YR01-△yhl B株作为减毒疫苗的可行性分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 YR01株鉴定结果 |
| 3.1.1 YR01株的形态特征 |
| 3.1.2 YR01株的理化特性 |
| 3.1.3 YR01株的分子特征 |
| 3.1.4 YR01株的致病性分析 |
| 3.1.5 YR01株感染虹鳟的组织病理学 |
| 3.2 qPCR检测方法的建立 |
| 3.2.1 扩增引物的特异性检测 |
| 3.2.2 标准曲线构建 |
| 3.2.3 灵敏度检测 |
| 3.3 虹鳟ERM病理模型的构建 |
| 3.3.1 临床症状观察 |
| 3.3.2 组织病理观察 |
| 3.3.3 致病菌检测 |
| 3.3.4 病理模型评价 |
| 3.4 鲁氏耶尔森菌感染虹鳟后脾脏转录组水平分析 |
| 3.4.1 RNA测序与数据处理 |
| 3.4.2 与参考基因组的匹配情况 |
| 3.4.3 差异表达基因的识别与分析 |
| 3.4.4 免疫相关DEGs的识别与分析 |
| 3.4.5 qRT-PCR验证 |
| 3.5 鲁氏耶尔森菌溶血素基因各片段毒力分析 |
| 3.5.1 YR01株溶血素基因(yhl BA)分段克隆结果 |
| 3.5.2 YR01株yhl BA基因片段表达载体的构建 |
| 3.5.3 YR01株yhl BA基因片段原核表达产物纯化分析 |
| 3.5.4 YR01株yhl BA基因片段原核表达产物的细胞毒性比较分析 |
| 3.6 YR01突变株(YR01-△yhl B)的构建 |
| 3.6.1 同源臂Kan抗性基因的扩增 |
| 3.6.2 打靶载体p-yhl B的构建 |
| 3.6.3 YR01-△yhl B突变株的构建 |
| 3.7 YR01-△yhl B株的生长及理化特性分析 |
| 3.7.1 YR01-△yhl B株的菌落形态观察 |
| 3.7.2 糖醇发酵能力检测 |
| 3.7.3 生长特性检测 |
| 3.7.4 药敏特性检测 |
| 3.8 YR01-△yhl B株作为减毒疫苗的可行性分析 |
| 3.8.1 细胞毒性检测 |
| 3.8.2 靶动物毒性评估 |
| 3.8.3 YR01-△yhl B株的免疫保护效果评价 |
| 4 讨论 |
| 4.1 ERM流行病学特征 |
| 4.1.1 ERM的发生及在我国的流行情况 |
| 4.1.2 鲁氏耶尔森菌的病原病理学特性比较 |
| 4.2 鲁氏耶尔森菌检测技术的探索突破 |
| 4.3 病理模型构建及其在研究中的应用 |
| 4.4 鲁氏耶尔森菌引起的虹鳟转录水平表达差异 |
| 4.4.1 细胞因子 |
| 4.4.2 细胞凋亡 |
| 4.4.3 模式识别受体 |
| 4.4.4 信号通路 |
| 4.5 鲁氏耶尔森菌溶血素基因致病性分析 |
| 4.6 鲁氏耶尔森菌YR01-△yhl B突变株特性分析 |
| 4.7 鲁氏耶尔森菌YR01-△yhl B突变株免疫原性分析 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 |
（2）沙门氏菌全基因组数据库构建及其分子靶标挖掘与应用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词索引 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 沙门氏菌概述 |
| 1.1.1 沙门氏菌生物学特性 |
| 1.1.2 沙门氏菌血清分型 |
| 1.2 沙门氏菌致病性 |
| 1.3 沙门氏菌分子检测方法 |
| 1.3.1 基于PCR的变温核酸扩增技术 |
| 1.3.2 恒温核酸扩增技术 |
| 1.4 沙门氏菌的防控 |
| 1.4.1 物理学方法 |
| 1.4.2 化学方法 |
| 1.4.3 生物学方法 |
| 1.5 本研究的目的及意义 |
| 第二章 沙门氏菌全基因组数据库的构建 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 实验方法 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 全基因组数据库 |
| 2.3.2 泛基因组分析结果 |
| 2.3.3 核心基因组分析结果 |
| 2.3.4 毒力和耐药基因分析结果 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 沙门氏菌属靶标的挖掘及LAMP体系的构建 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 实验方法 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 沙门氏菌属特异性检测靶标 |
| 3.3.2 LAMP靶基因的选择 |
| 3.3.3 LAMP的最佳反应条件 |
| 3.3.4 LAMP的特异性和灵敏度 |
| 3.3.5 人工污染和实际样品中LAMP的应用 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 沙门氏菌血清群靶标的挖掘及m PCR体系的构建 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 实验方法 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 沙门氏菌血清群特异性检测靶标 |
| 4.3.2 mPCR的组合 |
| 4.3.3 mPCR的特异性和灵敏度 |
| 4.3.4 实际样品中mPCR的应用 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 沙门氏菌血清型靶标的挖掘及链置换LAMP量子点荧光微球免疫层析试纸条体系的构建 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 实验材料 |
| 5.2.2 实验方法 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 B群常见血清型特异性检测靶标 |
| 5.3.2 D群常见血清型特异性检测靶标 |
| 5.3.3 C1 群常见血清型特异性检测靶标 |
| 5.3.4 C2 群常见血清型特异性检测靶标 |
| 5.3.5 E群常见血清型特异性检测靶标 |
| 5.3.6 链置换LAMP量子点荧光微球免疫层析试纸条 |
| 5.4 小结 |
| 第六章 沙门氏菌属靶标与毒力岛2 相关基因功能的初步研究 |
| 6.1 前言 |
| 6.2 材料与方法 |
| 6.2.1 实验材料 |
| 6.2.2 实验方法 |
| 6.3 结果与讨论 |
| 6.3.1 突变株的构建 |
| 6.3.2 突变株生物表型分析 |
| 6.3.3 突变株毒力分析 |
| 6.3.4 转录组结果分析 |
| 6.4 小结 |
| 第七章 新型沙门氏菌噬菌体分离与应用 |
| 7.1 前言 |
| 7.2 材料与方法 |
| 7.2.1 实验材料 |
| 7.2.2 实验方法 |
| 7.3 结果与讨论 |
| 7.3.1 噬菌体vB_SalP_TR2 的形态学 |
| 7.3.2 噬菌体vB_SalP_TR2 生物学特征 |
| 7.3.3 噬菌体vB_SalP_TR2 基因组特征 |
| 7.3.4 噬菌体vB_SalP_TR2 的应用 |
| 7.4 小结 |
| 主要结论与展望 |
| 主要结论 |
| 创新点 |
| 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
（3）拟态弧菌SCCF01株的全基因组解析及基因缺失株的构建与生物学特性的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词 |
| 符号说明 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 拟态弧菌的危害 |
| 2 弧菌的毒力因子 |
| 2.1 粘附素 |
| 2.2 鞭毛系统 |
| 2.3 外毒素 |
| 2.4 分泌系统 |
| 2.5 铁摄取系统 |
| 3 细菌基因组学研究 |
| 3.1 测序技术发展概况 |
| 3.2 细菌基因组的应用 |
| 4 渔用疫苗现状分析 |
| 4.1 渔用疫苗研究进展 |
| 4.2 活疫苗减毒策略分析 |
| 5 细菌基因组敲除技术研究进展 |
| 6 本研究的目的与意义 |
| 第二章 拟态弧菌SCCF01菌株全基因组测序注释及组分分析 |
| 1 试验材料 |
| 1.1 菌株 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 细菌基因组的提取和质控检测 |
| 2.2 Pacbio测序流程 |
| 2.3 基因组拼接和上传 |
| 2.4 基因模型预测 |
| 2.5 注释分析 |
| 2.6 基因组组分分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 全基因组测序和上传 |
| 3.2 注释分析 |
| 3.3 基因组组分分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 拟态弧菌SCCF01菌株全基因组序列测定 |
| 4.2 拟态弧菌SCCF01菌株全基因组注释分析 |
| 4.3 拟态弧菌SCCF01菌株全基因组组分分析 |
| 5 小结 |
| 第三章 拟态弧菌SCCF01菌株比较基因组学分析 |
| 1 比较菌株信息 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 种属差异整体比较 |
| 2.2 共线性分析 |
| 2.3 基因家族分析 |
| 2.4 SNP检测及注释 |
| 2.5 构建系统进化树 |
| 2.6 Core-Pan基因分析 |
| 2.7 InDel检测及注释 |
| 2.8 SV检测 |
| 3 结果 |
| 3.1 种属差异整体比较 |
| 3.2 共线性分析 |
| 3.3 基因家族分析 |
| 3.4 SNP检测及注释 |
| 3.5 构建系统进化树 |
| 3.6 Core-Pan基因分析 |
| 3.7 InDel检测及注释 |
| 3.8 SV检测 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第四章 拟态弧菌SCCF01菌株基因缺失株的构建和鉴定 |
| 1 试验材料 |
| 1.1 菌株和质粒 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 重组株的构建 |
| 2.2 重组株抗性基因的剔除 |
| 2.3 缺失株的鉴定 |
| 2.4 联合多基因缺失 |
| 3 结果 |
| 3.1 重组株的构建 |
| 3.2 重组株抗性基因的剔除 |
| 3.3 缺失株的鉴定 |
| 3.4 联合多基因缺失 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第五章 拟态弧菌SCCF01菌株基因缺失株的表型特征研究 |
| 1 试验材料 |
| 1.1 菌株 |
| 1.2 细胞株 |
| 1.3 试验动物 |
| 1.4 主要试剂 |
| 1.5 主要仪器 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 生理生化特性 |
| 2.2 形态学观察 |
| 2.3 生长特性试验 |
| 2.4 培养特性 |
| 2.5 运动能力 |
| 2.6 生物被膜形成 |
| 2.7 细胞粘附能力 |
| 2.8 自聚集能力 |
| 2.9 致病性试验 |
| 2.10 数据分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 生理生化特性 |
| 3.2 形态学观察 |
| 3.3 生长特性 |
| 3.4 培养特性 |
| 3.5 运动能力 |
| 3.6 生物被膜形成 |
| 3.7 细胞粘附能力 |
| 3.8 自聚集能力 |
| 3.9 致病性试验 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第六章 T2SS对分泌蛋白、自然感受现象及TonB系统对铁利用的影响研究 |
| 1 试验材料 |
| 1.1 菌株 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 T2SS对分泌蛋白和自然感受现象的影响研究 |
| 2.2 TonB系统对铁利用的影响研究 |
| 3 结果 |
| 3.1 T2SS对分泌蛋白和自然感受现象的影响研究 |
| 3.2 TonB系统对铁利用的影响研究 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文/书籍/专利 |
（4）微生物发酵生产D-乳酸的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 乳酸概述 |
| 1.1.1 乳酸的结构和性质 |
| 1.1.2 D-乳酸的应用 |
| 1.1.3 D-乳酸的生产方法 |
| 1.1.4 D-乳酸商业生产状况 |
| 1.2 .D-乳酸生产菌种 |
| 1.2.1 细菌 |
| 1.2.2 酵母 |
| 1.2.3 蓝细菌和藻类 |
| 1.3 .D-乳酸的发酵生产原料 |
| 1.3.1 用于D-乳酸发酵生产的氮源 |
| 1.3.2 用于D-乳酸发酵生产的碳源 |
| 1.4 .D-乳酸发酵生产的研究进展 |
| 1.4.1 蓝细菌产D-乳酸的研究现状 |
| 1.4.2 高温产D-乳酸的研究进展 |
| 1.4.3 耐热细菌嗜热机制的研究现状况 |
| 1.5 .高通量结合DNA甲基化测序 |
| 1.5.1 细菌DNA甲基化 |
| 1.5.2 DNA甲基化测序 |
| 1.6 .本课题研究的目的和意义 |
| 第二章 一种组合策略提高光驱动的D-乳酸合成 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 主要仪器和试剂 |
| 2.2.2 菌株和生长条件 |
| 2.2.3 定点突变和质粒构建 |
| 2.2.4 转化方法 |
| 2.2.5 菌株产D-乳酸条件的优化 |
| 2.2.6 酶活测定 |
| 2.2.7 反转录PCR分析基因转录情况 |
| 2.2.8 胞内丙酮酸浓度的测定 |
| 2.2.9 胞内NADPH和 NADH浓度的测定 |
| 2.2.10 D-乳酸的测定 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 改变LdhD的辅酶特异性 |
| 2.3.2 产D-乳酸蓝藻工程菌株的构建 |
| 2.3.3 蓝藻工程菌株生产D-乳酸 |
| 2.3.4 通二氧化碳对蓝藻产D-乳酸的影响 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 构建耐热地衣芽孢杆菌高产光学纯D-乳酸 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 主要仪器和试剂 |
| 3.2.2 菌株、质粒和培养条件 |
| 3.2.3 基因克隆(合成),表达和纯化 |
| 3.2.4 酶学性质测定 |
| 3.2.5 粗酶液的制备及酶活测定 |
| 3.2.6 基因敲除载体的构建 |
| 3.2.7 菌株MW3的基因敲除 |
| 3.2.8 发酵条件的优化 |
| 3.2.9 廉价氮源的筛选 |
| 3.2.10 廉价发酵培养基的优化 |
| 3.2.11 分批发酵和补料发酵 |
| 3.2.12 产物的测定 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 筛选一独特的热稳定的D-乳酸脱氢酶 |
| 3.3.2 LdhTi的酶学性质鉴定 |
| 3.3.3 在B.licheniformis MW3 代谢网络中制造“陷阱” |
| 3.3.4 发酵条件的优化 |
| 3.3.5 分批和补料发酵 |
| 3.3.6 利用廉价有机氮源发酵生产D-乳酸 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 芽孢杆菌适应环境温度变化的Tm值转换研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 主要仪器和试剂 |
| 4.2.2 菌株和生长条件 |
| 4.2.3 实验设计和样品制备 |
| 4.2.4 差示扫描量热(DSC)测定 |
| 4.2.5 SMRT测序 |
| 4.2.6 甲基转移酶编码基因的mRNA水平定量 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 温度对细菌DNA的Tm值影响 |
| 4.3.2 SMRT测序分析 |
| 4.3.3 m6A和m4C的甲基化识别位点分析 |
| 4.3.4 DNA甲基转移酶的分析挖掘 |
| 4.4 本章小结 |
| 总结(创新点) |
| 工作展望 |
| 参考文献 |
| 附录1 基因合成的引物序列 |
| 附录2 标准曲线 |
| 致谢 |
| 攻读博士期间论文发表及专利 |
（5）盐渍环境中优势菌群分析及分离菌株Q1UT、Q1RT和BZ1T的多相分类研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 盐渍环境与盐渍环境中的微生物 |
| 1.1.1 盐渍环境 |
| 1.1.2 盐渍环境中的微生物 |
| 1.2 研究盐渍环境中微生物的意义 |
| 1.3 土壤中微生物多样性研究方法 |
| 1.3.1 传统平板计数法 |
| 1.3.2 基于生物化学技术研究土壤微生物多样性 |
| 1.3.3 基于分子技术研究土壤微生物多样性 |
| 1.4 微生物多相分类研究方法 |
| 1.4.1 传统分类法 |
| 1.4.2 数值分类法 |
| 1.4.3 化学分类法 |
| 1.4.4 分子分类法 |
| 1.5 盐单胞菌属、噬嘌呤菌属及芽胞杆菌属的分类学研究进展 |
| 1.5.1 盐单胞菌属 |
| 1.5.2 噬嘌呤菌属 |
| 1.5.3 芽胞杆菌属 |
| 1.6 本课题研究的目的和意义 |
| 第二章 盐渍环境中优势菌群分析 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 土样来源 |
| 2.1.2 实验仪器 |
| 2.1.3 实验试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 分离实验培养基配方 |
| 2.2.2 分离株的纯化和保藏 |
| 2.2.3 分离菌株 16S r RNA基因序列测定 |
| 2.3 实验结果与讨论 |
| 2.3.1 分离菌株 16S r RNA基因部分序列测定结果 |
| 2.3.2 盐渍环境中优势菌群分析 |
| 第三章 分离菌株Q1UT、Q1RT和BZ1T的多相分类研究 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 菌株来源 |
| 3.1.2 实验仪器 |
| 3.1.3 实验试剂 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 形态学研究 |
| 3.2.2 系统发育分析 |
| 3.2.3 化学分类 |
| 3.2.4 分子分类 |
| 3.2.5 生理生化特性研究 |
| 3.2.6 持家基因序列测定及系统发育分析 |
| 3.3 实验结果与讨论 |
| 3.3.1 形态学研究结果 |
| 3.3.2 系统发育分析 |
| 3.3.3 化学分类研究 |
| 3.3.4 分子分类研究 |
| 3.3.5 生理生化特性研究结果 |
| 3.3.6 持家基因序列测定及系统发育分析结果 |
| 3.4 小结 |
| 3.4.1 新种泥色盐单胞菌（Halomonas lutescens sp. nov.）的描述 |
| 3.4.2 新种微白噬嘌呤菌（Prolinoborus albatus sp. nov.）的描述 |
| 3.4.3 新种扁平芽胞杆菌（Bacillus depressus sp. nov.）的描述 |
| 第四章 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表论文与研究成果清单 |
| 致谢 |
（6）猪源肠外致病性大肠杆菌比较基因组学和亚单位疫苗的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 1 前言 |
| 1.1 大肠杆菌研究背景 |
| 1.2 大肠杆菌的群系分布和血清型分型 |
| 1.3 肠外致病性大肠杆菌的致病机制 |
| 1.3.1 大肠杆菌毒力因子 |
| 1.3.2 肠外致病性大肠杆菌在宿主体内的致病过程 |
| 1.3.3 关于肠外致病性大肠杆菌毒力的假说 |
| 1.4 基因组基本元件 |
| 1.4.1 基因岛 |
| 1.4.2 插入元件 |
| 1.4.3 间隔集簇短回文重复区域 |
| 1.4.4 假基因 |
| 1.5 大肠杆菌基因组特点 |
| 1.6 大肠杆菌的进化分析研究 |
| 1.7 不同宿主ExPEC之间的关系 |
| 1.8 大肠杆菌的质粒 |
| 1.8.1 肠外致病性大肠杆菌的毒力质粒 |
| 1.8.2 质粒的复制子类型 |
| 1.8.3 大肠杆菌质粒的系统进化 |
| 1.9 肠外致病性大肠杆菌疫苗的研究现状 |
| 1.10 大肠杆菌的外膜蛋白 |
| 1.11 基因的适应性进化分析 |
| 2 猪源肠外致病性大肠杆菌PCN033和PCN061菌株全基因组测序、注释及比较基因组学分析 |
| 2.1 研究目的与意义 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 菌株及来源 |
| 2.2.2 主要培养基 |
| 2.2.3 试剂,溶液和试剂盒 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 细菌基因组的提取 |
| 2.3.2 基因组序列的拼接和验证 |
| 2.3.3 基因组的注释与基本分析 |
| 2.3.4 进化分析 |
| 2.3.5 比较基因组学分析 |
| 2.3.6 生物学特性的分析 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1 PCN033和PCN061菌株基因组测序结果 |
| 2.4.2 PCN033和PCN061菌株基因组基本特点 |
| 2.4.3 基因组基本元件的分析 |
| 2.4.4 进化分析 |
| 2.4.5 PCN033和PCN061菌株比较基因组学和相应生物表型的鉴定分析 |
| 2.4.6 质粒分析 |
| 2.5 讨论 |
| 2.5.1 基因组测序,注释以及比较分析中应注意的问题 |
| 2.5.2 猪源ExPEC强毒株PCN033和弱毒株PCN061基因组和生物表型的比较分析 |
| 2.5.3 猪源ExPEC强毒株PCN033中毒力相关序列的分析和展望 |
| 2.6 结论 |
| 3 猪源肠外致病性大肠杆菌候选亚单位疫苗OmpC和OmpF的研究 |
| 3.1 研究目的与意义 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 菌株及其活化和培养、质粒 |
| 3.2.2 猪源肠外大肠杆菌ompC和ompF基因的扩增以及PCR产物的回收 |
| 3.2.3 连接pMD18-T载体进行测序 |
| 3.2.4 原核表达载体的构建 |
| 3.2.5 融合蛋白的诱导表达和纯化 |
| 3.2.6 Western-blot检测 |
| 3.2.7 小鼠免疫及攻毒实验 |
| 3.2.8 酶联免疫吸附实验ELISA检测抗体效价 |
| 3.2.9 调理吞噬实验 |
| 3.2.10 基因ompC和ompF的适应性进化分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 重组质粒PCR和酶切鉴定 |
| 3.3.2 重组蛋白的鉴定 |
| 3.3.3 重组蛋白特异性IgG抗体水平 |
| 3.3.4 小鼠感染实验 |
| 3.3.5 调理吞噬实验 |
| 3.3.6 基因ompC和ompF的重组和选择压力分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 结论 |
| 参考文献 |
| 附表 |
| 发表文章 |
| 致谢 |
（7）埃莎霉素产生菌的分子育种及其分类的初步鉴定（论文提纲范文）
| 第一部分 利用调节基因进行必特螺旋霉素单组分(埃莎霉素)产生菌的分子育种 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 1 必特螺旋霉素概述 |
| 2 基因工程育种抗生素产生菌研究进展 |
| 3 本论文研究目的和意义 |
| 4 论文研究内容和技术路线 |
| 实验材料 |
| 1. 生物信息学分析工具 |
| 2. 菌种 |
| 3. 基因和载体 |
| 4. 试剂与工具酶 |
| 5. 实验仪器 |
| 6. 培养基 |
| 7. 常用缓冲液 |
| 实验方法 |
| 1. E.coli质粒DNA小量提取 |
| 2. E.coli质粒DNA大量提取 |
| 3. 限制酶切反应 |
| 4. DNA电泳及片段回收 |
| 5. DNA连接反应 |
| 6. E.coli DH5α感受态细胞的制备 |
| 7. 质粒DNA转化E.coli DH5α感受态细胞 |
| 8. E.coli转化子的验证 |
| 9. 链霉菌原生质体的制备、再生及DNA转化原生质体 |
| 10. 链霉菌总DNA提取方法 |
| 11. 少量快速提取链霉菌总DNA |
| 12. PCR反应 |
| 13. 测序 |
| 14. 菌株筛选、发酵及发酵液的提取 |
| 15. 抗生素生物效价测定 |
| 16. 高效液相色谱分析 |
| 实验结果与讨论 |
| 1. 含ist-acyB2连锁基因重组质粒pSETl52-ia的构建 |
| 2. E.coli ET 12567/PUZ8002(pSET152-ia)阳性转化子的筛选和鉴定 |
| 3. acyB2基因整合型工程菌WSJ-IA的筛选和鉴定 |
| 4. WSJ-IA菌种发酵产生埃莎霉素Ⅰ组分的检测 |
| 5. WSJ-IA遗传稳定性实验 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第二部分 基因工程埃莎霉素Ⅰ产生菌以及出发菌株-螺旋霉素产生菌分类的初步鉴定 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 1. 必特螺旋霉素单组分-埃莎霉素Ⅰ概述 |
| 2. 放线菌分类学研究进展 |
| 3. 本论文的研究目的和意义 |
| 4. 论文的研究内容和技术路线 |
| 实验材料 |
| 1. 生物信息学分析工具 |
| 2. 菌种来源 |
| 3. 主要试剂 |
| 4. 主要仪器 |
| 5. 培养基 |
| 实验方法 |
| 1. 菌株的形态和培养特征观察 |
| 2. 菌株生理生化特征测定 |
| 3. 菌株细胞壁化学组成分析 |
| 4. 基于菌株16SrRNA基因序列的系统发育分析 |
| 5. 基于菌株看家基因蛋白序列的系统发育分析 |
| 实验结果与讨论 |
| 1. 菌株的形态和培养特征观察结果 |
| 2. 生理生化特征实验结果 |
| 3. 细胞壁化学成分分析 |
| 4. 基于菌株16S rRNA基因序列的系统发育分析 |
| 5. 基于菌株看家基因部分序列和蛋白序列的系统发育分析 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 英文缩略语 |
| 附录 |
| 致谢 |
（8）养殖鳗鲡致病性气单胞菌的分离与鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 养殖鱼类主要疾病的研究现状 |
| 1.1.1 细菌性疾病 |
| 1.1.2 寄生虫性疾病 |
| 1.1.3 病毒性疾病 |
| 1.1.4 真菌及其他类疾病 |
| 1.2 养殖鳗鲡细菌性疾病的研究现状 |
| 1.2.1 养殖鳗鲡主要细菌性疾病的研究现状 |
| 1.2.2 养殖鱼类气单胞菌病的研究现状 |
| 1.3 鱼类细菌性疾病检测技术的研究现状 |
| 1.3.1 生理生化鉴定技术 |
| 1.3.2 免疫学诊断技术 |
| 1.3.3 分子生物学鉴定技术 |
| 1.4 本研究的背景、意义和内容 |
| 1.4.1 研究背景 |
| 1.4.2 研究意义 |
| 1.4.3 研究内容 |
| 第2章 养殖鳗鲡病原菌的分离、初步鉴定及攻毒感染试验 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 病原菌的分离 |
| 2.1.3 分离菌的初步生化鉴定 |
| 2.1.4 分离菌的电镜观察 |
| 2.1.5 攻毒感染试验 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 细菌的分离结果 |
| 2.2.2 分离菌株的革兰氏染色和电镜观察结果 |
| 2.2.3 分离菌株的生化鉴定结果 |
| 2.2.4 攻毒试验结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 鱼类不同脏器中致病性气单胞菌的分布 |
| 2.3.2 细菌的分离和鉴定方法 |
| 2.3.3 分离菌株的攻毒试验 |
| 第3章 养殖鳗鲡致病性气单胞菌的 BIOLOG 系统鉴定 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 试验菌株 |
| 3.1.2 试验试剂 |
| 3.1.3 主要器材 |
| 3.1.4 实验方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 Biolog 鉴定系统应用于微生物检测的研究 |
| 3.3.2 致病性气单胞菌的 Biolog 鉴定指标分析 |
| 3.3.3 气单胞菌对水产动物的致病性 |
| 第4章 养殖鳗鲡致病性气单胞菌的分子生物学鉴定 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 试验菌株 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 实验方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 基因序列 PCR 扩增后电泳检测 |
| 4.2.2 基因序列比对与系统发育树构建 |
| 4.2.3 细菌不同基因的多样性与遗传距离 |
| 4.2.4 分离菌的基因序列分析鉴定与 Biolog 系统鉴定结果比较 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 基因序列分析作为细菌鉴定依据的可行性分析 |
| 4.3.2 不同功能基因应用于气单胞菌属菌株的鉴定 |
| 第5章 养殖鳗鲡致病性气单胞菌的药物敏感性试验 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 试验菌株 |
| 5.1.2 试验试剂 |
| 5.1.3 实验方法 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 致病性气单胞菌对药物的敏感性 |
| 5.2.2 不同气单胞菌对药物的敏感性差异 |
| 5.3 讨论 |
| 5.3.1 药敏试验结果的判断标准及其影响因素 |
| 5.3.2 气单胞菌的药敏试验研究 |
| 5.3.3 药敏试验应用于细菌的分类鉴定研究 |
| 第6章 总结与展望 |
| 6.1 主要成果与创新之处 |
| 6.1.1 主要成果 |
| 6.1.2 创新之处 |
| 6.2 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在学期间发表或撰写的学术论文 |
（9）猪产肠毒素型大肠杆菌F41受体基因的精细定位与鉴别（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 目录 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 大肠杆菌简介 |
| 1.2.1 大肠杆菌的特性及种类 |
| 1.2.2 大肠杆菌的抗原结构 |
| 1.2.3 大肠杆菌的肠毒素 |
| 1.2.4 大肠杆菌菌毛种类 |
| 1.2.5 大肠杆菌的受体 |
| 1.2.6 大肠杆菌的致病机理 |
| 1.2.7 猪大肠杆菌性疾病 |
| 1.2.8 仔猪大肠杆菌病的防治 |
| 1.2.9 大肠杆菌腹泻病的分子抗病育种的可行性 |
| 1.2.9.1 ETEC F4ac分子抗病育种 |
| 1.2.9.2 ETEC F18分子抗病育种 |
| 1.3 ETEC F41研究进展 |
| 1.3.1 ETEC F41流行病学 |
| 1.3.2 ETEC F41黏附素 |
| 1.3.3 ETEC F41受体特性 |
| 1.3.4 ETEC F41致病机理 |
| 1.3.5 ETEC F41受体遗传学研究 |
| 1.3.5.1 ETEC F41受体的全基因组连锁定位分析 |
| 1.3.5.2 ETEC F41受体位置候选基因研究进展 |
| 1.3.5.2.1 ST3GAL1基因研究进展 |
| 1.3.5.2.2 ZFAT基因研究进展 |
| 1.4 畜禽重要经济性状基因座的定位 |
| 1.4.1 畜禽QTL定位的基本方法 |
| 1.4.1.1 候选基因法 |
| 1.4.1.2 标记-QTL连锁分析法 |
| 1.4.1.3 QTL定位中所使用的模型和统计方法 |
| 1.4.2 畜禽QTL精细定位 |
| 1.4.2.1 增加标记密度 |
| 1.4.2.2 扩大群体规模 |
| 1.4.2.3 改变实验群体设计 |
| 1.4.3 提高QTL精细定位的新策略 |
| 1.4.3.1 传递不平衡检验(TDT)定位 |
| 1.4.3.2 后裔同源相同IBD定位 |
| 1.4.3.3 连锁不平衡-连锁(LDLA)定位 |
| 1.4.3.4 选择性清除效应分析精细定位QTL |
| 1.5 家畜重要经济性状基因定位的新策略-全基因组关联分析(GWAS) |
| 1.5.1 全基因组关联分析(GWAS)的基本原理 |
| 1.5.2 全基因组关联分析(GWAS)的应用 |
| 1.5.2.1 GWAS在家畜单基因性状位点定位中的应用 |
| 1.5.2.2 GWAS在家畜多基因控制的复杂性状位点定位中的应用 |
| 1.6 本研究的目的和意义 |
| 1.6.1 本研究的目的 |
| 1.6.2 本研究的意义 |
| 第二章 基于微卫星标记的猪4号染色体ETEC F41受体基因的精细定位 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 实验动物 |
| 2.2.2 黏附表型判定 |
| 2.2.2.1 实验菌株 |
| 2.2.2.2 刷状缘的提取 |
| 2.2.2.3 黏附实验 |
| 2.2.3 基于微卫星标记的ETEC F41受体基因精细定位 |
| 2.2.3.1 新增微卫星标记的选择 |
| 2.2.3.2 微卫星标记的基因型检测 |
| 2.2.4 总RNA的提取 |
| 2.2.5 位置候选基因的空肠组织表达谱分析 |
| 2.2.6 统计方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 ETEC F41黏附表型分布 |
| 2.3.2 微卫星标记基因型检测结果 |
| 2.3.3 SSC4上微卫星标记遗传图谱 |
| 2.3.4 ETEC F41受体基因精细定位结果 |
| 2.3.5 总RNA提取结果 |
| 2.3.6 六个位置候选基因的组织表达谱分析 |
| 2.4 分析与讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 利用全基因组高通量SNP标记精细定位ETEC F41受体基因 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 实验动物 |
| 3.2.2 全基因组芯片扫描 |
| 3.2.3 突变位点的基因分型 |
| 3.2.4 统计分析 |
| 3.2.4.1 全基因组关联分析 |
| 3.2.4.2 远缘群体中3个多态位点与ETEC F41黏附表型的关联性分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 ETEC F41黏附表型分布 |
| 3.3.2 ETEC F41受体基因全基因组关联分析结果 |
| 3.3.3 资源群体强关联位点在远缘群体中基因型检测结果 |
| 3.3.4 目的标记位点在远缘群体中与ETEC F41黏附表型的关联性 |
| 3.3.5 目的标记位点的连锁不平衡(LD)分析 |
| 3.4 分析与讨论 |
| 3.4.1 关于ETEC F41黏附表型在远缘群体中的分布 |
| 3.4.2 关于ETEC F41受体基因全基因组关联分析 |
| 3.4.3 关于远缘群体中3个目的标记与ETEC F41黏附表型的关联分析 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 位置候选基因ST3GAL1的分离及其与ETEC F41易感性的关联性研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 实验动物 |
| 4.2.2 ST3GAL1基因全长cDNA的分离 |
| 4.2.3 ST3GAL1基因多态位点的鉴别及基因分型 |
| 4.2.3.1 ST3GAL1基因多态位点的鉴别 |
| 4.2.3.2 ST3GAL1基因多态位点的基因分型 |
| 4.2.4 统计分析 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 ETECF41黏附表型分布 |
| 4.3.2 ST3GAL1基因全长cDNA |
| 4.3.3 ST3GAL1基因多态位点的鉴别 |
| 4.3.4 ST3GAL1基因多态位点的检测 |
| A和c.477C>T多态位点的检测结果'>4.3.4.1 c.284T>A和c.477C>T多态位点的检测结果 |
| G多态位点的检测结果'>4.3.4.2 c.661A>G多态位点的检测结果 |
| 4.3.5 统计分析结果 |
| 4.3.5.1 多态位点的连锁不平衡检测 |
| 4.3.5.2 多态位点与ETEC F41黏附表型的关联性分析 |
| 4.3.5.2.1 多态位点与资源群体ETEC F41黏附表型的关联性分析 |
| 4.3.5.2.2 ST3GAL1基因2个多态位点与远缘群体ETEC F41黏附表型的关联性分析 |
| 4.4 分析与讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 位置候选基因ZFAT的分离及其与ETEC F41易感性的关联性研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 实验动物 |
| 5.2.2 总RNA的提取 |
| 5.2.3 ZFAT基因全长cDNA的分离 |
| 5.2.4 ZFAT基因多态位点的鉴别及基因分型 |
| 5.2.4.1 ZFAT基因多态位点的鉴别 |
| 5.2.4.2 ZFAT基因多态位点的基因分型 |
| 5.2.5 统计分析 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 总RNA提取结果 |
| 5.3.2 ZFAT基因全长cDNA |
| 5.3.3 ZFAT基因多态位点的鉴别及多态性检测 |
| 5.3.3.1 ZFAT基因多态位点的鉴别 |
| 5.3.3.2 ZFAT基因多态位点的基因分型结果 |
| 5.3.4 统计分析结果 |
| 5.3.4.1 多态位点与ETEC F41黏附表型的关联性分析 |
| 5.3.4.2 多态位点的连锁不平衡检测 |
| 5.4 分析与讨论 |
| 5.4.1 猪ZFAT基因的生物信息学分析 |
| 5.4.2 ZFAT基因的多态位点与ETEC F41黏附表型的关联性分析 |
| 5.4.3 种群间的连锁不平衡分析 |
| 5.5 小结 |
| 全文总结与展望 |
| 参考文献 |
| 附录1 ST3GAL1基因组部分序列 |
| 附录2 ST3GAL1基因CDNA序列 |
| 附录3 ZFAT基因CDNA序列 |
| 附录4 博士研究生学习期间发表的论文情况 |
| 致谢 |
（10）产酶芽孢杆菌的筛选、鉴定及对肉鸡的微生态效应研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一部分 文献综述 |
| 引言 |
| 第一章 芽孢杆菌研究进展 |
| 1 芽孢杆菌的分类概况 |
| 1.1 芽孢杆菌的分类简史 |
| 1.2 现有的芽孢杆菌属 |
| 2 芽孢杆菌属 |
| 3 芽孢杆菌分类鉴定方法 |
| 3.1 芽孢杆菌分类鉴定的常用特征 |
| 3.2 表型分类鉴定方法 |
| 3.2.1 全细胞可溶蛋白电泳分析 |
| 3.2.2 全细胞脂肪酸分析 |
| 3.2.3 多位点酶电泳分析 |
| 3.2.4 数值分类鉴定方法 |
| 3.3 遗传学分类鉴定方法 |
| 3.3.1 DNA-DNA杂交技术和DNA的G+C mol%测定 |
| 3.3.2 保守基因序列分析 |
| 4 芽孢杆菌的资源利用 |
| 4.1 在食品加工和保鲜中的应用 |
| 4.2 在饲料添加剂和生物兽药上的应用 |
| 4.3 在医学上的应用 |
| 4.4 在植物病虫害生物防治中的应用 |
| 4.5 生物肥料 |
| 4.6 在工业生产中的应用 |
| 4.7 在环境保护上的应用 |
| 4.8 在基因工程和重组基因工程疫苗上的应用 |
| 第二章 饲用芽孢杆菌研究进展 |
| 1 绿色饲料添加剂 |
| 2 动物微生态制剂的发展历史 |
| 3 研制饲用微生态制剂的益生菌菌种 |
| 4 饲用芽孢杆菌的作用机理 |
| 4.1 芽孢杆菌在动物消化道的增殖 |
| 4.2 生物夺氧,有利于厌氧菌的生长 |
| 4.3 拮抗动物病原细菌,维持和调整肠道微生态平衡 |
| 4.4 产生多种酶类,提高动物消化酶活性 |
| 4.5 芽孢杆菌的营养作用,促进动物生长 |
| 4.6 促进动物器官的生理机能成熟,改善动物生产性能 |
| 4.7 增强机体的免疫功能,提高抗病能力 |
| 5 饲用芽孢杆菌制剂的使用效果 |
| 5.1 芽孢杆菌制剂在动物生产上的应用 |
| 5.1.1 在猪生产上使用效果 |
| 5.1.2 在家禽生产上的应用效果 |
| 5.1.3 在反刍动物生产上的应用效果 |
| 5.1.4 在水产养殖上的应用效果 |
| 5.2 芽孢杆菌与其它益生菌复合使用 |
| 6 影响芽孢杆菌作用效果的因素 |
| 6.1 饲用芽孢杆菌菌种和活性 |
| 6.2 动物的生理状况 |
| 6.3 饲料成分 |
| 6.4 使用的剂量和饲喂方式 |
| 第三章 动物肠道微生物菌群结构及多样性研究方法 |
| 1 荧光原位杂交技术 |
| 2 脉冲场凝胶电泳 |
| 3 核酸探针杂交法 |
| 4 基因芯片技术 |
| 5 基于16S rDNA序列同源分析 |
| 6 ERIC-PCR |
| 7 PCR-DGGE方法 |
| 8 实时荧光定量PCR |
| 第四章 研究的目的意义及研究方法 |
| 1 饲用芽孢杆菌有待研究的问题 |
| 2 本研究的目的意义及研究方法 |
| 第二部分 研究内容 |
| 第五章 产酶芽孢杆菌的筛选及鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 菌种 |
| 1.2 培养基 |
| 1.2.1 产酶芽孢杆菌筛选培养基 |
| 1.2.2 芽孢杆菌产酶发酵培养基 |
| 1.2.3 菌种鉴定用培养基及微量生化发酵管 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.3.1 酶活测定试剂 |
| 1.3.2 16S rDNA序列分析用试剂 |
| 1.4 主要仪器设备 |
| 1.5 产酶芽孢杆菌的筛选 |
| 1.5.1 产酶芽孢杆菌的初筛 |
| 1.5.2 产酶芽孢杆菌的复筛 |
| 1.6 高产酶活芽孢杆菌的初步鉴定 |
| 1.7 16S rDNA序列分析 |
| 1.7.1 菌株基因组DNA的提取 |
| 1.7.2 菌株16S rDNA的扩增 |
| 1.7.3 PCR产物检测及16S rDNA序列分析 |
| 1.8 数据统计 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 产酶芽孢杆菌的筛选 |
| 2.1.1 产纤维素酶活性芽孢杆菌的筛选 |
| 2.1.2 产淀粉酶活性芽孢杆菌筛选 |
| 2.1.3 产蛋白酶活性芽孢杆菌的筛选 |
| 2.1.4 高产酶活芽孢杆菌的筛选结果 |
| 2.2 高产酶活Pab02菌株的初步鉴定 |
| 2.3 芽孢杆菌16S rDNA PCR产物的检验 |
| 2.4 芽孢杆菌Pab02 16S rDNA测序结果 |
| 2.5 16S rDNA序列分析 |
| 3 讨论 |
| 3.1 产酶活性芽孢杆菌的筛选 |
| 3.1.1 产纤维素酶活性芽孢杆菌筛选 |
| 3.1.2 产淀粉酶活性芽孢杆菌筛选 |
| 3.1.3 产蛋白酶活性芽孢杆菌筛选 |
| 3.2 益生芽孢杆菌Pab02的鉴定 |
| 第六章 芽孢杆菌Pab02对雄性小鼠生殖安全性评价 |
| 1 材料及方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 芽孢杆菌Pab02制剂的制备 |
| 1.1.2 实验动物及基础日粮 |
| 1.1.3 主要试剂及配制 |
| 1.1.4 主要仪器和设备 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 动物分组及饲养管理 |
| 1.2.2 小鼠体重及生殖器官的测定 |
| 1.2.3 小鼠睾丸组织形态学分析 |
| 1.2.4 小鼠睾丸组织SOD活性和MDA水平测定 |
| 1.2.5 小鼠附睾中精子活率、畸形率和精子顶体酶活性的检测 |
| 1.2.6 小鼠血清睾酮水平的检测 |
| 1.2.7 数据统计 |
| 2 结果 |
| 2.1 芽孢杆菌Pab02对小鼠体重及睾丸和附睾重的影响 |
| 2.2 芽孢杆菌Pab02对小鼠睾丸组织结构的影响 |
| 2.3 芽孢杆菌Pab02对小鼠睾丸组织SOD活性和MDA水平的影响 |
| 2.4 芽孢杆菌Pab02对小鼠附睾中精子活率、畸形率和精子顶体酶活性的影响 |
| 2.5 芽孢杆菌Pab02对小鼠血清睾酮水平的影响 |
| 3 讨论 |
| 3.1 芽孢杆菌Pab02对小鼠生长和生殖器官发育的影响 |
| 3.2 芽孢杆菌Pab02对小鼠睾丸组织MDA水平和SOD活性的影响 |
| 3.3 芽孢杆菌Pab02对小鼠精子活率、精子畸形的影响 |
| 3.4 芽孢杆菌对小鼠血清睾酮的影响 |
| 第七章 肉鸡口服芽孢杆菌Pab02后肠道中芽孢杆菌数量的动态变化 |
| 1 材料 |
| 1.1 肉鸡 |
| 1.2 菌株 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 主要试剂 |
| 2 方法 |
| 2.1 引物和探针的设计 |
| 2.2 制备芽孢杆菌Pab02菌悬液 |
| 2.3 动物分组及饲养 |
| 2.4 纯培养细菌基因组DNA的提取 |
| 2.5 采集样品和提取肠道菌群的总DNA |
| 2.6 标准品的制备 |
| 2.7 RT-qPCR条件 |
| 2.8 枯草芽孢杆菌TaqMan探针RT-qPCR标准曲线的制作 |
| 2.9 TaqMan探针RT-qPCR对鸡肠道内芽孢杆菌的检测 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 常规PCR产物电泳检测结果 |
| 3.2 芽孢杆菌属常规PCR产物测序结果 |
| 3.3 RT-qPCR标准曲线的建立 |
| 3.4 RT-qPCR检测鸡肠道中芽孢杆菌的结果 |
| 3.4.1 对照组鸡肠道内芽孢杆菌数的检测 |
| 3.4.2 灌服芽孢杆菌Pab02后对鸡肠道中芽孢杆菌数量的检测 |
| 4 讨论 |
| 4.1 常规PCR产物测序与引物和探针的验证 |
| 4.2 肉鸡肠道中芽孢杆菌数量RT-qPCR检测方法的建立 |
| 4.3 肠道菌群总DNA的提取 |
| 4.4 肉鸡肠道中芽孢杆菌数量及口服芽孢杆菌Pab02后的变化规律 |
| 第八章 ERIC-PCR/PCR-DGGE分析肉鸡口服枯草芽孢杆菌Pab02后肠道菌群结构多样性的研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 主要仪器设备 |
| 1.2 主要试剂 |
| 2 方法 |
| 2.1 肠道菌群总DNA样品的处理 |
| 2.2 ERIC-PCR技术分析 |
| 2.2.1 ERIC-PCR的反应体系和反应条件 |
| 2.2.2 各肠道菌群总DNA的ERIC-PCR扩增 |
| 2.2.3 图谱分析 |
| 2.3 PCR-DGGE技术分析 |
| 2.3.1 肠道菌群的16S rRNA V_3区PCR扩增 |
| 2.3.2 菌群基因组总DNA 16S rDNA V_3区扩增DNA片段DGGE分析 |
| 2.3.3 肠道菌群的DGGE条带的多样性分析 |
| 2.3.4 割胶回收特征性条带并克隆测序 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 ERIC-PCR分析肉鸡肠道菌群结构的多样性结果 |
| 3.1.1 肉鸡肠道菌群ERIC-PCR指纹图谱 |
| 3.1.2 ERIC-PCR检测肉鸡肠道菌群多样性 |
| 3.2 PCR-DGGE分析肉鸡肠道菌群结构的多样性 |
| 3.2.1 肉鸡肠道菌群PCR-DGGE指纹图谱 |
| 3.2.2 PCR-DGGE检测肉鸡肠道菌群多样性 |
| 3.2.3 优势条带回收图谱 |
| 3.2.4 肠道优势条带克隆测序鉴定结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 肉鸡灌服芽孢杆菌Pab02后对肠道菌群结构多样性影响 |
| 4.2 ERIC-PCR和PCR-DGGE检测肉鸡肠道菌群结构的比较 |
| 第九章 芽孢杆菌Pab02制剂对肉鸡生长、肌肉品质、肠道菌群、消化酶活及免疫功能的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 肉鸡 |
| 1.1.2 枯草芽孢杆菌Pab02制剂 |
| 1.1.3 硫酸新霉素制剂 |
| 1.1.4 肠道菌群检测培养基 |
| 1.1.5 基础日粮 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 动物分组及饲养管理 |
| 1.2.2 增重及料重比的测定 |
| 1.2.3 胴体品质的测定 |
| 1.2.4 肌肉一般营养物质和氨基酸成份的测定 |
| 1.2.5 肌肉氨基酸营养价值的评定 |
| 1.2.6 肠道菌群的检测 |
| 1.2.7 肠道消化酶活的检测 |
| 1.2.8 免疫功能的检测 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 芽孢杆菌Pab02制剂对肉鸡增重和饲料转化率的影响 |
| 2.2 枯草芽孢杆菌Pab02制剂对肉鸡胴体品质的影响 |
| 2.3 枯草芽孢杆菌Pab02制剂对鸡肉品质的影响 |
| 2.4 肉鸡肌肉氨基酸营养价值评价 |
| 2.5 枯草芽孢杆菌Pab02制剂对肉鸡肠道菌群的影响 |
| 2.6 枯草芽孢杆菌Pab02制剂对肉鸡消化酶活性的影响 |
| 2.7 芽孢杆菌Pab02制剂对肉鸡免疫器官的影响 |
| 2.8 芽孢杆菌Pab02制剂对新城疫血凝抑制抗体效价的影响 |
| 2.9 枯草芽孢杆菌Pab02制剂对肉鸡血清免疫球蛋白水平的影响 |
| 3 讨论 |
| 3.1 芽孢杆菌Pab02制剂对肉鸡增重及饲料转化率的影响 |
| 3.2 枯草芽孢杆菌Pab02制剂对肉鸡胴体品质和肌肉品质的影响 |
| 3.3 芽孢杆菌Pab02制剂对肠道菌群的调节作用 |
| 3.4 芽孢杆菌Pab02制剂对肠道消化酶活性的影响 |
| 3.5 芽孢杆菌Pab02制剂对肉鸡免疫功能的影响 |
| 第三部分 结论及创新内容 |
| 1 结论 |
| 2 创新内容 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表文章情况 |
四、耐热AKP在高GC含量细菌染色体杂交方法中的应用（论文参考文献）
- [1]虹鳟源鲁氏耶尔森菌主要生物学特性及减毒活疫苗研究[D]. 王荻. 东北农业大学, 2021
- [2]沙门氏菌全基因组数据库构建及其分子靶标挖掘与应用研究[D]. 尚玉婷. 江南大学, 2021
- [3]拟态弧菌SCCF01株的全基因组解析及基因缺失株的构建与生物学特性的研究[D]. 余泽辉. 四川农业大学, 2018(02)
- [4]微生物发酵生产D-乳酸的研究[D]. 李超. 上海交通大学, 2016(02)
- [5]盐渍环境中优势菌群分析及分离菌株Q1UT、Q1RT和BZ1T的多相分类研究[D]. 魏雪新. 北京理工大学, 2016(11)
- [6]猪源肠外致病性大肠杆菌比较基因组学和亚单位疫苗的研究[D]. 刘璨颖. 华中农业大学, 2014(09)
- [7]埃莎霉素产生菌的分子育种及其分类的初步鉴定[D]. 戴剑漉. 北京协和医学院, 2014(01)
- [8]养殖鳗鲡致病性气单胞菌的分离与鉴定[D]. 杨求华. 集美大学, 2012(02)
- [9]猪产肠毒素型大肠杆菌F41受体基因的精细定位与鉴别[D]. 季华员. 江西农业大学, 2011(12)
- [10]产酶芽孢杆菌的筛选、鉴定及对肉鸡的微生态效应研究[D]. 潘康成. 四川农业大学, 2009(05)