一、以HBc颗粒为呈现载体的HBV多表位复合基因真核表达载体的构建(论文文献综述)
孙振文[1](2020)在《CHO细胞源口蹄疫多表位疫苗的初步研究》文中提出中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary cell,CHO)作为哺乳动物细胞真核表达系统,不仅能重组蛋白的天然结构,而且最大化保证了重组蛋白的生物学和免疫学功能,已广泛用于生产医用药物、细胞因子和单抗等生物制剂。由于生产成本高,还没有广泛用于生产兽用疫苗抗原及其生物制剂,也没有用于口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)重组抗原的生产。目前口蹄疫(Foot-and-mouth diseas,FMD)重组亚单位疫苗重组抗原的生产大多采用原核表达系统,并不能保证其抗原天然结构和生物学功能。因此,开发可高水平分泌表达具有天然结构的FMDV抗原的基因工程细胞系显得尤为重要,也是未来疫苗研究的发展趋势。为此,本研究以O型FMDV抗原表位为材料,CHO细胞为研究对象,利用CRISPR/Cas9介导的同源重组技术为手段,构建组成型高水平分泌FMDV抗原的基因工程细胞系,为规模化生产具有天然结构和功能的FMDV重组抗原提供生产用基因工程CHO细胞系。首先,利用信息学技术预测、筛选能提高CHO细胞分泌表达O型FMDV抗原表位(OME1)的信号肽,设计信号肽-(OME1)融合基因,构建不同信号肽-OME1的pCI-neo重组真核表达质粒,转染CHO细胞筛选能提供目的蛋白分泌表达的信号肽。WB结果显示,有9种信号肽促进OME1融合基因在CHO细胞内实现了分泌表达,其中SCGB1D1 isoform信号肽-OME1的重组蛋白量最高,是一种适合CHO细胞分泌表达FMDV重组抗原的信号肽。其次,以SCGB1D1 isoform信号肽和重新串联的O型FMDV抗原表位(OME2)为元件,能自组装病毒样颗粒(VLPs)的HBcAg为骨架,设计SCGB1D1 isoform-HBcAg-OME2融合基因,构建携带SCGB1D1 isoform-HBcAg-OME2融合基因的供体质粒,利用CRISPR/Cas9介导的同源重组技术将携带SCGB1D1 isoform-HBcAgOME2的融合基因整合到CHO细胞染色体的HPRT次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶基因和8号染色体端粒区,构建携带SCGB1D1 isoform-HBc Ag-OME2融合基因的基因工程CHO细胞。经抗性压力筛选300个CHO细胞岛,并对其进行了扩增培养,免疫荧光显微镜观察到克隆的CHO细胞有大量的绿色荧光,并对其进行鉴定,Junction PCR从克隆的CHO细胞基因组中检测到了SCGB1D1isoform-HBc Ag-OME融合基因,提示基因成功整合进CHO,WB结果显示,CHO细胞培养液中含有能与抗his-tag抗体和O型FMDV阳性血清发生免疫反应的蛋白质成分,再次证实,融合基因整合成功,而且以组成型分泌表达。充分说明本研究成功构建了能以组成型分泌表达FMD重组抗原的基因工程CHO细胞系。总之,本研究不仅筛选到了一种能够促进CHO细胞高效分泌表达FMDV抗原表位重组蛋白的信号肽,而且成功构建了能以组成型分泌表达FMD重组抗原的基因工程CHO细胞系,这将为利用该细胞系规模化生产具有天然结构,保证其生物学和免疫学功能的FMD疫苗重组抗原提供了物质基础和新线索。
李正军[2](2018)在《基于乙肝核心抗原病毒样颗粒及其衍生物颗粒性质的纯化和应用过程设计》文中研究指明病毒样颗粒(Virus like particles,VLP)是多个蛋白质亚基组装而成的纳米颗粒,有望发展成为各种疫苗抗原、佐剂或药物载体,是近年来生物制药工程领域的热点之一。本文以乙肝核心抗原病毒样颗粒(Hepatitis B core antigen virus-like particles,HBc-VLP)为研究对象,在已有的蛋白质研究方法之上,对其进行颗粒学研究,建立了适合其批量制备的纯化工艺,探索了其作为疫苗抗原和药物载体的应用。主要研究结果如下:(1)分析了 HBc-VLP颗粒表面结构性质,利用其表面强疏水性的特点,建立了基于疏水层析的批量制备HBc-VLP的技术。以疏水层析纯化为核心,以60℃加热30min预处理为前级分离,以凝胶过滤层析为后级精制,从发酵培养后破菌上清液中分离纯化HBc-VLP,总收率41.92%,纯度大于99%,是迄今为止文献上报道的全套HBc-VLP分离纯化工艺。先后进行6批次发酵液的层析纯化,产品收率和纯度重现性良好。(2)根据结构同源性模拟计算了 HBc-VLP与三种衍生物颗粒表面疏水值的差异,优化了疏水层析条件,采用(1)中建立的HBc-VLP纯化工艺,成功地从发酵后细胞破碎上清液中纯化出高纯度的M2e-HBc、NP-HBc和OVA-HBc。其中,三种衍生物M2e-HBc、NP-HBc和OVA-HBc均以HBc-VLP为骨架,分别通过基因融合的方式插入了流感病毒基质蛋白M2e、流感病毒核蛋白NP和模型抗原卵清蛋白OVA三种抗原表位。(3)从颗粒变化的角度对纯化工艺中的前处理步骤进行了考察,发现当加热处理菌体破碎液沉淀宿主蛋白时,HBc-VLP在高于70℃处理后颗粒尺寸和分子量都有增加,而低于70℃处理就没有这种现象发生。仔细分析发现,HBc-VLP具有热敏可逆膨胀性,温度升高,亚基与亚基间孔道扩张,颗粒尺寸增大;但温度恢复常温后,尺寸也能复原。但是当温度大于70℃后,孔道扩张足够大,使得细胞破碎上清液中大量杂质蛋白能够通过孔道,而VLP是中空的颗粒,进入颗粒内部的杂质蛋白在颗粒内部积累,并在热处理后仍然驻留在颗粒内部,导致VLP尺寸增加和分子量增大。(4)建立了两步加热预处理的策略。第一步在60℃加热30min以沉淀去除菌体破碎上中大部分杂质蛋白,第二步升高到70℃加热30 min进一步沉淀残留的杂蛋白。两步加热的策略有效避免了一次升高到70℃出现的大量杂质进入颗粒的问题,HBc-VLP收率达到85.8%,纯度74.7%。耦合一步疏水层析精制使纯度达到99.0%,整个工艺收率77.7%。新工艺用于HBc-VLP的衍生物的纯化亦获得成功,M2e-HBc、NP-HBc和OVA-HBc的纯度都达到97%以上,收率均在50%以上。(5)根据上面HBc-VLP在高温下颗粒尺寸膨胀、亚基之间孔道加大的发现,设计了高温装载抗原的应用过程。将纯化后的M2e-HBc(表面融合流感基质蛋白M2e)作为流感疫苗的候选,通过加热法使流感病毒核蛋白抗原表位多肽(NP)进入到M2e-HBc颗粒中,构建了一种表面、内部都具有抗原的流感疫苗。免疫小鼠后,ELISA法检测针对M2e/NP的抗体,抗体水平较对照组有明显提升;A/FM/1/47(H1N1)流感病毒进行攻毒实验,内外双抗原流感疫苗保护率能够达到100%。(6)将加热装载法拓展到装载抗癌药物的应用上,以纯化的HBc-VLP为抗癌药物阿霉素(DOX)的载体,通过70℃加热90 min实现每个HBc-VLP分子装载4248个DOX,优于传统方法的装载效率。利用HBc-VLP多对二硫键对谷胱甘肽敏感的特性,实现阿霉素在肿瘤细胞内的控释。HBc-VLP表面化学修饰RGD靶向肽,达到特异性靶向的目的,取得了比传统给药更好的抑瘤效果。
单文俊[3](2018)在《基于乙肝病毒核心蛋白病毒样颗粒的诊断治疗一体化探针研究》文中研究说明随着纳米技术的不断发展,一系列新兴的纳米诊疗技术为癌症治疗提供了新的思路和希望。以病毒样颗粒为基础的纳米材料具有优异生物相容性、生物降解性及灵活的可修饰性等特点,在癌症的诊疗一体化研究上发挥着巨大作用。鉴于发展以病毒样颗粒为核心的新型诊疗一体化探针具有重要的可应用和临床转化意义,我们在本论文中研究设计了多种以乙肝病毒核心蛋白病毒样颗粒为基础的新型纳米材料,并着重探究了各种材料在肿瘤诊疗一体化中的应用。主要内容概括如下:为了提高化疗药物的治疗效果,我们设计研究了以乙肝病毒核心蛋白病毒样颗粒为核心的用于肿瘤化疗的纳米药物载体系统。通过基因工程技术将几种外源多肽(包括亲脂性多肽NS5A,组氨酸标签和肿瘤靶向肽RGD)插入到乙肝病毒核心蛋白(Hepatitis B virus core,HBc)的C-末端和主要免疫区域(Major immunodominant loop region,MIR)中,以此来构建具有肿瘤靶向的纳米药物载体。我们的研究表明,所构建的RGD-HBc-NS5A蛋白分子仍具有自组装特性,可形成单分散纳米颗粒(33.6±3.5nm)。我们还将阿霉素(DOX)通过疏水作用装载到RGD-HBc-NS5AVLPs的颗粒内部。RGD-HBc-NS5AVLPs可以通过与U87MG肿瘤细胞表面过表达的整合素ΑvΒ3相互作用而特异地靶向肿瘤细胞。RGD-HBc-NS5A/DOX VLPs在荷瘤小鼠模型中展现出显着肿瘤生长抑制作用(肿瘤抑制率为90.7%),并且明显降低由DOX带来的心脏毒性。为了开发用于肿瘤诊断与治疗的纳米药物,我们设计并合成了以HBc VLPs为核心的用于肿瘤诊断与治疗一体化的纳米靶向诊疗剂。我们将肿瘤靶向肽RGD成功展示在病毒样颗粒表面,并通过颗粒解聚-再组装过程将吲哚菁绿(ICG)装载到RGD-HBc VLPs内部。构建的RGD-HBc/ICG VLPs形貌均一,分散性良好。RGD-HBcVLPs作为载体可显着提高ICG的稳定性,延长其在体内的长循环时间,提高细胞摄取效率,并有效递送ICG至肿瘤部位。联合荧光与光声成像技术,RGD-HBc/ICG VLPs可以作为有效的诊断探针,简便快捷地获得肿瘤位置及血管等详细信息。RGD-HBc/ICG VLPs具有优异的光热与光动力效果,可以显着抑制肿瘤生长。为了提高肿瘤抗原的免疫原性,我们以HBc VLPs作为抗原载体,成功将模式抗原肽OVA257-264展示在病毒样颗粒上,通过电镜确定了 OVA-HBc蛋白分子能够形成直径为34.3 ±1.6 nm的单分散球形颗粒,形貌均一。体外免疫实验表明,OVA-HBcVLPs能够显着诱导BMDC(骨髓源树突状细胞)的成熟。体内实验表明,OVA-HBcVLPs经皮下免疫,可以在小鼠引流区淋巴结富集,能够有效诱导OT-I细胞的增殖并可刺激其分泌大量的IFN-γ。OVA-HBc VLPs经皮下免疫Naive C57BL/6小鼠能够诱导机体生产抗原特异性CD8+ T淋巴细胞,产生较强的细胞毒T淋巴细胞反应。小鼠肿瘤预防实验结果表明,OVA-HBc VLPs作为有效的肿瘤疫苗,可显着延缓肿瘤生长,提高小鼠肿瘤浸润淋巴细胞中的抗原特异性CD8+T细胞数量。
王国强[4](2018)在《O型口蹄疫病病毒多表位免疫原和表位嵌合病毒样颗粒研制及其免疫原性评价》文中研究表明口蹄疫(Foot-and-mouth disease,FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)引起的一种感染偶蹄类动物的急性、烈性、传染性病毒疾病,感染包括牛,猪,羊家畜和其它许多野生动物物种。如果一个正常无口蹄疫的国家暴发和流行口蹄疫,感染动物的生产力将严重下降,甚至被扑杀,同时由于疫区封锁和动物产品贸易的限制,将会个该国家带来巨大的经济损失和负面的政治影响。目前防止口蹄疫传播的控制措施主要包括限制动物的活动,屠宰患病动物和与患病动物密切接触病的动物,以及在一些流行地区定期对动物进行大规模疫苗接种。对发达国家来说,上述三个措施基本都可以做到,但对那些经济实力差、技术落后的发展中国家,完全扑杀感染动物和密切接触动物是不现实的,疫苗免疫仍然是这些国家控制和预防口蹄疫发生的主要手段。我国根据实际国情,目前实行积极预防,国家强制免疫为主,一旦发现口蹄疫,立即采取扑杀相结合的综合防控策略。灭活疫苗是当前我国和世界上使用最广泛的疫苗,在控制和净化口蹄疫方面发挥了重大作用。但是,灭活疫苗在实际生产和使用过程中有很多限制性因素。例如,在培养口蹄疫病毒时,病毒逃逸生产现场和灭活不彻底等安全风险;疫苗可能含痕量的口蹄疫病毒非结构蛋白,造成无法区别动物免疫和病毒感染;灭活疫苗热稳定性差,在运输和贮藏整个过程需要低温;灭活疫苗可以预防口蹄疫发生,但是一旦爆发,不能从感染动物中清除体内存在的病毒。为解决灭活疫苗的这些缺点,目前许多努力致力于开发新型疫苗,安全高效的表位疫苗就成了候选疫苗之一。本研究选择O型口蹄疫结构蛋白VP1上两个B细胞表位和一个T细胞表位以及非结构蛋白3A上的一个T细胞表位作为靶序列表位,在其中一个B细胞表位中引入一个氨基酸突变,然后将4个表位进行不同顺序排列组合和表位的串联重复。通过人工合成3条核苷酸序列,构建重组质粒,在大肠杆菌中表达目的蛋白,重组蛋白经过纯化、复性和环化,免疫动物。其中重组多表位蛋白r P2在豚鼠体内刺激产生了略高于商业合成肽疫苗的特异性抗体水平,在体外,并诱导了强的细胞免疫反应。重组多表位蛋白r P2和佐剂ISA 50V2乳化后免疫猪,也刺激猪产生了和商品化疫苗无差异的抗体水平。在宿主动物猪上做攻毒保护试验时,重组蛋白r P2免疫猪中仅有部分猪(2/5)抵抗了FMDV的攻击。同时,以噬菌体MS2作为展示外源多肽的病毒样颗粒平台,构建并表达了嵌合FMDV表位的重组蛋白,该嵌合蛋白可以在体外自组装成病毒样颗粒,纯化后免疫动物,嵌合VLPs诱导动物产生了高于合成肽疫苗的特异性抗体滴度,也刺激产生了高于串联重复蛋白的细胞免疫反应。1、猪O型口蹄疫重组串联多表位抗原制备及免疫原性分析根据国内流行的猪O型口蹄疫SEA拓扑型Mya98谱系O/MYA98/BY/2010毒株序列,选择FMDV VP1上第124-167位(包含G-H环及其两翼序列),第200-213位作为B细胞表位,VP1上第21-40位和非结构蛋白3A上第21-35位作为T细胞表位,在第124-167位上第158氨基酸引入突变(P158C)。将4个表位序列不同组合和串联重复,密码子优化后,人工合成3条序列。构建重组原核表达载体,转入大肠杆菌中诱导表达,三个蛋白均以包涵体形式表达。三个蛋白经过纯化,复性和环化,Western和间接ELISA检测,得到了有免疫活性的重组蛋白。三个重组蛋白和商业合成肽疫苗免疫豚鼠,经过环化和两个串联重复的多表位蛋白r P2刺激豚鼠产生了和合成肽疫苗无显着性差异的特异性抗体,并诱导产生了高于重组蛋白r P1和r P3的淋巴细胞增殖和细胞因子浓度(IL-2和IFN-γ)。从4种不同种类的佐剂中,选择佐剂ISA 50V2和重组多表位蛋白r P2组合是最优配伍。佐剂ISA 50V2和r P2乳化后免疫猪,刺激产生了和合成肽疫苗相当的特异性抗体水平。在攻毒保护试验中,免疫后第28天1000 ID50/2m L的O/Mya98/BY/2010开始攻毒,观察10天,5头猪中仅有2头猪抵抗了病毒的攻击,3头猪发病,其中2头猪延缓了发病时间,分别在第8天和第10天在一条腿蹄趾处出现水泡。重组多表位蛋白虽产生了部分保护,但还没有达到预期目的,需进一步分析原因,以待解决。2、噬菌体MS2介导的展示猪O型口蹄疫G-H Loop病毒样颗粒构建及免疫原性分析本试验以噬菌体MS2作为展示外源表位的载体平台,通过RT-PCR和SOE-PCR将FMDV VP1上第131-160位氨基酸基因序列插入噬菌体MS2外壳蛋白A-B环第15-16位氨基酸中间。构建重组质粒,在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,嵌合蛋白经过PEG8000的初步纯化和凝胶过滤的进一步纯化,得到纯度达90%的目的蛋白,经过DLS和TEM物理表征,证实30个氨基酸的插入没有影响MS2外壳蛋白的组装,嵌合蛋白在体外自组装形成了嵌合病毒样颗粒。DOT-ELISA进一步表明口蹄疫表位被很好的展示在MS2病毒样颗粒表面。嵌合病毒样颗粒r P-CP-EP131-160和串联多表位蛋白r P–(EP131-160)3免疫小鼠,和串联多表位蛋白相比,嵌合病毒样颗粒诱导产生了更高的特异性抗体水平和更强的T细胞反应。在豚鼠免疫试验中,得到了类似的结果。在宿主猪体内是否也可以产生和合成肽疫苗同样的抗体水平,以及能否在猪免疫攻毒保护试验中提供完全保护,最终保护效果需要进一步动物试验来确认。
霍春玲[5](2017)在《肠道病毒71型(EV71)和柯萨奇病毒A16型(CA16)多抗原表位嵌合病毒样颗粒的构建及其免疫原性研究》文中认为手足口病(hand,foot and mouth disease,HFMD)是一种严重危害婴幼儿健康的重要传染病,主要由肠道病毒感染引起。流行病学研究证实,引起婴幼儿手足口的肠道病毒主要包括肠道病毒71(enterovirus 71,EV71)和柯萨奇病毒A16(coxsackievirus A16,CA16)两种亚型。两种亚型毒株同时感染可能诱发严重的并发症甚至死亡。EV71和CA16共存在或共感染时可导致重组毒株出现,引起爆发流行,是严重的公共卫生问题之一。因此,研制抗EV71和CA16疫苗对于有效防控HFMD疫情的暴发流行至关重要。近年来,病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs)疫苗因其展示抗原和安全性高等优点成为新型疫苗的发展方向之一,人乳头瘤病毒和乙肝病毒等的病毒样颗粒疫苗已成功上市。嵌合多抗原表位的VLPs疫苗研发正在取得积极进展。本论文基于乙型肝炎病毒核心(HBc)的自组装能力,制备了以HBc为载体蛋白展示了 EV71和CA16的多个保守抗原表位的嵌合病毒样颗粒(VLPs)。以小鼠为模型,对VLPs的免疫原性、抗EV71或CA16感染的保护进行评价;基于EV71 P1和3CD在杆状病毒表达系统中共表达可自主切割包装成病毒样颗粒,设计了一种新型重组嵌合肠病毒VLPs,分别将CA16的单个或多个主要抗原表位替换EV71对应区域,研究了EV71和CA16抗原表位的嵌合表达及对VLPs自组装特性的影响,后续将评价嵌合VLPs诱导的抗EV71和CA16感染的免疫保护。主要研究结果包括:1.以截短的乙型肝炎病毒核心蛋白(tHBc)为载体蛋白,将EV71的保守抗原表位SP70和CA16 VP1蛋白保守中和表位PEP91融合片段插入HBc肽段的Asn75与Ser81残基之间,获得了融合片段tHBc/SP;然后将EV71编码VP2蛋白的CD4+ T细胞优势抗原表位A3融合在tHBc/SP的C端,获得了融合片段tHBc/SPA;以未插入外源基因的tHBc作为对照,将tHBc/SP、tHBc/SPA和tHBc三种基因片段分别克隆到大肠杆菌表达载体pET28中,构建重组表达质粒ptHBc/SP、ptHBc/SPA和ptHBc。转化大肠杆菌,筛选用于病毒样颗粒疫苗生产的工程菌株;经优化条件,高效表达了融合蛋白tHBc/SP、tHBc/SPA和tHBc。通过分离变性包涵体、亲和层析纯化融合蛋白和体外复性等实验,制备了高纯度的VLPs。2.以BALB/c小鼠为动物模型,对两种嵌合病毒样颗粒tHBc/SPA和tHBc/SP诱导的免疫应答和抗病毒感染免疫效力进行评估。结果显示,tHBc/SPA和tHBc/SP两种VLPs免疫小鼠均可诱导针对EV71和CA16的特异性体液免疫应答和细胞免疫应答。与灭活EV71相比,嵌合VLPs诱导Th1细胞因子显着升高,Th2细胞因子降低。用嵌合VLPs免疫母鼠诱导针对子代新生小鼠抗EV71致死感染的完全免疫保护效应和抗CA16致死感染的部分保护。共表达CD4+ T细胞表位没能提高嵌合VLPs在小鼠中的抗病毒效力。3.对杆状病毒表达系统进行优化改造,将巨细胞病毒(CMV)的启动子替换转移质粒pFBDM中的p10启动子驱动3CD基因、降低3CD的表达,减少p10控制3CD表达时与pH启动子驱动的P1表达存在的竞争以提高VLPs产量,获得重组转移质粒pFBDM P1-C3CD。将CA16 SP70单独替换EV71对应片段,构建重组转移pFBDM P1/SP70-C3CD;通过将CA16-SP70、VP2136-150、VP3176-190和VP448-62 同时替换EV71 相应片段,构建重组转移质粒pFBDM P1/4M-C3CD。转化宿主大肠杆菌DH1OMultiBac使四种重组转移质粒发生转座,提取同源重组产生的杆状病毒基因组Bacmid,分别转染昆虫细胞Sf9拯救重组杆状病毒 BacP1-C3CD、BacP1/SP70-C3CD 和 BacP1/4M-C3CD。SDS-PAGE和Western blot分析证实重组嵌合目的均高效表达;利用昆虫细胞大量培养和重组病毒接种,表达目的蛋白,经过超速离心、凝胶过滤层析和超滤纯化浓缩,制备了高纯度组分。经电镜观察三种重组杆状病毒感染Sf9细胞均生产VLPs。后续将进行嵌合VLPs疫苗的抗EV71和CA16致死感染的免疫效力评价。我们的研究成果为研制抗EV71和CA16感染的VLPs的新型疫苗奠定了重要基础。
许涛[6](2017)在《磁性人工抗原提呈细胞微孔反应板的研制及HBV抗原特异性T细胞数量与功能的检测》文中研究指明当今医学检验试剂领域,病原体特异性基因、抗原和抗体的检测试剂盒很多,竞争性也很强,但是却没有厂家生产针对病原体特异性T细胞的检测试剂盒。抗原特异性T细胞(Antigen-specific Tcell,AST)是介导适应性免疫应答的核心细胞,在清除与控制病原体感染、监视和杀伤肿瘤细胞及自身免疫性疾病的免疫损伤中发挥着至关重要的作用。众所周知,在抗病毒感染和抗肿瘤中,细胞免疫比体液免疫更加重要,即T细胞的作用比B细胞产生的抗体更重要。抗原特异性T细胞数量的多少和功能的强弱直接反映了人体特异性细胞免疫的功能状态,在监测疾病进程、指导治疗方案、评价临床疗效、预测疾病慢性转归以及疫苗效果评估等方面都有着不同于抗体的重要参考价值。尽管抗原特异性T细胞的检测技术从最初的51Cr释放法、有限稀释法、细胞内细胞因子染色法到现在的ELISPOT法、pMHC多聚体流式分析法、蛋白芯片法等已经有了快速发展。尽管这些技术方法各有优点,但是各自的缺点也非常明显。目前临床上依然极少对患者进行抗原特异性T细胞数量和功能的监测。因此,进一步探索操作简便、无需特殊仪器、无需HLA基因分型、能同步检测抗原特异性T细胞数量和功能的新方法和新试剂非常重要和急迫,为精准医疗提供重要的诊疗手段。研究目的:将磁珠式人工抗原提呈细胞技术、ELISPOT技术、磁性细胞分选技术以及微孔反应板有机整合一体,建立特异性细胞免疫功能状态的检测平台:即磁珠式人工抗原提呈细胞微孔反应板(aAPC-microplate)。首先,自制H-2Kb/OVA257-264单链三聚体(SCT),利用aAPC-microplate同步检测OT-1转基因鼠中OVA257-264抗原特异性CD8+ T细胞的数量和功能,进行方法学评估;然后用同样技术制备HLA-A2/HBV peptide多聚体,利用aAPC-microplate技术对慢性乙肝患者和健康体检者的外周血中HBV特异性CD8+ T细胞的数量与功能进行同步检测,对该方法进行初步临床验证。研究方法:1)利用重叠延伸 PCR 技术将 OVA257-264、(GS4)3、β2m、(GS4)4和 H-2Kb (α1/α2/α3)依次串联为H-2Kb/OVA257-264单链三聚体基因(SCT),联合同源重组克隆技术将其插入pET28a原核表达载体,制备pMHC单体和四聚体,验证其空间构象和与TCR的结合能力;然后包被磁珠,制备成人工抗原提呈细胞微孔反应板,同步检测OT-1转基因鼠中OVA257-264抗原表位特异性CD8+T细胞的频率和反应活性,进行特异性、准确性、灵敏度、重复性或精密度等方法学指标的评估,并与进口商品化H-2Kb-Ig/OVA257-264二聚体荧光流式检测法进行配对t检验和Pearson相关性分析,同时与传统ELISPOT法比较反应活性的检测;2)用金标准的PCR-Sequencing-Based Typing技术对86例健康体检人员血液样本和118例江苏地区汉族2型糖尿病血液标本分别进行HLA-A和HLA-B等位基因分型;利用基因重组克隆技术构建和表达所有频率大于1%的13种HLA-A等位基因重链重组质粒和8种常见HBV抗原表位与β2m轻链的重组质粒;利用6种在线表位预测数据库和软件对 HLA-A*01:01、A*03:01、A*30:01、A*31:01、A*32:01、A*33:03和A*6801等7种HLA-A等位基因分子限制性的HBV相关抗原表位肽进行预测;3)利用重叠延伸PCR和同源重组克隆技术构建和表达HLA-A*0201/HBc18-27、HLA-A*0201/HBs183-191、 HLA-A*0203/HBc18-27、 HLA-A *0203/HBs183-191、HLA-A*0206/HBc18-27等五种HLA-A2/HBVpeptide的单体和四聚体,包被磁珠,制备成制备成人工抗原提呈细胞微孔反应板;对临床慢性乙肝患者、健康体检者外周血中HBc18-27和HBs183-191抗原表位特异性CD8+ T细胞的数量与功能进行同步检测;并与进口商品HLA-A2-Ig二聚体的荧光流式分析法和传统ELISPOT法进行比较。研究结果:1)成功构建和表达H-2Kb/OVA257-264 SCT融合基因,制备成H-2Kb/OVA257-264 SCT单体,包被磁珠后用H-2Kb构象特异性荧光单抗染色和流式分析,证实能强烈结合,提示构象正确;制备成荧光标记的H-2Kb/OVA257-264 SCT四聚体,流式法检测4只OT-1鼠脾淋巴细胞群中OVA257-264抗原表位特异性CD8+T细胞频率。结果与进口商品化H-2Kb-Ig/OVA257-264二聚体的流式检测结果无统计学差异,证实H-2Kb/OVA257-264 SCT与TCR的结合能力;2) 7只OT-1鼠脾淋巴细胞群同时经aAPC-microplate法和H-2Kb-Ig/OVA257-264二聚体流式染色法检测OVA257-264表位特异性CD8+T细胞的频率,结果经配对t检验显示p=0.2464,表明无统计学差异,Pearson回归分析显示,相关系数r=0.946,P<0.01,相关方程为:Y=0.936X + 3.262,显示两种检测方法的吻合度很高;用H-2Kb-Ig/OVA257-264二聚体流式染色法检测aAPC-microplate孔内剩余细胞中OVA257-264特异性CD8+ T细胞的纯度,三次实验分别为92.35%、91.22%和92.10%,表明aAPC-microplate法的特异性达到90%以上;aAPC-microplate法检测7只OT-1鼠时,分析内 CV 值分别为 6.44%、4.01%、6.31%、9.08%、6.63%、4.24%和 3.11%,对其中1只进行三次独立重复检测,结果分别为25.47%、25.59%和24.49%,平均分析内CV值分别为3.11%、4.41%和10.62%,三次检测结果的分析间CV值为2.40%,平均分析内CV值均低于15%,表明该检测方法有良好的重复性或精密度,符合我国2000版生物制品鉴定标准;灵敏度分析显示,在5个不同稀释频率(10%, 1%,0.1%,0.05%,0.01%)的样品检测中 aAPC-microplate 法与 H-2Kb-Ig/OVA257-264 二聚体流式染色分析法的配对t检验无统计学差异,p=0.3973, Pearson分析的相关系数r=0.998,P<0.01,相关性方程为:Y=0.943X +0.21,aAPC-microplate方法可检测的频率下限低至0.01% - 0.05%,与传统的MHC多聚体染色加流式分析法相似,该灵敏度能满足临床标本检测的需要;3) 3只OT-1鼠脾淋巴细胞经aAPC-microplate检测频率后,分选后的OVA257-264特异性CD8+T细胞群经ConA刺激后分泌IFN-γ的反应活性比分别为43.83%、41.87%和48.99%;同时对3只OT-1鼠脾淋巴细胞用传统ELISPOT方法进行检测,在OVA257-264抗原肽刺激后脾淋巴细胞群中分泌IFN-γ的细胞比例经直线回归方程校正后分别为4.44%、4.01%和4.98%。由于原理和结果表现形式不同,两种方法的活性检测结果不能直接比较;4)在对人群血液标本进行HLA-A/B位点基因分型中,共获得所有频率大于1%的13种HLA-A等位基因型和32种HLA-B等位基因;成功构建和表达13种HLA-A等位基因的重链重组质粒和8种常见HBV抗原表位与β2m轻链的重组质粒;利用在线表位预测数据库预测获得 HLA-A*01:01、A*03:01、A*30:01、A*31:01、A*32:01、A*33:03和A*6801等7种等位基因型限制性的HBV抗原表位肽序列,每种等位基因均获得多个高亲和力的候选表位肽,分别来自HBsAg(P03138)、HBcAg(P03146)、HBpol(P03156)和HBx(P03165)等4种HBV抗原蛋白分子;5) 成功构建和表达HLA-A*0201/HBc18-27、HLA-A*0201/HBs183-191、HLA-A*0203/HBc18-27、HLA-A*0203/HBs183-191、HLA-A*0206/HBc18-27 等五种 HLA-A2/HBVpeptide的SCT分子,分别包被磁珠,制备成5种aAPC-beads,按照1:1的比例混合,制备成 HLA-A2 限制性、HBc18-27和 HBs183-191 表位特异性的 aAPC-microplate;6)用 aAPC-microplate 法和进口 HLA-A2-Ig/HBc18-27/HBs183-19 二聚体流式染色法对 10例HLA-A2阳性慢性乙肝患者、15例HLA-A2阴性慢性乙肝患者和15例HLA-A2阳性健康体检者的PBMC进行检测。配对t检验显示,两种方法对三组临床标本的检测结果均无统计学差异,p值分别为0.0821、0.0529和0.0594; Pearson相关性分析显示,相关系数r=0.980, P<0.01,相关性方程为:Y=0.984X-0.05,两者的吻合度很高;HLA-A2阳性慢乙肝患者外周血中HBc18-27和HBs183-191表位特异性的CD8+T细胞的频率明显高于两个对照组(0.1957% ± 0.0672% vs. 0.0176% ± 0.0068%,0.1957% ± 0.0672% vs. 0.0249% ± 0.0077%);7) 10名HLA-A2阳性慢性乙肝患者的PBMC经aAPC-microplate法检测频率后,分选后的HBc18-27和HBs183-191表位特异性的CD8+T细胞群经PHA刺激后分泌IFN-γ的反应活性比为22.79%± 3.40%;而同时患者PBMC中整体T细胞群经PHA刺激后的反应活性比为36.35% ± 3.58%,明显高于HBc18-27和HBs183-191表位特异性的CD8+ T细胞群的反应活性。这些结果提示:慢性乙肝患者体内针对乙肝病毒的特异性CD8+T细胞尽管频率高于健康者人群,但是其针对HBV抗原刺激后的活化、增值和分化能力低下。这可能是导致患者感染HBV后慢性转化的重要原因。研究结论:利用自制MHC多聚体建立的aAPC-microplate技术能对OVA257-264抗原特异性CD8+T细胞的数量和功能进行同步检测,具有很好的准确性、特异性、灵敏度、重复性或精密度,可检测的比例下限低至0.01% - 0.05%;利用自制HLA-A2/HBc18-27/HBs183-191 SCT多聚体建立的aAPC-microplate技术能对慢性乙肝患者临床血液标本中的HBc18-27和HBs183-191抗原特异性CD8+ T细胞数量和功能进行同步检测,与传统的MHC多聚体流式染色法检测结果无显着性差异,两者吻合度极高。
李图帅[7](2016)在《O型口蹄疫病毒VP1蛋白GH loop表位表面展示策略与免疫原性研究》文中认为口蹄疫(Foot-and-mouth disease,FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)引起的一种急性、热性、高度接触性传染病。该病毒主要感染牛、羊等偶蹄动物并可造成严重的经济损失。目前,我国国产的FMDV疫苗均是由灭活口蹄疫病毒,配用油佐剂制备而成,临床副反应大,免疫保护还有待进一步提高,同时在疫苗生产过程中存在灭活不完全而造成强毒逃逸的风险。因此,选择有效表面展示系统,利用基因工程技术展示FMDV抗原表位,进而制备FMDV亚单位疫苗,对于提升国产疫苗质量及安全性,具有很大的实际应用价值。VP1蛋白是FMDV主要的抗原,它含有的GH环第141-160位氨基酸为线性B细胞抗原表位,也是诱导机体产生中和抗体的免疫表位,可以诱导产生保护性免疫应答,因此是研究口蹄疫疫苗的理想抗原,基于口蹄疫VP1蛋白GH loop表位的合成肽疫苗目前在国内已成功上市。PCV2 Cap蛋白病毒样颗粒表面展示系统是国内外近年发展起来的一种外源抗原表位展示系统。该技术是利用外源肽段取代Cap蛋白内部的loop环,表达重组Cap蛋白,然后60个重组Cap蛋白可在体外自我组装为病毒样颗粒完成对外源抗原表位的展示。霍乱毒素B亚单位展示系统是利用外源抗原表位采取同源重组技术替换霍乱毒素B亚单位中KNG氨基酸基因片段,表达重组CTB蛋白,然后5个重组CTB蛋白可在体外聚集为五聚体结构进而完成对外源抗原表位的展示。本研究选择了 PCV2 Cap蛋白病毒样颗粒及霍乱毒素B亚单位作为展示FMDV抗原表位的载体系统,成功展示FMDV VP1的GH loop抗原表位,并以此为基础制备了 FMDV-PCV2二联亚单位疫苗及FMDV亚单位疫苗,初步评价其免疫保护效力,为研制高效FMDV疫苗奠定了良好的基础。本文主要研究内容如下:1.基因替换构建以PCV2 Cap为骨架展示FMDV GHloop的嵌合VLPs本试验以O型FMDV VP1主要B细胞表位GH loop为外源基因,在PCV2 Cap蛋白内部鉴定获得4个位置,以基因替换方式构建嵌合基因,构建成功的嵌合基因与PQZ表达载体相连后在大肠杆菌中成功诱导表达,SDS-PAGE鉴定表明,获得的重组蛋白大小分别为27 kDa左右,均为可溶性蛋白;Western-bloting分析显示,6种重组蛋白均能与PCV2 阳性血清及O型FMDV 阳性血清反应;透射电镜观察表明,重组Cap蛋白体外形成大量直径在20 nm左右的病毒样颗粒。50 μg/只纯化后重组蛋白自制疫苗免疫小鼠证实能够引发机体产生特异性细胞免疫和体液免疫应答,其中以Cap-loop4免疫效果最好。2.基因插入构建以PCV2 Cap为骨架展示FMDV GH loop的嵌合VLPs在前期研究基础上依次将FMDV GH loop基因片段插入PCV2 Cap蛋白内部鉴定获得4个位置处,以基因替换方式构建嵌合基因,构建成功的嵌合基因与PQZ表达载体相连后在大肠杆菌中成功诱导表达。SDS-PAGE鉴定表明,获得的重组蛋白大小分别为35 kDa左右,均为可溶性蛋白;Western-bloting分析显示,4种重组蛋白均能与PCV2阳性血清及O型FMDV血清呈阳性反应;透射电镜观察表明,重组Cap蛋白体外形成大量直径在20 nm左右的病毒样颗粒。50 μg/只纯化后重组蛋白自制疫苗免疫小鼠证实能够引发机体产生特异性细胞免疫和体液免疫应答,其中以Cap-iloop1免疫效果最好。3.以CTB为载体展示FMDV GH loop抗原表位方法的研究探讨以霍乱毒素B亚单位为载体制备猪O型口蹄疫亚单位疫苗的可行性。将FMDV GH loop基因片段取代CTB氨基酸的KNG肽段基因序列,基因替换方式构建嵌合基因,构建成功的嵌合基因与PQZ表达载体相连后在大肠杆菌中诱导表达。SDS-PAGE结果表明重组蛋白获得高效表达且具有良好可溶性;Western-blot分析结果显示重组蛋白能够与FMDV 阳性血清发生反应;神经节苷脂GM1抗原包被板鉴定表明,重组CTB蛋白能够形成五聚体结构;200 μg/头份重组蛋白制备疫苗免疫试验猪能够产生较高的抗体水平与细胞免疫反应。以上结果表明重组蛋白具有针对FMDV良好的免疫原性,为研究口蹄疫亚单位疫苗提供了新思路。
苏秋东[8](2014)在《乙型肝炎疫苗新制剂方案的免疫原性研究》文中进行了进一步梳理[目的]:制备嵌合乙型肝炎病毒(HBV)优势表位的病毒样颗粒(VLP)和生物佐剂与HBsAg共价偶联疫苗制剂两个思路探索解决现行疫苗在预防和控制HBV感染中所存在的低无应答、低效激起细胞免疫、无法打破免疫耐受以及氢氧化铝佐剂副反应等问题。[方法]:第一部分是以HBV核心抗原(HBcAg)病毒样颗粒为骨架,将HBV优势表位(HBsAg“α”抗原决定簇aa119-152片段;HBsAg"a”抗原决定簇aa139-148片段;preS1aa21-47片段;preS1aa37-45片段)插入到全长(aa1-183)或截短(aa1-144)HBc的主要免疫显性区域(Major Immunodominant Region, MIR)或者羧基端(aa144以后),构建系列表面展示HBV优势表位的HBc嵌合病毒样颗粒,并利用小鼠实验评价其免疫原性。其中所涉及的实验技术主要有基因优化技术、重组以及普通PCR技术、基因克隆技术、原核表达技术、蛋白纯化技术、蛋白鉴定技术、ELISPOT技术、流式细胞术等。第二部分是借鉴多糖偶联流感嗜血杆菌D蛋白疫苗构建的成功经验,从流感嗜血杆菌全基因组中通过巢式PCR技术获取D蛋白非酰化区域(命名为H17),并将其酶切连接入pET43.1a表达载体中,在E.coli表达工程菌中进行表达。然后利用硫酸铵分级沉淀、离子交换层析技术对目的蛋白进行纯化,进而获取纯度好、浓度高的H17蛋白。并利用戊二醛交联技术-分子筛分离偶联单体二步法将其与乙肝疫苗主成分HBsAg进行共价偶联,制备实验用偶联疫苗制剂,最后利用小鼠动物模型对此实验用偶联疫苗制剂的免疫原性进行评价。[结果]:第一部分成功构建H2、H3、H8、H9、H10、H11、S47、H20、H21等九个插入HBV优势表位的HBc为骨架蛋白的表达质粒(H20、H21分别为全长和截短HBc空载体),并利用原核表达系统进行表达。通过硫酸铵分级沉淀、离子交换层析、蛋白浓缩技术、蛋白透析复性技术、分子筛层析技术、超速离心技术获取H2、 H3、H8、H9、H11、S47等六个表面展示HBV优势表位的HBc-VLPs。最后选取H8、H11作为新制剂方案,并利用动物实验对其进行疫苗效果评价。H8可以诱发小鼠产生针对HBsAgpreS1的抗体,但针对HBsAg抗体水平相对preS1偏低(p<0.05),抗体水平都在42-49天达到峰值;ELISPOT吉果表明H8刺激免疫小鼠脾细胞实验中,IFN-y分泌细胞增生明显,显示可以有效激活Th1类细胞免疫应答;流式细胞术结果表明CD4+T细胞和CD8+T细胞在脾细胞中比例相对对照组明显增加(p<0.05),而且CD4+T细胞/CD8+T细胞比例相对对照组明显下降(p<0.05),提示H8可以诱发机体特异性CD8+T细胞的分化。H11可以诱发小鼠产生针对HBsAg的抗体,抗体水平在49-56天达到峰值;ELISPOT结果表明H11刺激免疫小鼠脾细胞实验中,IFN-y分泌细胞增生明显(p<0.05),显示可以有效激活Thl类细胞免疫应答;流式细胞术结果表明CD4+T细胞和CD8+T细胞在脾细胞中比例相对对照组明显增加(p<0.05),而且CD4+T细胞/CD8+T细胞比例相对对照组明显下降(p<0.05),提示H11可以诱发机体特异性CD8+T细胞的分化。第二部分利用巢式PCR技术获取流感嗜血杆菌D蛋白非酰化区域基因片段(命名为H17),并通过原核表达获取可溶性H17蛋白。利用硫酸铵分级沉淀、蛋白透析复性技术、离子交换层析等纯化技术获取高纯度、高浓度的H17蛋白,并通过Western Blotting检测其抗原性。利用戊二醛交联技术分子筛分离单体两步法共价偶联H17和HBsAg,并利用异种抗体夹心法初步评价偶联疫苗制剂抗原效价(1:1600)。动物实验证实,偶联疫苗制剂可以诱发小鼠产生针对HBsAg的高水平抗体,抗体水平在35-42天达到峰值,并在跟踪期间连续15周持高,比HBsAg单独免疫组和PBS组抗体水平都高(p<0.05),但比乙肝疫苗组低(p<0.05)。首针免疫偶联疫苗制剂组抗体水平升高明显(p<0.05),显示其免疫原性最强;ELISPOT实验结果表明,在刺激IL-4分泌细胞增生上,偶联疫苗制剂和乙肝疫苗水平相当(p>0.05),都比HBsAgfPPBS组高(p<0.05),显示在激发Th2类细胞免疫应答上,偶联疫苗制剂与乙肝疫苗水平相当,都比其他实验对照组强烈。但在刺激IFN-γ分泌细胞增生水平上,偶联疫苗制剂相比于其他实验及对照组都高(P<0.05),显示在激发Th1类细胞免疫应答水平上,偶联疫苗比其他实验对照组有优势;流式细胞术结果表明,相对于PBS组,CD4+T细胞和CD8+T细胞在脾细胞中比例明显升高,而且CD4+T细胞/CD8+T细胞比例相对对照组明显下降同,提示偶联疫苗制剂可以诱发机体特异性CD8+T细胞的分化。[结论]:第一部分,表面展示HBV优势表位的嵌合HBc病毒样颗粒H8和H11有效地将HBc和HBV优势表位(HBsAg "a"抗原决定簇或者preS1中和表位)串联到一个蛋白单体上(这对全面激发机体产生针对HBV的免疫应答至关重要),单体通过相互作用最终组装成病毒样颗粒。此病毒样颗粒在动物实验中有效激发小鼠产生了高水平的针对HBV优势表位的抗体,并有效激起Thl类细胞免疫应答,CD8+T细胞比例和数量都有所增加,充分显示其疫苗潜能。第二部分,偶联疫苗制剂将具强T细胞表位、疫苗载体潜能的流感嗜血杆菌杆菌D蛋白共价偶联到乙肝疫苗主成分HBsAg上,转变HBsAg的抗原递呈途径,使其有可能打破免疫耐受,消除低无应答等问题。动物实验也证实,偶联疫苗制剂充分激发小鼠产生了高水平的针对HBsAg的抗体,虽然峰值抗体水平低于乙肝疫苗,但在诱发Thl类细胞应答方面更强(Th2类细胞应答方面相当),CD8+T细胞比例和数量都有所增加,充分显示其疫苗潜能。
薛皓,张颖倩,薛付忠,马春红[9](2009)在《现有乙型肝炎多表位疫苗在中国人群中的理论免疫效果评价》文中指出目的预测现有乙型肝炎(HBV)多表位疫苗在中国的理论免疫应答率,并做出评价。方法利用"中国多表位疫苗设计的HLA-Ⅰ积累表型频率空间预测系统"计算现有的HBV表位DNA疫苗所涉及的HLA-A、B限制性表位组合在中国人群中的累积表型频率(CPF),得出理论免疫应答率,并绘制CPF预测等值线图,给出评价。结果现有各HBV多表位疫苗对中国人群的理论免疫应答率偏低,仅较多表位组合的疫苗理论免疫应答率高。现有HBV多表位疫苗存在不同方面的问题:大部分此类疫苗对中国人群的理论免疫应答率低;少数此类疫苗理论免疫应答率高,但为较多表位的组合,不符合多表位疫苗设计的原则,并没有用最少的表位组合达到最高的免疫应答率。结论现有的几种主要的HBV多表位疫苗并不能较好地符合中国人群的特点,效果不佳。
孙林[10](2009)在《乙型肝炎病毒全基因组序列变异性的空间遗传结构研究》文中认为乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus, HBV)感染是一个世界性的公共卫生问题。世界范围内HBV的感染者大约有20亿,其中慢性感染者约3.5亿-4亿,每年约有50万-120万人死于HBV感染所导致的慢性肝炎、肝硬化或肝细胞癌。HBV属嗜肝DNA病毒科,由于HBV复制过程中HBV DNA聚合酶缺乏校正功能,易导致HBV发生突变。目前,依据HBV全基因组序列核苷酸异质性≥8%或其S基因序列核苷酸异质性≥4%的标准,可将HBV分为A-H 8个基因型;进而又可依据同一基因型核苷酸序列差异≥4%而<8%的标准,再将HBV基因型分为不同的基因亚型;且HBV基因型及其基因亚型的分布具有明显的地域性和人种的特异性。因此有必要进一步研究不同地理区域和人群中HBV变异性的空间遗传结构特征。研究HBV序列变异性的空间遗传结构不仅对阐明HBV序列变异的空间异质性特征,探索HBV的空间变异轨迹及其与人群迁移的关系,划分HBV序列变异性的空间遗传结构地理界限等具有重要的理论意义;而且对制定区域化的乙型肝炎防治对策(HBV多表位疫苗的研制、HBV传染源分子流行病学追踪、区域化、HBV个性化治疗方案制定等方面)提供科学依据。目前,在研究HBV序列变异性的地理遗传结构时,多数研究是基于传统聚类方法构建系统发生树,从系统发生树的拓扑结构中识别HBV序列变异性的遗传结构,进而分析某些同源性较高的HBV序列是否对应特定的地理区域。然而,以上研究所采用的方法均是传统的聚类分析方法,未考虑HBV分离地(人群)的空间坐标,因而难以深入揭示HBV序列变异性的空间遗传结构特征。为此,本研究在GIS框架内,采用二维图论最小生成树模型与"Monmonier’s algorithm"计算几何学模型相结合的方法,从空间遗传结构连通性分析和空间遗传结构界限识别两个不同侧面研究全球范围内HBV序列变异性的空间遗传结构特征。主要结果:(一)HBV基因型及其亚型地理分布特征HBV全基因组序列进化树呈现明显的结构化特征,分为8个分枝,分别对应特定的基因型及其基因亚型,而多数基因型及其亚型均具有特定的优势地理分布区域。结果表明,全球范围内HBV序列变异性的遗传结构不仅具有相对独立的基因型和基因亚型拓扑结构,而且受宿主免疫压力等因素的影响在某些基因型和基因亚型分枝上还存在某些重组体。(二)HBV序列变异性的空间遗传拓扑结构特征1.HBV序列全部基因型及其亚型变异性的二维最小生成树显示其空间遗传拓扑结构特征:①整个最小生成树由4个分枝组成,分别为美洲大陆分枝、非洲大陆分枝、欧洲大陆分枝和亚洲-大洋洲分枝;②各分枝呈现出明显的地理结构特征,且分枝间有明显的地理、社会隔离特征。其中,海洋是HBV序列变异性地理隔离的主要天然屏障,例如,2、8、9、10和15号点(新西兰、澳大利亚及南太平洋岛国)的HBV序列在地理距离上虽然和美洲大陆接近,但由于海洋天然屏障的隔离并未出现连通分枝。又如,非洲的3、6、11、19和24号点(南非、马达加斯加、马拉维、乌干达和索马里)在地理距离上虽然与东南亚、大洋洲等接近,但也因海洋天然屏障的隔离并未出现连通分枝。而没有海洋天然地理屏障的大陆区域却一般是相互连通的。例如,非洲大陆之内各样本点相互连通,且整个非洲大陆通过中东地区与亚欧分枝连通。又如,大洋洲各样本点也相互连通,并且与亚洲、欧洲形成连通分枝。再如,南北美洲形成了一个连通分枝。因此,本研究揭示了HBV生物地理学本质特征规律,研究结果将对深入理解HBV进化特征、地理隔离特征、HBV与宿主间的空间关系等理论问题具有重要意义。同时也对HBV区域化防治措施的制定(HBV多表位疫苗的研制、区域化HBV个性化治疗方案的制定和区域化特征分子流行病学标记的寻找等)具有实际应用价值。2.多数HBV基因型及其亚型也同样呈现出明显的空间遗传结构特征:①A基因型的二维最小生成树由3个分枝组成,分别为非洲大陆分枝、欧洲大陆分枝和亚洲-北美洲大陆分枝;各分枝显示出明显的地理结构特征,且分枝间有明显的地理、社会隔离特征。其中,非洲和欧洲分别成为两个比较独立的分枝;亚、美之间尽管有太平洋隔离,但仍存在许多连通分枝,表明亚洲与美洲之间HBV序列高度相似,可能与近代人群频繁迁移、混合有关,也可能与该基因型具有比较广泛的宿主适应性有关。②B基因型的二维最小生成树显示,尽管有少量的分枝与欧美相连,但最小生成树主体仍在亚洲,并且各个分枝间存在隔离现象。③C基因型的二维最小生成树由2个分枝组成,分别为亚洲大陆分枝和大洋洲大陆分枝。各分枝显示出明显的地理结构特征,且分枝间有明显的地理、社会隔离特征。其中,亚洲与大洋洲分别成为两个比较独立的分枝。④D基因型的二维最小生成树由2个分枝组成:亚-非-欧-美分枝和大洋洲分枝。其中,澳洲、美洲和欧洲的宿主均为白种人,而亚洲为黄种人,表明,D基因型对宿主的适应性较广泛。⑤E基因型的二维最小生成树形成1个独立的分枝,局限于非洲。⑥F基因型的二维最小生成树主体位于中南美洲,但其与亚洲(日本)和欧洲(法国)存在个别连通分枝。该研究结果与传统的HBV基因地理分布研究结论基本一致,且进一步阐明了多数基因型及其亚型具有特异的区域化易感宿主;对特定人群的HBV多表位疫苗研制和区域化个性化个体治疗方案的制定具有重要的理论指导意义和实际应用价值。(三)HBV序列变异性的空间轨迹1.HBV序列全部基因型及其亚型变异性的空间轨迹多数是沿海岸线定向移动。非洲大陆的HBV序列沿非洲西海岸线向南移至南非,再沿东海岸线向北延伸到中东地区,然后在中东地区分为两枝:一枝沿亚欧大陆延伸到欧洲各国;另一枝经南亚和东南亚,向北逐渐延伸到中国北部直至俄罗斯(该枝的延伸轨迹中还可看到东西两条路线,西线延伸至中国西部,沿藏缅走廊继续向北延伸,再沿丝绸之路向西北延伸至西伯利亚;而东线则由东南亚沿东海岸线向北延伸到中国北部,同时向南延伸至太平洋岛国后继续向南延伸至大洋洲)。而亚洲分枝沿太平洋东海岸线向北延伸至俄罗斯的堪察加半岛,经白令海峡延伸至北美洲,再向南延伸至南美洲。上述HBV序列变异性的空间轨迹与人类走出非洲的基因流动轨迹基本吻合,表明HBV序列变异性随着宿主(人类)的迁移向世界各地传播蔓延,形成了与人群移动相吻合的流动轨迹。该研究结论对进一步研究HBV序列进化史具有重要的指导意义。2.研究结果还表明,尽管多数基因型及其亚型有其优势地理分布区域,但不同空间位置上的同一基因型间仍存在着特定的空间轨迹:①全球A基因型HBV序列变异性的最小生成树呈连通态势,且有明显的序列变异空间轨迹,这些轨迹多数沿海岸线定向移动。非洲大陆的A基因型HBV序列有两个分枝(一枝沿非洲西海岸线至冈比亚、再向东至索马里,然后再沿东海岸线延伸到中东地区;另一枝沿东海岸线延伸至中东地区),且在中东地区融合、进入南亚和东南亚。欧洲大陆的A基因型HBV序列沿地中海的海岸线延伸至亚洲大陆;而亚洲大陆与美洲大陆间A基因型序列存在很多连通通道,表明两者的关系密切。②B基因型分布较局限,轨迹不明显,主要局限在亚洲,表明其具有特殊的宿主易感人群(亚洲人群)。③C基因型分布也较局限,轨迹不明显,主要局限在亚洲,表明其具有特殊的宿主易感人群,但亚洲人群和大洋洲的土着居民更易感染C基因型。④D基因型呈现出纬向连通轨迹,可能与人群迁移交流有关。⑤E基因型以非洲东南部的岛国—马达加斯加为中心向西、向西北方向延伸,向西跨越莫桑比克海峡延伸到非洲西南部(安哥拉、纳米比亚和赞比亚)、非洲西部(塞内加尔、科特迪瓦、加纳、贝宁、尼日利亚和喀麦隆)。表明了E基因型以马达加斯加为中心向外定向扩张流行的轨迹。⑥F基因型沿中南美洲大陆呈南北走向。这些研究结果为进一步研究HBV同一基因型的进化史和空间传播轨迹,寻找其分子流行病学追踪标记具有重要意义。(四)HBV序列变异性的地理界限1.本研究表明,HBV序列在全球范围内存在许多具有统计学意义的地理界限。这些地理界限将全球分割成几个相对独立的遗传同质性地理区域:①全球HBV变异性以太平洋为界分为新世界(南北美洲)区域和旧世界(亚、非、欧)区域;②新世界区域中的HBV序列具有高度同质性;③旧世界区域中的HBV序列空间结构复杂,空间异质性程度高,整个区域又被许多亚界限分割成不同区域。其中,非洲成为一个比较独立的同质区域,而欧、亚、大洋洲成为另一个相对独立的同质区域。西伯利亚和北美洲靠近北极圈的部分地区成为一个相对独立的区域。该研究结果与人类群体遗传结构的地理界限基本吻合。表明,HBV序列的变异与其宿主的遗传结构一致,具有特定遗传同质性的人群(宿主)往往更易感染某一特定的基因型及其亚型,而特定的HBV基因亚型更适于在特定的人群中流行和生存。2.按照基因型分别对HBV序列进行地理界限分析,结果表明,即使同一基因型也存在许多具有统计学意义的地理界限(图22-图27),可将其划分为同质性更高的特定地理区域:①地理界限将A基因型及其亚型分割成相对同质的几大区域:以图22中界限Ⅰ为界分为南北两大区域,北部区域包括中亚、东亚、西伯利亚和北美洲,主要分布着A2基因亚型;以界限Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ所围成的南部同质区域包括东南亚、中东、非洲东部和南部,主要分布着A1基因亚型;以界限Ⅲ、V所围成的非洲西北部同质区域,主要分布着A3基因亚型;以界限Ⅳ、ⅡV所围成的欧洲西部同质区域,主要分布着A2基因亚型。北部区域和欧洲西部同质区域实际在地理距离上十分接近。②B基因型被近似平行的呈西南-东北走向的地理界限依次分割成几个相对同质的区域:以图23中界限Ⅰ所围成的北美洲同质区域,主要分布着B6基因亚型;以界限Ⅰ、Ⅱ所围成的同质区域主要包括日本,主要分布着B1基因亚型;以界限Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ所围成的同质区域主要包括中国,主要分布着B2基因亚型;以界限Ⅲ、Ⅴ所围成的同质区域包括东南亚,主要分布着B3、B5基因亚型;以界限Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ所围成的同质区域包括越南,主要分布着B4基因亚型;以界限Ⅵ、Ⅶ所围成的同质区域包括泰国和瑞士,主要分布着B2基因亚型。③C基因型的分布虽然局限于亚洲和大洋洲,但仍被一条呈东南-西北走向的地理界限分割成南北两大区域:北部同质区域包括日本、韩国、中国北部和乌兹别克斯坦,主要分布着C2基因亚型;该区域的HBV序列空间结构复杂,空间异质性程度高,整个区域又被许多亚界限分割成不同区域。其中,夏威夷成为一个比较独立的同质区域,而日本冲绳成为另一个相对独立的同质区域;南部同质区域包括东南亚、中国南部、澳洲和南太平洋岛国,主要分布着C1、C3、C4、和C5基因亚型,该区域的HBV序列空间结构复杂,空间异质性程度高,整个区域又被许多亚界限分割成不同区域。其中,东南亚成为一个比较独立的同质区域,主要分布着C1基因亚型;菲律宾成为一个比较独立的同质区域,主要分布着C5基因亚型;澳洲成为一个比较独立的同质区域,主要分布着C4基因亚型;南太平洋岛国成为一个比较独立的同质区域,主要分布着C3基因亚型。④D基因型分布广泛,被图25中界限Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ分割成相对独立的几个同质区域:包括美洲、非洲、南亚-东南亚(印度)、澳洲和欧洲-中亚-东亚-西伯利亚同质区域。欧洲-中亚-东亚-西伯利亚同质区域中的HBV序列空间结构复杂,空间异质性程度高,整个区域又被许多亚界限分割成不同区域。⑤E基因型虽然仅局限于非洲,但是被图26中界限Ⅰ分割为南北两个相对独立的同质区域:北部同质区域HBV序列空间结构复杂,整个区域又被许多亚界限分割成不同区域。尽管目前E基因型并未定义基因亚型,但仍显示出相对独立的同质地理亚群。⑥F基因型主要分布于中南美洲,但仍被图27中界限Ⅰ分割成南北两个相对独立的同质区域:北部区域包括中美洲和美国,主要分布着F1基因亚型;南部区域包括中南美洲,主要分布着F2基因亚型。以上研究结果表明,尽管多数同一基因型地理分布较为局限,但在其局限的区域内仍存在地理界限;这些地理界限将同一基因型划分成同质性更高的地理区域,多数可找到对应的基因亚型,表明HBV在基因亚型水平上也具有特定的易感人群。该结果对于进一步分析不同地理亚型的HBV序列差异性,寻找特定的流行病学分子标记,用于区域化分子流行病学监测、区域化HBV多表位疫苗的研制和区域化HBV个性化治疗方案的制定等均具有理论指导意义和实际应用价值。主要结论:(一)全球范围内HBV序列变异性的遗传结构不仅具有相对独立的基因型和基因亚型拓扑结构,而且受宿主免疫压力等因素的影响在某些基因型和基因亚型分枝上存在某些重组体。(二)HBV序列全部基因型及其各基因型的变异性呈现出特定的空间遗传拓扑结构特征,其二维图论最小生成树的各分枝均具有明显的地理结构特征和地理、社会隔离特征。其中,海洋是HBV序列变异性地理隔离的主要天然屏障。(三)HBV序列全部基因型及其各基因型的变异性具有明显的空间轨迹,其轨迹多沿海岸线定向移动,与人类走出非洲的基因流动轨迹基本吻合。表明,HBV序列变异性随着宿主(人类)的迁移而向世界各地传播蔓延,形成了与人群移动相一致的流动轨迹。对进一步研究同一基因型的进化史和空间传播轨迹,寻找其分子流行病学追踪标记具有重要意义。(四)全球HBV序列全部基因型及其各基因型的变异性能被具有统计学意义的地理界限分割成若干同质性的地理区域,这些界限和区域与人类群体遗传的地理界限基本吻合。表明,HBV序列的变异与其宿主的遗传结构一致,具有特定遗传同质性的人群(宿主)往往更易感染某一特定的基因型及其亚型,而特定的HBV基因亚型更适于在特定的人群中流行和生存。(五)HBV序列变异性的空间遗传结构特征对深入理解HBV进化特征、地理隔离特征、HBV与宿主间的空间关系等理论问题具有重要意义。同时也对HBV区域化防治措施的制定具有实际应用价值,包括HBV多表位疫苗的研制、区域化HBV个性化治疗方案的制定和区域化特征分子流行病学标记的寻找等诸多方面。主要创新点:(一)证明了HBV序列全部基因型及其各基因型的变异性均呈现特定的空间遗传拓扑结构特征。其二维图论最小生成树的各分枝均具有明显的地理结构特征和地理、社会隔离现象。其中海洋是HBV序列变异性地理隔离的主要天然屏障。(二)绘制出了HBV序列全部基因型及其各基因型的变异性的空间轨迹。其轨迹多沿海岸线定向移动,与人类走出非洲的基因流动轨迹基本吻合。为进一步研究同一基因型的进化史和空间传播轨迹,寻找其分子流行病学追踪标记具有重要意义(三)划定了全球HBV序列全部基因型及其各基因型的变异性的地理界限和同质的地理区域;这些界限和区域与人类群体遗传的地理界限基本吻合。指出HBV序列的变异与其宿主的遗传结构一致,具有特定遗传同质性的人群(宿主)往往更易感染某一特定的基因型及其亚型,而特定的HBV基因亚型更适于在特定的人群中流行和生存。
二、以HBc颗粒为呈现载体的HBV多表位复合基因真核表达载体的构建(论文开题报告)
(1)论文研究背景及目的
此处内容要求:
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景,再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题,并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例:
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
(2)本文研究方法
调查法:该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法:用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法:通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法:通过调查文献来获得资料,从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法:依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法:对研究对象进行“质”的方面的研究,这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法:通过具体的数字,使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法:运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法:这是社会科学用来分析社会现象的一种方法,从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法:通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、以HBc颗粒为呈现载体的HBV多表位复合基因真核表达载体的构建(论文提纲范文)
(1)CHO细胞源口蹄疫多表位疫苗的初步研究(论文提纲范文)
摘要 |
abstract |
第一章 绪论 |
1.1 口蹄疫表位疫苗 |
1.2 CHO细胞表达系统 |
1.2.1 培养基的优化 |
1.2.2 高产重组CHO细胞系的构建 |
1.3 信号肽在CHO细胞表达系统的应用 |
1.4 乙型肝炎病毒核心抗原 |
1.4.1 HBcAg插入位点 |
1.4.2 插入蛋白大小 |
1.4.3 外源片端性质 |
1.4.4 HBcAg的免疫原性 |
1.5 CRISPR/CAS9在CHO细胞中的应用 |
1.5.1 基因敲除 |
1.5.2 同源重组 |
1.6 目的与意义 |
1.6.1 研究目的 |
1.6.2 研究意义 |
第二章 增强CHO细胞分泌表达O型 FMDV抗原表位重组蛋白的信号肽筛选 |
2.1 材料 |
2.1.1 主要试剂 |
2.1.2 主要仪器设备 |
2.2 方法 |
2.2.1 目的基因设计与优化合成 |
2.2.2 信号肽切割位点的信息学分析 |
2.2.3 引物设计与合成 |
2.2.4 O型FMDV抗原表位重组质粒的构建 |
2.2.5 pCI-neo-OME1 质粒鉴定 |
2.2.6 pCI-neo-OME1 质粒转染CHO细胞 |
2.2.7 Western blot鉴定CHO细胞培养基中O型 FMDV抗原表位重组蛋白累积 |
2.3 结果 |
2.3.1 信号肽切割位点的信息学分析结果 |
2.3.2 pCI-neo-OME1 质粒鉴定结果 |
2.3.3 不同信号肽介导的O型FMDV抗原表位重组蛋白质分泌水平差异结果 |
2.4 讨论 |
2.5 结论 |
第三章 分泌表达信号肽-HBcAg-O型 FMDV抗原表位基因工程CHO细胞系的构建 |
3.1 材料 |
3.1.1 主要试剂 |
3.1.2 主要仪器设备 |
3.2 方法 |
3.2.0 CRISPR/Cas9 基因打靶位置确定 |
3.2.1 设计引物扩增打靶区域序列及测序 |
3.2.2 设计sgRNA |
3.2.3 构建打靶质粒 |
3.2.4 打靶质粒鉴定 |
3.2.5 验证打靶质粒切割效率 |
3.2.6 确定同源臂,构建供体质粒 |
3.2.7 瞬时转染供体质粒验证表达 |
3.2.8 共转染打靶质粒和供体质粒加压筛选阳性克隆 |
3.2.9 筛选荧光细胞系 |
3.2.10 3'Junction PCR(右同源臂)鉴定细胞 |
3.2.11 5'Junction PCR(左同源臂)鉴定细胞 |
3.2.12 细胞系目的蛋白表达验证 |
3.3 结果 |
3.3.1 扩增打靶区域序列及测序结果 |
3.3.2 设计sgRNA结果 |
3.3.3 打靶质粒鉴定 |
3.3.4 打靶质粒切割效率结果 |
3.3.5 瞬时转染供体质粒验证表达结果 |
3.3.6 同源重组荧光细胞筛选结果 |
3.3.7 3’Junction PCR(右同源臂)鉴定细胞结果 |
3.3.8 5’Junction PCR(左同源臂)鉴定细胞结果 |
3.3.9 细胞系目的蛋白表达验证结果 |
3.4 讨论 |
3.5 结论 |
第四章 全文结论 |
参考文献 |
致谢 |
作者简历 |
(2)基于乙肝核心抗原病毒样颗粒及其衍生物颗粒性质的纯化和应用过程设计(论文提纲范文)
摘要 |
Abstract |
1 绪论 |
1.1 病毒样颗粒 |
1.1.1 病毒样颗粒的分类 |
1.1.2 病毒样颗粒的表达系统 |
1.1.3 病毒样颗粒的纯化 |
1.1.4 病毒样颗粒的表征技术 |
1.2 病毒样颗粒在疫苗中的应用 |
1.2.1 病毒样颗粒与免疫应答 |
1.2.2 病毒样颗粒为基础的预防性疫苗和治疗性疫苗 |
1.3 病毒样颗粒作为纳米药物载体的应用 |
1.3.1 病毒样颗粒为载药体系的装载技术 |
1.3.2 病毒样颗粒载药系统的免疫逃逸策略 |
1.3.3 病毒样颗粒载药系统的靶向策略 |
1.3.4 病毒样颗粒载药系统的药物控释 |
1.4 乙肝病毒核心抗原病毒样颗粒(HBc-VLP)概述 |
1.4.1 HBc-VLP的结构特点 |
1.4.2 HBc-VLP的免疫特性 |
1.4.3 HBc-VLP的表达与纯化制备 |
1.4.4 HBc-VLP在疫苗载体领域的应用 |
1.4.5 HBc-VLP在纳米载体领域中的应用 |
1.5 论文立题依据及研究内容 |
1.5.1 论文立题依据 |
1.5.2 论文研究内容 |
2 HBc-VLP发酵表达与理化性质分析 |
2.1 研究背景 |
2.2 材料与设备 |
2.2.1 工程菌 |
2.2.2 试剂与设备 |
2.3 实验方法 |
2.3.1 工程菌的发酵培养和蛋白的诱导表达 |
2.3.2 菌体的收集与破碎 |
2.3.3 超速离心法制备HBc-VLP及衍生物标准品 |
2.3.4 理化性质分析 |
2.4 实验结果与讨论 |
2.4.1 重组菌种的培养与诱导表达检测 |
2.4.2 HBc-VLP及衍生物定量方法的建立 |
2.4.3 HBc-VLP的诱导优化 |
2.4.4 HBc-VLP及衍生物的规模发酵 |
2.4.5 HBc-VLP及衍生物的理化性质分析 |
2.5 本章小结 |
3 基于HBc-VLP及其衍生物颗粒表面疏水特性的纯化制备 |
3.1 研究背景 |
3.2 材料与设备 |
3.2.1 工程菌 |
3.2.2 试剂与设备 |
3.3 实验方法 |
3.3.1 工程菌的发酵培养 |
3.3.2 菌体的收集与破碎 |
3.3.3 HBc-VLP以及衍生物标准品的制备 |
3.3.4 加热预处理初步纯化HBc-VLP |
3.3.5 离子交换层析纯化HBc-VLP |
3.3.6 HBc-VLP疏水层析填料筛选 |
3.3.7 疏水层析纯化HBc-VLP |
3.3.8 动态结合载量(DBC)的测定 |
3.3.9 凝胶过滤层析精制HBc-VLP |
3.3.10 HBc-VLP及衍生物表面疏水性质计算 |
3.3.11 HBc-VLP及其衍生物的疏水性检测 |
3.3.12 理化性质检测 |
3.4 实验结果与讨论 |
3.4.1 HBc-VLP加热预处理和离子交换层析纯化 |
3.4.2 HBc-VLP表面疏水性分析和疏水层析介质的筛选 |
3.4.3 凝胶过滤层析(SEC)精制HBc-VLP |
3.4.4 HBc-VLP纯化工艺的确定和批次重复实验 |
3.4.5 同源模拟HBc-VLP衍生物的结构及表面性质分析 |
3.4.6 ANS荧光法预测HIC的最佳盐浓度 |
3.4.7 动态色谱法确定HIC的最佳盐浓度 |
3.4.8 HBc-VLP的衍生物的纯化 |
3.5 本章小结 |
4 基于HBc-VLP颗粒热膨胀特性的双重加热纯化预处理策略 |
4.1 研究背景 |
4.2 材料与设备 |
4.2.1 工程菌 |
4.2.2 试剂与设备 |
4.3 实验方法 |
4.3.1 工程菌的发酵培养 |
4.3.2 菌体的收集与破碎 |
4.3.3 利用超离技术纯化不同热处理原料中的HBc-VLP |
4.3.4 HBc-VLP热稳定性研究 |
4.3.5 结构表征 |
4.3.6 宿主蛋白检测 |
4.3.7 两步梯度加热预处理细菌破碎上清液 |
4.3.8 疏水层析精制 |
4.3.9 二次加热制备的HBc-VLP免疫评价 |
4.4 实验结果与讨论 |
4.4.1 HBc-VLP热稳定性研究 |
4.4.2 热处理纯化HBc-VLP研究 |
4.4.3 HBc-VLP颗粒内部HCP测量 |
4.4.4 HBc-VLP包载HCP机理分析 |
4.4.5 二次梯度加热纯化HBc-VLP工艺建立 |
4.4.6 以二次梯度加热法为核心纯化纯化HBc-VLP为骨架的候选疫苗 |
4.5 本章小结 |
5 基于HBc-VLP颗粒纳米孔道热膨胀特性的内、外双抗原流感疫苗设计与制备 |
5.1 研究背景 |
5.2 材料与设备 |
5.2.1 工程菌 |
5.2.2 实验动物与毒株 |
5.2.3 实验试剂与材料 |
5.2.4 主要试剂配制 |
5.2.5 主要仪器与设备 |
5.3 实验方法 |
5.3.1 工程菌的发酵培养 |
5.3.2 菌体的收集与破碎 |
5.3.3 M2e-HBc的制备 |
5.3.4 M2e-HBc加热装载NP制备双抗原流感疫苗 |
5.3.5 双抗原流感疫苗的结构表征 |
5.3.6 小鼠动物模型免疫与攻毒实验 |
5.3.7 ELISA检测血清抗体滴度 |
5.4 实验结果与讨论 |
5.4.1 内、外双抗原流感疫苗的制备 |
5.4.2 内、外双抗原流感疫苗的结构检测 |
5.4.3 内、外双抗原流感疫苗免疫抗体水平检测 |
5.4.4 内、外双抗原流感疫苗抗体分型检测 |
5.4.5 内、外双抗原流感疫苗攻毒保护力评价 |
5.5 本章小结 |
6 基于HBc-VLP颗粒特性的阿霉素药物装载与控释 |
6.1 研究背景 |
6.2 材料与设备 |
6.2.1 常规实验材料与药品 |
6.2.2 细胞、动物及相关耗材 |
6.3 实验方法 |
6.3.1 HBc-VLP为载体装载DOX制备HBc-DOX (HD) |
6.3.2 HD颗粒表面通过PEG偶联RGD制备HBc-DOX-PEG-RGD |
6.3.3 HBc-VLP载药量的确定 |
6.3.4 理化性质检测与颗粒表征 |
6.3.5 体外药物释放检测 |
6.3.6 MTT毒性试验考察HDPR的细胞毒性 |
6.3.7 流式细胞仪检测HDPR的细胞内吞情况 |
6.3.8 激光共聚焦检测HDPR的细胞摄取 |
6.3.9 体内荧光成像与器官分布研究 |
6.3.10 体内抑瘤实验 |
6.4 实验结果与讨论 |
6.4.1 HBc-VLP热装载DOX初步探究 |
6.4.2 HBc-VLP装载DOX药量的计算方法的建立 |
6.4.3 HBc-VLP热装载DOX条件优化 |
6.4.4 HBc-VLP加热装载DOX与传统解聚-再组装法装载效率的比较 |
6.4.5 HBc-Dox表面化学修饰RGD靶向肽 |
6.4.6 HBc-DOX-PEG-RGD (HDPR)的体外稳定性以及智能释放性能 |
6.4.7 游离和装载于HBc-VLP中的DOX体外细胞毒性 |
6.4.8 HBc-VLP装载对DOX胞内摄取的影响 |
6.4.9 游离和装载于HBc-VLP中的DOX胞内定位 |
6.4.10 药物的肿瘤靶向性以及抑瘤活性评价 |
6.4.11 HDPR肿瘤靶向性和高抑瘤活性的机理分析与讨论 |
6.5 本章小结 |
7 结论与展望 |
7.1 概要 |
7.2 本论文的主要结论 |
7.3 本论文的创新点 |
7.4 展望 |
参考文献 |
附录A 英文缩写对照表 |
个人简历及攻读学位期间发表的学术论文与科研成果 |
作者简历 |
获奖情况 |
已发表的文章目录 |
申请专利目录 |
致谢 |
(3)基于乙肝病毒核心蛋白病毒样颗粒的诊断治疗一体化探针研究(论文提纲范文)
摘要 |
Abstract |
第一章 绪论 |
1.1 蛋白纳米笼 |
1.1.1 病毒样颗粒 |
1.2 病毒样颗粒的修饰方法 |
1.3 病毒样颗粒在医学中的应用 |
1.3.1 病毒样样颗粒作为疫苗的应用 |
1.3.1.1 基于病毒样颗粒的商业化疫苗 |
1.3.1.2 病毒样颗粒作为肿瘤疫苗的研究 |
1.3.1.3 病毒样颗粒作为抗病原微生物感染疫苗的研究 |
1.3.2 病毒样样颗粒作为药物载体的应用 |
1.3.2.1 病毒样颗粒作为化疗药物载体的应用 |
1.3.2.2 病毒样颗粒作为光敏剂载体的应用 |
1.3.2.3 病毒样颗粒在基因治疗方面的应用 |
1.3.2.4 病毒样颗粒在分子影像方面的应用 |
1.4 本论文的选题思路及研究内容 |
1.5 参考文献 |
第二章 基于HBcVLPs的纳米靶向化疗药物载体系统的构建、表征与应用研究 |
2.1 引言 |
2.2 实验部分 |
2.2.0 仪器与设备 |
2.2.1 实验材料与试剂 |
2.2.2 常用溶液的配制 |
2.2.3 实验方法 |
2.2.3.1 基因修饰的HBc VLPs的构建 |
2.2.3.2 表达和纯化基因修饰的HBc VLPs |
2.2.3.3 Western Blot分析 |
2.2.3.4 DOX的装载 |
2.2.3.5 pH依赖的药物释放 |
2.2.3.6 形貌观察 |
2.2.3.7 小鼠和细胞系来源 |
2.2.3.8 细胞毒性 |
2.2.3.9 共聚焦荧光显微镜观察细胞摄取效率 |
2.2.3.10 流式细胞术分析细胞摄取效率 |
2.2.3.11 荷瘤小鼠活体成像分析 |
2.2.3.12 肿瘤组织免疫荧光分析 |
2.2.3.13 放射性配体与受体结合分析实验 |
2.2.3.14 体内抗肿瘤活性评估 |
2.2.3.15 病毒样颗粒系统毒性评估 |
2.2.3.16 统计分析 |
2.3 结果与讨论 |
2.3.1 基因修饰的HBc VLPs的设计及表征 |
2.3.2 DOX装载 |
2.3.3 体外释放DOX研究 |
2.3.4 细胞毒性和体外细胞摄取效率研究 |
2.3.5 RGD-HBc-NS5A VLPs在体内的肿瘤靶向性研究 |
2.3.6 RGD-HBc-NS5A/DOX VLPs对荷瘤小鼠抗肿瘤效果评价 |
2.3.7 体内安全性评价 |
2.4 本章小结 |
2.5 参考文献 |
第三章 基于HBc VLPs的纳米靶向诊疗系统的构建、表征与应用研究 |
3.1 引言 |
3.2 研究方法 |
3.2.1 仪器与设备 |
3.2.2 实验材料与试剂 |
3.2.3 实验方法 |
3.2.3.1 RGD-HBc VLPs的设计、制备 |
3.2.3.2 RGD-HBc/ICG VLPs的制备和表征 |
3.2.3.3 RGD-HBc/ICG VLPs稳定性检测 |
3.2.3.4 RGD-HBc/ICG VLPs的体外光热响应强度测定 |
3.2.3.5 RGD-HBc/ICG VLPs的体外单线态氧产生测定 |
3.2.3.6 RGD-HBc/ICG VLPs的体外光声信号测定 |
3.2.3.7 细胞和动物来源 |
3.2.3.8 RGD-HBc/ICG VLPs的细胞摄取 |
3.2.3.9 RGD-HBc/ICG VLPs的细胞光毒性测定 |
3.2.3.10 RGD-HBc/ICG VLPs体内荧光和光声成像 |
3.2.3.11 RGD-HBc/ICG VLPs的体内光热/光动力测定 |
3.2.3.12 肿瘤组织中氧化应激水平检测 |
3.2.3.13 主要器官及肿瘤的组织学分析 |
3.2.3.14 统计学分析 |
3.3 研究结果 |
3.3.1 RGD-HBc/ICG VLPs的制备与表征 |
3.3.2 RGD-HBc/ICG VLPs的稳定性研究 |
3.3.3 RGD-HBc/ICG VLPs的体外光热、光动力、光声效果评价 |
3.3.4 RGD-HBc/ICG VLPs的体外细胞内摄取和体外细胞毒性研究 |
3.3.5 RGD-HBc/ICG VLPs的体内荧光和光声成像研究 |
3.3.6 RGD-HBc/ICG VLPs的体内光热和光动力研究 |
3.3.7 RGD-HBc/ICG VLPs的体内抗肿瘤研究 |
3.4 本章小结 |
3.5 参考文献 |
第四章 基于HBc VLPs的纳米肿瘤疫苗的构建、表征与应用研究 |
4.1 引言 |
4.2 实验部分 |
4.2.1 仪器与设备 |
4.2.2 实验材料与试剂 |
4.2.3 常用溶液的配制 |
4.2.4 实验方法 |
4.2.4.1 OVA-HBc蛋白的设计 |
4.2.4.2 OVA-HBc VLPs的表达和纯化 |
4.2.4.3 小鼠和细胞系来源 |
4.2.4.4 BMDC细胞的获取 |
4.2.4.5 CFSE法检测抗原特异的T细胞增殖与胞内分泌IFN-γ的检测 |
4.2.4.6 体内特异性杀伤实验 |
4.2.4.7 淋巴结荧光成像 |
4.2.4.8 B16-OVA肿瘤预防及治疗实验 |
4.2.4.9 荷瘤小鼠生物发光成像 |
4.2.4.10 肿瘤浸润淋巴细胞的分离与检测 |
4.2.4.11 数据统计分析 |
4.3 结果与讨论 |
4.3.1 OVA-HBc VLPs的表征 |
4.3.2 OVA-HBc VLPs诱导BMDC成熟 |
4.3.3 OVA-HBc VLPs在淋巴结迁移研究 |
4.3.4 OVA-HBc VLPs诱导体内CTL反应的研究 |
4.3.5 OVA-HBc VLPs诱导OT-I细胞增殖及IFN-γ分泌研究 |
4.3.6 OVA-HBc VLPs作为抗肿瘤疫苗的体内肿瘤预防实验评价 |
4.3.7 OVA-HBc VLPs作为治疗性疫苗的体内抗肿瘤实验结果 |
4.4 本章小结 |
4.5 参考文献 |
第五章 总结与展望 |
5.1 总结 |
5.2 展望 |
附录Ⅰ 主要符号对照表 |
附录Ⅱ 目的蛋白氨基酸序列及对应核酸编码序列 |
附录Ⅲ 载体构建测序结果 |
在学期间发表论文 |
致谢 |
(4)O型口蹄疫病病毒多表位免疫原和表位嵌合病毒样颗粒研制及其免疫原性评价(论文提纲范文)
致谢 |
中文摘要 |
文献综述 |
1.口蹄疫 |
1.1 口蹄疫概况 |
1.2 世界范围内口蹄疫流行情况 |
1.3 中国口蹄疫流行情况 |
1.4 口蹄疫防控 |
2.口蹄疫病毒的基本特性 |
2.1 生物学特性 |
2.2 病毒基因组组成及其功能 |
3.口蹄疫疫苗研究进展 |
3.1 弱毒疫苗 |
3.2 灭活疫苗 |
3.3 基因工程亚单位疫苗 |
3.4 表位疫苗 |
3.4.1 表位疫苗免疫学理论基础 |
3.4.2 抗原表位筛选与鉴定 |
3.4.3 表位疫苗的设计 |
3.4.4 表位之间的连接 |
3.4.5 口蹄疫表位疫苗 |
3.5 病毒样颗粒疫苗 |
3.6 活载体疫苗 |
3.7 核酸疫苗 |
3.8 总结 |
第二部分 研究内容 |
第一章 FMDV串联重组表位抗原的制备和免疫原性研究 |
1 材料和方法 |
1.1 试验材料 |
1.1.1 质粒、动物、灭活病毒、商业疫苗和佐剂 |
1.1.2 主要试剂和试剂盒 |
1.1.3 仪器设备 |
1.1.4 试剂配制 |
1.2 试验方法 |
1.2.1 多表位基因的设计及合成 |
1.2.2 目的基因片段和粘性末端线性化载体的获得 |
1.2.3 重组质粒构建 |
1.2.4 重组质粒的筛选与鉴定 |
1.2.5 重组串联蛋白表达与纯化 |
1.2.6 重组串联重复表位蛋白的纯化和复性 |
1.2.7 串联重组多表位蛋白的环化 |
1.2.8 复性串联重组多表位蛋白免疫活性测定 |
1.2.9 重组串联重复表位蛋白在豚鼠内引起的免疫反应分析 |
1.2.10 佐剂的筛选 |
1.2.11 候选重组多表位蛋白在猪体内引起的抗体水平 |
1.2.12 猪攻毒保护试验 |
1.3 结果与分析 |
1.3.1 多表位串联重组表位蛋白构建策略 |
1.3.2 重组质粒构建 |
1.3.3 重组载体鉴定 |
1.3.4 重组蛋白表达 |
1.3.5 重组蛋白纯化和复性 |
1.3.6 .复性蛋白免疫活性检测 |
1.3.7 重组多表位蛋白引起豚鼠免疫反应分析 |
1.3.8 佐剂筛选 |
1.3.9 rP2引起猪产生抗FMDV特异性抗体检测 |
1.3.10 攻毒试验 |
2 讨论 |
3 小结 |
第二章 噬菌体MS2介导的口蹄疫主要抗原表位G-H环嵌合病毒样颗粒免疫原性研究 |
1 材料和方法 |
1.1 试验材料 |
1.1.1 质粒、灭活病毒、灭活疫苗和佐剂 |
1.1.2 主要试剂和试剂盒 |
1.1.3 仪器设备 |
1.2 试验方法 |
1.2.1 引物设计 |
1.2.2 重组质粒的构建 |
1.2.3 重组蛋白的表达及可溶性分析 |
1.2.4 重组蛋白的纯化 |
1.2.5 重组蛋白的物理表征 |
1.2.6 重组蛋白免疫活性检测 |
1.2.7 疫苗制备及小鼠免疫 |
1.2.8 嵌合病毒样颗粒和串联重复蛋白豚鼠免疫 |
1.3 试验结果 |
1.3.1 RT‐PCR和 SOE‐PCR获得目的基因 |
1.3.2 重组质粒的鉴定 |
1.3.3 重组蛋白可溶性分析 |
1.3.4 重组蛋白纯化结果 |
1.3.5 重组蛋白免疫活性分析 |
1.3.6 病毒样颗粒物理表征 |
1.3.7 嵌合病毒样颗粒和串联多表位蛋白在小鼠体内免疫反应评价 |
1.3.8 嵌合病毒样颗粒和串联多表位蛋白在豚鼠体内免疫反应检测 |
2 讨论 |
3 小结 |
全文总结 |
参考文献 |
第三部分 附录部分 |
附录A 缩略词表 |
附录B 攻毒博士期间发表及待发表的学术论文 |
Abstract |
(5)肠道病毒71型(EV71)和柯萨奇病毒A16型(CA16)多抗原表位嵌合病毒样颗粒的构建及其免疫原性研究(论文提纲范文)
摘要 Abstract 第一章 引言 |
1.1 概述 |
1.2 流行病学 |
1.3 基因组结构及其编码蛋白质 |
1.4 肠道病毒感染与免疫 |
1.5 手足口病疫苗研究现状 |
1.5.1 减毒活疫苗 |
1.5.2 灭活疫苗 |
1.5.3 表位疫苗 |
1.5.4 亚单位疫苗 |
1.5.5 DNA疫苗 |
1.5.6 病毒样颗粒疫苗 |
1.6 乙肝病毒core蛋白(HBc)与病毒样颗粒(VLPs) |
1.7 手足口病疫苗效力评价的相关动物模型 |
1.8 杆状病毒表达系统与重组疫苗的研究 |
1.9 本研究目的与意义 第二章 HBc为载体的EV71和CA16嵌合抗原表位病毒样颗粒的制备及其免疫原性 |
2.1 实验材料 |
2.1.1 实验仪器 |
2.1.2 细胞、病毒、菌株、质粒、工具酶、试剂及实验动物 |
2.1.3 主要试剂配制 |
2.2 实验方法 |
2.2.1 分子克隆方法 |
2.2.2 重组蛋白的诱导表达与鉴定 |
2.2.3 细胞实验细胞的复苏、传代与冻存 |
2.2.4 动物实验 |
2.2.5 免疫检测 |
2.3 实验结果 |
2.3.1 HBc为载体的EV71和CA16嵌合抗原表位病毒样颗粒的制备 |
2.3.2 嵌合病毒样颗粒诱导特异性体液免疫应答 |
2.3.3 嵌合病毒样颗粒诱导特异性细胞免疫应答 |
2.3.4 EV71小鼠适应株(Mouse adapted virus,MAV) EV71的制备 |
2.3.5 嵌合病毒样颗粒诱导抗EV71和CA16感染的主动免疫保护 |
2.3.6 嵌合病毒样颗粒诱导抗EV71和CA16感染的被动免疫保护 |
2.4 讨论 |
2.5 研究总结 第三章 基于杆状病毒表达EV71和CA16重组抗原表位嵌合病毒样颗粒的制备与鉴定 |
3.1 实验材料 |
3.1.1 相关仪器 |
3.1.2 细胞细胞、病毒、菌株、质粒、工具酶、试剂 |
3.1.3 培养基及溶液配制 |
3.2 实验方法 |
3.2.1 细胞培养 |
3.2.2 重组转移质粒的构建 |
3.2.3 重组转移质粒在DH10MultiBac中的同源重组 |
3.2.4 重组Bacmid的提取 |
3.2.5 重组Bacmid的转染和重组杆状病毒的拯救 |
3.2.6 重组杆状病毒的免疫荧光检测 |
3.2.7 重组杆状病毒基因组DNA的提取 |
3.2.8 重组杆状病毒的增殖 |
3.2.9 杆状病毒的滴度测定 |
3.2.10 重组嵌合蛋白蛋白表达与鉴定 |
3.2.11 重组嵌合蛋白纯化 |
3.3 实验结果 |
3.3.1 重组转移质粒pFBDM P1-C3CD、pFBDM P1/SP70-C3CD、pFBDMP1/4M-C3CD的构建与鉴定 |
3.3.2 杆状病毒BacP1-C3CD、BacP1/SP70-C3CD、BacP1/4M-C3CD的拯救与鉴定 |
3.3.3 VLPs P1-C3CD VLPs P1/SP70-C3CD、VLPs P1/4M-C3CD的表达与鉴定 |
3.3.4 VLPs P1-C3CD、 VLPs P1/SP70-C3CD、VLPs P1/4M-C3CD的纯化与电镜观察 |
3.4 讨论 |
3.5 研究总结 总结与展望 参考文献 攻博期间发表的科研成果 致谢 附录 |
(6)磁性人工抗原提呈细胞微孔反应板的研制及HBV抗原特异性T细胞数量与功能的检测(论文提纲范文)
中文摘要 |
英文摘要 |
主要英文缩写词 |
前言 |
参考文献 |
文献综述 |
参考文献 |
第一章 基于自制关键试剂的aAPC-microplate技术同步检测AST细胞数量和反应活性的方法学论证 |
前言 |
第一节 H-2K~b/OVA_(257-264)单链三聚体分子的构建、表达与验证 |
1. 材料 |
2. 方法 |
3. 结果 |
4. 讨论 |
第二节 利用aAPC-m icroplate同步检测对OVA_(257-264)抗原特异性T细胞的数量和反应活性 |
1. 材料 |
2. 方法 |
3. 结果 |
4. 讨论 |
本章小结 |
第二章 HLA-1类等位基因的筛选和重组质粒构建以及HBV特异性抗原表位肽的预测 |
前言 |
第一节 HLA-A、-B等位基因分型与筛选 |
1. 材料 |
2. 方法 |
3. 结果 |
4. 讨论 |
第二节 HLA-A等位基因重链与轻链重组质粒的构建与表达 |
1. 材料 |
2. 方法 |
3. 结果 |
4. 讨论 |
第三节 HLA-A分子限制性HBV抗原表位肽的预测 |
1. 材料 |
2. 方法 |
3. 结果 |
4. 讨论 |
本章小结 |
第三章 利用aAPC-microplate技术同步检测HBV抗原特异性T细胞的数量和反应活性 |
前言 |
第一节 HLA-A2/HBc_(18-27)/HBs_(183-191)单链三聚体的构建、表达与验证 |
1. 材料 |
2. 方法 |
3. 结果 |
4. 讨论 |
第二节 aAPC-microplate技术对HBV抗原特异性T细胞数量和功能检测 |
1. 材料 |
2. 方法 |
3. 结果 |
4. 讨论 |
本章小结 |
全文总结 |
参考文献 |
致谢 |
作者简介 |
(7)O型口蹄疫病毒VP1蛋白GH loop表位表面展示策略与免疫原性研究(论文提纲范文)
摘要 |
ABSTRACT |
英文缩略词表 |
上篇 第一章文献综述 |
1 口蹄疫病毒疫苗研究进展 |
1.1 FMD病原学及分子生物学研究 |
1.2 FMDV疫苗研究现状 |
1.3 FMDV疫苗存在的问题 |
1.4 展望 |
2 抗原表位表面展示系统研究进展 |
2.1 VLPs表面展示系统研究进展 |
2.2 CTB表面展示系统研究进展 |
2.3 其他几种常见的表面展示系统 |
3 猪圆环病毒2型疫苗研究进展 |
3.1 PCV2病原学及分子生物学研究 |
3.2 PCV2 Cap蛋白结构研究进展 |
3.3 PCV2疫苗研究现状 |
3.4 展望 |
参考文献 |
下篇 试验研究 |
第二章 基因替换构建PCV2 Cap为骨架展示FMDV GH loop的嵌合VLPs |
1 材料与方法 |
1.1 材料 |
1.2 方法 |
2 结果 |
2.1 重组质粒PQZ-Cap-GH loop重组表达质粒的鉴定 |
2.2 重组蛋白Cap-loops的表达和可溶性鉴定 |
2.3 重组蛋白Cap-GH loop免疫原性的鉴定 |
2.4 病毒样颗粒的组装 |
2.5 重组蛋白浓缩纯化的鉴定 |
2.6 动物实验结果 |
3 讨论 |
参考文献 |
第三章 基因插入构建PCV2 Cap为骨架展示FMDVGH loop的嵌合VLPs |
1 材料与方法 |
1.1 材料 |
1.2 方法 |
2 结果 |
2.1 重组表达质粒pQZ-Cap-iGH loop的鉴定 |
2.2 重组蛋白Cap-iGH loop的表达和可溶性鉴定 |
2.3 重组蛋白Cap-iGH loop免疫原性的鉴定 |
2.4 嵌合病毒样颗粒组装 |
2.5 重组蛋白浓缩纯化的鉴定 |
2.6 动物实验结果 |
3 讨论 |
参考文献 |
第四章 以CTB为载体展示FMDVGH loop抗原表位方法的研究 |
1 材料与方法 |
1.1 材料 |
1.2 方法 |
2 结果 |
2.1 重组表达质粒的鉴定 |
2.2 重组蛋白的表达和可溶性鉴定 |
2.3 重组菌表达产物的Western-blot分析 |
2.4 重组蛋白五聚体形成鉴定 |
2.5 重组蛋白免疫动物体液免疫反应 |
2.6 淋巴细胞增殖检测结果 |
3 讨论 |
参考文献 |
全文总结 |
攻读硕士学位期间研究成果 |
致谢 |
(8)乙型肝炎疫苗新制剂方案的免疫原性研究(论文提纲范文)
英文缩略词表 |
前言 |
中文摘要 |
ABSTRACT |
第一部分 嵌合HBV优势表位的HBC病毒样颗粒的构建、纯化与鉴定 |
1 实验材料 |
1.1 菌株和质粒 |
1.2 实验用抗体或抗原 |
1.3 分子生物学实验试剂 |
1.4 蛋白表达纯化试剂 |
1.5 层析介质 |
1.6 主要仪器 |
1.7 常用溶液配制 |
1.8 重组表达质粒提取的溶液配制 |
1.9 分子生物学分析软件 |
2 实验方法 |
2.1 嵌合HBV优势表位的HBc基因片段的获取 |
2.2 嵌合HBV优势表位的HBc表达质粒的构建 |
2.3 嵌合HBV优势表位的HBc表达基因的表达 |
2.4 嵌合HBV优势表位的HBc病毒样颗粒的纯化 |
2.5 嵌合HBV优势表位的HBc病毒样颗粒的鉴定 |
3 实验结果 |
3.1 H2病毒样颗粒的获取实验结果 |
3.2 H3病毒样颗粒的获取实验结果 |
3.3 H8病毒样颗粒的获取实验结果 |
3.4 H9病毒样颗粒的获取实验结果 |
3.5 H10构建实验结果 |
3.6 H11病毒样颗粒的获取实验结果 |
3.7 S47病毒样颗粒的获取实验结果 |
3.8 H20构建实验结果 |
3.9 H21构建实验结果 |
3.10 Western Blotting实验结果 |
3.11 ELISA实验结果 |
4 实验讨论 |
4.1 抗原表位和HBc骨架的选择 |
4.2 系列病毒样颗粒的组装 |
4.3 系列病毒样颗粒的抗原性 |
4.4 病毒样颗粒表面展示HBV优势表位 |
5 实验小结 |
5.1 获取表达基因 |
5.2 组装病毒样颗粒 |
5.3 纯化病毒样颗粒 |
5.4 验证病毒样颗粒 |
第二部分 生物佐剂PROTEIN D与实验用偶联疫苗制剂的制备 |
1 实验方法 |
1.1 H17的构建 |
1.2 H17蛋白的表达 |
1.3 H17蛋白的纯化 |
1.4 H17-HBsAg的偶联 |
1.5 双抗体夹心法评价偶联效价 |
2 实验结果 |
2.1 H17基因片段的获取 |
2.2 H17表达质粒的构建 |
2.3 H17测序和双酶切鉴定 |
2.4 H17小量表达和大量表达 |
2.5 H17-DEAE纯化 |
2.6 H17-WB检测 |
2.7 H17-HBsAg偶联效价 |
3 实验讨论 |
3.1 H17基因片段的选取 |
3.2 H17蛋白的纯化 |
3.3 H17-HBsAg偶联 |
4 实验小结 |
4.1 H17基因片段的获取 |
4.2 H17蛋白的表达与纯化 |
4.3 H17-HBsAg的偶联 |
第三部分 乙型肝炎疫苗新制剂方案的免疫原性研究 |
1 实验材料 |
1.1 免疫用佐剂 |
1.2 免疫用实验动物 |
1.3 实验试剂 |
1.4 实验仪器 |
1.5 常用溶液配制 |
2 实验方法 |
2.1 动物免疫 |
2.2 免疫动物的检测 |
3 实验结果 |
3.1 H8免疫动物实验结果 |
3.2 H11免疫动物实验结果 |
3.3 H17-HBsAg免疫动物实验结果 |
4 实验讨论 |
4.1 H8动物免疫评价 |
4.2 H11动物免疫评价 |
4.3 H17-HBsAg动物免疫评价 |
5 实验小结 |
5.1 H8病毒样颗粒的免疫效果 |
5.2 H11病毒样颗粒的免疫效果 |
5.3 H17-HBsAg的免疫效果 |
全文总结 |
参考文献 |
论文综述 |
参考文献 |
个人简历 |
致谢 |
(9)现有乙型肝炎多表位疫苗在中国人群中的理论免疫效果评价(论文提纲范文)
1 材料与方法 |
1.1 材料 |
1.2 方法 |
1.2.1 HBV多表位疫苗理论免疫应答率的估计方法 |
1.2.2 计算现有的HBV多表位DNA疫苗在中国人群中的理论免疫应答率 |
1.2.3 理论免疫效果评价方法 |
2 结 果 |
2.1 HLA-A2限制性HBV多表位疫苗对中国人群的理论免疫应答率 |
2.2 HLA-A2、A3 (A11) 限制性HBV多表位疫苗对中国人群的理论免疫应答率 |
2.3 HLA-A1、A2、A3、A24、B7限制性HBV多表位疫苗对中国人群的理论免疫应答率 |
3 讨 论 |
(10)乙型肝炎病毒全基因组序列变异性的空间遗传结构研究(论文提纲范文)
中文摘要 ABSTRACT 符号说明 前言 材料与方法 1 |
资料来源与空间数据库的建立 2 |
分子进化与系统发生分析 3 |
空间遗传学分析方法 结果与分析 1.HBV系统发生分析结果 2.二维图论聚类分析结果 3.HBV序列变异性的空间异质性地理界限分析 讨论 1.HBV全基因组序列变异性的空间遗传结构特征及其解析 2.HBV序列变异性的空间遗传结构研究的应用前景 3.HBV序列变异性的空间遗传结构分析方法 结论 创新与不足 附录 参考文献 致谢 攻读学位期间发表的学术论文题目 学位论文评阅及答辩情况表 外文论文 |
四、以HBc颗粒为呈现载体的HBV多表位复合基因真核表达载体的构建(论文参考文献)
- [1]CHO细胞源口蹄疫多表位疫苗的初步研究[D]. 孙振文. 中国农业科学院, 2020(01)
- [2]基于乙肝核心抗原病毒样颗粒及其衍生物颗粒性质的纯化和应用过程设计[D]. 李正军. 中国科学院大学(中国科学院过程工程研究所), 2018(02)
- [3]基于乙肝病毒核心蛋白病毒样颗粒的诊断治疗一体化探针研究[D]. 单文俊. 厦门大学, 2018(06)
- [4]O型口蹄疫病病毒多表位免疫原和表位嵌合病毒样颗粒研制及其免疫原性评价[D]. 王国强. 河南农业大学, 2018
- [5]肠道病毒71型(EV71)和柯萨奇病毒A16型(CA16)多抗原表位嵌合病毒样颗粒的构建及其免疫原性研究[D]. 霍春玲. 武汉大学, 2017(02)
- [6]磁性人工抗原提呈细胞微孔反应板的研制及HBV抗原特异性T细胞数量与功能的检测[D]. 许涛. 东南大学, 2017(02)
- [7]O型口蹄疫病毒VP1蛋白GH loop表位表面展示策略与免疫原性研究[D]. 李图帅. 南京农业大学, 2016(05)
- [8]乙型肝炎疫苗新制剂方案的免疫原性研究[D]. 苏秋东. 中国疾病预防控制中心, 2014(04)
- [9]现有乙型肝炎多表位疫苗在中国人群中的理论免疫效果评价[J]. 薛皓,张颖倩,薛付忠,马春红. 山东大学学报(医学版), 2009(10)
- [10]乙型肝炎病毒全基因组序列变异性的空间遗传结构研究[D]. 孙林. 山东大学, 2009(04)