一、基因工程在油菜遗传改良中的应用（论文文献综述）
范睿深[1]（2021）在《山桐子油脂合成相关基因的克隆及功能分析》文中进行了进一步梳理山桐子是十分重要的木本油料植物,其果实含油率高,亚油酸含量在60%以上具有“树上油库”的美称,在食品、保健品、医药、化工等方面拥有多种用途,具有很高的开发利用价值。选育优良品种,是开发利用山桐子的前提,然而由于缺乏山桐子果实油脂合成相关基因的理论研究及完善的遗传转化体系,严重制约了山桐子这一优良油料树种的良种选育。深入了解山桐子油脂合成相关基因的分子调控机理和功能,对山桐子果实资源的开发具有重要的意义,建立山桐子遗传转化体系有利于利用分子育种技术对山桐子进行遗传改良,还能为其他油料植物基因功能的研究提供借鉴。本研究以山桐子果实为试验材料,分析了不同发育时期山桐子果实的油脂含量及脂肪酸组分的动态变化,对山桐子油脂合成相关基因进行挖掘。在此基础上对油脂合成有关基因成功进行了克隆,从中选出与亚油酸合成有关的基因,通过表达分析验证其基因功能。为了进一步对山桐子进行遗传改良,以叶片为外植体,建立了山桐子遗传转化受体系统,取得以下结果:（1）揭示了山桐子果实不同发育时期油脂含量及脂肪酸组分的动态变化规律。在山桐子果实发育过程中,含油率逐渐增加呈“S”型增长模式,在80～90 DAP（days after pollination）有一个间歇期,在此时期果实颜色发生变化;亚油酸含量在脂肪酸组分中的比例逐渐减小,但其最终值仍在64%以上,在70 DAP和130 DAP时期,果实中的油脂含量,主要脂肪酸组分均差异显着。（2）通过转录组测序发掘油脂合成相关基因。从转录组中发掘出了33个与山桐子油脂合成有关的基因,其中有18个基因在70 DAP和130 DAP的表达量差异显着。其中,Ip ACCase、Ip KAS I、Ip KAS II、Ip SAD、Ip FAD2和Ip FAD3等6个基因是山桐子脂肪酸合成的关键基因;Ip GPAT和Ip DGAT2等2个基因是山桐子TAG合成的关键基因。（3）克隆获得了Ip SAD、Ip FAD2、Ip FAD3、Ip GPAT和Ip DGAT2等5个山桐子不饱和脂肪酸合成相关基因的全长序列。系统进化树结果显示,它们与毛果杨和胡杨的亲缘关系较近。预测蛋白的生物信息学分析推测,这5个功能基因在山桐子油酸、亚油酸及油脂合成过程中发挥着关键作用。（4）对亚油酸合成关键基因Ip FAD2和Ip DGAT2的功能进行了验证。原核表达载体的重组质粒在IPTG的诱导下可以正常表达出与预测蛋白大小基本一致且具有生物活性的蛋白;转化拟南芥表明,转Ip FAD2和转Ip DGAT2分别可以使拟南芥种子的亚油酸和油脂含量增加13.50～29.86%和27.70～39.09%;Ip FAD2和Ip DGAT2的表达量决定了山桐子果实中亚油酸含量及油脂含量。（5）建立了山桐子叶片愈伤组织遗传转化受体系统。愈伤组织诱导最适培养基:MS+蔗糖30 g/L+6-BA 1.0 mg/L+2,4-D 2.0 mg/L+琼脂6 g/L（p H=5.8）,诱导率为36.67%;愈伤组织继代最适培养基:MS+蔗糖30 g/L+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.5mg/L+琼脂6 g/L（p H=5.8）,愈伤组织增值系数为4.46;不定芽诱导最适培养基:MS+蔗糖30 g/L+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+TDZ 0.1 mg/L+琼脂6 g/L（p H=5.8）,不定芽诱导率为22.22%;不定芽复壮最适培养基:MS+蔗糖30 g/L+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L+TDZ 0.08 mg/L+琼脂6 g/L（p H=5.8）,增值系数为4.45。抗生素敏感性试验表明,Cef对愈伤组织致死的最大浓度为200 mg/L,Kan对愈伤组织致死的最小浓度为50 mg/L。
郭聚领[2]（2020）在《分子标记辅助选育甘蓝型油菜高油酸恢复系》文中提出油菜是我国第一大油料作物,约占我国自产食用植物油的50%以上。油酸（C18:1）是构成菜籽油的主要成分,其含量决定菜籽油的营养品质和经济价值。高油酸菜籽油具有较高的营养特性、食用品质及存储加工品质,在日常饮食、工业加工和医药领域都发挥重要作用,培育高油酸油菜已成为品质育种的重要目标之一。本研究以甘蓝型油菜自交系J-4008和L3为高油酸供体亲本,以甘蓝型油菜自交系6105R、ZY28和GCZS11为轮回亲本,采用传统回交育种与分子标记辅助选择育种（MAS）相结合的育种策略,选育出了综合农艺性状与轮回亲本6105R、ZY28和GCZS11相近的甘蓝型油菜高油酸恢复系。主要结果如下:1.基于5个甘蓝型油菜自交系J-4008、L3、6105R、ZY28和GCZS11的重测序数据开发出了与Bna A.FAD2.a基因紧密连锁的In Del标记FAD2-J-15、FAD2-J-38和FAD2-L-9、FAD2-L-2等,同时根据L3 Bna A.FAD2.a基因特异突变位点,开发出双等位基因检测标记L3-fad2a-1和L3-fad2A-1。其中L3-fad2a-1标记用于特异检测突变型基因Bna A.FAD2.a,L3-fad2A-1标记用于特异检测野生型基因Bna A.FAD2.A。本研究还根据高油酸供体亲本J-4008与轮回亲本Bna A.FAD2.A 478位C/T的差异,开发了一个KASP标记。2.分别以高油酸供体亲本J-4008和L3与轮回亲本构建了6105R×J-4008、ZY28×J-4008、GCZS11×J-4008和6105R×L3、ZY28×L3、GCZS11×L3六个组合的BC1F1、BC2F1、BC3F1、BC3F2世代群体。通过分子标记辅助选择,在以J-4008为供体的组合的BC3F2世代中,分别获得5株、4株和7株高油酸位点基因型纯合（Bna A.FAD2.a/Bna A.FAD2.a）的单株。在以L3为供体的组合的BC3F2世代中,分别获得6株、5株和4株高油酸含量位点基因型纯合（Bna A.FAD2.a/Bna A.FAD2.a）单株。3.利用气相色谱法检测24株中选单株自交种子和亲本种子的油酸含量并对其进行差异显着性分析。高油酸供体亲本种子的油酸含量为76.03%,轮回亲本种子的油酸含量在60.12%-64.58%之间,6份高油酸位点基因型杂合单株自交种的油酸含量在64.26%-68.42%之间,18份高油酸位点纯合单株自交种的油酸含量在66.14%-75.34%之间。通过差异显着性分析发现,中选单株自交种的油酸含量极显着高于轮回亲本的油酸含量。4.通过对各个组合BC3F2世代中高油酸位点纯合的单株产量相关性状（每角粒数、角果长和千粒重）进行考察并对其进行差异显着性分析,结果表明改良株系的主要产量性状与轮回亲本（6105R、ZY28和GCZS11）之间差异不显着。
王会,刘佳,付丽,梅德圣[3]（2013）在《基因工程技术在油菜油脂中的研究进展》文中研究指明油菜是中国最主要的油料作物,在人们的日常生活及工业生产中都占有重要地位。本研究综述了植物油脂合成的生物化学过程,介绍了目前通过基因工程技术提高油菜种子含油量的三个主要途径和取得的成效,以及基因工程技术在油菜油酸、芥酸及月桂酸等脂肪酸品质改良研究方面的最新进展,同时对基因工程技术在油菜油脂研究中的发展趋势进行了展望。
黄昌蓉[4]（2013）在《甘蓝型油菜早熟基因遗传转化体系的建立及转基因植株初步鉴定》文中研究表明早熟是油菜育种改良的目标性状之一。近年来,随着现代生物技术的飞速发展与成熟,农杆菌介导的转基因技术广泛地运用在油菜上,但转化效率受到众多因素的影响,因此建立和完善一套稳定高效的再生和遗传转化体系非常重要。本文以甘蓝型油菜品种‘浙双758’等为研究材料,探讨了油菜再生和遗传转化体系中的相关问题,并对转基因苗进行了初步的PCR鉴定,取得的主要研究结果如下：1.以子叶柄为外植体油菜再生体系的改进与完善。在本试验室研究基础上,进一步研究了切下子叶柄外植体时油菜的苗龄,常用外源激素的浓度及配比组合对子叶柄外植体再生频率的影响。试验结果表明,甘蓝型油菜不同品种的芽再生率和苗龄的关系走势大致相同,均随着时间的增加,苗龄越老,芽分化频率也随着快速下降,但下降的趋势和时间不完全相同。‘浙大619’最佳苗龄为播种后的第6天,此时再生率最高为65%,‘浙双758’和‘浙双72’最佳苗龄均为播种后第5天,芽的再生率分别为68%和65%。研究中还发现苗龄为10天时,三个品种的子叶外植体都基本不能再分化出再生芽,故用于再生的外植体不宜太老,应掌握好最佳的时间。在诱导愈伤的培养基上,2,4-D在低浓度范围下,诱导愈伤组织的能力随着2,4-D浓度的增加而增加,诱导的愈伤组织膨大呈绿色,致密；当2,4-D浓度超过一定范围后,愈伤组织的诱导率反而下降,并且诱导出的愈伤组织有的呈白色,在后续的再分化中不能正常分化出健康的再生芽；而本试验中采用低浓度的2,4-D和6-BA组合的预培养基,愈伤组织的分化情况好,分化的愈伤正常,愈伤的诱导率比2mg/L2,4-D的预培养基要高,根据实验结果,最佳预培养基为MS+1mg/L2,4-D+1mg/L6-BA。在再生植株生根上,添加一定浓度的NAA对再生植株根的再生有显着的促进作用。当NAA超过一定浓度后,促进作用下降,但未达到抑制水平,试验结果显示最佳的生根培养基为1/2MS+0.1mg/LNAA。Kan对再生植株的生根有一定的影响,会影响正常的生根,试验中应选择低浓度、且影响相对较小的Kan来筛选转化的植株。2、农杆菌介导的甘蓝型油菜子叶柄外植体遗传转化体系的建立。试验结果表明：同一种抗生素同一浓度对带有目的基因的农杆菌LBA4404和EHA105的抑制效果不同,并且抑制效果随着抗生素浓度的升高而增大；不同的抗生素对带有目的基因的农杆菌的抑制效果也不同。用农杆菌EHA105转导目的基因到油菜,发现用抗生素抑菌较困难,易发生农杆菌污染,而LBA4404则可用抗生素很好地抑制住。转化体系中选用农杆菌LBA4404介导,抗生素用500mg/L的特美汀。对于农杆菌侵染的时间和浓度的研究表明,油菜子叶柄外植体的褐化程度和污染率随着农杆菌侵染的菌液浓度和时间的增大而升高,高浓度或者长时间的菌液侵染子叶柄外植体,可能造成外植体全部褐化,并且在分化培养阶段500mg/L的特美汀控制不住农杆菌的生长,导致外植体全部污染褐化死亡。选择农杆菌LBA4404菌液浓度为OD600=0.2时,褐化程度轻,抗性芽率也较高,农杆菌也容易控制,不会发生爆长的情况,在农杆菌LBA4404的OD600值为0.2时试验中选择60s的侵染时间较好。在Kan的敏感性试验中,发现Kan对油菜子叶柄的再生有抑制作用,愈伤组织的诱导率随着Kan浓度的增大先下降后又上升,说明高浓度的Kan能促进子叶柄外植体愈伤组织的形成,但此时的愈伤是不正常的愈伤,愈伤组织色白坚硬,愈伤膨大到一定程度后生长势变弱,之后基本不能再进行正常绿色芽的分化,只能分化出一些白化、半白化和紫色的再生苗。综合各种因素,试验中宜选择含有15mg/L Kan的培养基进行转化和筛选。3、获得了农杆菌介导经过PCR初步鉴定为阳性的转基因植株。‘浙双758’子叶柄外植体愈伤组织经农杆菌侵染后进行抗性筛选及PCR验证获得的转基因植株。
孙丹丹[5]（2011）在《根癌农杆菌介导ipt基因转化甘蓝型油菜》文中进行了进一步梳理油菜不仅是我国,同时也是世界上重要的经济作物和主要的食用油来源,是仅次于大豆的重要植物油脂的来源,也是当今世界上发展最快的多用途作物之一。目前,我国的油菜栽培面积、产量虽均居世界首位,但其单产却远远低于德国、丹麦等欧洲高产国家。近几十年来,随着人口的不断增加,环境的急剧恶化及耕地的逐渐减少,人口与土地之间的矛盾也日益加剧。因此,培育出超高产油菜成为当下我国油菜生产最主要的研究任务。但是由于常规的遗传改良育种方法所需的时间较长,工作量大,天然突变体难以发现,诱变育种具有不确定性,并且发展潜力也相当有限等因素,所以人们已经开始寻求其它能突破常规育种障碍的新技术。随着分子生物学的不断发展和转基因技术的日趋成熟,利用基因工程技术获得期望的优良作物品种已成为现阶段遗传改良工作者首选的育种途径。细胞分裂素能促进营养物质的定向运输,在种子和果实的发育过程中能促进坐果,影响果实和种子中同化物的积累,此外还具有促进胚乳的发育,以及具有增大果体的功能。因此利用基因工程手段,调控内源细胞分裂素含量,为进一步提高油菜产量提供了新的方向。本实验利用ipt基因（细胞分裂素合成关键酶基因）与Napin（油菜种子储藏蛋白）基因的启动子融合构建的、在种子发育时期,特异表达的ipt基因植物双元表达载体,介导油菜遗传转化,使得ipt基因在油菜种子的发育时期特异性高效表达,以期增加油菜种子形成时期内源细胞分裂素的含量,从而提高营养物质向种子定向运输的效率,为提高油菜的灌浆速度,进一步培育出超高产油菜种质奠定基础。研究的主要内容和结果如下：1、甘蓝型油菜无菌苗培养体系的建立种子洗去表面浮土和残种后,75%酒精洗涤45s-lmin,无菌水洗2-3次,0.1%HgCl2浸泡10min,无菌水洗5-6次,浸泡5h后,接种于种子发芽培养基：MS培养基+3%蔗糖+0.7%琼脂,pH5.8,成苗率达100%,污染率为0（此处数据皆为以中双8号为实验材料时的数据）。2、以子叶和下胚轴为外植体的高频再生体系建立以苗龄4-7天的油菜子叶和下胚轴为外植体,接至分化培养基：MS+3mg/L 6-BA+0.02mg/L NAA+3%蔗糖+0.7%琼脂粉,pH5.8,可直接再生出芽,且再生频率达到100%；接至生根培养基：1/2MS+3%蔗糖+0.8%琼脂粉+0.2mg/LNAA,pH6.1,生根率亦达到100%。3、有效抑制子叶和下胚轴愈伤分化的筛选压浓度的确定将油菜无菌苗子叶和下胚轴分别接种到有不同PPT浓度的分化培养基中,并测试其对愈伤诱导所产生的抑制效果。结果发现,抑制油菜外植体愈伤分化的筛选压PPT浓度为15mg/L。4、根癌农杆菌介导的油菜遗传转化体系的建立油菜的最适转化条件：切取油菜无菌苗的带柄子叶,柄长0.1～0.2cm,下胚轴长约0.5cm,以OD600=0.3的农杆菌菌液感染子叶6～8min,下胚轴0.5～1min,暗培养3d后,用含500mg/LCef的MS液体培养基振荡脱菌,无菌水冲洗4-6次后,用无菌滤纸吸干其表面水分,然后接入延迟培养基上,延迟筛选6d后,转入分化筛选培养基上进行筛选,得到长约1-2cm左右的的芽时,将其切下接入生根培养基,待苗长至5-7cm且能正常生根时移栽,并对能够正常生根的抗性苗做进一步鉴定。5、转化植株组织化学检测及PCR检测剪取转化植株幼嫩部位的叶片,做GUS组织化学染色,43株抗性苗中,有18株的叶片,被染成蓝色,初步证明了外源基因已经插入到受体植物的基因组中；PCR检测结果显示,有11株扩增出与阳性对照相同的条带,进一步证明了外源基因已经成功整合至油菜基因组中。
田保明[6]（2010）在《基于RNAi技术的BnFAE1基因沉默及对甘蓝型油菜芥酸合成的影响》文中进行了进一步梳理芥酸是十字花科特有一种22碳超长链脂肪酸,广泛存在于十字花科芸薹属植物种子中。芥酸本身不仅不易被人体消化吸收、营养价值低,而且它在脂肪酸所占比例较大也直接制约其它有益的脂肪酸的含量。因此,低芥酸已成为国际上食用油的重要品质标准和遗传改良的重要目标。油菜中芥酸合成是在脂肪酸延长酶（FAE1）及其它酶的协同下,催化油酰-CoA以丙二酰辅酶A为碳源经过两个相继的缩合反应,先行合成C20：1△11,随后一步生成芥酸（C22：1△13）。其中,由FAE1基因编码的β-酮酯酰-CoA合酶催化第一步（缩合）反应,是芥酸合成中的关键酶。本实验依据依据植物RNA干扰的原理和研究中用于构建RNAi载体的基本经验,选择fae 1 （GenBanK:AY577313）基因的1147-440区间的序列（498bp）分别以反向和正向的形式插入到含有种子特异性表达的启动子和终止子的载体中,并在反向和正向插入的基因片段之间即间隔区导入一个来源于豌豆rbcS-3C intron（83bp）片段,然后通过转基因技术将正、反向重复序列整合到植物的基因组中,这样由反向重复序列转录形成的mRNA就会经互补配对导致发卡状RNA （hpRNA）的形成,由此形成的dsRNA诱导发生RNAi,进而诱发内源fael转录的mRNA发生降解。经农杆菌介导转化甘蓝型油菜Y015,获得19株阳性植株。半定量RT-PCR检测FAE1基因表达,fael基因的沉默效果均十分明显,FAE1表达下调62-98%。从T1、T3两代之间FAE1的沉默效应可以看出,RNAi介导的FAE1基因沉默效应可以在两代之间稳定遗传。进一步的脂肪酸检测分析,芥酸含量只相当于对照芥酸含量的0.5-41.62%,减少58.38-95.50%；C20脂肪酸也有了明显的降低趋势,减少51.19-89.51%,芥酸含量的降低与FAE1酶的抑制成明显的一致关系。与此同时,转基因植株的油酸、亚油酸等脂肪酸含量比对照相应均有显着增加,油酸含量增加11.44-36.23%、亚油酸含量增加54.90-104.62%、亚麻酸含量增加87.23-119.02%,芥酸含量的降低与油酸、亚油酸含量的升高成明显的负相关关系。软脂酸、硬脂酸含量较对照变化不大。
黄冰艳,张新友,高伟,苗利娟,李会勇,严玫,易明林[7]（2009）在《油料作物脂肪酸基因工程研究回顾与展望》文中进行了进一步梳理从脂肪酸生物合成关键酶的研究、遗传转化方法、植株再生及转化体筛选技术等方面概括了近年来主要油料作物脂肪酸基因工程研究新进展,并结合目前主要农作物转基因研究现状和商品化转基因作物的推广状况讨论了油料作物基因工程研究的发展前景。
霍蓉[8]（2009）在《HarpinXooc蛋白编码基因在转基因油菜后代中的遗传表达以及对农艺性状的影响》文中研究指明Harpins是一类由革兰氏阴性植物病原细菌产生的非寄主专化性激发子,可以激发烟草的过敏反应（Hypersensitive Response, HR）,诱导植物产生抗病性、抗虫性并可以促进植物生长。Harpins类激发子都具有相似的生化特征：富含甘氨酸（Gly）,不含半胱氨酸（Cys）,热稳定,对蛋白酶敏感。经Harpin蛋白处理,植物可以对真菌、细菌、害虫等多种病原物产生抗性。将编码Harpin蛋白的基因转入水稻、烟草、马铃薯等植物中,能提高转基因植株的抗病水平hrf2基因来源于水稻细条斑病菌Xanthomonas oryzae pv. oryzicola菌株RS105,该基因共414 bp,其产物HarpinXooc （HpaG）含138个氨基酸,分子量约为15.3KD。HarpinXooc蛋白具有与其他Harpins蛋白类似的特征和功能,能够诱导植物产生抗病性、抗虫性并促进植物生长。本研究旨在将编码Harpinxooc的基因hrf2转化油菜,以期获得抗病性提高和性状优良的转基因油菜,为新品系的培育奠定基础。本实验通过农杆菌介导法将含有hrf2基因的植物表达载体pCAMBIA1301∷hrf2介导转化甘蓝型油菜扬油4号,经GUS染色和PCR检测,共筛选了16株抗性再生植株（T0代）。自花授粉得到的种子在田间种植作为T1代, GUS组织化学染色分析结果表明：外源基因在后代中的分离情况符合孟德尔单基因3：1分离定律。对T1代GUS染色呈阳性的植株进行PCR检测、Southern blot检测、RT-PCR检测,结果证明,hrf2基因已整合到油菜基因组中并能在转录水平正常表达。株系T1-1中,外源基因的拷贝数为1。为了鉴定转基因植株的抗病性,对PCR阳性植株进行离体叶片抗菌核病实验结果表明：株系T1-1、T1-2、T1-3、T1-4、T1-5的病斑直径显着小于对照,最小的只有1.6 cm,与对照相比,减小32.4%。我们选择T1代中PCR结果呈阳性且抗病性提高的32棵植株自花授粉,收获的种子第二年在田间种植作为T2代。PCR结果表明,有78%的植株能扩增出约414 bp的特异性条带,经测序,与hrf2基因一致性为100%。离体叶片抗病性结果表明：32个株系中,62.5%的转基因株系病斑显着小于对照,其中45%的株系在0.01的水平病斑显着小于对照,抗病性显着提高。田间条件下,转基因植株的生长健康,发育正常,转基因植株的部分农艺性状发生变异,但T1、T2代植株的农艺性状表现稳定。转基因植株开花期延迟,与未转化植株相比,开花期均延迟约7～10天。多数转基因植株茎基部较粗,每荚粒数均少于对照,但是千粒重有所增加。T1、T2代中茎基部直径最大达到2.53及3.07 cm,分别比对照增加38.5%与61.5%。单株产量在两代中最大分别为96.11 g与94.75 g,比对照分别增重22.7%与12.2%。由此,我们认为,通过基因工程方法培育具有抗病性且农艺性状优良的油菜新品种是一种可行的有效地策略。
徐漫[9]（2009）在《外源基因清除技术（Gene-deletor）在转基因油菜中的应用研究》文中进行了进一步梳理近年来,全球转基因油菜大面积种植带来的环境安全性问题已成为人们关注的焦点。为解决转基因油菜花粉飘逸可能造成的安全性威胁,本论文以构建的外源基因清除表达载体遗传转化甘蓝型油菜（Brassica napus）, pBin 19-LF-LAT59-FLP-NOS-35S-GUS:NPTⅡ-NOS-35S-GFP-NOS-LF,该载体以番茄花粉特异启动子LAT59驱动重组酶FLP基因表达,以CaMV35S启动子分别驱动报告基因GUS、GFP以及筛选基因NPTⅡ表达。以pBin1935S-GUS:NPTⅡ-NOS载体为对照载体。探索外源基因清除技术在油菜转基因研究中的可行性,期望培育出花粉中无外源基因的转基因油菜,为转基因油菜育种打下基础。取得如下研究结果：（1）以甘蓝型油菜品种特选四号下胚轴和花柄为受体,采用农杆菌介导法进行油菜遗传转化。转化的pBin19-LAT59-FLP载体中,289个花柄切段获得抗卡那霉素（Km）抗性植株15株,935个下胚轴切段获得抗性植株75株,通过报告基因GUS分析及PCR检测鉴定,获得转基因油菜株系22株；转化的pBin19-35S-GUS载体中,获得10株抗性植株,但未鉴定出转基因植株。（2）以1%醋酸洋红对转基因植株、野生型植株和经组织培养获得的对照植株花粉进行染色。检测后发现花粉活力分别为95.45%、97.90%、98.79%,t检验结果表明：转基因植株花粉活力分别比组培植株花粉活力、野生型植株花粉活力低,差异达显着水平,而组培植株花粉活力与野生型植株花粉活力差异不显着。（3）在转基因植株花粉发育减数分裂期、四分体期、单核期、双核期、成熟期进行GUS染色,发现花粉减数分裂期、四分体期、单核期、双核期仍有GUS蛋白表达。在花粉成熟期,对10株转基因植株成熟花粉进行GUS染色,每株取10朵花,共29509粒花粉中没有观察到有蓝色花粉,证明外源基因已从花粉中完全清除,而不含有删除系统的转基因油菜花粉GUS组织化学染色是蓝色。（4）转基因植株外源基因清除效率分析,分别对转基因植株自交、转基因植株为母本与野生型植株为父本杂交、转基因植株为父本与野生型植株为母本杂交,收获种子后在培养皿中发芽,以幼芽进行GUS组织化学染色,结果表明,9个独立的转基因油菜株系花粉中外源基因清除效率为10.20%-100%,其中6个株系清除效率达到100%。本研究采用花粉特异启动子LAT59驱动重组酶基因FLP表达,首次证明外源基因清除系统可以在油菜花粉成熟期清除转基因油菜中的外源基因,最高清除效率达到100%,利用外源基因清除技术可以解决转基因油菜的环境安全性问题。
俞斌[10]（2009）在《不同来源甘蓝型油菜品系DH群体遗传变异研究及抗（耐）菌核病恢复系选育》文中研究说明油菜是我国重要的油料作物和经济作物,我国常年种植面积超过一亿亩,年产油菜籽达1100万吨,种植面积和产量均占世界的三分之一,是世界上最大的油菜种植国和生产国（Zhou and Fu,2007）。因此利用各种生物技术手段,对油菜的主要性状进行进行遗传改良,增强其产量、品质及抗病虫害等能力,提高育种水平,对于发展我国油菜生产具有重要意义。甘蓝型油菜是常异花授粉的多倍体作物,在通过不同常规选择方法所获得的品种（品系）内可能存在不同程度的遗传变异。油菜小孢子培养是20世纪80年代发展起来的一项重要的生物技术,通过小孢子培养可以迅速获得基因型纯合的材料,因此研究利用该技术对不同来源的甘蓝型油菜品种（系）进行小孢子培养所获得DH群体的遗传变异特点,对于进一步改良这些油菜品种具有重要指导意义。菌核病位居我国油菜三大病害之首,主要发生在油菜的主产区长江流域,一般年份能造成10%的产量损失,重病年份可以使油菜产量减少80%。多年来,国内外在该病害的发生和流行规律及预测预报等方面做了大量的研究工作,在药剂和农业栽培措施防治等方面取得了一定的成绩,但仍未从根本上改变油菜菌核病严重危害的局面,因此,选育和利用抗（耐）病品种,作为最经济有效的方式,越来越受到人们的重视。在本试验中,以三个不同来源的波里马恢复系ZS4R、7-5和P24为供体,构建了3个DH群体。以7-5和P24 DH群体,及雷伟侠构建的包含有144个DH系的650 DH群体为材料,考查主要的农艺性状和品质性状,来探索常规品种（系）小孢子培养后代的遗传变异规律,以期为育种选择及小孢子培养技术的进一步应用提供参考。并以ZS4R、7-5、P24和650 DH群体为材料,选择抗（耐）菌核病恢复系,以期直接应用于育种工作。主要结果如下:1.对ZS4R、7-5和P24进行了小孢子培养,得到了分别包含有101、356和421个DH系的3个DH群体。2.在7-5和P24 DH群体中,所有的农艺性状和品质性状都产生了较大的分离,可以从中选择性状更优的DH系用于育种。3.7-5、P24 DH群体与650 DH群体相比,农艺性状和品质性状的变异系数没有显着的差异。4.在7-5、P24和650 DH群体中,角果长度和硫甙含量都出现了偏分离的现象,说明小孢子培养过程存在配子选择机制。5.对ZS4R、7-5、P24和650 DH群体的苗期菌核病抗性考查发现,四个DH群体苗期菌核病抗性平均水平呈现偏分离,ZS4R、7-5和P24 DH群体平均抗性强于各自的供体亲本,650 DH群体平均抗性偏向于高抗亲本。6.对ZS4R、7-5、P24和650 DH群体进行抗（耐）菌核病恢复系的选育过程中,对苗期和成株期菌核病抗性进行了相关分析,发现苗期抗性和成株期抗性相关系数极低。7.经过3年的选择鉴定,并配合以分子标记技术鉴定DH系间的遗传距离,最终在ZS4R、7-5、P24和650 DH群体中选到了10个菌核病抗性显着增强的优良DH恢复系,并应用于育种工作。本研究结果表明,常规育种方法所获得的油菜品种（系）的小孢子培养后代存在着丰富的遗传变异,且对其进行进一步的选择是有效的。
二、基因工程在油菜遗传改良中的应用（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、基因工程在油菜遗传改良中的应用（论文提纲范文）
（1）山桐子油脂合成相关基因的克隆及功能分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.2 山桐子的研究进展 |
| 1.2.1 山桐子概述 |
| 1.2.2 国内外山桐子研究现状 |
| 1.3 植物油脂的生物合成 |
| 1.3.1 植物油脂的合成步骤 |
| 1.3.2 植物油脂合成相关基因的研究进展 |
| 1.4 植物功能基因的研究方法 |
| 1.4.1 基因测序技术 |
| 1.4.2 基因克隆技术 |
| 1.4.3 植物基因的功能验证 |
| 1.5 植物的遗传转化方法 |
| 1.6 本研究的目的意义与研究内容 |
| 1.6.1 目的意义 |
| 1.6.2 研究内容 |
| 1.7 技术路线 |
| 第二章 山桐子果实发育过程中油脂含量及脂肪酸组分的动态变化 |
| 2.1 试验材料与方法 |
| 2.1.1 试验材料 |
| 2.1.2 主要仪器和试剂 |
| 2.1.3 山桐子果实油脂的提取 |
| 2.1.4 山桐子果实脂肪酸组分的测量 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 山桐子果实的含油率 |
| 2.2.2 山桐子果实的脂肪酸组分 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 山桐子果实发育过程中油脂含量的动态变化 |
| 2.3.2 山桐子果实发育过程中酸组分的动态变化 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 山桐子果实转录组分析及油脂合成相关基因的挖掘 |
| 3.1 试验材料与方法 |
| 3.1.1 试验材料 |
| 3.1.2 主要仪器和试剂 |
| 3.1.3 山桐子果实RNA的提取及检测 |
| 3.1.4 cDNA文库构建及转录组测序 |
| 3.1.5 转录组数据的过滤及从头组装 |
| 3.1.6 Unigene的功能注释 |
| 3.1.7 Unigene的差异表达检测 |
| 3.1.8 差异表达Unigene的Pathway功能分析 |
| 3.1.9 q-PCR分析验证转录组测序准确性 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 RNA质量检测 |
| 3.2.2 转录组数据分析及组装 |
| 3.2.3 山桐子Unigene的功能注释 |
| 3.2.4 山桐子差异表达基因分析 |
| 3.2.5 山桐子差异表达基因的功能注释 |
| 3.2.6 参与山桐子油脂合成基因的鉴定 |
| 3.2.7 转录组测序的q-PCR验证 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 山桐子油脂的生物合成模型 |
| 3.3.2 参与山桐子脂肪酸合成的关键基因 |
| 3.3.3 参与山桐子TAG合成的关键基因 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 山桐子不饱和脂肪酸合成相关基因的克隆及表达分析 |
| 4.1 试验材料与方法 |
| 4.1.1 试验材料 |
| 4.1.2 主要仪器和试剂 |
| 4.1.3 引物设计 |
| 4.1.4 山桐子果实RNA的提取及检测 |
| 4.1.5 山桐子不饱和脂肪酸合成相关基因核心序列的克隆 |
| 4.1.6 山桐子不饱和脂肪酸合成相关基因全长序列的克隆 |
| 4.1.7 山桐子不饱和脂肪酸合成相关基因的生物信息学分析 |
| 4.1.8 山桐子不饱和脂肪酸合成相关基因的表达分析 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 山桐子不饱和脂肪酸合成相关基因的全长序列 |
| 4.2.2 山桐子不饱和脂肪酸合成相关基因的生物信息学分析 |
| 4.2.3 山桐子不饱和脂肪酸合成相关基因的表达分析 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 山桐子不饱和脂肪酸合成相关基因的基本信息 |
| 4.3.2 山桐子不饱和脂肪酸合成相关基因的表达模式 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 山桐子亚油酸合成关键基因Ip FAD2 和Ip DGAT2 的功能分析 |
| 5.1 试验材料与方法 |
| 5.1.1 试验材料 |
| 5.1.2 主要仪器和试剂 |
| 5.1.3 引物设计 |
| 5.1.4 山桐子Ip FAD2 和Ip DGAT2 基因表达载体的构建 |
| 5.1.5 山桐子Ip FAD2 和Ip DGAT2 基因的原核表达 |
| 5.1.6 山桐子Ip FAD2 和Ip DGAT2 基因的真核表达 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 山桐子Ip FAD2 和Ip DGAT2 基因的的原核表达 |
| 5.2.2 山桐子Ip FAD2 基因的的真核表达 |
| 5.2.3 山桐子Ip DGAT2基因的的真核表达 |
| 5.3 讨论 |
| 5.3.1 山桐子Ip FAD2 基因的功能验证 |
| 5.3.2 山桐子Ip DGAT2基因的功能验证 |
| 5.4 小结 |
| 第六章 山桐子遗传转化受体系统的建立 |
| 6.1 试验材料与方法 |
| 6.1.1 试验材料 |
| 6.1.2 主要仪器和试剂 |
| 6.1.3 叶片愈伤组织再生体系的建立 |
| 6.1.4 愈伤组织的抗生素敏感性试验 |
| 6.2 结果与分析 |
| 6.2.1 叶片的消毒与灭菌 |
| 6.2.2 愈伤组织的诱导 |
| 6.2.3 愈伤组织的继代 |
| 6.2.4 不定芽的诱导 |
| 6.2.5 不定芽的复壮 |
| 6.2.6 抗生素敏感性 |
| 6.3 讨论 |
| 6.3.1 山桐子叶片愈伤组织再生体系 |
| 6.3.2 山桐子叶片愈伤组织的抗生素敏感性 |
| 6.4 小结 |
| 第七章 结论 |
| 7.1 结论 |
| 7.2 创新点 |
| 7.3 问题与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（2）分子标记辅助选育甘蓝型油菜高油酸恢复系（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 1 前言 |
| 1.1 油菜脂肪酸生物合成及油酸含量的遗传基础 |
| 1.1.1 油菜脂肪酸的生物合成 |
| 1.1.2 油酸含量的遗传基础 |
| 1.2 油菜FAD2基因的研究进展 |
| 1.2.1 FAD2是控制油菜油酸含量的关键基因 |
| 1.2.2 甘蓝型油菜FAD2基因拷贝数及功能 |
| 1.3 油菜高油酸育种的主要方法 |
| 1.3.1 传统育种 |
| 1.3.2 诱变育种 |
| 1.3.3 基因工程育种 |
| 1.4 分子标记技术在作物遗传育种中的应用 |
| 1.4.1 分子标记辅助选择在作物遗传育种中的应用 |
| 1.4.2 甘蓝型油菜高油酸QTL定位 |
| 1.4.3 油酸分子标记的开发及应用 |
| 1.5 研究目的和意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.2 试验材料的种植与管理 |
| 2.3 技术路线 |
| 2.3.1 标记开发技术路线 |
| 2.3.2 回交育种技术路线 |
| 2.4 BnaA.FAD2.A基因等位基因特异引物及In Del连锁标记的设计 |
| 2.4.1 与BnaA.FAD2.A基因连锁的标记In Del标记设计 |
| 2.4.2 BnaA.FAD2.A等位基因特异引物设计 |
| 2.4.3 KASP标记开发 |
| 2.5 分子标记及分子标记辅助选择 |
| 2.5.1 前景选择分子标记 |
| 2.5.2 前景选择的目标 |
| 2.5.3 背景选择分子标记 |
| 2.5.4 背景选择的目标 |
| 2.6 试验方法 |
| 2.6.1 叶片DNA的提取 |
| 2.6.2 辅助选择标记PCR扩增 |
| 2.6.3 PCR产物的电泳检测 |
| 2.6.4 气相色谱法测定种子油酸含量 |
| 2.6.5 田间试验材料的自交与杂交 |
| 2.6.6 油酸表型考察 |
| 2.6.7 农艺性状考察 |
| 2.7 数据统计及分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 测序质量评估 |
| 3.2 BnaA.FAD2.A基因连锁标记和等位基因特异标记开发 |
| 3.2.1 与BnaA.FAD2.A基因连锁的In Del标记开发及验证 |
| 3.2.2 L3高油酸等位基因突变位点的确定及等位基因特异标记开发 |
| 3.2.3 J-4008 BnaA.FAD2.a KASP标记的开发 |
| 3.3 群体的前景选择和背景选择 |
| 3.3.1 BC_1F_1群体的分子标记辅助选择和自交种油酸含量分析 |
| 3.3.2 BC_2F_1群体的前景选择和自交种油酸含量分析 |
| 3.3.3 BC_3F_1群体的前景选择和背景选择 |
| 3.3.4 BC_3F_2群体前景选择 |
| 3.4 BC_3F_2油酸表型考察 |
| 3.5 BC_3F_2世代中选单株农艺性状考察 |
| 4 讨论 |
| 4.1 不同环境条件对甘蓝型油菜种子油酸含量的影响 |
| 4.2 不同类型前景选择标记选择效果的比较 |
| 4.3 不同类型分子标记在背景选择中的效果分析 |
| 4.4 不同转育材料油酸含量差异分析 |
| 4.5 分子标记辅助回交育种的策略 |
| 4.6 进一步工作设想 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录1 BnaA.FAD2.A连锁标记筛选全部引物信息 |
| 附录2 背景分析标记筛选全部引物信息 |
| 附录3 亲本序列分析亲缘关系分析 |
| 附录4 不同轮回亲本及其改良单株间种子油酸含量比较 |
| 致谢 |
（3）基因工程技术在油菜油脂中的研究进展（论文提纲范文）
| 0 引言 |
| 1 植物油脂的生物合成过程 |
| 2 利用基因工程技术提高油菜含油量 |
| 3 利用基因工程技术改良油菜油脂品质 |
| 4 展望 |
（4）甘蓝型油菜早熟基因遗传转化体系的建立及转基因植株初步鉴定（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 1 文献综述 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 油菜再生体系研究进展 |
| 1.2.1 外植体的选择对油菜再生体系的影响 |
| 1.2.2 基因型的差异对油菜再生体系的影响 |
| 1.2.3 培养基类型对油菜再生的影响 |
| 1.3 油菜遗传转化体系研究进展 |
| 1.3.1 油菜的遗传转化方法 |
| 1.3.1.1 生物介导的遗传转化方法 |
| 1.3.1.2 物理化学介质介导的遗传转化方法 |
| 1.3.2 外植体的预培养 |
| 1.3.3 农杆菌的侵染时间、浓度和共培养 |
| 1.3.4 抗生素的筛选浓度 |
| 1.4 油菜再生和遗传转化过程中遇到的问题及解决方法 |
| 1.4.1 外植体组织褐化 |
| 1.4.2 外植体组织玻璃化 |
| 1.5 转基因在油菜育种中的应用 |
| 1.5.1 抗除草剂 |
| 1.5.2 抗病虫害 |
| 1.5.3 提高品质、改变农艺性状及工业用途 |
| 1.5.4 育性与自交不亲和性的转变 |
| 1.6 转基因作物的安全问题 |
| 1.7 选题的目的意义 |
| 2 油菜子叶柄外植体高效再生体系的建立 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 试验材料 |
| 2.2.2 无菌外植体子叶柄的准备和接种 |
| 2.2.3 培养基 |
| 2.2.4 不同激素类型和浓度对子叶外植体的影响 |
| 2.2.5 油菜不同苗龄对子叶外植体再生的影响 |
| 2.2.6 不同浓度和配比的激素对油菜子叶愈伤组织诱导的影响 |
| 2.2.7 不同浓度NAA和Kan对油菜再生植株生根的影响 |
| 2.2.8 再生植株的生根和移栽 |
| 2.2.9 数据分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 不同激素类型和浓度对子叶不定芽的影响 |
| 2.3.2 油菜不同苗龄和品种对子叶不定芽分化的影响 |
| 2.3.3 不同浓度和配比的激素对油菜子叶柄愈伤组织诱导的影响 |
| 2.3.4 不同浓度NAA和Kan对油菜再生植株生根的影响 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 不同激素类型和浓度对子叶的影响 |
| 2.4.2 油菜不同苗龄和品种对子叶不定芽分化率的影响 |
| 2.4.3 不同浓度和配比的激素对油菜子叶柄愈伤组织诱导的影响 |
| 2.4.4 不同浓度NAA和Kan对油菜再生植株生根的影响 |
| 3 油菜子叶柄外植体遗传转化体系的建立 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 试验材料、菌种与质粒 |
| 3.2.2 试验试剂及培养基 |
| 3.2.3 含目的基因的农杆菌菌株的获得 |
| 3.2.3.1 EHA105和LBA4404感受态细胞的制备 |
| 3.2.3.2 质粒的转化 |
| 3.2.3.3 质粒DNA的小量提取 |
| 3.2.3.4 农杆菌阳性克隆的鉴定 |
| 3.2.3.5 保存鉴定后的阳性克隆 |
| 3.2.4 抑菌剂的抑菌效果比较 |
| 3.2.5 农杆菌侵染时间和浓度对油菜子叶柄的影响 |
| 3.2.6 卡那霉素本底抗性检测 |
| 3.2.7 转基因植株检测 |
| 3.2.7.1 再生植株DNA提取 |
| 3.2.7.2 转基因植株PCR检测 |
| 3.2.8 再生植株的生根、移栽和春化 |
| 3.2.9 数据分析 |
| 3.3 结果分析 |
| 3.3.1 目的基因的检测 |
| 3.3.1.1 大肠杆菌DH5α阳性克隆鉴定 |
| 3.3.1.2 农杆菌EHA105与LBA4404阳性克隆鉴定 |
| 3.3.2 抗生素的抑菌效果比较 |
| 3.3.3 农杆菌侵染时间和浓度对油菜子叶柄的影响 |
| 3.3.4 卡那霉素本底抗性检测 |
| 3.3.5 转基因植株的初步鉴定 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 抗生素的抑菌效果比较 |
| 3.4.2 农杆菌侵染时间和浓度对油菜子叶柄的影响 |
| 3.4.3 卡那霉素本底抗性检测 |
| 4 主要结论和展望 |
| 5 参考文献 |
（5）根癌农杆菌介导ipt基因转化甘蓝型油菜（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 文献综述 |
| 1.1 细胞分裂素研究概况 |
| 1.1.1 细胞分裂素的发现及其分布 |
| 1.1.2 细胞分裂素的分类 |
| 1.2 细胞分裂素的生理作用 |
| 1.2.1 细胞分裂素在植物生长过程中的作用 |
| 1.2.2 细胞分裂素在植株果实形成和种子发育中的主要生理功能 |
| 1.3 植物基因工程概况 |
| 1.4 油菜基因工程概况 |
| 1.4.1 基因工程在油菜品质改良方面的应用 |
| 1.4.2 基因工程在油菜抗性改良方面的应用 |
| 1.4.3 转基因油菜的安全性 |
| 1.5 ipt基因工程的研究概况 |
| 1.5.1 ipt基因简介 |
| 1.5.2 ipt基因工程和研究进展 |
| 1.6 本研究的研究背景、目的意义、主要内容和技术线路 |
| 1.6.1 研究背景和目的意义 |
| 1.6.2 研究的主要内容和技术路线 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 菌株和载体 |
| 2.1.3 培养基及培养土 |
| 2.2 实验仪器 |
| 2.3 实验试剂及主要试剂的配法 |
| 2.3.1 组织培养培养基及主要添加成分的配法 |
| 2.3.2 细菌培养培养基及常用抗生素的配法 |
| 2.3.3 GUS组织化学染色的相关试剂配法 |
| 2.3.4 质粒提取、DNA提取和分子检测时相关试剂及其配法 |
| 2.4 实验方法 |
| 2.4.1 无菌材料的准备 |
| 2.4.2 培养条件 |
| 2.4.3 子叶和下胚轴再生体系的建立及优化 |
| 2.4.4 重组质粒pCAMBIA3301-ipt转化农杆菌LBA4404的PCR验证 |
| 2.4.5 根癌农杆菌介导的遗传转化体系的建立 |
| 2.4.6 转化植株的生根与移栽 |
| 2.4.7 转基因植株的Gus组织化学检测 |
| 2.4.8 转基因植株的PCR检测 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 影响种子消毒的因素 |
| 3.1.1 种子预浸泡处理对升汞消毒效果的影响 |
| 3.1.2 最适消毒液和消毒时间的选择 |
| 3.2 子叶柄下胚轴芽再生过程中PPT浓度的确定 |
| 3.3 影响外植体分化率的因素 |
| 3.3.1 苗龄对甘蓝型油菜子叶柄和下胚轴分化的影响 |
| 3.3.2 不同激素配比对外植体再生率的影响 |
| 3.3.3 不同基因型子叶和下胚轴的分化再生能力比较 |
| 3.4 重组质粒pCAMBIA3301-ipt转化根癌农杆菌LBA4404的PCR验证 |
| 3.5 影响转化率的因素 |
| 3.5.1 不同的预培养时间对油菜子叶和下胚轴转化率的影响 |
| 3.5.2 共培养时间对遗传转化的影响 |
| 3.5.3 延迟培养时间对子叶和下胚轴遗传转化的影响 |
| 3.5.4 不同抗生素对抗性芽生根移栽生活率的影响 |
| 3.5.5 转基因植株获得及移栽 |
| 3.6 转化植株的Gus组织化学检测 |
| 3.7 转化植株的PCR检测 |
| 4 讨论与结论 |
| 4.1 讨论 |
| 4.1.1 外植体的选择及其预培养 |
| 4.1.2 农杆菌浸染及外植体的共培养 |
| 4.1.3 农杆菌介导遗传转化过程中，培养基中外加AgNO_3的作用 |
| 4.1.4 延迟培养时间 |
| 4.1.5 抗生素的选择 |
| 4.2 结论 |
| 参考文献 |
| 附录一 主要英文缩写词表 |
| 附录二 植物表达载体pCAMBIA3301质粒图谱 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
| 在校期间发表论文 |
（6）基于RNAi技术的BnFAE1基因沉默及对甘蓝型油菜芥酸合成的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1 植物脂肪酸的生物合成途径 |
| 1.1 脂肪酸的种类 |
| 1.2 植物脂肪酸生物合成途径 |
| 2 芥酸的生物合成与遗传 |
| 2.1 芥酸的作用 |
| 2.2 芥酸含量的遗传 |
| 2.3 芥酸的生物合成 |
| 3 芥酸的生物合成与基因调控 |
| 3.1 脂肪酸延长基因(FAE1) |
| 3.2 芥酸生物合成的基因工程 |
| 3.2.1 低芥酸油菜的基因工程 |
| 3.2.2 高芥酸油菜的基因工程 |
| 4 RNAI研究背景及其应用 |
| 4.1 RNAi的发现 |
| 4.2 RNAi的产生机制 |
| 4.3 RNAi在植物中的应用 |
| 4.3.1 RNAi在植物功能基因组研究中的应用 |
| 4.3.2 RNAi在植物品质改良中的应用 |
| 4.3.3 降低作物中有害物质的含量 |
| 4.3.4 RNAi在提高植物抗病性的应用 |
| 5 研究的目的意义、原理、主要内容和技术路线 |
| 5.1. 研究的目的、意义 |
| 5.2 技术原理 |
| 5.3 技术路线 |
| 第二章 甘蓝型油菜FAE1 RNAI表达载体的构建 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 主要仪器设备与生产厂家 |
| 1.2 质粒与菌株 |
| 1.3 分子生物学试剂及Kit |
| 1.4 生化试剂 |
| 1.5 主要试剂配制 |
| 1.6 PCR引物 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 油菜总DNA提取 |
| 2.2 pUC19.RBi、pCAMBIA1301、pUC19.RBi1质粒DNA的提取 |
| 2.3 组成fae1 RNA干扰体5个片段的序列来源、结构设计 |
| 2.3.1 启动子 |
| 2.3.2 干扰体茎体(Stem)部分 |
| 2.3.3 环体(Loop) |
| 2.3.4 终止子caMV3'UTR(polyA signal) |
| 2.4 组成fae1 RNA干扰体5个片段的克隆 |
| 2.4.1 Napin pro、fae1-1、fae1-2三个片段的PCR扩增 |
| 2.4.2 rbcs-3C intron片段扩增 |
| 2.4.3 caMV 3' UTR片段扩增 |
| 2.5 PCR产物检测 |
| 2.6 PCR产物的胶回收纯化 |
| 2.7 PCR产物胶回收片段与T-载体的连接 |
| 2.8 连接产物的细菌转化 |
| 2.9 筛选后PCR鉴定 |
| 2.10 重组质粒测序 |
| 2.11 fae1 RNAi克隆载体构建 |
| 2.11.1 中间载体pUC19.BNp、pUC19.3C的构建 |
| 2.11.2 pUC19.BNp质粒的建立 |
| 2.11.3 pUC19.3C质粒的建立 |
| 2.11.4 油菜fae1 RNAi体各片段的组装 |
| 2.12 fae1 RNAi植物表达载体的构建 |
| 2.13 农杆菌感受态细胞的制备 |
| 2.14 pCAMBIA3301-fae1i向农杆菌的导入 |
| 2.15 以pCAMBIA3301-fae1i质粒转化农杆菌的PCR验证 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 fae1 RNAi载体5个组成片段的克隆及序列测定结果 |
| 3.2 fae1 RNAi干扰载体的测序验证 |
| 3.3 fae1 RNAi载体的构建结果 |
| 3.3.1 fae1-1.3C.fae1-2重组体的鉴定 |
| 3.3.2 Pro.BNp.CaMV 3' UTR重组体的鉴定 |
| 3.4 油菜fae1 RNAi载体的鉴定 |
| 3.5 油菜fae1 RNAi植物表达载体的鉴定 |
| 3.6 以pCAMBIA3301-fae1i质粒转化农杆菌的PCR验证结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 转录形成mRNA发卡结构,形成dsRNA诱导产生RNAi |
| 4.2 关于对fae1-1、fae1-2两个干扰片段的克隆途径 |
| 4.3 关于fae1 RNA干扰体启动子的选择 |
| 4.4 构建hpRNA高效表达载体是RNAi技术应用的关键 |
| 第三章 根癌农杆菌介导FAE1 RNAI转化甘蓝型油菜 |
| 1. 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 主要仪器设备 |
| 1.1.2 供试材料 |
| 1.1.3 菌株及质粒 |
| 1.1.4 培养基 |
| 1.1.5 试剂 |
| 1.1.6 酶 |
| 1.1.7 PCR引物 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 初始材料的获得 |
| 1.2.2 培养条件 |
| 1.2.3 苗龄对油菜子叶柄分化的影响实验 |
| 1.2.4 PPT选择剂浓度的确定 |
| 1.2.5 油菜的遗传转化 |
| 1.2.6 抗性植株的检测 |
| 2. 结果 |
| 2.1 PPT选择剂浓度的确定 |
| 2.2 延迟筛选时间对子叶柄遗传转化的影响 |
| 2.3 不同基因型对转化频率的影响 |
| 2.4 fae1 RNAi转基因油菜GUS组织化学染色检测 |
| 3. 讨论 |
| 3.1 关于影响农杆菌介导油菜子叶柄遗传转化的因素探讨 |
| 3.2 试管苗移栽成活是植物组织培养的一个重要环节 |
| 第四章 RNAI对FAE1的基因沉默效果及芥酸合成的影响分析 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 植物材料 |
| 1.2 主要仪器设备与生产厂家 |
| 1.3 菌株和载体 |
| 1.4 实验试剂配制 |
| 1.4.1 DNA和质粒提取及电泳检测的相关试剂 |
| 1.4.2 Southern blot相关试剂 |
| 1.4.3 RNA的提取半定量RT-PCR相关试剂 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 基因组DNA质量及浓度检测 |
| 2.1.1 琼脂糖凝胶电泳鉴定油菜叶片基因组DNA |
| 2.1.2 油菜叶片总DNA定量分析 |
| 2.2 PCR检测转基因油菜 |
| 2.2.1 引物设计 |
| 2.2.2 PCR体系的建立 |
| 2.3 Southern blot |
| 2.3.1 酶切和凝胶电泳 |
| 2.3.2 标记探针的制备 |
| 2.3.3 转膜 |
| 2.3.4 杂交 |
| 2.3.5 洗膜、信号检测 |
| 2.4 基因表达半定量RT-PCR分析 |
| 2.4.1 油菜幼嫩种子RNA的提取 |
| 2.4.2 普通琼脂糖凝胶电泳鉴定油菜幼嫩种子总RNA的质量 |
| 2.4.3 RNA样品中残留的DNA的消化 |
| 2.4.4 普通琼脂糖凝胶电泳鉴定DNaseI消化后油菜幼嫩种子总RNA |
| 2.4.5 紫外分光光度计测定DNase I消化后总RNA的质量与浓度 |
| 2.4.6 基因表达分析 |
| 2.5 转基因植株的遗传 |
| 2.6 脂肪酸组成的检测 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 抗性植株PCR扩增电泳检测 |
| 3.2 Southern Blot结果分析 |
| 3.2.1 DNA限制性内切酶酶切效果检验 |
| 3.2.2 探针的制备 |
| 3.2.3 Southern Blot分析 |
| 3.3 FAE1基因的表达分析 |
| 3.3.1 RNA的提取 |
| 3.3.2 PCR模板量的确定和指数增长期的确定 |
| 3.3.3 fae1基因在幼嫩种子中的表达分析 |
| 3.4 脂肪酸组成分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 报告基因的选择 |
| 4.2 关于GUS检测与PCR扩增检测结果存在出入的因素探讨 |
| 4.3 关于RNAi对fae1基因沉默效果及对芥酸形成的影响分析 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录1 博士研究生期间发表的论文 |
| 附录2 DNA MARKER和载体图谱 |
| 附录3 植物表达载体PCAMBIA3301-FAE1I质粒图谱 |
| 附录4 FAE1 RNA干扰体构建流程图 |
| 附录5 NAPIN基因启动子测序彩图 |
| 附录6 油菜转化体系流程及成苗图片 |
（7）油料作物脂肪酸基因工程研究回顾与展望（论文提纲范文）
| 1 脂肪酸生物合成途径及关键酶基因 |
| 2 遗传转化方法、植株再生及转化体筛选技术 |
| 3 基因工程在油料作物脂肪酸改良中的应用 |
| 3.1 提高含油量 |
| 3.2 改善营养价值 |
| 3.2.1 提高油酸/亚油酸比值 |
| 3.2.2 高γ-亚麻酸 |
| 3.2.3 合成长链多不饱和脂肪酸 |
| 3.3 提高在食品工业中的利用价值 |
| 4 前景展望 |
| 4.1 挖掘新的功能基因, 拓宽可用基因资源 |
| 4.2 多基因转化和删除标记基因 |
（8）HarpinXooc蛋白编码基因在转基因油菜后代中的遗传表达以及对农艺性状的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 上篇 文献综述 |
| 第一章 转基因油菜抗病育种研究进展 |
| 1.基因转化与油菜抗病 |
| 1.1 基因转化与抗真菌病害 |
| 1.2 基因转化与抗病毒病害 |
| 2.油菜转化方法 |
| 2.1 农杆菌介导法 |
| 2.2 基因枪法 |
| 2.3 激光微束穿刺法 |
| 2.4 电击法 |
| 2.5 PEG介导法 |
| 2.6 显微注射法 |
| 2.7 真空渗入法 |
| 2.8 Floral-dip法 |
| 2.9 花粉介导法 |
| 3.油菜转化筛选标记方法 |
| 3.1 传统标记基因 |
| 3.2 新型标记基因 |
| 3.3 无标记转基因技术 |
| 4.转基因植物后代中外源基因的遗传表达分析 |
| 4.1 转基因油菜后代中目标性状的遗传与表达 |
| 4.2 影响目标性状稳定遗传表达的因素 |
| 5.外源基因对非目标农艺性状的影响及原因分析 |
| 5.1 外源基因对非目标性状的影响 |
| 5.2 外源基因对非目标性状产生影响的原因 |
| 6.转基因研究中存在的问题与展望 |
| 6.1 提高外源基因的转化率,建立高频再生系统 |
| 6.2 转基因油菜的安全性问题 |
| 第二章 Harpin的分子遗传学基础与生物学效应 |
| 1.Harpin的遗传学特征 |
| 1.1 植物病原细菌的致病岛与hrp基因簇 |
| 1.2 Harpin的分子特征 |
| 2.Harpin在植物上的作用及其作用机理 |
| 2.1 Harpin在植物上的作用 |
| 2.2 Harpin在植物上的作用机理 |
| 2.3 Harpin在植物细胞上的作用位点 |
| 3.hrf2的分子特征 |
| 4.结语 |
| 下篇 研究内容 |
| 第一章 转基因油菜的产生和鉴定 |
| 1.材料和方法 |
| 2.结果和分析 |
| 2.1 质粒转化农杆菌后的验证 |
| 2.2 不同培养条件对抗性芽再生频率的影响 |
| 2.3 抗性再生油菜植株的获得 |
| 2.4 再生植株的PCR检测 |
| 2.5 再生植株的GUS活性检测 |
| 3.讨论 |
| 第二章 转基因油菜植株T_1代的选育鉴定与农艺性状分析 |
| 1.材料和方法 |
| 2.结果与分析 |
| 2.1 转基因植株的生长情况 |
| 2.2 外源基因在T_1代植株的遗传分离情况 |
| 2.3 转基因植株的PCR检测 |
| 2.4 转基因植株的Southern Blot检测与RT-PCR分析 |
| 2.5 转基因植株的抗病性检测 |
| 2.6 转基因植株的生长发育与农艺性状调查 |
| 3.讨论 |
| 第三章 转基因油菜植株T2代的选育、鉴定与农艺性状分析 |
| 1.材料与方法 |
| 2.结果与分析 |
| 2.1 T_2代转基因植株的生长情况 |
| 2.2 T_2代转基因植株的PCR检测结果 |
| 2.3 T_2代转基因植株的抗病性检测结果 |
| 2.4 T_2代转基因植株的农艺性状调查 |
| 3.讨论 |
| 参考文献 |
| 缩略语 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表的论文 |
（9）外源基因清除技术（Gene-deletor）在转基因油菜中的应用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一部分 文献综述 |
| 1.转基因油菜的研究进展 |
| 1.1 油菜遗传转化方法 |
| 1.1.1 农杆菌介导法 |
| 1.1.2 基因枪法 |
| 1.1.3 PEG法 |
| 1.1.4 激光微束穿刺法 |
| 1.1.5 花粉管通道法 |
| 1.1.6 in planta转化法 |
| 1.2 油菜遗传转化受体 |
| 1.2.1 下胚轴、子叶受体 |
| 1.2.2 花药受体 |
| 1.2.3 小孢子、茎段受体 |
| 1.3 油菜遗传转化基因 |
| 1.3.1 油酸脱饱和酶基因 |
| 1.3.2 抗虫基因 |
| 1.3.3 抗病基因 |
| 1.3.4 雄性不育基因 |
| 1.4 油菜选择标记基因 |
| 1.4.1 抗抗生素基因 |
| 1.4.2 抗除草剂基因 |
| 1.4.3 绿色荧光蛋白 |
| 2.转基因作物与环境安全性 |
| 2.1 国内外转基因作物现状 |
| 2.2 转基因作物环境安全性问题 |
| 2.2.1 "杂草化"问题 |
| 2.2.2 影响生物多样性 |
| 2.2.3 花粉飘逸问题 |
| 3. 位点特异性重组酶系统 |
| 3.1 Cre/lox重组系统 |
| 3.2 R/RS重组系统 |
| 3.3 FLP/FRT重组系统 |
| 3.4 Lox/FRT重组系统 |
| 4.本文研究的目的及意义 |
| 第二部分 农杆菌介导法遗传转化油菜及转基因植株外源基因清除效率分析 |
| 前言 |
| 1.材料方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 下胚轴 |
| 1.1.2 花柄 |
| 1.2 主要试剂及配方 |
| 1.3 菌株与质粒 |
| 1.3.1 感受态细胞的制备 |
| 1.3.2 感受态细胞的转化 |
| 1.3.3 重组质粒PCR验证 |
| 1.4 花粉生活力检测 |
| 1.5 花粉GUS组织化学检测 |
| 1.6 转基因植株花粉外源基因清除效率检测 |
| 1.7 遗传转化方法 |
| 1.8 再生植株检测 |
| 1.8.1 GUS组织化学染色 |
| 1.8.2 CTAB法小量提取油菜基因组DNA |
| 1.8.3 PCR分子检测 |
| 1.8.4 Southern印迹杂交 |
| 1.8.4.1 油菜基因组DNA提取、酶切及电泳 |
| 1.8.4.2 地高辛标记探针的制备 |
| 1.8.4.3 Southern印迹 |
| 1.8.4.4 预杂交和杂交 |
| 1.8.4.5 洗膜 |
| 1.8.4.6 检测杂交信号 |
| 2.结果分析 |
| 2.1 重组质粒PCR验证 |
| 2.2 转基因植株的获得 |
| 2.2.1 再生植株的抗性筛选 |
| 2.2.2 GUS组织化学检测 |
| 2.2.3 PCR分子鉴定 |
| 2.2.4 Southern印迹杂交检测 |
| 2.3 转基因油菜植株移栽及性状观察 |
| 2.4 花粉生活力检测 |
| 2.5 花粉GUS组织化学检测 |
| 2.6 转基因植株花粉外源基因清除效率分析 |
| 3.讨论 |
| 4.展望 |
| 参考文献 |
| 缩略词 |
| 致谢 |
| 附录 |
（10）不同来源甘蓝型油菜品系DH群体遗传变异研究及抗（耐）菌核病恢复系选育（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 1 文献综述 |
| 1.1 现代生物技术在油菜遗传改良中的应用 |
| 1.1.1 植物组织培养技术 |
| 1.1.1.1 单倍体培养技术 |
| 1.1.1.2 胚挽救与原生质体融合 |
| 1.1.2 转基因技术 |
| 1.1.2.1 品质性状改良 |
| 1.1.2.2 抗除草剂 |
| 1.1.2.3 抗病虫害 |
| 1.1.2.4 抗非生物逆境 |
| 1.1.2.5 雄性不育 |
| 1.1.2.6 生长发育 |
| 1.1.2.7 生产工业原料 |
| 1.1.3 分子标记技术 |
| 1.1.3.1 遗传图谱的构建和基因定位 |
| 1.1.3.2 DNA指纹图谱和种质资源分析 |
| 1.1.3.3 分子标记辅助选择 |
| 1.2 小孢子培养技术在油菜遗传改良中的应用 |
| 1.2.1 油菜小孢子培养的影响因素 |
| 1.2.1.1 供体植株的基因型的影响 |
| 1.2.1.2 小孢子发育时期的影响 |
| 1.2.1.3 供体植株的生长条件及生理状态 |
| 1.2.1.4 培养基组成的影响 |
| 1.2.2 小孢子培养在油菜遗传改良中的应用 |
| 1.2.2.1 纯化与选育品种、自交系,缩短育种周期 |
| 1.2.2.2 克服远缘杂种不育性与分离,创建新种质 |
| 1.2.2.3 利用DH群体进行遗传分析和基因定位 |
| 1.2.2.4 小孢子培养为诱变育种提供了新途径 |
| 1.2.2.5 小孢子是基因转化良好的受体 |
| 1.3 油菜菌核病及抗病遗传育种研究进展 |
| 1.3.1 核盘菌的生物习性及其对油菜生产的危害 |
| 1.3.2 抗源的筛选 |
| 1.3.2.1 抗病鉴定方法 |
| 1.3.2.1.1 菌丝体接种鉴定 |
| 1.3.2.1.2 子囊孢子接种法 |
| 1.3.2.1.3 草酸鉴定法 |
| 1.3.2.1.4 田间病圃和自然发病 |
| 1.3.2.2 抗源的筛选 |
| 1.3.2.3 无花瓣育种 |
| 1.3.3 抗病性的遗传特性及分子生物学研究 |
| 1.3.4 抗病新种质的创建 |
| 1.3.4.1 远缘杂交 |
| 1.3.4.2 诱变育种 |
| 1.3.4.3 转基因 |
| 2 本研究的目的与意义 |
| 3 不同来源甘蓝型油菜品系DH群体遗传变异研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 小孢子的分离与培养 |
| 3.1.2.1 培养基 |
| 3.1.2.2 小孢子的分离与培养 |
| 3.1.2.3 胚状体的培养和植株再生继代 |
| 3.1.2.4 再生苗田间移栽 |
| 3.1.2.5 倍性调查与收获 |
| 3.1.2.6 DH系的田间种植 |
| 3.1.3 农艺性状的考查 |
| 3.1.4 品质性状的考查 |
| 3.1.5 数据分析 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 小孢子培养及DH群体的获得 |
| 3.2.2 DH群体农艺性状分析 |
| 3.2.2.1 DH群体农艺性状的遗传变异 |
| 3.2.2.2 DH群体农艺性状相关性分析 |
| 3.2.3 DH群体品质性状分析 |
| 3.2.3.1 DH群体品质性状的遗传变异 |
| 3.2.3.2 DH群体品质性状相关性分析 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 小孢子培养可有效用于自交系改良 |
| 3.3.2 自交系与杂交F_1小孢子培养后代变异系数无显着差异 |
| 3.3.3 甘蓝型油菜小孢子培养过程存在配子选择机制 |
| 3.3.4 性状的相关分析 |
| 4 抗(耐)菌核病恢复系的选育 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 抗(耐)菌核病DH恢复系选育路线 |
| 4.1.3 抗耐菌核病性鉴定 |
| 4.1.3.1 土豆培养基配制(PDA) |
| 4.1.3.2 核盘菌的培养 |
| 4.1.3.3 离体叶菌丝块接种 |
| 4.1.3.4 成株期菌丝块接种 |
| 4.1.4 农艺性状的考查 |
| 4.1.5 品质性状的考查 |
| 4.1.6 DH系遗传距离的评价 |
| 4.1.6.1 DNA的提取 |
| 4.1.6.2 SSR分析 |
| 4.1.6.3 AFLP分析 |
| 4.1.6.3.1 总DNA的酶切与连接 |
| 4.1.6.3.2 预扩增 |
| 4.1.6.3.3 选择性扩增 |
| 4.1.6.3.4 扩增产物的PAGE胶检测 |
| 4.1.6.4 数据记载及统计分析 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 小孢子培养及DH群体的获得 |
| 4.2.2 DH群体苗期抗性鉴定及筛选 |
| 4.2.2.1 DH群体苗期抗性的遗传变异 |
| 4.2.2.2 各DH群体苗期抗(耐)菌核病性分布 |
| 4.2.3 DH系的进一步筛选 |
| 4.2.4 抗(耐)菌核病DH系的获得 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 小孢子培养可有效用于菌核病抗性改良 |
| 4.3.2 DH群体苗期菌核病抗性呈偏分离 |
| 4.3.3 苗期和成株期抗性不相关 |
| 4.3.4 抗病性需多年鉴定 |
| 4.3.5 菌核病抗性育种仍依靠表型选择 |
| 4.3.6 油菜抗(耐)菌核病研究存在的问题与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录1 B5和NLN培养基配方(g/L) |
| 附录2 DNA提取所需相关试剂的配制方法 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
四、基因工程在油菜遗传改良中的应用（论文参考文献）
- [1]山桐子油脂合成相关基因的克隆及功能分析[D]. 范睿深. 西北农林科技大学, 2021(01)
- [2]分子标记辅助选育甘蓝型油菜高油酸恢复系[D]. 郭聚领. 华中农业大学, 2020(05)
- [3]基因工程技术在油菜油脂中的研究进展[J]. 王会,刘佳,付丽,梅德圣. 中国农学通报, 2013(24)
- [4]甘蓝型油菜早熟基因遗传转化体系的建立及转基因植株初步鉴定[D]. 黄昌蓉. 浙江大学, 2013(02)
- [5]根癌农杆菌介导ipt基因转化甘蓝型油菜[D]. 孙丹丹. 郑州大学, 2011(04)
- [6]基于RNAi技术的BnFAE1基因沉默及对甘蓝型油菜芥酸合成的影响[D]. 田保明. 华中农业大学, 2010(06)
- [7]油料作物脂肪酸基因工程研究回顾与展望[J]. 黄冰艳,张新友,高伟,苗利娟,李会勇,严玫,易明林. 河南农业科学, 2009(09)
- [8]HarpinXooc蛋白编码基因在转基因油菜后代中的遗传表达以及对农艺性状的影响[D]. 霍蓉. 南京农业大学, 2009(S1)
- [9]外源基因清除技术（Gene-deletor）在转基因油菜中的应用研究[D]. 徐漫. 贵州大学, 2009(S1)
- [10]不同来源甘蓝型油菜品系DH群体遗传变异研究及抗（耐）菌核病恢复系选育[D]. 俞斌. 华中农业大学, 2009(07)