一、骨肉瘤细胞增殖活性的测定及其与预后的关系（论文文献综述）
邱仁娜[1]（2021）在《氯喹协同载阿霉素还原响应性纳米凝胶抗骨肉瘤的作用与机制研究》文中提出背景骨肉瘤是一种原发的恶性骨肿瘤,其恶性度高,生长迅速,转移早,预后差,是青少年癌症死亡的主要原因。目前在发病原因、生物学行为、辅助治疗方式以及评价手段等方面仍存在较多尚待解决的问题,药物的副作用和耐药是化学治疗的主要不足,迫切需要改进策略,以提高治疗效果和安全性。与传统化疗药物相比,纳米药物具有血液循环时间长、肿瘤选择性高、对肿瘤微环境敏感、可控释放等特点,其中具有刺激响应性的聚氨基酸纳米凝胶能够在刺激条件（pH、谷胱甘肽、酶等）下发生形貌或性能方面的转变如溶胀或解组装,帮助纳米药物克服体内多重的生物屏障、显着改善纳米药物的靶向输送和释放,从而提高纳米药物的疗效,并减轻对正常组织的副作用。氯喹能够增加溶酶体的pH值并阻止溶酶体与自噬体的融合,理论上可以帮助纳米药物发生溶酶体逃逸,加速纳米药物在细胞内的药物释放。近些年研究发现,细胞内的自噬异常与肿瘤的发生发展密切相关,氯喹作为一种经典的自噬抑制剂,其抗肿瘤作用得到了广泛的研究。在骨肉瘤的发生发展过程中自噬是作为肿瘤抑制机制促进细胞死亡,还是作为肿瘤存活机制介导耐药性的产生,尚存在争议。目的本研究通过合理设计纳米药物载体,用于克服阿霉素在体内循环、肿瘤富集、肿瘤渗透、细胞内吞和细胞内释放过程中的障碍,达到增效、减毒的目的,并阐明氯喹协同抗骨肉瘤作用的机制。方法1.以mPEG113-NH2为大分子引发剂,引发L-Phe NCA和L-Cys NCA开环聚合制备共聚物mPEG113-P（Phe-co-Cys）,核磁共振波谱、动态光散射（dynamic light scattering,DLS）、透射电镜（transmission eletron microscope,TEM）、傅里叶变换红外光谱分析、元素分析和凝胶渗透色谱分析共聚物的化学结构、粒径和形貌特征,验证稳定性和还原响应性,MTT法检测体外生物相容性。2.纳米沉淀法制备载阿霉素还原响应性纳米凝胶（简称NGs/Dox）,测定载药量和载药效率,DLS、TEM进行粒径和粒子形貌分析,体外阿霉素累积释放曲线和激光共聚焦扫描显微镜（confocal laser scanning microscopy,CLSM）、流式细胞术检测体外释放行为,MTT法检测体外细胞毒性,并验证还原响应性。3.MTT法检测氯喹联合NGs/Dox的体外抗骨肉瘤效果,并考察两药联合应用后的作用性质。4.流式细胞术观察氯喹对于骨肉瘤细胞摄取NGs/Dox的影响,CLSM观察氯喹对于NGs/Dox发生溶酶体逃逸的影响。TEM观察氯喹处理前后骨肉瘤细胞内自噬体的数量变化,Western Blot检测LC3 Ⅰ、LC3 Ⅱ和P62蛋白的表达。5.高效液相色谱法检测SD大鼠血清中阿霉素随时间变化的浓度,经PK solver程序处理数据获得NGs/Dox和阿霉素的清除半衰期、时间曲线下面积、清除率。6.Maestro活体荧光成像系统观察阿霉素荧光在骨肉瘤荷瘤小鼠各脏器和肿瘤的分布情况,并进行半定量分析。7.观察骨肉瘤荷瘤小鼠的肿瘤体积与一般情况、体重变化趋势,并在开始治疗的第21天获取血清、肿瘤组织及各主要脏器,进行生化、组织病理学检测及免疫组织化学分析。结果1.成功制备共聚物mPEG113-P（Phe10-co-Cys5）,TEM结果显示共聚物mPEG113-P（Phe10-co-Cys5）在水溶液中可自组装成球形纳米凝胶（简称NGs）,半径为30.56±3.21nm。DLS测定纳米凝胶半径为40.2±22.7nm,0、2、6、12和24小时粒径均未发生明显变化,在含有10.0mM GSH的PBS中,粒径呈现增大趋势。随着纳米凝胶浓度的增加和时间的推移,两种骨肉瘤细胞的生存率始终维持在95%以上。2.TEM显示NGs/Dox仍呈现出规则的球形外貌,半径为41.67±7.17nm,DLS测得的半径为62.4±32.2nm。3.与阿霉素相比,NGs/Dox表现出持续释放的同时,并未出现明显的突释现象。GSH+组测得的阿霉素释放率均高于GSH-组（72小时P<0.001）。CLSM结果显示随着时间的推移,两种骨肉瘤细胞对于NGs/Dox的摄取逐渐增加,并且逐渐向细胞核内集中。与GSH-组相比,GSH+组细胞内,尤其是细胞核内观察到更强的阿霉素荧光。流式细胞术结果显示NGs/Dox与两种骨肉瘤细胞分别共培养2/6小时,GSH+组细胞内阿霉素荧光强度和阿霉素荧光阳性细胞比例均较GSH-组明显增加。4.NGs/Dox在浓度0.04～10.00mg/L范围内,对于两种骨肉瘤细胞的体外增殖均有一定程度的抑制作用,相较于NGs/Dox（GSH-）组、Dox组,NGs/Dox（GSH+）组能够更加高效地抑制两种骨肉瘤细胞的体外增殖。与CQ-组相比,CQ+组所有检测浓度（0.04～10.00mg/L）的NGs/Dox、阿霉素对于两种骨肉瘤细胞,均表现出更强的细胞增殖抑制作用,阿霉素或NGs/Dox与氯喹联合应用的性质为协同作用。5.CLSM结果显示在没有20.0μM氯喹预处理的条件下,NGs/Dox被细胞摄取4小时发生溶酶体逃逸,在20.0μM氯喹预处理的条件下NGs/Dox被细胞摄取2小时即可发生溶酶体逃逸,继而释放出阿霉素进入细胞核发挥作用。TEM示与对照组相比,在高倍镜下可以观察到大量自噬体。Western blot结果显示相对于CQ-组,CQ+组P62、LC3 Ⅱ表达量均升高。6.药代动力学结果显示NGs/Dox、阿霉素的清除半衰期分别为16.15±2.86、5.64±0.7小时（P<0.001）。NGs/Dox的时间曲线下面积是阿霉素的11.54倍（P<0.001）,而阿霉素的清除效率则为NGs/Dox的7.12倍（P<0.01）。7.离体荧光成像结果显示与阿霉素相比,NGs/Dox在尾静脉给药后的1、6和12小时在肿瘤内均具有更高的荧光强度,12小时的荧光强度半定量结果显示,肿瘤中NGs/Dox组的荧光信号强度值较Dox组明显升高（皮下瘤和原位瘤模型分别为P<0.01,P<0.001）。8.对照组肿瘤体积增长最为迅速,其他治疗组的肿瘤生长均受到不同程度的抑制,大小趋势为 NGs/Dox（CQ+）组<NGs/Dox 组<Dox（CQ+）组<Dox 组<CQ组<对照组。两种荷瘤模型各组间相对肿瘤坏死面积趋势的结果:NGs/Dox（CQ+）组>NGs/Dox 组>Dox（CQ+）组>Dox 组>CQ 组>对照组。各组间 cleaved caspase-3荧光强度的趋势为NGs/Dox组>Dox组>对照组,Ki-67的荧光强度趋势与 cleaved caspase-3 正相反,NGs/Dox（CQ+）组<NGs/Dox 组<Dox（CQ+）组<Dox组<CQ组<对照组。9.荷瘤小鼠体重下降最多的为阿霉素组,小鼠同时出现食欲降低、活动减少的情况,体重下降最少的为NGs/Dox（CQ+）组,组织病理学结果示阿霉素组和Dox（CQ+）组的心脏、肝脏、肺脏和肾脏均呈现出更为严重的损伤,NGs/Dox组和NGs/Dox（CQ+）组接近,较对照组和CQ组更轻。结论1.设计并合成了一种共聚物mPEG113-P（Phe10-co-Cys5）,在水溶液中可自组装成球形纳米凝胶,具有合适的粒径大小和形貌特征,能够在生理环境下保持稳定,并具有良好的还原响应性和生物相容性,可以作为纳米药物载体进行下一步的抗骨肉瘤实验研究。2.NGs/Dox粒径均一、大小合适,能够延长阿霉素在血液循环中的时间,避免其被过早地清除,增加其在骨肉瘤组织中的蓄积,并在骨肉瘤细胞内高谷胱甘肽条件下,响应性地释放阿霉素,与小分子阿霉素相比,能够发挥增效、减毒抗骨肉瘤的作用。3.在K7M2细胞构建的骨肉瘤皮下瘤模型和143B细胞构建的骨肉瘤原位瘤模型中,NGs/Dox联合氯喹在抗肿瘤疗效方面优势更为明显,与单独应用NGs/Dox相比,并未观察到更为严重的毒副作用。4.氯喹通过帮助NGs/Dox溶酶体逃逸和抑制自噬发挥协同抗骨肉瘤作用。
蔡启轩[2]（2021）在《长链非编码RNA LINC01614通过miR-520a-3p/SNX3调控轴促进骨肉瘤进展的分子机制》文中提出骨肉瘤是儿童和青少年中最常见的原发恶性骨肿瘤,侵袭性强且易早期转移,以至于患者病程快、预后差,往往造成致命的威胁。尽管近些年肿瘤的治疗手段有了长足的提升,但因骨肉瘤复杂的致病机制难以被攻破,治疗效果很难实现突破性的进展。因此深入探究骨肉瘤致病的分子机制,寻找骨肉瘤中关键的功能分子对骨肉瘤的早期诊断及有效治疗具有极其重要的意义。长链非编码RNA（Lnc RNAs）是构成非蛋白质编码RNA的一类大分子。Lnc RNAs可以通过与不同分子的相互作用,参与多种细胞生物过程（信号、诱饵、引导、支架）。另外lnc RNAs不仅在调节一些正常的生理过程中发挥作用,还参与调控肿瘤的发生、发展及远处转移等,一些lnc RNAs已被证实可以作为生物标志物（预后指标、治疗靶点）,甚至可以调节患者对化疗药物的敏感性。目前已经证明了lnc RNAs在骨肉瘤的发生发展中起到重要的调控功能,因此,继续探寻尚未“解锁”的lnc RNAs,系统多维地探究lnc RNAs在骨肉瘤中扮演的角色,筛选具有关键作用的lnc RNAs,深入挖掘其在骨肉瘤中具体的调控作用,不仅有助于发现骨肉瘤相关的致病机制,还可以为骨肉瘤的精准治疗提供理论基础,为医疗的发展做出贡献。本研究中通过对骨肉瘤癌及癌旁组织样本进行全转录组测序分析,检测差异表达的lnc RNAs、miRNAs及m RNAs分子表达谱数据,运用计算生物学研究方法,获取三种差异基因之间的分子调控网络数据,通过GO功能注释及KEGG代谢通路分析,对差异lnc RNAs/miRNAs/m RNAs共调控网络的靶基因及筛选出的核心lnc RNAs的靶基因进行功能分析,并通过细胞学及组织学对LINC01614（核心lnc RNAs）进行验证。验证无误后,对其调控骨肉瘤的生物学功能（增殖、迁移、侵袭、凋亡等）进行实验探究,结合LINC01614/miR-520a-3p/SNX3三者之间的调控关系,进一步对该调控轴进行验证并确定其在骨肉瘤中的调控功能,从而明确LINC01614可以通过miR-520a-3p/SNX3调控轴促进骨肉瘤进展的机制。第一部分骨肉瘤中以lnc RNAs为核心的调控网络构建及关键基因的筛选我们利用三组骨肉瘤癌及癌旁组织样本进行全转录组测序以获取其分子表达谱数据,通过对比分析共筛选得到163个差异表达lnc RNAs（67个上调表达,96个下调表达）,207个差异表达miRNAs（92个上调表达,115个下调表达）及4247个差异表达m RNAs（2019个上调表达,2228个下调表达）。综合应用LNCipedia、DAVID、STRING等多种数据库,结合生物信息统计学分析方法,获取lnc RNAs/miRNAs/m RNAs共调控网络关系并对差异表达lnc RANs的靶基因进行功能分析,发现骨肉瘤中差异表达lnc RNAs可能具有调控骨细胞分化、蛋白结合和生物大分子合成的功能,并可能参与了PI3K-Akt、AMPK等与肿瘤发生发展密切相关的代谢通路。另外我们通过差异表达显着情况选取了LINC01614、MALAT1两种lnc RNAs,分别构建了以两者为核心的lnc RNAs/miRNAs/m RNAs调控网络,并对调控网络中的靶基因进行了功能分析及蛋白互作网络分析,发现LINC01614的靶基因可能参与调控Wnt信号通路、细胞迁移等致癌生物学过程;MALAT1的靶基因可能参与了调控成骨分化、蛋白质转运等生物学过程。我们进一步利用骨肉瘤细胞和正常成骨细胞及骨肉瘤癌和癌旁组织标本对选取的这两种lnc RNAs的表达情况进行了q RT-PCR检测,发现两者在多种骨肉瘤细胞及骨肉瘤癌组织中均呈现高表达,这与我们之前生信分析的结果一致,同时也为我们进一步深入挖掘lnc RNAs在骨肉瘤中的调控功能及相关分子机制提供了方向。第二部分LINC01614在骨肉瘤中的调控功能研究通过第一部分的分析及验证,我们选取了LINC01614为本研究的突破口,旨在探究其在骨肉瘤中的相关调控功能。首先我们利用从“TARGET”数据库获得的骨肉瘤患者的临床数据进行了生存分析研究,发现LINC01614与患者生存率呈负相关,且与骨肉瘤病理分期呈正相关,提示了LINC01614可能在骨肉瘤的发生发展中起到不利作用。接下来体外实验,通过CCK-8实验检测细胞增殖情况,结果提示沉默LINC01614可以明显抑制骨肉瘤细胞的增殖能力;通过transwell细胞侵袭实验和细胞划痕实验检测细胞侵袭及迁移能力,发现沉默LINC01614可以抑制骨肉瘤细胞的侵袭和迁移能力;通过Western Blot检测沉默LINC01614骨肉瘤细胞内的PCNA、caspase-3以及E-cadherin的蛋白表达情况,再次验证沉默LINC01614可抑制骨肉瘤细胞的增殖、侵袭及迁移能力,并提示LINC01614可能与骨肉瘤细胞凋亡有关;通过流式细胞仪检测细胞凋亡情况,发现沉默LINC01614可以促进骨肉瘤细胞的凋亡。体内实验中,通过小鼠移植瘤实验,发现沉默LINC01614可以有效降低骨肉瘤在体内的成瘤速度及体积。总而言之,体内与体外实验均可证明LINC01614具有促进骨肉瘤进展的作用。第三部分LINC01614调控骨肉瘤发生发展的分子机制研究通过对第一部分中LINC01614调控网络的分析,结合第二部分LINC01614在骨肉瘤中的调控作用,我们提出了LINC01614可能通过miR-520a-3p/SNX3调控轴来促进骨肉瘤进展的假设。接下来,我们通过q RT-PCR及Western Blot等实验对三者结合关系进行了验证;并应用生物信息学数据库预测miR-520a-3p与LINC01614以及miR-520a-3p与SNX3的结合位点,再通过荧光素酶报告基因实验对结合位点进行了验证;在此基础上,我们又补充了Ago2 RIP实验进一步验证三者结合方式,结果提示LINC01614可通过竞争性结合miR-520a-3p来调控SNX3的表达。而后通过对沉默和过表达miR-520a-3p、沉默SNX3以及各自空白对照的骨肉瘤细胞进行CCK8细胞增殖实验、transwell细胞侵袭实验、细胞划痕实验以及流式细胞凋亡实验,实验结果提示miR-520a-3p、SNX3可影响骨肉瘤细胞的增殖、侵袭、迁移及凋亡过程;再通过对共转染miR-520a-3pinhibitor+sh RNA-NC、miR-520a-3p-inhibitor+sh RNA-LINC01614及miR-520a-3pinhibitor+sh RNA-SNX3等多组细胞进行CCK8细胞增殖实验、transwell细胞侵袭实验、细胞划痕实验以及流式细胞凋亡实验,发现LINC01614及SNX3均可影响miR-520a-3p对骨肉瘤细胞功能的调控作用,结果提示LINC01614可通过竞争性结合miR-520a-3p来调控SNX3的表达,从而对骨肉瘤的发生发展起到一定的调控作用。最后,我们通过Western Blot检测沉默LINC01614、沉默SNX3、沉默及过表达miR-520a-3p骨肉瘤细胞内的β-catenin及Wnt1蛋白表达情况,结果提示LINC01614/miR-520a-3p/SNX3调控骨肉瘤的生物功能有可能与其参与调控Wnt信号通路相关,这也为今后的研究提供了一定思路。
刘媛[3]（2021）在《长链非编码RNA参与骨肉瘤和胃癌增殖、迁移与耐药的机制研究》文中认为背景:恶性肿瘤是严重危害我国居民生命健康的主要慢性疾病。根据组织来源的不同,将上皮组织来源的恶性肿瘤统称为癌,而间叶组织来源的则统称为肉瘤,其中骨肉瘤是最常见的间叶组织恶性肿瘤,胃癌则是常见的腺癌。无论是骨肉瘤还是胃癌,探究其发病原因及机制,找到新的治疗靶点和生物标志物,仍是目前研究亟需解决的问题,从而为临床诊断和治疗提供了新的思路和理论基础。lncRNA是一种非编码的RNA转录物,它涉及调控多种机制,包括转录,翻译,蛋白质修饰以及某些信号通路,其中lncRNA可以作为miRNA的海绵,进而调节miRNA的水平和下游基因表达,发挥重要病理生理作用。LBX2-AS1是新近在食管鳞状上皮癌发现的一种促癌lncRNA,作为ceRNA调控靶基因的表达,且能促进胃癌、肝癌、卵巢癌、神经胶质瘤等多种肿瘤的发展和进程[1-6],但在骨肉瘤中作用却没有报道;LncRNA TUG1则在肺癌[7]、卵巢癌[8]、胰腺癌[9]等多种肿瘤中高表达,还参与调控细胞增殖、凋亡和EMT信号通路,但TUG1在胃癌中的作用还尚不清楚。本文选定恶性肿瘤两种不同组织来源的典型病理类型骨肉瘤及胃癌作为研究对象,探索lncRNAs参与骨肉瘤和胃癌的发生发展。第一部分:长链非编码RNA LBX2-AS1通过LBX2-AS1/miR-5010-5p/WNT7B轴促进骨肉瘤细胞的增殖和迁移目的:（1）阐明LBX2-AS1在骨肉瘤细胞中的表达水平并探究是否参与调控骨肉瘤的增殖和迁移。（2）阐明LBX2-AS1是否通过作为ceRNA竞争性吸附miR-5010-5p调控下游WNT7B表达,进而影响骨肉瘤的生物学功能。方法:首先培养人成骨细胞h FOB1.19和骨肉瘤Saos-2,143b细胞,通过荧光定量PCR检测LBX2-AS1在成骨细胞和骨肉瘤细胞的表达水平,然后在Saos-2与143b细胞中转染si-LBX2-AS1构建LBX2-AS1低表达细胞株,采用RT-PCR检测si-LBX2-AS1在细胞中的转染效率,通过CCK8实验、划痕实验和Transwell实验检测LBX2-AS1低表达细胞株增殖、迁移及侵袭能力。通过直接结合种子序列预测的方法预测LBX2-AS1调控的miRNA以及下游靶基因,通过荧光素酶报告、Western bolt和RT-PCR验证了LBX2-AS1与miR-5010-5p和WNT7B的关系。采用恢复实验分析LBX2-AS1和miR-5010-5p同时沉默对骨肉瘤细胞增殖、迁移和侵袭的影响。结果:（1）荧光定量PCR的结果显示,与成骨细胞相比,LBX2-AS1在骨肉瘤细胞中的表达水平显着升高。（2）RT-PCR结果表明,对照组LBX2-AS1的表达量是转染si-LBX2-AS1骨肉瘤细胞株的3倍（p<0.05）,LBX2-AS1低表达细胞株构建成功。（3）CCK-8、划痕实验和Transwell实验结果验证了LBX2-AS1促进骨肉瘤细胞的增殖和迁移。（4）预测结果显示miR-5010-5p可能是LBX2-AS1调控的miRNA,而WNT7B则是被调控的下游靶基因,荧光素酶报告实验结果显示miR-5010-5p分别与LBX2-AS1（WT）和WNT7B（WT）共转染可以影响荧光素酶的强度,证明了LBX2-AS1可以与miR-5010-5p结合,而WNT7B则是miR-5010-5p的靶标,Western bolt和RT-qPCR结果验证了LBX2-AS1作为ceRNA吸附miR-5010-5p上调WNT7B。（5）CCK-8、划痕和迁移实验结果证明,在LBX2-AS1低表达细胞中沉默miR-5010-5p,因沉默LBX2-AS1而抑制的增殖和迁移可以被恢复,即LBX2-AS1通过调控miR-5010-5p/WNT7B轴促进骨肉瘤细胞增殖和迁移。结论:（1）LBX2-AS1在骨肉瘤中高表达并促进骨肉瘤的增殖和迁移。（2）LBX2-AS1作为ceRNA通过调控miR-5010-5p/WNT7B轴促进骨肉瘤进展。第二部分:TUG1在胃癌中作用的生物信息学分析及实验验证目的:（1）生物信息学分析TUG1在胃腺癌中的表达水平、与临床特征的相关性以及诊断价值。（2）生物信息学分析TUG1在胃腺癌中的潜在作用。（3）实验初步验证TUG1对胃癌多药耐药,迁移,侵袭的影响。方法:（1）下载TCGA数据库中胃腺癌相关的临床数据和RNAseq数据,分析TUG1在配对和非配对的正常组织和癌组织中的表达。（2）使用TCGA数据库中胃腺癌相关临床数据分析TUG1表达与临床特征之间的相关性。（3）使用KM plotter数据库分析TUG1对胃腺癌患者总生存率OS（n=881）、首次进展时间FP（n=645）、和无疾病进展时间PFS（n=503）的影响。（4）使用TCGA数据库中胃腺癌相关的临床数据和RNAseq数据分析TUG1在胃腺癌中的诊断价值。（5）分析TCGA数据库胃腺癌中TUG1的共表达基因,对其进行GO/KEGG富集分析。（6）将TCGA数据库中胃腺癌相关RNAseq数据按照TUG1的高低表达进行分组,GSEA分析TUG1相关的生物学过程和信号通路。（7）免疫组化验证TUG1在胃癌组织切片中的表达,同时分析其与临床病理特征的相关性及生存分析。（8）RT-PCR比较TUG1在胃癌细胞株及耐药细胞株的表达差异;（9）构建稳转的TUG1过表达的胃癌细胞株和沉默的耐药细胞株,通过流式细胞术和RT-PCR检测转染成功与否;（10）通过CCK-8、划痕和迁移实验检测TUG1过表达及沉默对胃癌细胞的增殖、迁移和耐药的影响。结果:（1）胃腺癌组织中的TUG1基因表达水平在配对样本和非配对样本中均显着高于正常组织。（2）TUG1的高表达与年龄（p=0.044）,抗反流治疗（p=0.001）,疾病特异性生存率（p=0.038）显着相关。（3）TUG1高表达与不良的总生存率,无进展生存率和首次进展率相关。（4）GO/KEGG富集分析结果表示TUG1参与调控细胞周期和DNA复制相关通路。（5）GSEA分析表示TUG1参与增殖的正向调节,底物依赖性细胞迁移以及凋亡执行阶段的调节。（6）RT-PCR结果显示TUG1在胃癌耐药株中表达高于胃癌细胞株。（7）TUG1过表达的胃癌细胞株及沉默的耐药细胞株构建成功。（8）CCK-8、划痕和迁移实验结果表明TUG1促进胃癌细胞的耐药、迁移和侵袭。结论:（1）生物信息学分析TUG1在胃腺癌中可以作为诊断的分子标志物,并参与调控增殖,迁移以及DNA复制相关通路（2）实验验证结果表明TUG1上调促进了细胞增殖和迁移进而增加胃癌耐药。
刘光平[4]（2021）在《TIPE1介导PRMT1调控STAT3精氨酸甲基化修饰参与骨肉瘤增殖机制研究》文中认为【研究目的】骨肉瘤是一种起源于骨骼系统的恶性原发性肿瘤,其发病年龄多见于青少年和中青年人群,骨肉瘤发生的原因目前不明,主流的观点认为其主要与患者本身的基因缺陷、病毒感染及电离辐射等因素相关,最终导致骨骼系统产生不成熟的骨质或者类骨质成份。骨肉瘤恶性程度较高,容易发生远处转移（主要为肺部转移）,因此预后较差。尽管目前临床上施行手术、化疗、靶向治疗等综合治疗手段可以使骨肉瘤患者的生存率得到极大的提升,但国内骨肉瘤复发病人5年生存率仅20%左右,因此寻找有效治疗靶点、发现早期诊断标志物以及阐明其发病机制至关重要。TIPE基因家族由4个成员组成（包括TIPE、TIPE1、TIPE2和TIPE3）,该基因家族与机体免疫调节和肿瘤发生密切相关。尽管四个成员之间具有显着的序列同源性,但它们参与了不同的细胞生物学活动调节过程。研究发现TIPE1在肝癌、乳腺癌等肿瘤类型中主要行使抑癌基因功能,课题组曾首次阐明TIPE1促进了宫颈癌及鼻咽癌的恶性生物学行为,但它在骨肉瘤中的生物学作用目前尚不清楚。本课题利用临床标本、细胞、动物模型及多种分子生物学技术,系统揭示TIPE1如何精准调控PRMT1活性,以及如何通过蛋白精氨酸甲基化修饰方式调控STAT3精氨酸位点甲基化水平参与骨肉瘤增殖的详细过程。本课题的完成不仅阐明了TIPE1在骨肉瘤发生中的新型分子机制,并可为骨肉瘤临床诊断及预后提供潜在的肿瘤分子标志物。【研究方法】一、TIPE1对骨肉瘤细胞增殖能力的影响。1.细胞模型:为明确TIPE1对骨肉瘤细胞增殖水平是否有影响,我们在TIPE1表达较低的骨肉瘤细胞系MNNG/HOS CL#5过表达TIPE1,在TIPE1表达较高的骨肉瘤细胞系MG63转染TIPE1干扰慢病毒,利用CCK8、克隆形成等实验观测细胞增殖指标,通过流式细胞仪PI染色技术检测细胞周期改变情况。2.裸鼠成瘤实验:选择4-6周龄BALB/c裸鼠,将过表达TIPE1的骨肉瘤细胞系MNNG/HOS CL#5及对照细胞种植于裸鼠腋窝处皮下,进行裸鼠成瘤实验,待瘤体直径至0.5cm大小时,比较肿瘤生长速率、肿瘤体积变化。二、TIPE1通过调控PRMT1/STAT3通路调控骨肉瘤增殖的分子机制。1.TIPE1通过与PRMT1直接结合调控STAT3通路。（1）转录组芯片及基于IPA的经典通路分析:过表达TIPE1及对照的骨肉瘤细胞系MNNG/HOS CL#5,经过准备poly-A RNA controls→合成第一链cDNA→合成第二链cDNA→通过体外转录合成标记cRNA→cRNA纯化及定量-→cRNA片段标记→杂交等步骤,得到芯片数据,最后通过基于IPA的经典通路分析,发现TIPE1在骨肉瘤中调控的关键通路STAT3;利用实时荧光定量PCR技术进行进一步验证。（2）利用Co-IP-MS等技术,初步确立TIPE1通过PRMT1调控下游分子STAT3的逻辑关系:首先构建用于Co-IP-MS技术的特殊TIPE1载体,在骨肉瘤细胞系中过表达,最后通过Co-IP→质谱分析→基于定量蛋白质组学的生信分析→Co-IP、Duolink等技术进一步验证,初步明确TIPE1通过与PRMT1直接结合,调控下游分子STAT3的确切分子机制。（3）干扰PRMT1,过表达TIPE1后Western Blot检测STAT3蛋白的表达变化,CCK8测生长曲线观测TIPE1对骨肉瘤增殖抑制现象的逆转,进一步明确TIPE1-PRMT1-STAT3的调控逻辑关系。2.PRMT1系列截短序列的构建及TIPE1与PRMT1相互作用位点的确定。根据PRMT1蛋白结构域,构建系列截短序列,在HEK293T细胞中共转染TIPE1-Flag和PRMT1-HA全长或不同缺失片段的表达载体,用Co-IP方法确定TIPE1蛋白与PRMT1相互作用的特定位点。3.TIPE1通过抑制PRMT1精氨酸甲基转移酶活性抑制STAT3甲基化水平。（1）利用精氨酸单甲基化修饰定量蛋白质组学技术,通过蛋白提取→蛋白酶解→MMA（精氨酸单甲基化）富集→质谱检测→信息分析等流程,鉴定TIPE1对骨肉瘤细胞系中精氨酸单甲基化修饰程度,以及STAT3蛋白精氨酸单甲基化修饰情况。（2）TIPE1抑制PRMT1对相关底物蛋白STAT3甲基化水平的验证:由于缺乏STAT3甲基化抗体,各组都首先转染STAT3-His,利用His抗体进行免疫共沉淀富集STAT3蛋白,最后利用通用型甲基化抗体检测STAT3甲基化水平。将TIPE1-Flag转染到HEK293T细胞中,检测在细胞正常生理条件下,TIPE1是否以剂量依赖方式调控内源PRMT1对其底物STAT3的甲基化能力。利用siRNA技术,将TIPE1-sh转染到HEK293T细胞中,抑制内源TIPE1的表达后,检测内源PRMT1对STAT3的甲基化水平影响;过表达TIPE1的HEK293T细胞中抑制内源PRMT1的表达后,检测PRMT1底物的甲基化水平。4.TIPE1抑制STAT3的转录水平。在HEK293T细胞中共转染pGL3-promoter vector 或者APRE luciferase reportorgene,以及PRMT1-HA、TIPE1-Flag、STAT3-His载体,在IL-6的刺激下,利用双荧光素酶活性测定发现TIPE1对PRMT1调控的下游基因STAT3的转录激活能力。三、临床标本验证TIPE1通过PRMT1/STAT3通路参与骨肉瘤发生。利用组织芯片,验证肿瘤组织中TIPE1表达水平与肿瘤分期的关系;分析TCGA数据库肿瘤组织中TIPE 1的表达与STAT3表达的相关性。【实验结果】一、TIPE1抑制骨肉瘤细胞增殖能力。1.体外实验。本研究结果显示TIPE1可明显抑制两种骨肉瘤细胞系的增殖速度,细胞周期结果提示TIPE1也显着降低骨肉瘤细胞周期S期比值,另外TIPE1可使骨肉瘤细胞克隆形成能力明显减弱。2.体内实验。本研究结果提示TIPE1可显着抑制骨肉瘤细胞裸鼠成瘤能力,进一步的免疫组化结果表明TIPE1可抑制细胞增殖指标Ki67的表达水平。二、TIPE1介导PRMT1调控STAT3精氨酸甲基化修饰参与骨肉瘤增殖的分子机制。1.TIPE1通过与PRMT1直接结合调控STAT3通路。前期结果提示TIPE1可以抑制骨肉瘤细胞增殖,为进一步明确其中机制,课题组利用转录组芯片及基于IPA的经典通路分析,结果提示TIPE1在骨肉瘤细胞系MNNG/HOS CL#5中主要抑制STAT3通路,qPCR验证结果也显示过表达TIPE1后STAT3表达明显降低。那么,TIPE1在骨肉瘤中抑制STAT3通路的机制到底如何?带着上述疑问,课题组利用Co-IP-MS等技术,发现TIPE1可能通过与PRMT1相互作用发挥生物学功能。基于STAT3蛋白是PRMT1的已知调控底物,因此我们认为TIPE1通过抑制PRMT1的功能,继而影响了 STAT3的表达。继而,我们利用挽救实验对PRMT1进行干扰后,发现可逆转过表达TIPE1导致的STAT3抑制现象,且骨肉瘤细胞增殖被TIPE1抑制的现象也明显得以逆转。以上结果表明TIPE1可能通过PRMT1抑制了 STAT3通路。2.PRMT1系列截短序列的构建及TIPE1与PRMT1相互作用位点的确定。课题组构建了系列截短PRMT1序列,通过Co-IP实验发现TIPE1蛋白主要与PRMT1的催化区域结合。3.TIPE1通过抑制PRMT1精氨酸甲基转移酶活性抑制STAT3甲基化水平。TIPE1究竟通过哪种方式来抑制PRMT1的甲基转移能力是课题组的主要研究内容之一,已有研究发现PRMT1甲基化酶催化区和同源二聚化区是其发挥甲基化酶活性最关键的结构域。基于上述结果发现TIPE1主要与PRMT1催化区域结合,我们认为TIPE1可能影响了 PRMT1的甲基化酶活性。因此,利用精氨酸单甲基化修饰定量蛋白质组学技术发现TIPE1可下调STAT3精氨酸位点甲基化水平。进一步分析发现过表达TIPE1以浓度依赖方式抑制内源PRMT1介导的STAT3甲基化,干扰TIPE1则促进内源PRMT1介导的STAT3甲基化。4.TIPE1抑制STAT3的转录水平。利用双荧光素酶活性实验发现TIPE1抑制PRMT1调控的下游基因STAT3的转录能力。我们的结果发现TIPE1可显着抑制PRMT1介导的STAT3转录水平,该结果进一步提示TIPE1通过抑制PRMT1底物STAT3甲基化水平,将最终导致STAT3转录水平的下调。三、临床标本验证TIPE1抑制STAT3通路参与骨肉瘤发生。利用组织芯片,发现肿瘤组织中TIPE1表达水平与骨肉瘤肿瘤分期负相关,TCGA数据库显示肉瘤组织中TIPE1的表达与STAT3表达也具有负相关性。该结果在临床上进一步证实了 TIPE1负调控STAT3的现象。【结论】虽然文献报道了 PRMT1及STAT3在肿瘤中的重要生物学功能,并初步阐述了PRMT1调控STAT3的相关机制,但是TIPE1如何调控PRMT1及相关下游信号通路尚不明确。本课题的完成阐明了TIPE1精准调控PRMT1活性的方式,明确了TIPE1通过调控PRMT1活性,继而影响下游分子STAT3表达的确切分子机制,最终对骨肉瘤细胞增殖起明显抑制作用。本课题的完成将为骨肉瘤患者的临床诊疗提供了新的靶点和治疗策略,同时为骨肉瘤预后预测及早期诊断标志物的发现提供理论与实践可能。
张利[5]（2021）在《CXCL13趋化型CAR-T细胞对骨肉瘤治疗及其机制的研究》文中研究表明骨肉瘤（Osteosarcoma,OS）是一种多发病于青少年的恶性肿瘤,易发生肺转移。对于转移性的骨肉瘤,手术治疗和放化疗的临床治疗效果不佳,患者的五年生存率低于30%,目前缺少有效的治疗方案。嵌合抗原受体T细胞疗法（Chimeric antigen receptor T,CAR-T）对肿瘤细胞的杀伤并不需要依赖于MHCI（Major histocompatibility complex class I molecule）类分子,可以有效的防止肿瘤逃逸。实体瘤特殊的免疫微环境使得CAR-T细胞很难浸润到肿瘤组织中,即使浸润到肿瘤组织中,也会因严峻的免疫抑制性环境而耗竭。NKG2D（Natural killer group 2D）是一种NK（Nature killer）细胞表面激活受体,当其与配体结合后通过激活下游信号通路使NK细胞释放各种细胞因子,进而发挥其杀伤肿瘤作用。在我们的研究中发现,OS组织中NKG2D配体蛋白MICA/B（MHC class I chain-related protein A/B）高表达,同时趋化因子CXCL13（chemokine C-X-C motif ligand 13）促进了骨肉瘤的转移和侵袭。CXCR5（C-X-C chemokine receptor type5）为CXCL13的受体;CXCL13可以趋化CXCR5+T淋巴细胞归巢到肿瘤组织发挥抑制肿瘤的作用。本研究制备人源和鼠源的CXCR5共表达的NKG2D-CAR-T细胞,探究CAR-T细胞的对骨肉瘤治疗作用及相关机制。第一部分共表达CXCR5的NKG2D-CAR-T细胞治疗骨肉瘤的研究制备人源对照CAR-T（Mock-CAR-T）,NKG2D-CAR-T和CXCR5-NKG2D-CAR-T细胞。对比于NKG2D-CAR-T细胞,CXCR5-NKG2D-CAR-T细胞向CXCL13细胞因子的趋化能力和对靶细胞的杀伤能力明显加强;CXCR5-NKG2D-CAR-T细胞激活相关的分子如TNF-α（Tumor necrosis factorα）、IFN-γ（Interferonγ）、CD107a和Gzm B（Granzyme B）的表达量显着提高,体外增殖能力显着增强,并且PD-1（Programmed cell death-1）和TIM-3（T cell immunoglobulin domain and mucin domain-3）的表达水平更低。RNA测序结果显示CXCR5-NKG2D-CAR-T细胞在增殖、记忆性分化、抵抗免疫耗竭和NFAT通路相关的基因表达显着提高。通过Western blotting、钙信号检测和NFAT-Jurkat报告基因等方法验证显示CXCR5-NKG2D-CAR-T通过CXCL13/CXCR5/Ca2+/NFAT信号轴提高了CAR-T细胞的综合效果。体内实验使用U-2OS细胞对NSG小鼠进行皮下荷瘤,建立骨肉瘤模型,检测CAR-T细胞对荷瘤小鼠的肿瘤杀伤情况。与NKG2D-CAR-T细胞相比,CXCR5-NKG2D-CAR-T细胞可以在体内存活时间更长,血液中CD8+T淋巴细胞的比例升高,实现更好的肿瘤趋化效果和对肿瘤的抑制能力。第二部分CXCR5-NKG2D-CAR-T细胞对骨肉瘤肿瘤免疫微环境的影响构建鼠源的Mock-CAR-T,NKG2D-CAR-T和CXCR5-NKG2D-CAR-T细胞以及鼠源的CXCL13过表达骨肉瘤细胞系。对比于鼠源的NKG2D-CAR-T细胞,CXCR5-NKG2D-CAR-T细胞的体外趋化能力明显提高;并且展现出更强的骨肉瘤细胞杀伤能力;与细胞杀伤相关的分子如Gzm B,CD107a和IFN-γ的表达量明显提高;体外增殖能力得到明显的增强;并显着降低了耗竭相关的PD-1的表达量。将鼠源的骨肉瘤细胞注射到小鼠胫骨内进行原位建模。对比于鼠源的NKG2D-CAR-T细胞,鼠源的CXCR5-NKG2D-CAR-T细胞在体内的存活时间、CD8+T淋巴细胞的比例和记忆性T细胞的分化方面展现出优势;并产生更好的肿瘤和淋巴结的归巢能力;产生更强肿瘤抑制效果;并显着降低了肿瘤中髓系来源的抑制性细胞（Myeloid-derived suppressor cells,MDSCs）、肿瘤相关的巨噬细胞（Tumor-associated macrophages,TAMs）和调节性T细胞（Regulatory T cells,Tregs）的比例;对抑制性的骨肉瘤免疫微环境有较好的改善作用。结论:CXCR5的共表达显着提高了NKG2D-CAR-T细胞的肿瘤趋化和杀伤能力,并改善了骨肉瘤免疫微环境,本研究为骨肉瘤的CAR-T细胞免疫疗法提出了一种新的方案。
杜兴[6]（2021）在《辛伐他汀调控YAP介导的SOX9转录抑制骨肉瘤转移的作用及分子机制研究》文中研究表明背景与目的:骨肉瘤发病率高、恶性程度高、易转移,其中远处转移是导致患者疗效不佳和预后不良的重要因素。他汀类药物主要用于降血脂,近年来也被发现具有抑制肿瘤增殖及转移的作用,但目前在骨肉瘤方面的研究较少。研究报道,YAP和SOX9在骨肉瘤中均高表达,且与骨肉瘤细胞的迁移、侵袭有关。此外,课题组前期生物信息学预测发现,SOX9可能是YAP下游的靶基因。因此,本研究的目的是验证辛伐他汀是否可以通过调控YAP介导的SOX9转录抑制骨肉瘤转移,并在此基础上进一步探索辛伐他汀抑制骨肉瘤转移的相关机制,以期丰富骨肉瘤转移的研究内容和研究现状。方法:第一部分:首先检测辛伐他汀的作用靶点（HMGCR）在骨肉瘤细胞中的活性以及辛伐他汀是否能抑制骨肉瘤细胞的迁移、侵袭;其次检测敲低SOX9后骨肉瘤细胞迁移侵袭能力的变化;然后检测辛伐他汀处理后骨肉瘤细胞SOX9的表达;最后通过双荧光素酶标记实验,检测辛伐他汀对骨肉瘤细胞SOX9启动子活性的影响。第二部分:首先对SOX9启动子区域进行分析,预测出TEAD与SOX9启动子可能的结合区域;其次通过染色质免疫共沉淀（Ch IP）对各预测结合位点进行筛选和验证;然后通过构造相应结合位点缺失的含SOX9启动子区域的双荧光素酶报告基因载体,检测其与TEAD结合后SOX9启动子活性的改变,进一步筛选出具体的结合位点;最后检测敲低YAP或TEAD后SOX9的表达。第三部分:首先检测骨肉瘤细胞中YAP磷酸化和细胞定位,以及YAP敲低后骨肉瘤细胞迁移侵袭能力的变化;其次检测辛伐他汀对YAP磷酸化和细胞定位的影响;最后通过Ch IP技术检测YAP与SOX9启动子的结合能力是否受辛伐他汀的调控。第四部分:首先检测RhoA在骨肉瘤细胞中的表达以及辛伐他汀处理后RhoA活性的变化;其次过表达RhoA后,检测辛伐他汀对YAP活性以及SOX9表达的影响;然后检测辛伐他汀对细胞骨架组装的影响;最后检测RhoA抑制剂（C3转移酶）和细胞骨架抑制剂（细胞松弛素D）处理后,骨肉瘤细胞YAP活性和SOX9的表达。第五部分:通过裸鼠尾静脉注射骨肉瘤细胞诱导肺转移的方法,评估辛伐他汀能否抑制骨肉瘤肺转移、能否延长裸鼠生存时间;此外通过免疫组化法检测裸鼠骨肉瘤肺转移结节中RhoA、YAP以及SOX9等蛋白的表达。结果:第一部分:HMGCR在骨肉瘤细胞中高表达;通过辛伐他汀下调甲羟戊酸的代谢,明显抑制骨肉瘤细胞的迁移、侵袭和EMT;骨肉瘤细胞中SOX9的高度激活状态有助于其迁移、侵袭和EMT;辛伐他汀通过甲羟戊酸途径调控骨肉瘤细胞SOX9的转录活性。第二部分:SOX9是YAP-TEAD的直接靶基因;SOX9启动子区域内的TB1位点,是TEAD与SOX9结合并调控SOX9转录活性所必须的。第三部分:骨肉瘤细胞中YAP的活性高度上调,与骨肉瘤细胞的迁移、侵袭和EMT过程密切相关;辛伐他汀通过甲羟戊酸途径调控YAP的活性,进而抑制骨肉瘤细胞的迁移、侵袭;通过下调甲羟戊酸的代谢,辛伐他汀可明显降低YAP和SOX9启动子结合。第四部分:RhoA在骨肉瘤细胞中高表达;辛伐他汀通过甲羟戊酸途径调控RhoA活性和细胞骨架的组装,进而抑制骨肉瘤细胞迁移、侵袭;辛伐他汀通过RhoA调控细胞骨架的组装,进而抑制YAP活性及下游SOX9的转录。第五部分:辛伐他汀在体内对骨肉瘤肺转移有明显的的抑制作用,主要表现为降低肺转移的发生率（20%vs.80%）及肺转移结节的数量（0.2个/只vs.1.6个/只）,延长裸鼠的生存期（P<0.05）等三个方面;RhoA、YAP以及SOX9在骨肉瘤肺转移结节中呈明显高表达状态。结论:RhoA、YAP和SOX9在骨肉瘤细胞中高度激活,促进其迁移、侵袭。辛伐他汀通过甲羟戊酸途径调节SOX9表达来调控骨肉瘤细胞的迁移和侵袭;而SOX9是YAP-TEAD的直接靶基因,辛伐他汀通过RhoA和细胞骨架调节YAP活性来调控SOX9转录。同时,辛伐他汀在体内可抑制骨肉瘤细胞肺转移。综上,辛伐他汀通过甲羟戊酸途径抑制RhoA的细胞膜定位,干扰细胞骨架组装,下调YAP活性,降低YAP靶基因SOX9转录,进而抑制骨肉瘤转移。
何韶辉[7]（2021）在《尤文肉瘤临床预后模型的建立与肿瘤进展的机制研究》文中研究表明研究背景尤文肉瘤是儿童和青少年第二常见的恶性骨与软组织肿瘤,具有好发年龄小（10-20岁）,恶性程度高,侵袭能力强,临床预后差等特点。局灶性尤文肉瘤的5年总体生存率约为65%,而发生于脊柱的尤文肉瘤患者仅为42%左右。高达80%尤文肉瘤患者在初诊时即伴有远处转移灶,其5年总体生存率低于30%。骨源性尤文肉瘤好发于四肢长骨干骺端,而起源于脊柱和骨盆的尤文肉瘤相对较少。事实上,受限于病例较少,目前临床研究中缺乏关于脊柱-骨盆尤文肉瘤患者发生转移的风险因素分析和预后预测模型的建立及验证的报道。机制研究上,为了筛选影响尤文肉瘤发生发展潜在的关键蛋白,我们通过前期系统的生物信息学分析发现细胞外基质蛋白Tenascin-C和去泛素化酶ZRANB1在尤文肉瘤组织中的表达水平分别升高和下降。然而目前关于Tenascin-C和ZRANB1在尤文肉瘤恶性生物学行为中的功能和相关机制尚不清楚。本论文从临床和基础研究角度出发,分别探究脊柱-骨盆尤文肉瘤患者的临床预后模型,以及Tenascin-C和ZRANB1在尤文肉瘤进展中的功能和调控机制。研究目的1、建立基于大样本的脊柱-骨盆尤文肉瘤患者的临床预后预测模型,并利用外部队列验证模型的稳定性,同时分析影响脊柱-骨盆尤文肉瘤发生转移的风险因素。2、探索Tenascin-C调控尤文肉瘤进展中的功能和机制:（1）明确Tenascin-C在尤文肉瘤中的表达情况及与临床预后的相关性。（2）明确Tenascin-C在调控尤文肉瘤进展中的作用。（3）明确Tenascin-C与融合蛋白EWS-FLI1的调控关系。（4）探索Tenascin-C调控尤文肉瘤进展的可能机制。3、探索ZRANB1调控尤文肉瘤进展中的功能和机制:（1）明确ZRANB1在尤文肉瘤中的表达情况及与临床预后的相关性。（2）明确ZRANB1在调控尤文肉瘤增殖中的作用。（3）探索ZRANB1调控尤文肉瘤进展的可能机制。1、利用“监控、流行病学特征及终点事件数据库”（SEER）收集371例符合入组条件的脊柱-骨盆尤文肉瘤患者的临床数据。通过Log-rank检验和Cox风险比例模型分析影响预后的临床因素,并根据鉴定的预后独立影响因素建立基于列线图的预测模型。而后利用本中心收治的脊柱-骨盆尤文肉瘤病例作为外部队列验证模型的稳定性。另外,通过logistic回归分析探讨影响脊柱-骨盆尤文肉瘤发生转移的相关风险因素。2、（1）利用公共数据库和本中心收集的肿瘤标本,通过免疫组织化学染色、蛋白免疫印迹等实验检测Tenascin-C在尤文肉瘤中的表达情况,并结合临床随访数据分析Tenascin-C与尤文肉瘤患者预后的相关性。（2）利用CRISPR/Cas9编辑技术构建Tenascin-C敲除的单克隆尤文肉瘤细胞系。并利用CCK8增殖实验、Transwell迁移实验和HUVEC成管实验探究Tenascin-C对尤文肉瘤细胞增殖、迁移及血管生成能力的影响。通过构建裸鼠肺转移模型探讨Tenascin-C对尤文肉瘤细胞远处转移能力的影响。（3）利用蛋白免疫印迹、实时荧光定量PCR、双荧光素酶报告基因实验、以及染色质免疫共沉淀实验探讨Tenascin-C表达是否受融合蛋白EWS-FLI1的转录调控。（4）利用转录组测序分析Tenascin-C在尤文肉瘤中调控的潜在信号通路,并利用蛋白免疫印迹、实时荧光定量PCR、细胞免疫荧光实验进一步挖掘Tenascin-C调控尤文肉瘤恶性生物学行为的潜在机制。同时利用单细胞转录组测序分析尤文肉瘤中的细胞亚群,并与正常细胞群比较进一步验证Tenascin-C的表达情况及调控的信号通路下游基因的表达情况。3、（1）通过加权基因共表达网络分析法（WGCNA）挖掘影响尤文肉瘤进展的潜在基因,并通过本中心组织芯片验证基因的表达情况和预后价值。（2）通过慢病毒感染构建ZRANB1敲减和过表达的稳定细胞系,并利用CCK8增殖实验、细胞克隆形成实验以及裸鼠皮下荷瘤实验探究ZRANB1在调控尤文肉瘤增殖中的作用。（3）利用细胞转录组测序探索ZRANB1调控尤文肉瘤增殖的潜在机制,并利用免疫组织化学染色、蛋白质蛋白免疫印迹、放线菌酮实验、免疫共沉淀实验、体内泛素化实验以及流式细胞术等实验深入探讨ZRANB1调控尤文肉瘤增殖的具体机制。研究结果1、单因素和多因素生存分析发现,影响脊柱-骨盆尤文肉瘤患者预后的因素包材料与方法括患者的年龄,肿瘤范围、肿瘤体积大小以及原发部位手术。基于上述因素建立的预测模型内部和外部队列验证均显示模型具有良好的预测价值和稳定性。另外风险分析发现肿瘤大小>59mm和肿瘤侵犯淋巴结是脊柱-骨盆尤文肉瘤发生转移的高危因素。2、Tenascin-C促进尤文肉瘤的进展:（1）Tenascin-C在尤文肉瘤组织和细胞系中呈明显高表达,且Tenascin-C的表达情况与尤文肉瘤的总体生存期和无转移生存期均相关。（2）Tenascin-C能够促进尤文肉瘤的增殖、迁移和远处肺转移的能力,同时能够明显增强肿瘤微环境中血管生成能力。（3）Tenascin-C表达量与EWS-FLI1表达水平有关,而且EWS-FLI1能够通过直接结合Tenascin-C启动子区域,转录激活Tenascin-C的表达。（4）转录组测序分析提示Tenascin-C敲除后,部分差异基因富集于Hippo信号通路。利用单细胞转录组测序分析发现,尤文肉瘤由大量肿瘤细胞、成纤维细胞及少量的内皮细胞和血管平滑肌细胞组成,同时通过与正常间充质干细胞群比较,进一步验证了Tenascin-C在尤文肉瘤细胞群中的高表达状态。在肿瘤细胞群中,YAP正向调控的下游靶基因（CYR61和CTGF）表达明显上调,而负向调控的靶基因（DDIT4和TNFSF10）表达水平下降。上述测序结果提示Tenascin-C可能通过调控Hippo-YAP信号通路促进尤文肉瘤的恶性进展。进一步分析差异基因表达谱发现MALAT1差异最为明显。利用公共数据库也发现MALAT1在尤文肉瘤组织中表达明显高于正常对照组织。通过RNA荧光原位杂交实验进一步证实了MALAT1在尤文肉瘤组织中高表达,且与Tenascin-C的表达情况呈正相关。检测尤文肉瘤细胞敲除Tenascin-C后Hippo通路相关蛋白的表达,发现YAP的磷酸化水平（Ser127）降低,核定位比例增高。Hippo-YAP信号通路下游靶基因CYR61和CTGF表达量都相应增加。随后利用维替泊芬阻断YAP-TEAD转录复合体形成的实验发现,MALAT1表达水平显着下降。进一步检测Tenascin-C相关的细胞膜受体发现Integrinα5、αV和β1在肿瘤组织中表达水平较高。使用特异性抗体阻断Integrinα5,而非IntegrinαV,能够促进p-YAP（Ser127）的水平升高并使YAP滞留于胞浆内,与此同时MALAT1水平显着下降。检测Integrin下游激酶表达情况发现,Tenascin-C敲除后Src磷酸化（Tyr416）水平有所下降。使用Saracatinib特异性抑制Src激酶活性后发现,YAP主要定位于细胞胞浆内,且YAP下游靶基因MYC表达量也明显下降。3、ZRANB1抑制尤文肉瘤的增殖:（1）通过WGCNA和组织芯片染色分析发现ZRANB1在尤文肉瘤组织和细胞系中表达量下降,且ZRANB1低表达的尤文肉瘤患者临床预后较差。（2）敲减ZRANB1后,尤文肉瘤细胞增殖能力增强,而回补ZRANB1后,肿瘤细胞增殖受到明显抑制。（3）转录组测序分析提示ZRANB1调控尤文肉瘤增殖可能与溶酶体相关的信号通路有关。进一步蛋白免疫印迹实验发现ZRANB1能够抑制氨基酸刺激信号下的m TORC1活性,同时免疫组化分析发现ZRANB1低表达时,p-S6（Ser235/236）表达水平升高。我们利用流式细胞仪分析发现敲减ZRANB1后,尤文肉瘤细胞大小与正常对照组相比明显增大,而回补ZRANB1后细胞有所减小。接着我们发现ZRANB1能够促进该信号通路中的重要组分NPRL2的表达,放线菌酮实验证明ZRANB1能够增加NPRL2的稳定性。进一步蛋白质免疫共沉淀实验发现ZRANB1与NPRL2存在相互作用,且该相互作用可能依赖于ZRANB1的OTU结构域。最后,体内泛素化实验发现ZRANB1能够通过清除NPRL2蛋白的K48位多聚泛素链增强NPRL2的蛋白稳定性,进而抑制m TORC1的活性。研究结论1、基于临床预后独立影响因素建立的预测模型具有较好的稳定性和适用性,可用于临床初诊脊柱-骨盆尤文肉瘤患者时预后情况的预测和评价。临床实践中,若发现脊柱-骨盆尤文肉瘤患者影像学上肿瘤大小>59mm和/或肿瘤侵犯淋巴结组织,应高度怀疑肿瘤发生转移的可能。2、Tenascin-C在尤文肉瘤中表达水平明显升高,且与尤文肉瘤患者临床预后相关。功能上,Tenascin-C能够明显促进尤文肉瘤的增殖、迁移及远处转移能力,同时增强肿瘤微环境中的血管生成。机制上,特征性融合蛋白EWS-FLI1能够结合Tenascin-C启动子区域（nt-360～368）,转录激活Tenascin-C的表达。与此同时,Tenascin-C可通过Integrinα5/β1介导,激活Src,后者可进一步诱导YAP的去磷酸化和核转位,促进MALAT1和其他Hippo-YAP下游靶基因的表达。3、ZRANB1在尤文肉瘤中表达下调,且ZRANB1低表达的尤文肉瘤患者预后较差。ZRANB1能够通过清除NPRL2蛋白的K48位多聚泛素链抑制m TORC1的活性,进而抑制尤文肉瘤细胞的增殖能力。
程里[8]（2021）在《Gankyrin对骨肉瘤增殖、侵袭和转移的影响及机制研究》文中研究指明作为原发恶性骨肿瘤,骨肉瘤常发生于儿童和青少年时期,大约有15%-20%的患者在诊断初期就被发现存在转移,其发生发展的机制不明。深入探讨骨肉瘤发生发展的分子机制,寻找骨肉瘤基因治疗的靶点,将为有效治疗骨肉瘤提供新思路和实验依据。目的:探究癌蛋白Gankyrin对骨肉瘤增殖、侵袭和转移的影响,并阐明其分子机制。方法:采用real-time PCR和western blot实验检测Gankyrin在骨肉瘤细胞系和人骨肉瘤组织中m RNA和蛋白表达;利用免疫组织化学染色实验检测Gankyrin在骨肉瘤组织中表达,并解析Gankyrin表达与骨肉瘤组织临床病理学特征以及患者预后的关系;采用western blot实验检测骨肉瘤MG63细胞过表达Gankyrin和骨肉瘤U2OS细胞敲低Gankyrin对肿瘤发生发展相关信号转导通路的影响;采用real-time PCR实验检测Gankyrin对YAP m RNA表达的影响,免疫组织化学染色实验检测Gankyrin对YAP蛋白亚细胞定位的影响;利用real-time PCR和western blot实验检测YAP对Gankyrin m RNA和蛋白表达水平的影响;采用荧光素酶报告实验、western blot实验探究Gankyrin对YAP的调控机制;免疫荧光染色、免疫共沉淀和MTT实验检测Gankyrin和YAP相互作用及对骨肉瘤细胞增殖的影响;裸鼠成瘤实验检测Gankyrin对骨肉瘤体内增殖的影响,western blot、real-time PCR和免疫组织化学染色实验进一步检测在成瘤组织中Gankyrin对YAP的调控作用;免疫组化实验检测Gankyrin与YAP在人骨肉瘤组织中表达相关性。利用划痕实验检测Gankyrin对骨肉瘤细胞迁移的影响;采用Transwell侵袭实验检测Gankyrin对骨肉瘤细胞侵袭的影响;分别利用real-time PCR实验和western blot实验检测Gankyrin对骨肉瘤细胞中肿瘤干细胞标记物m RNA和蛋白表达水平的影响;分别采用real-time PCR实验和western blot实验检测Gankyrin对Hedgehog和Wnt信号通路关键分子m RNA和蛋白表达水平的影响;免疫共沉淀实验检测Gankyrin与Gli1的相互作用;免疫荧光实验检测Gankyrin与Gli1在骨肉瘤细胞和组织中的共定位情况;免疫组织化学染色实验检测Gankyrin与Gli1在人骨肉瘤组织标本中表达的相关性;免疫共沉淀检测Gankyrin对Gli1的泛素化调节;裸鼠肺转移瘤实验检测Gankyrin调控Gli1对骨肉瘤体内肺转移的影响。结果:1.Gankyrin在骨肉瘤中的表达及与骨肉瘤患者不良预后的相关性在骨肉瘤细胞系中,Gankyrin m RNA和蛋白表达水平明显高于正常成骨细胞系;在人骨肉瘤组织中,Gankyrin m RNA和蛋白表达水平明显高于癌旁正常组织,Gankyrin高表达与肿瘤组织分化程度、肿瘤分期以及远处转移呈正相关,且Gankyrin高表达相比较于低表达患者呈现更加不良预后。2.Gankyrin调控YAP表达的机制2.1 Gankyrin增强YAP表达,并与YAP形成正反馈回路Gankyrin对信号传导与转录激活因子3（STAT3,signal transducer and activator of transcription 3）信号通路、蛋白激酶B（Akt,protein kinase B）信号通路、Jun氨基末端激酶（JNK,Jun N-terminal kinase）信号通路和细胞外信号调节蛋白激酶（ERK,extracellular regulated protein kinase）信号通路没有明显调控作用;过表达Gankyrin可以上调YAP表达水平,而敲低Gankyrin则下调YAP表达水平,然而,p-YAP、LATS1和p-LATS1表达水平并不会受Gankyrin影响;Gankyrin不会影响YAP m RNA表达水平以及YAP蛋白细胞核定位;相反地,YAP能够上调Gankyrin的m RNA和蛋白表达水平。2.2 Mi R-200a对YAP调控机制在骨肉瘤细胞中,mi R-200a能够靶向结合YAP的3’-非编码区（UTR,untranslated regions）区域,mi R-200a mimics（mi R-200a模拟物）下调骨肉瘤细胞中YAP蛋白表达水平,而mi RNA-200a inhibitors（mi R-200a抑制物）上调骨肉瘤细胞中YAP蛋白表达水平。2.3 Gankyrin通过P53-mi R-200a调控YAP表达的机制过表达P53上调mi R-200a水平,而敲低P53则下调mi R-200a水平;过表达P53抑制YAP表达,而敲低P53下调YAP表达;敲低Gankyrin可以上调P53表达并下调YAP表达,而同时敲低Gankyrin和P53可以逆转该现象;过表达Gankyrin则可以下调P53表达并上调YAP表达,而同时过表达Gankyrin和P53可以逆转该现象;敲低Gankyrin可以上调mi R-200a表达,而同时敲低Gankyrin和P53可以逆转该现象;过表达Gankyrin则可以下调mi R-200a表达,而同时过表达Gankyrin和P53可以逆转该现象。3.Gankyrin与YAP的相互作用及对骨肉瘤细胞体外增殖的影响Gankyrin和YAP在U2OS和MG63细胞以及人骨肉瘤组织中存在共定位;Gankyrin和YAP在U2OS和MG63细胞中存在相互作用;在U2OS细胞和MG63细胞中敲低Gankyrin或YAP可以抑制骨肉瘤细胞生长,而同时敲低Gankyrin和过表达YAP或者同时敲低YAP和过表达Gankyrin则可以逆转这种现象。4.Gankyrin对骨肉瘤体内增殖的影响敲低Gankyrin使骨肉瘤细胞成瘤体积和重量均降低,且成瘤时间增加;过表达Gankyrin使骨肉瘤细胞成瘤体积和重量均增加,且成瘤时间减少;在敲低gankyrin的成瘤组织中,P53蛋白水平升高,Gankyrin和YAP蛋白水平降低,p-YAP蛋白水平无变化,Gankyrin和ki67染色强度降低;在过表达Gankyrin的成瘤组织中,P53蛋白水平下降,Gankyrin和YAP蛋白水平升高,p-YAP蛋白水平无变化,Gankyrin和ki67染色强度增加。5.Gankyrin和YAP在骨肉瘤组织标本中表达相关性Gankyrin和YAP在骨肉瘤组织标本中表达具有正相关性;Gankyrin和YAP同时呈高表达的骨肉瘤患者相对于Gankyrin高表达而YAP低表达、YAP高表达而Gankyrin低表达、Gankyrin低表达且YAP低表达的患者表现出更加不良的预后。6.Gankyrin对骨肉瘤细胞迁移、侵袭和干细胞特性的影响过表达Gankyrin促进骨肉瘤细胞迁移和侵袭,敲低Gankyrin抑制骨肉瘤细胞迁移和侵袭;此外,过表达Gankyrin上调骨肉瘤细胞中肿瘤干细胞标记物（包括CD133、OCT4以及Nanog）m RNA和蛋白表达水平,敲低Gankyrin抑制骨肉瘤细胞中肿瘤干细胞标记物m RNA和蛋白表达水平。7.Gankyrin调控Gli1影响骨肉瘤细胞迁移、侵袭和干细胞特性的机制7.1 Gankyrin调控Gli1对骨肉瘤细胞迁移、侵袭和干细胞特性的影响敲低Gankyrin下调骨肉瘤细胞中Hedgehog（Hh）信号通路关键分子（Gli1和PTCH1）m RNA表达水平,而对Wnt信号通路关键分子（β-catenin和AXIN2）m RNA表达无影响;过表达Gankyrin上调骨肉瘤细胞中Hedgehog信号通路关键分子m RNA表达水平,而对Wnt信号通路关键分子m RNA表达无影响;相应的,敲低Gankyrin下调骨肉瘤细胞中Hedgehog信号通路关键分子蛋白表达水平,过表达Gankyrin上调骨肉瘤细胞中Hedgehog信号通路关键分子蛋白表达水平;此外,在过表达Gankyrin的同时敲低Gli1可以逆转Gankyrin诱导的肿瘤干细胞标记物上调以及骨肉瘤细胞迁移和侵袭。7.2 Gankyrin与Gli1相互作用Gankyrin与Gli1在骨肉瘤细胞中相互作用;Gankyrin与Gli1在骨肉瘤细胞和组织中存在共定位;此外,在人骨肉瘤组织标本中,Gankyrin与Gli1表达呈正相关;Gankyrin和Gli1同时呈高表达的骨肉瘤患者相对于Gli1高表达而Gankyrin低表达以及Gankyrin低表达且Gli1低表达的患者表现出更加不良的预后。7.3 Gankyrin调控Gli1的机制Gankyrin通过抑制Gli1的泛素化降解上调Gli1蛋白表达水平。8.Gankyrin调控Gli1对骨肉瘤体内肺转移的影响过表达Gankyrin促进骨肉瘤体内肺转移,此外,在过表达Gankyrin的同时敲低Gli1可以逆转Gankyrin诱导的骨肉瘤体内肺转移。结论:1.Gankyrin在骨肉瘤中高表达,且与肿瘤组织分化程度、肿瘤分期以及远处转移以及患者不良预后呈正相关;2.Gankyrin增强YAP表达,并与YAP形成正反馈回路,机制上,Gankyrin通过调控P53阻止mi R-200a介导的YAP下调;3.Gankyrin与YAP相互作用并协同促进骨肉瘤细胞体外增殖;4.Gankyrin促进骨肉瘤体内增殖并上调YAP表达水平;5.Gankyrin和YAP在骨肉瘤组织标本中表达具有相关性;6.Gankyrin促进骨肉瘤细胞迁移、侵袭和干细胞特性;7.Gankyrin通过上调Gli1促进骨肉瘤细胞迁移、侵袭和干细胞特性,机制上,Gankyrin与Gli1相互作用,且Gankyrin抑制Gli1蛋白泛素化降解;8.Gankyrin通过上调Gli1促进骨肉瘤体内肺转移。
顾军权[9]（2021）在《抑制VEGF和Survivin基因的一链双靶siRNA干预骨肉瘤的研究》文中研究说明目的研究同时靶向VEGF和Survivin基因的一链双靶siRNA对骨肉瘤细胞株（MG-63和Saos-2）中VEGF和Survivin基因的抑制效应,和对细胞迁移,血管生成,增殖以及凋亡的影响。本研究通过探讨一链双靶siRNA的作用机制,拓展了目前的核酸干扰技术,为一链多靶核酸干扰技术的开发奠定了基础。本研究将为多靶siRNA核酸干扰相关药物的研发提供理论依据和技术支持。方法1.合成两个单靶siRNA（siRNA-Survivin和siRNA-VEGF）,在此基础上,设计并合成同时靶向VEGF和Survivin基因的一链双靶siRNA（siRNA-VEGF-&Survivin）。2.将靶向VEGF和Survivin两个单靶siRNA和同时靶向VEGF和Survivin一链双靶siRNA转染到骨肉瘤细胞（MG-63和Saos-2）中,通过荧光显微镜检测转染效率。3.运用QRT-PCR和Western Blot技术检测各转染组细胞（MG-63和Saos-2）中VEGF和Survivin基因m RNA及蛋白的表达。4.免疫荧光法和免疫组化检测各转染组细胞（MG-63和Saos-2）中VEGF和Survivin蛋白的定位及表达,并检测其基因沉默效果。5.MTT法检测各转染组MG-63和Saos-2细胞的增殖水平,流式细胞术检测MG-63和Saos-2细胞凋亡水平。6.划痕试验测定各转染组MG-63和Saos-2的细胞迁移,血管形成试验检测各转染组MG-63和Saos-2细胞的血管形成。结果1..成功构建符合设计要求的靶向VEGF和Survivin的单靶siRNA和一链双靶siRNA序列。2.各组siRNA均成功地转染到MG-63和Saos-2细胞中,转染率达到80%。3.Western Blot、QRT-PCR、免疫荧光和免疫组化法分析显示:单靶siRNA组和一链双靶siRNA组中VEGF和Survivin m RNA和蛋白的表达水平均低于对照组和未转染组,差异有统计学意义（均P<0.05）。一链双靶siRNA组在m RNA和蛋白的表达水平上与各单靶siRNA组相似,差异无统计学意义（P>0.05）。4.双靶siRNA组具有较强的抑制肿瘤细胞增殖和血管形成,并阻抑肿瘤细胞迁移而促进肿瘤细胞凋亡,效果均明显优于单靶siRNA组。结论1.沉默VEGF和Survivin基因的单靶siRNA-VEGF、siRNA-Survivin和一链双靶siRNA均能有效下调MG-63和Saos-2细胞中VEGF和Survivin基因的表达。2.体外实验证实,单靶siRNA和一链双靶siRNA对骨肉瘤细胞（MG-63和Saos-2）的迁移和血管生成具有明显的抑制作用。3.体外实验证实,单靶siRNA和一链双靶siRNA均能抑制骨肉瘤细胞（MG-63和Saos-2）增殖,促进细胞凋亡。4.一链双靶siRNA能显着抑制骨肉瘤细胞（MG-63和Saos-2）的增殖和血管形成,并阻抑骨肉瘤细胞（MG-63和Saos-2）迁移而促进其凋亡,效果均明显优于单靶siRNA组。5.VEGF和Survivin基因无相关性,一链双靶siRNA较单靶siRNA发挥了双倍的抑制骨肉瘤细胞增殖和促进凋亡的效果。
范人杰[10]（2020）在《MiR-615-5p靶向AKT1调控骨肉瘤细胞增殖、侵袭和迁移的机制研究》文中研究表明背景:骨肉瘤（Osteosarcoma,OS）是一种侵袭性骨癌,目前骨肉瘤的治疗方法主要为基于相关指南的标准治疗方案,包括手术切除、化疗、靶向治疗以及放疗等。骨肉瘤患者的5年生存率大约为60～70%;局部进展期、转移或者复发患者的五年生存率仅为20%。令人遗憾的是,尽管放化疗、靶向治疗以及其他多种辅助治疗的方法已经在大多数患者中应用,但是骨肉瘤患者的术后生存时间并未发生显着延长。传统治疗方法在骨肉瘤的治疗方面受到了限制。通过寻找基于肿瘤患者遗传学或表观遗传学的异常改变的治疗靶点,为提高骨肉瘤治疗效果,改善患者预后提供了可能。这其中,Micro RNAs（mi RNAs）已经得到了广泛的研究,mi RNAs在肿瘤的发生和发展中既可能发挥促癌作用,又可能发挥抑癌功能。当某种mi RNAs是促癌基因时,其过表达将促进肿瘤的发展;相反,如果某种mi RNAs是抑癌基因,则其过表达将抑制肿瘤的发展。例如,mi R-135b、mi R-150、mi R-542-5p和mi R-652等已被证实在骨肉瘤细胞中异常表达。mi R-615-5p在肝癌、淋巴瘤和恶性胶质瘤等多种肿瘤组织中的表达水平下调,且这种异常表达与肿瘤细胞的增殖、侵袭和迁移等存在直接或间接关系。mi R-615-5p的靶目标包括AKT、IGF1/IGF2等。AKT1基因的生理功能为编码丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,有研究认为,AKT1的上调促进了骨肉瘤的肺转移,AKT1的下调能够明显抑制MAT1介导的骨肉瘤细胞体外迁移和侵袭的促进作用,抑制异种移植裸鼠的肿瘤生长,减少转移性肺肿瘤的数量。因此,mi R-615-5p在多数肿瘤中具有显着的抑癌作用,AKT1信号通路在肿瘤的发生和发展过程中具有重要的作用,其在包括骨肉瘤在内的多种肿瘤的作用得到了确认,并且多种AKT1的调控因子已经被发现,但具体mi R-615-5p和AKT1在骨肉瘤中功能,以及两者相互作用关系仍有待进一步研究。目的:拟通过分子生物学实验探讨mi R-615-5p/AKT1调控轴在骨肉瘤中的表达水平,以及对骨肉瘤细胞生物学功能的影响。方法:收集29例2018年6月至2019年6月在我科手术治疗的骨肉瘤患者的癌变组织及癌旁正常组织。经中国科学院细胞研究所购买并培养骨肉瘤细胞（U2OS）及人正常成骨细胞（h FOB）。（1）q RT-PCR法检测癌变组织及癌旁正常组织、U2OS细胞及h FOB细胞中mi R-615-5p表达水平。（2）将U2OS细胞分为对照组、过表达组及无义对照组,分别用脂质体将mi R-615-5p模拟物及无义RNA转染至骨肉瘤U2OS细胞中,q RT-PCR检测细胞中mi R-615-5p表达水平,考察转染效率。（3）CCK-8法检测各组细胞活力及增殖情况。（4）划痕实验检测各组细胞侵袭能力。（5）Transwell实验检测各组细胞体外迁移能力。（6）通过生物信息学软件Targetscan7.2获取mi R-615-5p及AKT1的序列信息,考察二者序列是否具有片段性互补序列,分析二者可能存在的结合位点。（7）Western blot法检测三组细胞AKT1蛋白表达水平。（8）双荧光素酶报告实验检测mi R-615-5p和AKT1的结合关系。结果:（1）骨肉瘤对mi R-615-5p表达水平影响。（1）骨肉瘤组织中mi R-615-5p的相对表达水平低于癌旁正常组织,差异有统计学意义（P<0.05）。（2）U2OS细胞中mi R-615-5p的相对表达水平低于h FOB细胞,差异有统计学意义（P<0.05）。（2）mi R-615-5p过表达对骨肉瘤细胞生物学行为的影响。（1）过表达组mi R-615-5p的相对表达水平高于对照组,差异有统计学意义（P<0.05）。（2）mi R-615-5p过表达后,U2OS细胞的细胞活力和增殖能力显着抑制,差异有统计学意义（P<0.05）。（3）mi R-615-5p过表达后,U2OS细胞组的划痕愈合程度远低于对照组,差异有统计学意义（P<0.05）。（4）mi R-615-5p过表达后,U2OS细胞组的穿过小室细胞数量低于对照组,差异有统计学意义（P<0.05）。（3）考察mi R-615-5p通过AKT1影响U2OS细胞生物学行为的相关机制。（1）序列对比结果显示,mi R-615-5p与AKT1 3’-UTR存在结合位点。（2）mi R-615-5p过表达后,U2OS细胞AKT1蛋白表达水平降低,差异有统计学意义（P<0.05）。（3）双荧光素酶报告基因分析mi R-615-5p与AKT1表达相互作用结果显示,与Control组比较,在转染mi R-615-5p的细胞中,AKT1 3’-UTR WT的荧光素酶活性下降,差异有统计学意义（P<0.05）。结论:（1）mi R-615-5p在骨肉瘤组织和骨肉瘤细胞系U2OS中低表达。（2）mi R-615-5p过表达可抑制U2OS细胞的增殖、迁移和侵袭能力。（3）AKT1是mi R-615-5p的直接靶点,mi R-615-5p可通过AKT1调控U2OS细胞的生物学行为。（4）本研究发现,mi R-615-5p可能是骨肉瘤的潜在分子治疗靶点。
二、骨肉瘤细胞增殖活性的测定及其与预后的关系（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、骨肉瘤细胞增殖活性的测定及其与预后的关系（论文提纲范文）
（1）氯喹协同载阿霉素还原响应性纳米凝胶抗骨肉瘤的作用与机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词 |
| 第1章 引言 |
| 第2章 文献综述 |
| 2.1 骨肉瘤概述 |
| 2.2 骨肉瘤的治疗 |
| 2.2.1 化疗 |
| 2.2.2 手术治疗 |
| 2.2.3 放疗 |
| 2.2.4 免疫治疗 |
| 2.2.5 分子靶向治疗 |
| 2.2.6 其他治疗 |
| 2.2.7 骨肉瘤治疗中存在的问题 |
| 2.3 抗肿瘤纳米药物 |
| 2.3.1 纳米药物概述 |
| 2.3.2 用于肿瘤诊断与治疗的常见纳米药物载体 |
| 2.3.3 纳米药物体内输送所面临的多重关键挑战 |
| 2.3.4 CAPIR级联 |
| 2.4 氯喹的抗肿瘤机制研究 |
| 2.4.1 自噬抑制作用 |
| 2.4.2 肿瘤血管正常化作用 |
| 2.4.3 降低纳米药物的肝脏清除作用 |
| 2.4.4 其他抗肿瘤机制 |
| 第3章 材料与方法 |
| 3.1 实验药品及仪器 |
| 3.1.1 主要试剂与药品 |
| 3.1.2 主要仪器与器材 |
| 3.2 共聚物mPEG_(113)-P(Phe-co-Cys)的制备与表征 |
| 3.2.1 聚乙二醇单甲醚端氨基化 |
| 3.2.2 NCA的合成与纯化 |
| 3.2.3 共聚物mPEG_(113)-P(Phe-co-Cys)的合成 |
| 3.2.4 基本表征 |
| 3.2.5 NGs的体外生物相容性分析 |
| 3.3 载阿霉素还原响应性纳米凝胶的制备与表征 |
| 3.3.1 载阿霉素还原响应性纳米凝胶的制备 |
| 3.3.2 NGs/Dox的基本表征 |
| 3.4 NGs/Dox的体外释放 |
| 3.4.1 体外阿霉素累积释放曲线 |
| 3.4.2 细胞内的释放过程 |
| 3.5 氯喹联合NGs/Dox抗骨肉瘤的体外效果评价 |
| 3.5.1 NGs/Dox的体外细胞毒性 |
| 3.5.2 氯喹的体外细胞毒性 |
| 3.5.3 氯喹联合NGs/Dox的体外细胞毒性分析 |
| 3.6 氯喹发挥协同抗骨肉瘤作用的机制 |
| 3.6.1 氯喹对于肿瘤细胞摄取NGs/Dox的作用 |
| 3.6.2 NGs/Dox的溶酶体逃逸 |
| 3.6.3 氯喹自噬抑制作用的表征 |
| 3.7 NGs/Dox体内药物代谢动力学测定 |
| 3.8 骨肉瘤荷瘤动物模型的建立 |
| 3.8.1 K7M2 皮下肿瘤模型 |
| 3.8.2 143B原位瘤模型 |
| 3.9 NGs/Dox的组织分布 |
| 3.10 氯喹协同NGs/Dox的抑瘤效果评价及体内生物安全性分析 |
| 3.10.1 血清学检测 |
| 3.10.2 组织病理学 |
| 3.10.3 免疫组织化学分析 |
| 3.11 统计学分析 |
| 第4章 结果 |
| 4.1 共聚物mPEG_(113)-P(Phe-co-Cys)的表征 |
| 4.2 NGs的稳定性、还原响应性和体外生物相容性评价 |
| 4.3 NGs/Dox的基本表征 |
| 4.4 NGs/Dox的体外阿霉素释放 |
| 4.5 氯喹联合NGs/Dox抗骨肉瘤的体外细胞毒性分析 |
| 4.5.1 NGs/Dox的体外细胞毒性 |
| 4.5.2 氯喹的体外细胞毒性 |
| 4.5.3 氯喹联合NGs/Dox抗骨肉瘤的体外细胞毒性分析 |
| 4.6 氯喹发挥协同抗骨肉瘤作用的机制 |
| 4.6.1 NGs/Dox的肿瘤细胞摄取 |
| 4.6.2 NGs/Dox的溶酶体逃逸 |
| 4.6.3 氯喹的自噬抑制作用 |
| 4.7 NGs/Dox的药物代谢动力学测定 |
| 4.8 NGs/Dox的组织分布 |
| 4.9 氯喹协同NGs/Dox抗骨肉瘤的效果评价 |
| 4.10 氯喹协同NGs/Dox的体内生物安全性分析 |
| 第5章 讨论 |
| 5.1 mPEG_(113)-P(Phe_(10)-co-Cys_5)的制备 |
| 5.2 mPEG_(113)-P(Phe_(10)-co-Cys_5)的表征 |
| 5.2.1 NGs的稳定性 |
| 5.2.2 NGs的还原响应性 |
| 5.2.3 NGs的体外生物相容性 |
| 5.3 体外阿霉素的包装、释放与细胞摄取 |
| 5.3.1 体外阿霉素的包装 |
| 5.3.2 NGs/Dox的体外阿霉素释放与细胞摄取 |
| 5.4 NGs/Dox的药物代谢动力学和组织分布 |
| 5.5 氯喹协同NGs/Dox对骨肉瘤的抑制作用 |
| 5.6 氯喹协同NGs/Dox抗骨肉瘤的减毒效果和体内安全性 |
| 5.7 氯喹的抗骨肉瘤机制研究 |
| 第6章 结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（2）长链非编码RNA LINC01614通过miR-520a-3p/SNX3调控轴促进骨肉瘤进展的分子机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 概述 |
| 1.2 LncRNAs的结构及功能特点 |
| 1.2.1 LncRNAs的起源及分类 |
| 1.2.2 LncRNAs在细胞内的调控模式 |
| 1.2.3 LncRNAs的调控作用 |
| 1.3 LncRNAs在骨肉瘤中的研究进展 |
| 1.3.1 LncRNAs在骨肉瘤发病机制中的作用 |
| 1.3.2 LncRNAs参与调控骨肉瘤的分子通路 |
| 1.3.3 LncRNAs参与调控骨肉瘤的细胞通路 |
| 1.3.4 LncRNAs在骨肉瘤中的临床应用情况 |
| 1.4 CeRNA在骨肉瘤中的研究进展 |
| 1.4.1 CeRNA调控骨肉瘤的生物功能 |
| 1.4.2 CeRNA调节骨肉瘤的耐药 |
| 1.5 LINC01614、miR-520a-3p、SNX3 在肿瘤中的研究现状 |
| 1.5.1 LINC01614 在肿瘤中的研究现状 |
| 1.5.2 MiR-520a-3p在肿瘤中的研究现状 |
| 1.5.3 SNX3 在肿瘤中的研究现状 |
| 第二章 骨肉瘤中以LncRNAs为核心的调控网络构建及关键基因筛选 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 骨肉瘤组织中差异表达lncRNAs、miRNAs及 mRNAs分子表达谱检测及分析 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 实验方法 |
| 2.2.3 实验结果 |
| 2.3 骨肉瘤中差异表达lncRANs靶基因的调控功能分析及以LINC01614、MALAT1 为中心的促癌调控网络提取和功能分析 |
| 2.3.1 实验材料 |
| 2.3.2 实验方法 |
| 2.3.3 实验结果 |
| 2.4 LINC01614及MALAT1 在骨肉瘤细胞及骨肉瘤组织中表达水平的验证 |
| 2.4.1 实验材料 |
| 2.4.2 实验方法 |
| 2.4.3 实验结果 |
| 2.5 讨论 |
| 第三章 LINC01614 在骨肉瘤中的调控功能研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 LINC01614 与骨肉瘤患者生存率及组织学分期有关 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 分析方法 |
| 3.2.3 分析结果 |
| 3.3 沉默LINC01614 抑制骨肉瘤细胞增殖、迁移、侵袭,并促进骨肉瘤细胞凋亡 |
| 3.3.1 实验材料 |
| 3.3.2 实验方法 |
| 3.3.3 实验结果 |
| 3.4 沉默LINC01614 抑制骨肉瘤小鼠模型肿瘤生长 |
| 3.4.1 实验材料 |
| 3.4.2 实验方法 |
| 3.4.3 实验结果 |
| 3.5 讨论 |
| 第四章 LINC01614 调控骨肉瘤发生发展的分子机制研究 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 LINC01614 通过miR-520a-3p调控骨肉瘤的生物功能 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 实验方法 |
| 4.2.3 实验结果 |
| 4.3 LINC01614 通过竞争性结合miR-520a-3p调控SNX3 的表达 |
| 4.3.1 实验材料 |
| 4.3.2 实验方法 |
| 4.3.3 实验结果 |
| 4.4 LINC01614/miR-520a-3p通过SNX3 调控骨肉瘤的发生与发展 |
| 4.4.1 实验材料 |
| 4.4.2 实验方法 |
| 4.4.3 实验结果 |
| 4.5 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（3）长链非编码RNA参与骨肉瘤和胃癌增殖、迁移与耐药的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 中英文缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分:长链非编码RNALBX2-AS1 通过LBX2-AS1/miR-5010-5p/WNT7B轴促进骨肉瘤细胞的增殖和迁移 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验仪器 |
| 2.1.2 实验耗材 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞培养 |
| 2.2.2 LBX2-AS1 沉默 |
| 2.2.3 CCK-8 细胞活力检测 |
| 2.2.4 细胞迁移侵袭能力检测 |
| 2.2.5 生物信息学预测靶基因 |
| 2.2.6 荧光素酶报告检测 |
| 2.2.7 miRNA转染 |
| 2.2.8 实时定量PCR检测LBX2-AS1 的表达水平 |
| 2.2.9 蛋白免疫印迹分析 |
| 2.2.10 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 LBX2-AS1 在骨肉瘤细胞中高表达 |
| 3.2 LBX2-AS1 促进骨肉瘤细胞的增殖 |
| 3.2.1 构建LBX2-AS1低表达的骨肉瘤细胞株 |
| 3.2.2 沉默LBX2-AS1 抑制了骨肉瘤细胞的增殖 |
| 3.3 沉默LBX2-AS1 的表达抑制骨肉瘤细胞的迁移 |
| 3.4 LBX2-AS1 通过miR-5010-5p调控WNT7B的表达 |
| 3.4.1 预测LBX2-AS1 可能通过结合miR-5010-5p进而调控下游基因WNT7B |
| 3.4.2 miR-5010-5p可以与LBX2-AS1和WNT7B结合 |
| 3.4.3 LBX2-AS1 调控miR-5010-5p和 WNT7B的表达 |
| 3.4.4 miR-5010-5p调控下游WNT7B的表达 |
| 3.5 抑制miR-5010-5p表达可以恢复沉默LBX2-AS1 对骨肉瘤细胞的增殖、迁移的影响 |
| 3.5.1 LBX2-AS1 低表达细胞系中抑制miR-5010-5p表达可以恢复WNT7B的表达 |
| 3.5.2 抑制miR-5010-5p的表达可以恢复沉默LBX2-AS1 所抑制的骨肉瘤细胞的增殖 |
| 3.5.3 抑制miR-5010-5p的表达可以恢复沉默LBX2-AS1 所抑制的骨肉瘤细胞的迁移 |
| 4 讨论 |
| 5 研究结论 |
| 第二部分:TUG1 在胃癌中作用的生物信息学分析及实验验证 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验仪器 |
| 2.1.2 实验耗材 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 生物信息学分析方法 |
| 2.2.2 湿实验实验方法 |
| 2.2.3 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 生物信息学分析结果 |
| 3.1.1 患者的基线特征 |
| 3.1.2 胃腺癌中TUG1 高表达 |
| 3.1.3 TUG1 表达与临床特征的相关性 |
| 3.1.4 TUG1 的高表达提示预后不良 |
| 3.1.5 TUG1 在胃腺癌中的诊断价值 |
| 3.1.6 GO和 KEGG富集分析TUG1 的共表达基因 |
| 3.1.7 GSEA识别与TUG1 相关的生物学过程和信号通路 |
| 3.2 湿实验结果 |
| 3.2.1 TUG1 在胃癌患者表达水平高,与淋巴结转移及Ki-67密切相关 |
| 3.2.2 TUG1 高表达患者生存分析 |
| 3.2.3 TUG1 高表达可能与耐药相关 |
| 3.2.4 TUG1 促进胃癌细胞的耐药 |
| 3.2.5 TUG1 促进胃癌细胞迁移和侵袭 |
| 4 讨论 |
| 5 研究结论 |
| 全文总结 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的研究成果 |
| 综述 非编码RNA在骨肉瘤发病、诊断和预后中的作用 |
| 参考文献 |
（4）TIPE1介导PRMT1调控STAT3精氨酸甲基化修饰参与骨肉瘤增殖机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 缩略语表 |
| 前言 |
| 第一部分 免疫分子TIPE1对骨肉瘤细胞增殖等生物学行为的影响 |
| 技术路线 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 TIPE1调控PRMT1/STAT3通路影响骨肉瘤增殖的分子机制研究 |
| 技术路线 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 第三部分 临床标本验证TIPE1抑制STAT3表达参与骨肉瘤发生 |
| 技术路线 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 英文论文1 |
| 英文论文2 |
（5）CXCL13趋化型CAR-T细胞对骨肉瘤治疗及其机制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 研究背景及文献综述 |
| 1.骨肉瘤及其治疗现状 |
| 1.1 骨肉瘤的危害 |
| 1.2 骨肉瘤的免疫微环境 |
| 1.3 骨肉瘤的免疫治疗概况 |
| 2.NK G2D配体在骨肉瘤中的表达 |
| 3.趋化因子CXCL13与CXCR5 在肿瘤中的作用 |
| 4.肿瘤微环境 |
| 4.1 肿瘤浸润的MDSCs细胞 |
| 4.2 肿瘤浸润的巨噬细胞 |
| 4.3 肿瘤浸润的Tregs细胞 |
| 5.嵌合抗原受体T细胞免疫疗法及其研究进展 |
| 5.1 CAR-T概述 |
| 5.2 嵌合抗原受体的结构 |
| 5.3 CAR-T细胞治疗研究进展 |
| 6.NFAT信号通路及其作用机制 |
| 第二章 CXCR5-NKG2D-CAR-T细胞治疗骨肉瘤的研究 |
| 1.引言 |
| 2.材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 CXCL13 与骨肉瘤的关系 |
| 2.3 Mock-CAR、NKG2D-CAR、CXCR5-NKG2D-CAR的构建和T细胞的感染 |
| 2.4 CAR-T细胞的制备 |
| 2.5 CAR-T细胞体外活性研究 |
| 2.6 CXCR5-NKG2D-CAR-T细胞机制研究 |
| 2.7 CXCR5-NKG2D-CAR-T细胞治疗骨肉瘤体内研究 |
| 3.实验结果 |
| 3.1 CXCL13 的表达量与骨肉瘤病人免疫和生存期的关系 |
| 3.2 Mock、NKG2D、CXCR5-NKG2D CAR表达载体、病毒包装和T细胞的感染 |
| 3.3 Mock-CAR-T、NKG2D-CAR-T和 CXCR5-NKG2D-CAR-T体外活性 |
| 3.4 CXCR5增强NKG2D-CAR-T细胞活性的机制研究 |
| 3.5 CXCR5 增强了NKG2D-CAR-T的体内抗肿瘤活性 |
| 4.讨论 |
| 5.小结 |
| 第三章 mCXCR5-NKG2D-CAR-T对骨肉瘤肿瘤免疫微环境的影响 |
| 1.引言 |
| 2.实验材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 CXCR5-NKG2D-CAR-T细胞的体外活性研究 |
| 2.4 CXCR5-NKG2D-CAR-T细胞对BALB/c骨肉瘤小鼠的治疗 |
| 3.实验结果 |
| 3.1 鼠源CAR-T细胞和鼠源靶细胞的制备 |
| 3.2 mCXCR5-NKG2D-CAR-T细胞体外活性检测 |
| 3.3 mCXCR5-NKG2D-CAR-T细胞的体内活性检测 |
| 4.讨论 |
| 5.小结 |
| 参考文献 |
| 简历 |
| 已发表文章 |
| 发表专利 |
| 获得奖励 |
| 致谢 |
| 附件一 RNA测序后定量PCR引物序列 |
（6）辛伐他汀调控YAP介导的SOX9转录抑制骨肉瘤转移的作用及分子机制研究（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 辛伐他汀通过调节SOX9表达来调控骨肉瘤细胞的迁移和侵袭 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 SOX9是YAP-TEAD的直接靶基因 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 辛伐他汀通过调节YAP活性来调控SOX9转录 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四部分 辛伐他汀通过RhoA和细胞骨架调节YAP活性以及SOX9表达 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第五部分 辛伐他汀在体内抑制骨肉瘤细胞肺转移 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 文献综述 他汀类药物抗肿瘤的机制及临床研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间的科研成果及参加的学术会议 |
（7）尤文肉瘤临床预后模型的建立与肿瘤进展的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 脊柱-骨盆尤文肉瘤临床预后模型的建立与外部验证 |
| 第一节 引言 |
| 第二节 实验材料与方法 |
| 第三节 实验结果 |
| 第四节 讨论 |
| 第二部分 Tenascin-C调控尤文肉瘤进展的功能和机制研究 |
| 第一章 Tenascin-C在尤文肉瘤中的表达及功能研究 |
| 第一节 引言 |
| 第二节 实验材料与方法 |
| 第三节 实验结果 |
| 第四节 讨论 |
| 第二章 Tenascin-C与融合蛋白EWS-FLI1 的关系研究 |
| 第一节 引言 |
| 第二节 实验材料与方法 |
| 第三节 实验结果 |
| 第四节 讨论 |
| 第三章 Tenascin-C调控经Integrinα5β1 介导的Hippo-YAP通路 |
| 第一节 引言 |
| 第二节 实验材料与方法 |
| 第三节 实验结果 |
| 第四节 讨论 |
| 第三部分 去泛素化酶ZRANB1 调控尤文肉瘤进展的功能和机制研究. |
| 第一章 基于加权基因共表达网络分析筛选和验证目的基因 |
| 第一节 引言 |
| 第二节 实验材料与方法 |
| 第三节 实验结果 |
| 第四节 讨论 |
| 第二章 ZRANB1 通过去泛素化NPRL2 调控尤文肉瘤增殖 |
| 第一节 引言 |
| 第二节 实验材料与方法 |
| 第三节 实验结果 |
| 第四节 讨论 |
| 文献综述 |
| 一、尤文肉瘤的流行病学特征和诊疗进展 |
| (一)尤文肉瘤的流行病学特征 |
| (二)尤文肉瘤的诊疗进展 |
| (三)尤文肉瘤治疗的潜在药物靶点 |
| 二、细胞外基质与肿瘤的关系 |
| (一)细胞外基质概述 |
| (二)细胞外基质重塑在肿瘤发生发展中的作用 |
| (三)Tenascin-C在肿瘤发生发展中的功能和机制 |
| 三、Hippo信号通路与肿瘤的关系 |
| (一)Hippo信号通路概述 |
| (二)YAP/TAZ在肿瘤发生发展中的作用及相关机制 |
| (三)YAP/TAZ作为药物靶点在肿瘤治疗中的应用 |
| 四、去泛素化酶与肿瘤的关系 |
| (一)去泛素化酶概述 |
| (二)去泛素化酶在肿瘤发生发展中的作用及相关机制 |
| (三)去泛素化酶ZRANB1 调控肿瘤恶性行为的研究进展 |
| 五、mTORC1 信号通路与肿瘤的关系 |
| (一)mTORC1 信号通路概述 |
| (二)mTORC1 信号通路在肿瘤发生发展中的作用及相关机制 |
| 六、总结与展望 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间个人发表论文和参加科研工作的情况 |
| 致谢 |
（8）Gankyrin对骨肉瘤增殖、侵袭和转移的影响及机制研究（论文提纲范文）
| 英文缩略词表(Abbreviation) |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一部分 Gankyrin上调YAP对骨肉瘤增殖的影响和机制研究 |
| 1 前言 |
| 2 实验材料 |
| 2.1 患者标本的收集 |
| 2.2 实验动物 |
| 2.3 质粒及主要试剂 |
| 2.4 主要仪器与设备 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 Real-time PCR实验 |
| 3.2 Western blot实验 |
| 3.3 免疫组织化学染色实验 |
| 3.4 细胞培养及转染 |
| 3.5 细胞免疫荧光染色实验 |
| 3.6 组织免疫荧光染色实验 |
| 3.7 荧光素酶报告实验 |
| 3.8 免疫共沉淀实验 |
| 3.9 MTT实验 |
| 3.10 裸鼠成瘤实验 |
| 3.11 统计方法 |
| 4 实验结果 |
| 4.1 Gankyrin在骨肉瘤中的表达及与骨肉瘤患者不良预后的相关性 |
| 4.2 Gankyrin调控YAP表达的机制 |
| 4.3 Gankyrin与 YAP的相互作用及对骨肉瘤细胞体外增殖的影响 |
| 4.4 Gankyrin对骨肉瘤体内增殖的影响 |
| 4.5 Gankyrin和 YAP在骨肉瘤组织标本中表达相关性 |
| 5 讨论 |
| 6 结论 |
| 7 创新之处 |
| 8 参考文献 |
| 第二部分 Gankyrin调控Hedgehog信号通路对骨肉瘤侵袭和转移的影响和机制研究 |
| 1 前言 |
| 2 实验材料 |
| 2.1 患者标本的收集 |
| 2.2 实验动物 |
| 2.3 质粒及主要试剂 |
| 2.4 主要仪器与设备 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 细胞划痕 |
| 3.2 Transwell侵袭实验 |
| 3.3 Real-time PCR实验 |
| 3.4 Western blot实验 |
| 3.5 免疫共沉淀实验 |
| 3.6 细胞免疫荧光染色实验 |
| 3.7 组织免疫荧光染色实验 |
| 3.8 免疫组织化学染色实验 |
| 3.9 肺转移瘤模型 |
| 3.10 H&E染色 |
| 3.11 统计方法 |
| 4 实验结果 |
| 4.1 Gankyrin对骨肉瘤细胞迁移、侵袭和干细胞特性的影响 |
| 4.2 Gankyrin调控Gli1 影响骨肉瘤细胞迁移、侵袭和干细胞特性的机制 |
| 4.3 Gankyrin调控Gli1 对骨肉瘤体内肺转移的影响 |
| 5 讨论 |
| 6 结论 |
| 7 创新之处 |
| 8 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 综述 Hippo信号通路调控机制及在肿瘤中的研究进展 |
| 参考文献 |
（9）抑制VEGF和Survivin基因的一链双靶siRNA干预骨肉瘤的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 课题来源、研究目的、意义和国内外研究现状 |
| 1.2 论文的主要研究内容 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 主要试剂和材料 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 实验试剂配制 |
| 2.1.3 细胞计数 |
| 2.1.4 细胞株和siRNA |
| 2.2 主要仪器设备 |
| 2.3 实验流程与方法 |
| 2.3.1 构建单靶和一链双靶siRNA |
| 2.3.2 MG-63和Saos-2 细胞的培养 |
| 2.3.3 MG-63和Saos-2 细胞的转染 |
| 2.3.4 QRT-PCR检测细胞mRNA表达 |
| 2.3.5 Western blot检测细胞蛋白表达 |
| 2.3.6 MTT法检测各转染组细胞的增殖水平 |
| 2.3.7 流式细胞仪检测细胞凋亡 |
| 2.3.8 划痕实验检测细胞迁移能力 |
| 2.3.9 血管形成试验 |
| 2.3.10 细胞免疫组化染色 |
| 2.3.11 细胞免疫荧光染色及激光共焦距显微镜观察 |
| 2.4 统计学处理 |
| 第三章 结果 |
| 3.1 骨肉瘤MG-63和Saos-2 细胞的培养 |
| 3.2 VEGF siRNA,Survivin siRNA和一链双靶siRNA对 MG-63和Saos-2 细胞VEGF和Survivin m RNA和蛋白表达的影响 |
| 3.3 VEGF siRNA,Survivin siRNA和一链双靶siRNA对 MG-63和Saos-2 细胞增殖和凋亡的影响 |
| 3.4 VEGF siRNA,Survivin siRNA和一链双靶siRNA对 MG-63和Saos-2 细胞迁移的影响 |
| 3.5 VEGF siRNA,Survivin siRNA和一链双靶siRNA对 MG-63和Saos-2 细胞血管形成的影响 |
| 3.6 细胞免疫组化和细胞免疫荧光化学染色结果 |
| 第四章 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 骨肉瘤治疗的研究进展 |
| 参考文献 |
| 英文缩写词表 |
| 在攻读博士学位期间公开发表的论文与参加的项目 |
| 致谢 |
（10）MiR-615-5p靶向AKT1调控骨肉瘤细胞增殖、侵袭和迁移的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 中英文缩略词表 |
| 前言 |
| 一、骨肉瘤及MIRNAS |
| 二、MIR-615及其生物学功能研究简介 |
| 三、AKT1生物学功能及调控因子研究 |
| 四、本研究目的及意义 |
| 第一部分 骨肉瘤组织及细胞中MIR-615-5P表达水平研究 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 第二部分 MIR-615-5P过表达对骨肉瘤细胞生物学行为的影响 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 第三部分 MIR-615-5P通过AKT1 影响U2OS细胞生物学行为的相关机制研究 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 综述 MIRNAS在骨肉瘤中的作用机制研究进展 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表论文和参加科研工作情况说明 |
| 致谢 |
四、骨肉瘤细胞增殖活性的测定及其与预后的关系（论文参考文献）
- [1]氯喹协同载阿霉素还原响应性纳米凝胶抗骨肉瘤的作用与机制研究[D]. 邱仁娜. 吉林大学, 2021(01)
- [2]长链非编码RNA LINC01614通过miR-520a-3p/SNX3调控轴促进骨肉瘤进展的分子机制[D]. 蔡启轩. 吉林大学, 2021(01)
- [3]长链非编码RNA参与骨肉瘤和胃癌增殖、迁移与耐药的机制研究[D]. 刘媛. 南昌大学, 2021(01)
- [4]TIPE1介导PRMT1调控STAT3精氨酸甲基化修饰参与骨肉瘤增殖机制研究[D]. 刘光平. 山东大学, 2021(12)
- [5]CXCL13趋化型CAR-T细胞对骨肉瘤治疗及其机制的研究[D]. 张利. 华东师范大学, 2021(12)
- [6]辛伐他汀调控YAP介导的SOX9转录抑制骨肉瘤转移的作用及分子机制研究[D]. 杜兴. 重庆医科大学, 2021(01)
- [7]尤文肉瘤临床预后模型的建立与肿瘤进展的机制研究[D]. 何韶辉. 中国人民解放军海军军医大学, 2021(01)
- [8]Gankyrin对骨肉瘤增殖、侵袭和转移的影响及机制研究[D]. 程里. 安徽医科大学, 2021(01)
- [9]抑制VEGF和Survivin基因的一链双靶siRNA干预骨肉瘤的研究[D]. 顾军权. 苏州大学, 2021(06)
- [10]MiR-615-5p靶向AKT1调控骨肉瘤细胞增殖、侵袭和迁移的机制研究[D]. 范人杰. 中国人民解放军海军军医大学, 2020(06)