不稳定冠状动脉粥样硬化斑块的研究进展

一、不稳定性冠状动脉粥样硬化斑块的研究进展（论文文献综述）

林朋^[1]（2021）在《基于血管内超声探讨MHR与斑块稳定性的相关性研究》文中研究表明目的通过血管内超声（intravenous ultrasound,IVUS）探讨单核细胞/高密度脂蛋白胆固醇比值（monocyte to high density lipoprotein cholesterol ratio,MHR）与冠状动脉粥样硬化斑块稳定性的相关性,评估MHR对经皮冠状动脉介入治疗（percutaneous coronary intervention,PCI）冠心病患者12个月的主要不良心血管事件（major adverse cardiovascular events,MACEs）预测价值。方法选取2017年6月至2019年6月于蚌埠医学院第一附属医院行PCI及IVUS的132例冠心病患者,入院后详细记录患者临床资料:性别、年龄、高血压病史、糖尿病病史、吸烟史、左室射血分数（left ventricular ejection fractions,LVEF）、中性粒细胞计数、单核细胞计数、总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇（low density lipoprotein cholesterol,LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（high density lipoprotein cholesterol,HDL-C）、C反应蛋白（C-reactive protein,CRP）,并同时计算出MHR,并规律随访患者12个月,记录是否发生MACEs:心源性死亡、靶血管再次血运重建（target lesion revascularizition,TLR）、非致命性心肌梗死、支架内再狭窄、支架内血栓等。分析IVUS图像,识别罪犯血管的斑块稳定性,分为稳定性斑块组（35例）、不稳定性斑块组（97例）。评估MHR在冠心病患者斑块稳定性的诊断价值,分析MHR与PCI术后12月内发生MACE的相关性。结果1.入组患者基线资料分析显示与斑块稳定组相比,斑块不稳定组患者平均年龄大、吸烟比例高、糖尿病病史占比高、单核细胞计数、HDL-C、MHR、CRP均明显升高,差异有统计学意义（P均<0.05）;两组在性别、高血压病占比、收缩压、舒张压、LVEF、中性粒细胞比值、总胆固醇、甘油三酯、LDL-C、HDL-C指标中,差异均无统计学意义（P均>0.05）。两组介入资料对比,两组中植入的支架数目、支架长度、支架直径、罪犯血管占比以及IVUS指标方面均无统计学意义（P均>0.05）。2.为比较中性粒细胞计数、单核细胞计数、总胆固醇、甘油三酯、LDL-C、HDL-C、MHR、CRP及MHR联合CRP在评估斑块稳定性的价值,进行ROC曲线分析显示中性粒细胞计数、单核细胞计数、总胆固醇、甘油三酯、LDL-C、HDL-C的曲线面积均小于0.7,MHR、CRP及MHR联合CRP的曲线下面积分别为0.726、0.710及0.732。3.应用ROC曲线分析MHR水平对冠心病患者行PCI术后12个月内发生MACE的预测效能,曲线下的面积为0.794（95%CI:0.715～0.859,P<0.001）,切点值在19.31时预测最大,诊断敏感性为68.42%、特异性为83.19%。4.将临床上常见的心血管危险因素进行单因素Logistic回归分析,结果显示,吸烟、2型糖尿病、LDL-C、HDL-C、CRP、MHR与冠状动脉粥样硬化斑块稳定性呈显着相关（P均<0.05）。纳入上述指标进一步行多因素Logistic回归分析,结果显示2型糖尿病、CRP、MHR是冠状动脉粥样硬化不稳定性斑块的独立危险因素（P均<0.05）。结论MHR对冠心病患者斑块的稳定性有诊断价值,是不稳定性斑块的独立危险因素,MHR以及MHR联合CRP在评估斑块稳定性较单一指标更有意义,且对冠心病患者行PCI后12个月发生MACE具有预测价值。

陈芳芳^[2]（2021）在《脂肪细胞来源外泌体在糖尿病动脉粥样硬化疾病中的作用及机制研究》文中提出研究背景糖尿病是21世纪全球最严重的公共卫生问题之一,我国已成为糖尿病患者总数最多的国家。与未患糖尿病的成年人相比,大约75%的2型糖尿病患者死于心血管并发症。研究表明,冠心病合并2型糖尿病患者的冠状动脉受累程度高且弥漫病变较多、狭窄程度较重,临床治疗困难明显增加。经皮冠状动脉介入治疗（Percutaneous coronary interventions,PCI）是目前用于治疗冠心病合并糖尿病的有效手段。但是在PCI日臻完善的今天,糖尿病一直是PCI术中并发症和术后近、远期预后不良的独立危险因素。糖尿病患者PCI术后支架内再狭窄发生率显着升高,是严重影响患者预后的主要因素。支架内再狭窄（Int-stentrestenosis,ISR）是涉及多种机制的复杂疾病过程,是恶化2型糖尿病心血管并发症患者预后的核心问题。现有观点认为以平滑肌细胞增殖为核心的血管内膜增生是支架内再狭窄的主要病理过程和关键环节。以此为靶点开发的雷帕霉素、紫杉醇药物洗脱支架可在一定程度上降低支架内再狭窄的发生率,但存在“晚期追赶现象”,且晚期支架内再狭窄发生率仍高达10%。由此推测平滑肌细胞增殖可能只是血管内膜增生的主要中间过程而非启动因素,而糖尿病导致PCI术后支架内再狭窄发生率显着增高的关键机制也尚未阐明。因此,探索糖尿病条件下血管内膜增生的启动环节,寻找以此为靶点的干预方法,才能从源头上阻断支架内再狭窄的发生发展。对于血管结构而言,内皮细胞作为管壁组织与血液中各种病理性刺激的天然屏障,是保护平滑肌细胞免受刺激因素干扰的关键,在血管内膜增生过程中可能是先于平滑肌细胞发挥作用的核心角色。支架的植入过程中存在内皮细胞受损,内皮细胞损伤是启动动脉粥样硬化的关键步骤。围手术期药物的规范应用已在最大程度上保护了内皮细胞的完整性,而平滑肌细胞仍能不断受到刺激而增殖。近期关于内皮细胞在刺激因素下向间质细胞转变即内皮间质转化（Endothelial-Mesenchymal Transition,EndMT）的研究给了我们一定的启示。EndMT 是指在某些特定的生理或病理条件下,内皮细胞失去其自身特异性抗原,而获得间质细胞抗原,同时其生物学特性明显改变,获得较强的增殖、迁移、收缩能力。EndMT在冠状动脉和肺动脉的发育过程中可使内皮细胞向平滑肌细胞进行转化,对心血管系统的正常发育有至关重要的作用。EndMT参与了诸多与血管内膜增生相关疾病的发生过程,促进动脉粥样硬化,但未涉及PCI术后再狭窄防治的研究。因此,EndMT可能是支架内再狭窄发生的关键步骤。近来研究证实,多种外界刺激因素在内皮细胞发生EndMT中起重要作用,包括高糖、炎症、低氧、脂代谢异常、氧化应激、机械牵张力、吸烟等,但是糖尿病、动脉粥样硬化及支架内再狭窄的发病机制复杂,涉及上述多种机制的协同作用。外泌体（Exosomes）能够携带大量蛋白质、核酸及脂质成分,整合来源细胞的有效刺激信息,有效实现信号的级联放大和远距离传输。Exosomes所携带、传递的信息成分多与其来源细胞/组织密切相关。糖尿病状态下,脂肪细胞来源外泌体（Adipocyte-derived exosomes,AdExos）含有脂肪组织炎症及胰岛素抵抗的相关蛋白及核酸成分,能够通过作用于靶细胞诱发多种生物学功能,可能是链接胰岛素抵抗的脂肪组织与糖尿病动脉血管之间的重要桥梁,是整合机体多种刺激因素,诱发EndMT的关键载体。Sonic hedgehog（Shh）作为Hedgehog蛋白三种同源形式之一,表达最广泛,活性最高,是参与胚胎发育的关键蛋白。在肿瘤领域的研究发现,Shh具有激活Snail信号通路促进上皮间质转化（Epithelial-mesenchymal transition,EMT）的作用,而EndMT是EMT的一种特殊类型。进一步研究证实,Snail信号通路亦是调节EndMT形成的关键信号通路。综上,我们提出研究假说:糖尿病状态下,携带Shh的AdExos增多,被内皮细胞摄取,AdExos通过其表面携带的Shh激活Snail依赖的EndMT过程,导致内皮细胞发生表型转换,逐渐向间质细胞转化,促进血管内膜增生,最终导致支架内再狭窄的发生。鉴于以上假说,我们将进行体内及体外实验,在整体和细胞水平研究脂肪细胞来源外泌体在血管再狭窄中的作用及具体机制。研究目的1.在整体动物水平证实AdExos通过其携带的Shh促进内皮间质转化,加剧血管内膜增生,进而影响糖尿病血管再狭窄的发生;2.从细胞水平探索AdExos促内皮间质转化的特性,验证AdExos通过其携带的Shh激活内皮细胞Snail信号通路并促进EndMT,为2型糖尿病PCI术后支架内再狭窄防治提供新的靶点。研究方法1.培养、诱导分化3T3-L1前脂肪细胞并建立胰岛素抵抗模型首先,我们通过胰岛素、3-异丁基-1-甲基,黄嘌呤与地塞米松联合诱导的方法将3T3-L1前脂肪细胞诱导分化为成熟的脂肪细胞,再通过高糖联合高胰岛素的方法建立胰岛素抵抗的脂肪细胞模型,采用无exosomes血清培养并收集细胞上清,获取对照组（Control,Ctrl）及胰岛素抵抗组（Insulin resistance,IR）脂肪细胞上清。2.Shh腺病毒转染3T3-L1脂肪细胞在建立胰岛素抵抗模型的基础上,我们再将Shh干扰及过表达的腺病毒转染入成熟脂肪细胞中,采用无exosomes血清培养后,收集细胞上清,获取胰岛素抵抗组、Shh干扰的胰岛素抵抗组、Shh过表达的胰岛素抵抗组及空载体胰岛素抵抗组的脂肪细胞上清。3.AdExos的分离提取及特征鉴定将前文中获得的多种脂肪细胞上清通过超速差速离心法,分离提取上清中的外泌体,由此获得对照组外泌体（Ctrl-AdExos）、胰岛素抵抗组外泌体（IR-AdExos）、Shh干扰的胰岛素抵抗组外泌体（IR-AdExosshh-）、Shh过表达的胰岛素抵抗组外泌体（IR-AdExosshh+）及空载体胰岛素抵抗组外泌体（IR-AdExosvector）;再采用透射电镜、动态光散射粒度仪、流式细胞仪及Western blot等方法进行AdExos的特征鉴定。4.2型糖尿病血管再狭窄ApoE-/-小鼠模型的构建4周龄的雄性ApoE-/-小鼠,适应性喂养1周后,禁食处理12～14小时,进行腹腔糖耐量试验（Intraperitoneal glucose tolerance test,IPGTT）后随机分为高脂饮食组和普通饮食组,高脂饮食组予以高脂饲料喂养,普通饮食组予以普通生长繁殖饲料喂养;6周后再次进行IPGTT试验,出现胰岛素抵抗的高脂饮食组小鼠给予一次性腹腔注射链脲佐菌素（Streptozotocin,STZ）（剂量标准为75mg/kg）,普通饮食组小鼠给予同等剂量的枸橼酸钠缓冲液进行腹腔注射;继续以原饲料喂养2周后,再次进行IPGTT试验和随机血糖检测,如果小鼠的随机血糖水平≥11.1mmol/L,且有多饮、多尿、多食等现象,则纳入2型糖尿病组。对2型糖尿病组小鼠和对照组小鼠通过植入股动脉袖套的方法构建血管再狭窄模型。分别给予生理盐水、IR-AdExos及IR-AdExosshh-经尾静脉注射,最后得到动物分组分别为普通饮食再狭窄组（Chow）、普通饮食+IR-AdExos再狭窄组（Chow+IR-AdExos）、普通饮食+IR-AdExosshh-再狭窄组（Chow+IR-AdExosshh）、糖尿病再狭窄组（DM）、糖尿病+IR-AdExos再狭窄组（DM+IR-AdExos）及糖尿病+IR-AdExosshh-再狭窄组（DM+IR-AdExosshh-）。5.小鼠体内血管对AdExos的摄取为了验证小鼠血管能够摄取AdExos,我们采用PKH26染料标记AdExos,经尾静脉注射入再狭窄模型小鼠,制作血管标本切片,通过免疫荧光染色观察AdExos在体内的摄取情况。6.病理组织学染色观察血管再狭窄情况对股动脉再狭窄部位组织标本切片进行Hematoxylin-eosin staining（HE）染色、Verhoeffs Van Gieson弹性纤维染色及免疫组化染色,观察血管再狭窄情况。7.免疫荧光染色检测再狭窄部位EndMT发生情况通过进行 CD31 和 SM22α、CD31 和 Vimentin、Ve-Cadherin 和 SM22α、Ve-Cadherin和Vimentin免疫荧光共定位染色的方法检测血管再狭窄部位EndMT的发生情况。8.分离提取小鼠主动脉内皮细胞,验证内皮细胞对AdExos的摄取为了进一步研究AdExos对内皮细胞发生内皮间质转化的影响,我们进行了体外细胞实验,通过酶消法提取小鼠主动脉内皮细胞,给予PKH26标记的AdExos,采用鬼笔环肽标记细胞骨架蛋白,显微镜下观察内皮细胞对AdExos的摄取。9.AdExos刺激孵育小鼠主动脉内皮细胞,检测细胞中EndMT发生情况再将所获取的Ctrl-AdExos、IR-AdExos、IR-AdExosshh-、IR-AdExosshh+、IR-AdExosvector等不同培养条件来源的AdExos及TGF-β、SHH重组蛋白用以刺激孵育小鼠主动脉内皮细胞,通过免疫荧光染色及Western blot的方法评价内皮标记物和间质标记物的表达变化及EndMT的发生情况。10.Western blot 检测分子机制方面,取AdExos及重组蛋白刺激孵育后的小鼠主动脉内皮细胞,提取蛋白质,采用Western blot方法检测Shh、内皮细胞及间质细胞标记物的表达及信号通路分子的表达情况。研究结果1.建立3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗模型3T3-L1前脂肪细胞诱导分化至成熟脂肪细胞后,细胞质内出现较多、较大的脂滴;高糖高胰岛素条件培养成熟脂肪细胞24h后,脂肪细胞总蛋白中总IRS1表达量显着减少,磷酸化Ser307位点的IRS1表达量显着增高,Akt的磷酸化水平降低;脂肪细胞细胞膜蛋白Glut4表达减少而细胞浆蛋白Glut4表达增加,提示胰岛素抵抗状态下Glut4细胞膜转位减少;胰岛素抵抗状态下,脂肪细胞脂质沉积增多。上述结果表明我们成功建立了 3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗模型。2.AdExos的分离提取及特征鉴定透射电镜观察下发现AdExos呈膜包被的囊泡状,直径在30～100nm范围内;动态光散射粒度仪结果表明AdExos直径范围分布于30～100nm;Western blot及流式细胞学结果表明AdExos阳性表达CD63、TSG101及CD81,而不表达GRP94和Calnexin。3.构建2型糖尿病血管再狭窄ApoE-/-小鼠模型ApoE-/-小鼠通过高脂饮食饲养联合链脲佐菌素（Streptozotocin,STZ）一次性注射的方法构建2型糖尿病模型,糖尿病小鼠随机血糖≥11.1 mmol/L,且有多饮、多尿、多食等现象。在此模型的基础上,通过股动脉袖套植入的方式构建再狭窄模型。4.糖尿病脂肪组织来源外泌体富集Shh分子通过Western blot方法检测对照组和糖尿病组小鼠脂肪组织来源外泌体蛋白中Shh分子的表达情况,结果表明糖尿病组小鼠脂肪组织来源外泌体中Shh含量显着高于对照组,证明糖尿病脂肪组织来源外泌体富集Shh分子。5.小鼠体内血管对AdExos的摄取在免疫荧光显微镜下进行观察,发现PKH26标记的AdExos呈红色荧光,分布于小鼠血管范围内,证明小鼠血管能够成功摄取AdExos。6.IR-AdExos通过携带的Shh分子促进血管再狭窄高分辨率显微超声技术检测股动脉收缩期最大流速（Peak systolic velocity,PSV）,HE染色分析血管再狭窄,综合二者结果确定血管再狭窄情况。结果表明,糖尿病组小鼠股动脉再狭窄情况与普通饮食组相比明显加重;与普通饮食组或糖尿病组相比,普通饮食+IR-AdExos组或糖尿病+IR-AdExos组的再狭窄情况进一步加重;而Shh蛋白敲减后的IR-AdExos,其促血管再狭窄的能力有所下降,即普通饮食+IR-AdExosshh-组小鼠股动脉再狭窄较普通饮食+IR-AdExos组小鼠更轻,糖尿病+IR-AdExosshh-组小鼠股动脉再狭窄程度比糖尿病+IR-AdExos组小鼠更轻。7.IR-AdExos通过携带的Shh分子促进股动脉再狭窄部位EndMT的发生通过免疫荧光共定位的方法检测血管再狭窄部位发生EndMT的情况,免疫荧光共定位时,如果内皮细胞同时表达内皮细胞特征性标志物（CD31、Ve-Cadherin）和间充质细胞特征性标志物（SM22α、Vimentin）则记为发生内皮细间质转化的细胞。结果表明糖尿病状态下,内皮细胞标志物减少,间质细胞标志物增加,提示发生EndMT;尾静脉注射IR-AdExos能够进一步促进EndMT的发生,而敲减Shh的IR-AdExos其促EndMT作用减弱,证明IR-AdExos表面的Shh分子是IR-AdExos发挥促EndMT作用的主要分子靶点。8.成功提取原代小鼠主动脉内皮细胞,小鼠主动脉内皮细胞能够摄取AdExos我们采用酶消法成功提取小鼠主动脉内皮细胞,经免疫荧光染色证明所提取的内皮细胞阳性表达内皮细胞标记物CD31,证明小鼠主动脉内皮细胞提取成功。将PKH26标记的AdExos与小鼠主动脉内皮细胞共同孵育,显微镜下观察可见细胞浆内有红色荧光,即为被小鼠主动脉内皮细胞摄取的AdExos,证明小鼠主动脉内皮细胞能够摄取AdExos。9.AdExos促进内皮细胞发生EndMT将 Ctrl-AdExos、IR-AdExos、IR-AdExosshh-、IR-AdExosshh+、IR-AdExosvector等不同培养条件来源的AdExos及TGF-β、SHH重组蛋白刺激孵育小鼠主动脉内皮细胞后,通过免疫荧光共定位的方法检测内皮细胞EndMT的发生。免疫荧光共定位时,如果内皮细胞同时表达内皮细胞特征性标志物（CD31、Ve-Cadherin）和间充质细胞特征性标志物（α-SMA、FAP、FSP-1）则记为发生内皮细间质转化的细胞。与Ctrl组相比,IR-AdExos组内皮细胞发生EndMT增多;与IR-AdExos组相比,IR-AdExosshh-组发生EndMT的内皮细胞数量并无显着增加,而IR-AdExosshh+组中发生EndMT的内皮细胞数量进一步增加;TGF-β作为阳性对照,在其刺激下,发生EndMT的内皮细胞数量显着增加;SHH重组蛋白刺激组中,发生EndMT的内皮细胞数量也有显着增加。上述结果表明,IR-AdExos能够促进内皮细胞发生EndMT,且该作用是经由其携带的Shh分子发挥的。另,TGF-β及SHH也具有促进内皮细胞发生EndMT的作用。10.IR-AdExos促进血管再狭窄EndMT的分子机制与Ctrl组相比,IR-AdExos组内皮细胞中Snail和Slug表达显着升高。证明IR-AdExos的促EndMT作用是通过其表面的Shh作用于下游的Snail和Slug分子发挥作用。研究结论1.胰岛素抵抗条件下,脂肪细胞中脂质含量增多,脂肪细胞来源外泌体富集Shh分子;2.IR-AdExos能够通过携带的Shh分子,经由Shh/Snail/Slug信号通路促进小鼠主动脉内皮细胞发生EndMT;3.富集Shh的IR-AdExos能够明显促进血管内皮细胞发生间质转化,进而加剧糖尿病小鼠血管再狭窄的发生,可能是糖尿病脂肪组织促进血管再狭窄的重要机制之一,IR-AdExos有望成为进一步防治糖尿病ISR的新靶点。研究背景糖尿病已成为21世纪威胁人类生命健康的重大慢性疾病之一。近年来,我国糖尿病患病率增长迅速,中国已成为全球糖尿病患者总数最多的国家。心血管疾病是糖尿病患者的主要死亡原因。粥样斑块破裂导致的急性冠脉综合征是糖尿病患者心血管事件的主要原因。但是糖尿病患者冠状动脉病变严重、易损斑块发生率高的机制尚未完全阐明。循证医学证据表明,积极控制血糖可以降低糖尿病患者微血管病变的发生率,但强化降糖治疗能否降低2型糖尿病患者心血管事件的发生率尚未得到证实。这提示血糖和胰岛素水平仅能反映代谢水平,而不是糖尿病患者冠状动脉病变严重、易损斑块发生率高的根本原因。因此,亟需深入探讨糖尿病患者大血管并发症增加的深层次机制。既往研究发现动脉粥样硬化斑块内常出现病理性新生血管,且在易损斑块和斑块易损部位尤为明显,与斑块稳定性密切相关。病理性新生血管是动脉粥样硬化易损斑块形成的关键环节。越来越多的证据表明,动脉损伤部位病理性新生血管形成与粥样硬化斑块引起的急性冠脉综合症有关,这些斑块脆性较大且易发生破裂,进而导致血管阻塞。除了斑块内出血机制以外,病理性新生血管还通过白细胞征募来促进动脉粥样硬化斑块的不稳定性。2型糖尿病和动脉粥样硬化同属慢性炎症性疾病,在2型糖尿病状态下,脂质在脂肪细胞中不断存储,随着脂肪细胞逐渐增大,导致脂肪细胞功能失调,脂肪因子分泌紊乱,大量促炎因子合成释放,引发全身代谢性炎症反应、胰岛素抵抗,从而加速斑块进展,促进易损斑块的形成。此外,有研究发现,脂肪细胞能够分泌内皮特异性丝裂原和促血管生长因子,参与新生血管的形成。但功能失调的脂肪组织如何促进斑块内新生血管的形成,从而促进斑块发生发展的确切机制至今尚未见报道。近期,有学者认为外泌体（Exosomes）是脂肪组织与血管间信息传递的重要载体。Exosomes是由多种细胞（如血小板、内皮细胞、单核细胞等）产生的,携带大量与其细胞/组织来源和功能密切相关的蛋白质、核酸和脂质成分。可实现信号的级联放大和远距离传输。在人体内所有exosomes中,脂肪细胞来源的exosomes（Adipocyte-derived exosomes,AdExos）与糖尿病动脉粥样硬化的发生发展及新生血管形成的关系日益引起人们的关注。Hulsmans等认为,AdExos是将脂肪组织产生的炎症及氧化应激信息传递到血管的重要使者,从而引起内皮损伤、诱发动脉粥样硬化。但是,AdExos对于斑块稳定性变化及斑块内病理性新生血管的形成有无影响尚未见报道。研究发现AdExos富含纤粘连蛋白、层粘连蛋白,有利于循环中的AdExos粘附、迁移、浸润于内皮细胞。糖尿病慢性低度炎症状态下,受损的内皮细胞通透性增加且炎症因子（IL-6、IL-8）、趋化因子（MCP-1）、粘附因子（VCAM-1、E-selectin）表达上调,为循环中的AdExos粘附、浸润创造了良好的条件。此外,AdExos携带丰富的促血管生成miRNA,如miR221、miR27b、miR21、miR17～92等。脂肪组织作为内分泌器官,是多器官间相互联系的纽带。Hedgehog 蛋白在哺乳动物中有 Sonichedgehog（Shh）、Indianhedgehog（Ihh）及Desert hedgehog（Dhh）三种同源形式,其中Shh表达最广泛,活性最高。Hedgehog在斑马鱼胚胎发育中通过VEGF促进主动脉生成。Shh缺失的小鼠发育中的肺缺乏正常血管化的能力。Hedgehog信号可通过控制众多促血管生成因子包括VEGF-a,VEGF-b,VEGF-c及AngII的表达而调控新生血管的生成。Hedgehog蛋白促血管生成功能的发挥是通过连接到一种12次跨膜受体蛋白--Patched实现的。在正常情况下,Patched受体与另一种7次跨膜受体蛋白——Smoothened（Smo）相结合且抑制Smo的作用。当Hedgehog蛋白与Patched受体结合后,解除了对Smo的抑制作用,进而启动信号转导。Smo是Hedgehog信号通路的信息转换器,把细胞外的Hedgehog蛋白信号向细胞内传递,激活胶质瘤相关原癌基因（Glioma-associated oncogene homolog,Gli）转录因子。综上所述,我们提出了如下假说:糖尿病状态下,功能失调的脂肪组织释放入循环血液中的AdExos数量增多,其通过其表面的Hedgehog蛋白与内皮细胞上的Patched受体结合,促进病理性新生血管的形成,加速斑块进展及易损斑块的形成。研究目的1.从细胞水平分析AdExos促血管生成的特性;2.体外验证AdExos是否通过启动Hedgehog信号通路,促进新生血管的形成。研究方法1.培养、诱导分化3T3-L1前脂肪细胞并建立胰岛素抵抗模型通过胰岛素、3-异丁基-1-甲基-黄嘌呤与地塞米松联合诱导的方法将3T3-LI前脂肪细胞诱导分化为成熟的脂肪细胞。再通过高糖+高胰岛素的方法建立胰岛素抵抗的脂肪细胞模型。采用无exosomes血清培养并收集细胞上清,获取对照组（Control,Ctrl）及胰岛素抵抗组（Insulin resistance,IR）脂肪细胞上清。2.Shh腺病毒转染3T3-L1脂肪细胞在建立胰岛素抵抗模型的基础上,我们再将Shh干扰及过表达的腺病毒转染入成熟脂肪细胞中,采用无exosomes血清培养后,收集细胞上清,获取胰岛素抵抗组、Shh干扰的胰岛素抵抗组、Shh过表达的胰岛素抵抗组及空载体胰岛素抵抗组的脂肪细胞上清。3.AdExos的分离提取将前文中获得的多种脂肪细胞上清通过超速差速离心法,分离提取上清中的外泌体,由此获得对照组外泌体（Ctrl-AdExos）、胰岛素抵抗组外泌体（IR-AdExos）、Shh干扰的胰岛素抵抗组外泌体（IR-AdExosshh-）、Shh过表达的胰岛素抵抗组外泌体（IR-AdExosshh+）及空载体胰岛素抵抗组外泌体（IR-AdExosvector）。4.分离提取小鼠主动脉内皮细胞,验证内皮细胞对AdExos的摄取为了进一步研究AdExos对内皮细胞血管新生能力的影响,我们进行了体外细胞实验,通过酶消法提取小鼠主动脉内皮细胞,给予PKH26标记的AdExos,显微镜下观察内皮细胞对AdExos的摄取。5.AdExos刺激孵育小鼠主动脉内皮细胞,检测内皮细胞功能的改变将所获取的 Ctrl-AdExos、IR-AdExos、IR-AdExosshh-、IR-AdExosshh+、IR-AdExosvector等不同培养条件来源的AdExos及VEGF、SHH重组蛋白用以刺激孵育小鼠主动脉内皮细胞,通过PCNA/KI67免疫荧光染色检测内皮细胞增殖功能,通过细胞划痕实验检测迁移功能。6.小管形成实验检测AdExos促血管新生的特性将 Ctrl-AdExos、IR-AdExos、IR-AdExosshh-、IR-AdExosshh+、IR-AdExosvector等不同培养条件来源的AdExos及VEGF、SHH重组蛋白用以刺激孵育小鼠主动脉内皮细胞,通过小管形成实验观察小管形成的数量及分支长度,评价AdExos的促血管新生的能力。7.Hedgehog信号通路在AdExos促血管新生中的作用分子机制方面,给予Hedgehog蛋白阻断剂——环巴胺阻断Hedgehog信号通路,通过小管形成实验观察小管形成的数量及分支长度,检测内皮细胞的小管形成功能。给予Hedgehog蛋白阻断剂——环巴胺和Gli抑制剂——Gant61刺激孵育,提取小鼠主动脉内皮细胞的蛋白质,通过Western blot方法检测信号通路分子的表达情况。研究结果1.成功提取原代小鼠主动脉内皮细胞,小鼠主动脉内皮细胞能够摄取AdExos我们采用酶消法成功提取小鼠主动脉内皮细胞,经免疫荧光染色证明所提取的内皮细胞阳性表达内皮细胞标记物CD31,证明小鼠主动脉内皮细胞提取成功。将PKH26标记的AdExos与小鼠主动脉内皮细胞共同孵育,显微镜下观察可见细胞浆内有红色荧光,即为被小鼠主动脉内皮细胞摄取的AdExos,证明小鼠主动脉内皮细胞能够摄取AdExos。2.IR-AdExos改变小鼠主动脉内皮细胞的增殖和迁移功能用Ctrl-AdExos、IR-AdExos、VEGF及SHH重组蛋白刺激孵育小鼠主动脉内皮细胞。首先进行PCNA和KI67免疫荧光染色,结果显示:与对照组相比,Ctrl-AdExos刺激组的PCNA和KI67的表达量有所增加,IR-AdExos刺激组的PCNA和KI67的表达量显着增加,以VEGF作为促血管新生的阳性对照用以刺激内皮细胞,结果发现,与对照组相比,VEGF刺激组中内皮细胞的PCNA及KI67表达量均显着增加。表明IR-AdExos、VEGF能够显着增强内皮细胞的增殖功能。细胞划痕实验结果显示:与对照组相比,Ctrl-AdExos刺激组的细胞迁移率有增加,IR-AdExos细胞迁移率显着增加,VEGF刺激组细胞迁移率明显增加。表明IR-AdExos、VEGF能够显着增强内皮细胞的迁移功能。3.AdExos促进小鼠主动脉内皮细胞的小管形成功能用Ctrl-AdExos、IR-AdExos、VEGF及SHH重组蛋白刺激孵育小鼠主动脉内皮细胞。进行小管形成实验,结果发现:与对照组相比,Ctrl-AdExos刺激组细胞小管形成数量、分支长度增加,IR-AdExos刺激组细胞小管形成数量、分支长度显着增加,VEGF阳性对照组内皮细胞小管形成数量、分支长度显着增加。表明IR-AdExos、VEGF能够明显增强内皮细胞的小管形成功能。4.Shh基因干预的IR-AdExos影响小鼠主动脉内皮细胞的增殖和迁移功能用 IR-AdExos、IR-AdExosshh-、IR-AdExosshh+、IR-AdExosvector 等不同培养条件来源的AdExos及VEGF、SHH重组蛋白刺激孵育小鼠主动脉内皮细胞。进行PCNA和KI67免疫荧光染色,结果显示:与IR-AdExos组相比,IR-AdExosshh-组中内皮细胞PCNA、KI67的表达量有所降低,IR-AdExosshh+组内皮细胞中PCNA、KI67的表达量显着增加。表明Shh是IR-AdExos促进内皮细胞增殖功能的重要分子。细胞划痕实验结果显示:与IR-AdExos组相比,IR-AdExosshh-组中细胞迁移率降低,IR-AdExosshh+组内皮细胞细胞迁移率显着增加。表明Shh是IR-AdExos促进内皮细胞迁移功能的重要分子。5.Shh基因干预的IR-AdExos影响小鼠主动脉内皮细胞的小管形成功能用 IR-AdExos、IR-AdExosshh-、IR-AdExosshh+、IR-AdExosvector 等不同培养条件来源的AdExos及VEGF、SHH重组蛋白刺激孵育小鼠主动脉内皮细胞。进行小管形成实验,结果显示:与IR-AdExos组相比,IR-AdExosshh-组中内皮细胞小管形成数量、分支长度降低,IR-AdExosshh+组内皮细胞小管形成数量、分支长度显着增加。表明Shh是IR-AdExos促进内皮细胞血管新生的重要分子。6.Hedgehog信号通路在AdExos促血管新生中的作用给予 Hedgehog 抑制剂环巴胺和 IR-AdExos、IR-AdExosshh-、IR-AdExosshh+、IR-AdExosvector等不同培养条件来源的AdExos以及VEGF重组蛋白刺激孵育小鼠主动脉内皮细胞和人脐静脉内皮细胞,检测内皮细胞小管形成功能,结果表明IR-AdExos+环巴胺组的小管形成数量、分支长度显着降低,证明Hedgehog是AdExos促血管新生的关键分子。7.AdExos促血管新生信号通路分子的表达情况给予Hedgehog抑制剂环巴胺、Gli抑制剂Gant61及IR-AdExosshh+刺激孵育小鼠主动脉内皮细胞和人脐静脉内皮细胞。Western blot结果显示:IR-AdExosshh+刺激条件下,小鼠主动脉内皮细胞中Gli表达量显着升高;给予环巴胺和Gant61（Gli抑制剂）后,Gli表达量显着降低,证明AdExos通过Patched/Gli信号通路促进血管新生。研究结论1.IR-AdExos能够增强小鼠主动脉内皮细胞增殖、迁移和小管形成功能,促进血管新生;2.Shh是IR-AdExos促进内皮细胞功能改变的关键分子;3.IR-AdExos通过Patched/Gli信号通路促进血管新生。

史张^[3]（2021）在《基于高分辨率磁共振对动脉粥样硬化不稳定斑块诊疗的临床及实验研究》文中指出第一部分基于高分辨率磁共振管壁成像对颅内动脉粥样硬化所致卒中复发及预后评估的临床研究第一章:颅内动脉粥样硬化斑块特征预测复发性脑卒中的前瞻性研究目的:颅内动脉粥样硬化引起的缺血性脑卒中复发率较高。然而,目前很少有研究利用高分辨率磁共振管壁成像（high-resolution vessel wall magnetic resonance imaging,hr-VW-MRI）技术预测复发性脑卒中。本研究旨在评估hr-VW-MRI在预测颅内动脉粥样硬化所致复发性脑血管缺血事件风险的价值。材料与方法:本研究前瞻性纳入首次发生急性/亚急性缺血性脑卒中的患者共58例（平均年龄57.7±11.5岁;男性45例）。所有患者分别在初次入院前及临床规范治疗大于三个月后行hr-VW-MRI检查,并对每个患者进行临床随访直到急性缺血性脑血管事件或短暂性缺血发作（transient ischemic attack,TIA）再次发生,随访时间不超过48个月。通过hr-VW-MRI评估并记录责任动脉最狭窄层面的狭窄率、斑块负荷（plaque burden,PB）、最小管腔面积（minimum luminal area,MLA）、斑块强化率及各种指标前后变化的百分比。PB的定义为（1-MLA/最狭窄层面的管壁面积）×100%。统计分析采用单因素及多因素Cox回归预测复发性脑卒中,并计算风险比（hazard ratio,HR）和95%置信区间（95%confidence interval,95%CI）。结果:基线和随访两次hr-VW-MRI扫描的平均时间间隔为6.2±4.1个月,其中12例患者（占总人数的20.7%）在10.9±9.2个月内发生了同侧责任血管的复发性TIA或缺血性脑卒中。单因素分析表明基线的甘油三酯、PB变化百分比和PB进展与卒中复发显着相关（所有P<0.05）。多因素Cox回归发现PB进展（HR,6.293;95%CI,1.620-24.444;P=0.001）是复发性缺血事件预测的独立影像学特征。结论:PB进展与复发性缺血性脑血管事件独立相关,hr-VW-MRI有助于复发性脑卒中患者的预测和风险分层。第二章:强化药物治疗后对复发性脑卒中预测及神经功能预后评估的前瞻性研究目的:前期研究认为高分辨率磁共振成像技术有助于预测（intracranial atherosclerotic disease,ICAD）引起的复发性脑卒中,但采用二维非全脑成像技术和缺乏规范临床随访及预后评估是其主要缺陷。本章研究旨在基于三维hr-VW-MRI通过短期随访和长期随访两个时间维度,探讨经强化药物治疗后患者临床和影像特征的变化规律,并评估复发性缺血性脑血管事件和神经功能残障的独立危险因素。材料与方法:本研究前瞻性分析因急性缺血性脑卒中入院治疗的患者,所有患者均在入院前行三维头颈联合hr-VW-MRI检查,并要求患者在强化药物治疗3个月后进行临床指标（包括体育运动及与动脉粥样硬化相关的临床症状和血液指标）和hr-VW-MRI影像特征的复查评估。随后在2021年3月1日前以电话采访形式进行患者症状和残障评估。通过改良兰金量表（modified rankin scale,m RS）来确定预后不佳和神经功能残障。统计分析采用单因素及多因素Cox回归预测复发性脑卒中、单因素及多因素Logistic回归评估预后情况,并计算风险比（HR）、优势比（odds ratio,OR）和95%置信区间（95%CI）。结果:最终纳入研究的患者为80人（平均年龄:59.64±12.03）,两次MRI扫描的平均时间间隔为92.4±15.9天,长期随访的平均天数为583.4±130.8天。强化药物治疗后,斑块活性减弱（强化率减低,P<0.001;直方图均数值升高,P=0.012）。在复发性卒中的高危因素研究中,凸月形斑块与短期卒中复发显着相关（HR=7.137;95%CI,1.531-33.277;P=0.047）,而在长期随访中体育运动与否则是卒中复发的独立危险因素（HR=0.104;95%CI,0.018-0.591;P=0.010）。在神经功能预后评估中,短期治疗后的预后优劣与患者高危因素控制不佳（OR=4.544;95%CI,1.238-24.761;P=0.045）、总运动代谢当量（OR=0.678;95%CI,0.465-0.990;P=0.044）和熵（OR=0.073;95%CI,0.011-0.473;P=0.006）显着相关,而斑块位于第二象限（OR=9.617;95%,2.0159-44.911;P=0.004）、服药依从性（OR=0.135;95%,0.030-0.610;P=0.009）和高危因素控制不佳（OR=6.234;95%,1.723-22.553;P=0.005）则与其长期治疗后神经功能残障有关。结论:hr-VW-MRI可评估强化药物治疗后斑块变化情况,并有助于ICAD引起的缺血性脑卒中患者复发风险预测和功能残障评估。第二部分多功能纳米脂质体靶向巨噬细胞对动脉粥样硬化不稳定斑块的诊治一体化实验研究目的:不稳定动脉粥样硬化斑块破裂造成的心脑血管疾病是全球死亡的主要原因,而M1型巨噬细胞向M2型的极化可能会使斑块的不稳定性转为稳定。我们设想构建一种共载125碘-氧化铁纳米粒(125I-ION)和姜黄素（Cur）的纳米粒脂质体(9-CCN(125I-ION/Cur)-LNPs),通过单光子发射断层扫描（SPECT）和磁共振成像（MRI）联合的多模态成像手段,将姜黄素靶向输送至动脉粥样硬化斑块,达到诊治一体化目的。材料与方法:首先,制备9-CCN(125I-ION/Cur)-LNPs,并检测铁和姜黄素的包封率、载药率以及该纳米脂质体的物理稳定性、放射化学稳定性和弛豫时间。其次,对该纳米脂质体进行体外评估,检测分析9-CCN(125I-ION/Cur)-LNPs在巨噬细胞中的摄取情况,并分离兔主动脉粥样硬化斑块中的巨噬细胞。进而,建立新西兰大白兔的动脉粥硬化动物模型,在注射前及每10天注射靶向纳米粒脂质体后,分别在注射后6h及36h进行体内SPECT和MRI扫描,评估斑块情况。最后,离体兔主动脉,进行病理切片、染色,分析斑块的病理学特征。结果:透射电镜显示9-CCN(125I-ION/Cur)-LNPs粒度均一、超顺磁性好、放射化学纯度为97.2%,且在体内循环中较为稳定。体外摄取研究发现,姜黄素和核素放射性均在RAW264.7细胞中摄取较高,而MRI图中ION的摄取在两种细胞中几乎相同,并且体外实验表明9-CCN(125I-ION/Cur)-LNPs和姜黄素可促进巨噬细胞极化为M2表型。此外,体内实验表明,9-CCN(125I-ION/Cur)-LNPs可以特异性地与动脉粥样硬化斑块中的促炎M1型巨噬细胞结合,并将125I-ION和姜黄素传递到巨噬细胞中。由于M1向M2极化,不稳定的动脉粥样硬化斑块变得稳定,导致纳米粒脂质体的吸收显着减少,SPECT/CT核素摄取显着下降。结论:9-CCN(125I-ION/Cur)-LNPs实现了同时检测和改善动脉粥样硬化斑块易损性,核医学和磁共振联合成像的方式可精准检测斑块并评估疗效,实现动脉粥样硬化疾病的诊治一体化。

耿嘉男^[4]（2020）在《基于人参皂苷Rg3与瑞舒伐他汀不同内皮保护机制的二者联用抗动脉粥样硬化作用研究》文中进行了进一步梳理动脉粥样硬化（atherosclerosis,AS）是导致不稳定冠状动脉综合征和心源性猝死的重要原因之一,流行病学统计结果显示,自2015年以来亚洲众多国家中因脂代谢异常引发AS导致的心血管疾病发病率急剧上升,已成为除传染性疾病外有较高死亡率的疾病。内皮细胞是血管内膜的主要组成细胞,是保护血管的第一道重要屏障,内膜异常是AS典型病理改变,表现为内皮细胞愈合能力降低、抗炎症细胞浸润能力下降以及细胞凋亡等,进而累及血管进一步损伤。人参皂苷Rg3（ginsenoside Rg3,Rg3）是人参的主要活性成分之一,其抗肿瘤和免疫调节等药理作用已经被熟知。随着研究的不断深入,Rg3对心血管系统的保护作用亦被证实,但有关Rg3抗AS作用及相关机制尚未明确。瑞舒伐他汀属他汀类药物,为HMG-Co A还原酶抑制剂,因具有比其他同类药物调节血脂作用更强、半衰期更短以及生物利用度更高等优点而备受青睐,但其抗AS机制及是否与内皮保护作用有关尚需深入研究。本论文基于吉林省科技厅自然科学基金项目:“瑞舒伐他汀对ox-LDL导致内皮细胞内质网应激的干预作用及分子机制研究”（编号:20150101200JC）,探讨瑞舒伐他汀在脂代谢异常引发AS中除降脂外的内皮保护作用及机制,同时对比研究Rg3的内皮保护和抗AS作用及机制。并通过体内实验比较瑞舒伐他汀、Rg3或二者联用对ApoE-/-小鼠AS的保护作用,以期为临床不能耐受全剂量他汀类药物或高肝酶活性患者,联合应用瑞舒伐他汀和Rg3治疗,确保更有效的冠状动脉护理提供理论依据。主要研究如下:1.Rg3对ox-LDL诱导内皮细胞功能异常的作用及机制研究为确定Rg3是否对ox-LDL导致内皮细胞异常有改善作用,建立ox-LDL（200μg/mL）诱导的内皮细胞（HUVECs）损伤模型,Rg3（15、30μmol/L）对HUVECs进行预处理,应用划痕实验、单核细胞黏附实验和Western blotting等方法,研究Rg3对ox-LDL诱导HUVECs功能异常的影响。实验结果显示,Rg3可显着对抗ox-LDL导致的HUVECs愈合能力及抗单核细胞黏附功能下降,减少FAK的磷酸化,抑制黏附分子ICAM-1和VCAM-1的表达,抑制基质金属蛋白酶MMP-2和MMP-9的表达,表明Rg3可抑制ox-LDL诱导HUVECs功能异常,且与抑制FAK介导的黏附因子表达有关。为阐明Rg3对ox-LDL诱导HUVECs功能异常的作用机制,采用了迁移实验、单核细胞黏附实验、Western blotting、免疫荧光和qPCR等方法和技术,对相关指标进行了检测。实验结果显示,Rg3可显着增强ox-LDL抑制HUVECs的PPARγ表达,抑制损伤的内皮细胞内NF-κB活化后核易位,降低炎症因子MCP-1和IL-6 mRNA水平;给予GW9662（PPARγ特异性抑制剂）对HUVECs进行预处理,可显着抑制Rg3增强HUVECs迁移及抗单核细胞黏附能力的作用,并抑制Rg3下调FAK的磷酸化、黏附因子和基质金属蛋白酶表达、NF-κB活化后核易位以及炎症因子的作用,表明Rg3可能通过上调内皮细胞PPARγ表达发挥抑制ox-LDL诱导HUVECs异常的作用。2.瑞舒伐他汀对ox-LDL诱导内皮细胞凋亡的保护作用及机制研究建立ox-LDL诱导的内皮细胞损伤模型,瑞舒伐他汀（0.01、0.1及1μmol/L）对HUVECs进行预处理,应用试剂盒、MTT、流式细胞术、DAPI染色和Western blotting等技术和方法,探究瑞舒伐他汀的抗AS作用是否与内皮保护及抗内皮凋亡有关。实验结果显示,瑞舒伐他汀可显着增强ox-LDL刺激下HUVECs分泌NO水平降低,降低细胞氧化应激水平,增强HUVECs的PI3K/Akt/eNOS通路活化及Bcl-2/Bax的比率;MTT结果显示,瑞舒伐他汀可抑制ox-LDL诱导的HUVECs生存率下降;流式细胞术检测结果显示,瑞舒伐他汀可显着降低ox-LDL诱导的HUVECs凋亡率升高;DAPI染色结果显示,瑞舒伐他汀可显着抑制ox-LDL诱导的HUVECs细胞核损伤,以上均表明瑞舒伐他汀可以抑制ox-LDL诱导的HUVECs损伤及凋亡。此外,内皮细胞因其含有丰富的内质网,提示其可能对内质网应激异常导致细胞凋亡更为敏感,为阐明瑞舒伐他汀抑制ox-LDL诱导HUVECs凋亡的作用机制,对内质网应激相关通路进行检测,结果显示瑞舒伐他汀显着降低CHOP、sXBP1和Caspase-12mRNA水平,抑制GRP78表达,降低PERK、IRE1α及eIF2α的磷酸化,表明瑞舒伐他汀可能通过抑制内质网应激相关通路来抑制ox-LDL诱导的HUVECs凋亡。3.Rg3与瑞舒伐他汀联合应用对高脂饮食诱导ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化作用研究为比较Rg3与瑞舒伐他汀的抗AS作用,探究Rg3与瑞舒伐他汀联用是否可更有效抑制AS发生及发展,本研究采用高脂饲料（含40%脂肪,1.25%胆固醇）饲养ApoE-/-小鼠成功复制动脉粥样硬化模型后,随机分为4组:模型组、Rg3组（Rg3）、瑞舒伐他汀组（RSV）和Rg3与瑞舒伐他汀联用组（Rg3+RSV）,以C57BL/6J小鼠保持喂养普通饲料作为正常对照。给药4 w后,检测小鼠血清T-CHO、TG、LDL-C、HDL-C及CRP水平,HE染色和油红O染色观察小鼠主动脉AS斑块情况,MASSON染色检测小鼠主动脉胶原含量,免疫荧光染色检测小鼠主动脉内皮细胞凋亡情况,免疫组织化学染色检测主动脉和斑块巨噬细胞及平滑肌细胞含量,进而统计各组小鼠AS斑块核帽比及易损指数。本研究结果表明,与正常对照组比较,模型组小鼠T-CHO、TG、LDL-C以及CRP水平均显着升高,HDL-C水平显着降低;主动脉内膜及内膜下细胞排列紊乱,大量胞质呈空泡状,且主动脉内膜隆起纤维斑块层,动脉壁炎细胞浸润、泡沫化严重;主动脉内皮细胞凋亡显着增多,动脉壁胶原纤维含量显着减少;主动脉及斑块部位巨噬细胞表达显着增多,平滑肌细胞显着减少,小鼠AS斑块核帽比及易损指数显着升高。首先,与模型组比较,Rg3+RSV组及RSV组均显着降低小鼠血清LDL-C水平,显着抑制小鼠主动脉内皮细胞凋亡,且两组水平无显着差异,同时Rg3+RSV组显着降低小鼠血清T-CHO水平,但较正常仍呈较高水平,RSV组小鼠血清TG水平显着下降,提示瑞舒伐他汀可能发挥主要降低小鼠血清脂蛋白及抗内皮细胞凋亡作用;其次,Rg3+RSV组和Rg3组均显着降低AS小鼠血清中CRP水平,两组无显着差异,提示Rg3可能发挥主要降低小鼠炎症水平作用;另外,Rg3+RSV组和RSV组小鼠主动脉的胶原纤维含量较模型均显着增加,Rg3+RSV组和Rg3组巨噬细胞表达较模型组减少更为显着,而Rg3+RSV组α-SMA阳性表达增多显着,使得Rg3+RSV组AS斑块核帽比及易损指数降低更为显着。综上所述,Rg3可增强血管内皮细胞愈合能力及抵御炎症细胞黏附的能力,降低炎症因子和促AS细胞因子水平,可能与调节PPARγ/FAK信号通路有关,且Rg3可降低AS小鼠炎症水平,降低主动脉内膜及AS斑块巨噬细胞浸润,表明其可能通过抑制炎症对内皮损伤发挥抗AS作用;瑞舒伐他汀除改善AS小鼠血脂水平外,具有抑制AS小鼠血管内皮细胞凋亡作用,可能与增强血管内皮细胞PI3K/Akt/eNOS通路活化以及抑制内质网应激相关通路有关;另外,Rg3显示出显着抑制ApoE-/-小鼠的AS发生发展的作用,且Rg3与瑞舒伐他汀联用抗AS效果更为显着,提示当临床应用他汀类药物治疗AS效果不理想或对他汀类药物不耐受时,联合应用Rg3可能更有效发挥治疗AS作用。

刘斌^[5]（2020）在《炎症微环境的免疫调控与血管重构分子机制的研究》文中指出1研究背景急性冠脉综合征（acute coronary syndrome,ACS）是由于冠状动脉粥样硬化斑块糜烂或破裂,从而引起斑块表面血栓形成和/或远端血栓栓塞,造成完全或者不完全的心肌缺血为特征的一组临床疾病。2016年流行病学的报告显示:我国有2.9亿心血管疾病患者,2015年心血管病死亡是城乡居民总死亡首位原因,城市为42.61%,农村为45.01%,其中ACS占比近50%,并且ACS的发病年龄逐步有年轻化的趋势。根据心肌梗死全球通用定义（第三版）,ACS分为ST抬高型心肌梗死（ST segment elevation myocardial infarction STE-ACS）和非ST段抬高型 ACS（non-ST segment elevation ACS,NSTE-ACS）。冠状动脉内血栓形成和/或血栓栓塞是ACS最主要的致病因素,易损斑块的破裂是ACS发作的基础。因此,深入研究易损斑块的分子细胞生物学机制,探讨预测动脉粥样硬化斑块易损性的新生物标志物,对降低急性冠脉综合征的发生,最大程度地减少严重心血管事件的发生具有重要的临床意义。巨噬细胞、单核细胞及其炎症反应在斑块进展中发挥了重要的作用。巨噬细胞和单核细胞能吞噬胆固醇微粒,在泡沫细胞的形成、死亡以及坏死核心的形成中起到了重要的作用,并参与炎症反应和斑块破裂,从而加快了斑块破裂的进展。近期的研究表明,巨噬细胞和单核细胞在斑块中聚集的机制可能是局部细胞增生（而非浸润）。此外,中性粒细胞来源的cathelicidins可诱导循环单核细胞的粘附,从而表明中性粒细胞可能先于单核细胞参与血管炎症反应。与白细胞活化相关的炎症介质分子也可能与动脉粥样硬化性疾病的进展有关。白介素6（interleukin-6,IL-6）能促使血管损伤部位中活化的白细胞和平滑肌细胞分泌C反应蛋白。研究表明,IL-6受体的Asp358Ala等位基因变异是冠心病的危险因素,提示IL-6信号通路在动脉粥样硬化的进程中发挥了重要的作用。白介素等相关炎症因子信号通路与动脉粥样硬化的发生和进展密切相关,但是,目前确切的分子机制仍然不明确。白介素增强子结合因子3（ILF3）是一种双链RNA结合蛋白,参与了 DNA代谢、转录调控,翻译,RNA稳定以及microRNA的加工和定位。最近的研究表明其在ACS中可能的生理作用,包括早期心肌损伤、血栓形成、中风、发炎和血脂异常。但是人们对其在动脉粥样硬化斑块易损性中的作用知之甚少,同时血清中的ILF3作为普通人群预测ACS危险的生物标志物的临床价值和潜在的病理机制仍不清楚。在本研究中,我们在人的血清样品以及冠脉狭窄患者斑块组织中探讨了ILF3对动脉粥样硬化斑块易损性的作用,同时通过血清ILF3预测急性冠脉综合征,为临床早期检测和诊断ACS提供了新的靶点。2目的（1）明确人血清ILF3含量的变化是否与ACS的发生相关（2）明确ILF3在血管及心肌组织的表达变化,探讨血清ILF3含量的变化是否与血管损伤或心肌损伤的发生相关,探讨其可能的分泌部位（3）探讨ILF3能否作为新的AS斑块破裂的预测标志物3方法3.1研究人群该研究包括回顾性研究和前瞻性验证队列。从山东省的四家医院的急诊科选择了因胸痛就诊的526名ACS患者（包括221例AMI和305例UA）。此外,本研究还纳入了 210名健康对照者。其中,在300例ACS患者（包括150例AMI患者和150例UA患者）和85名健康对照者（发现队列）确定了准确的蛋白质定量分析临界值,对226名潜在入选受试者（包括71例AMI患者、155例UA患者）和125例健康对照者的临床表现进行了评估,其中病例组和对照组的年龄,性别和体重指数（body mass index,BMI）分布相似。该研究方案已经通过当地伦理委员会批准,批准号为（KYLL-2018（KS）-233）;所有纳入的参与者均提供了书面知情同意书。所有患者均接受了初步临床评估,包括临床病史,体格检查,12导联心电图,连续心电图监测,脉搏血氧饱和度,标准血液检查和胸部X光检查。只要有临床指征,在就诊时以及1至3小时后都检测hs-cTnI。患者的入选时机和治疗由主治医师决定下进行的。所有最终诊断均基于详实的医疗记录,包括患者病史,体格检查,实验室和放射学检查结果,ECG,超声心动图,心脏运动实验和冠状动脉造影。在监护人的许可下,通过医院急诊科分诊处使用的电子病历系统获得了患者信息和临床检查结果。所有的心肌梗死患者均按最新的指南进行诊断。通过hs-cTnI的上升和/或下降模式诊断出坏死,其中至少一个值高于第99个百分位数,hs-cTnI分析的不精确度为10%。对于hs-cTnI的分析,最低检测下限是0.01g/L。因此,为了表现肌钙蛋白升高的趋势,初始值正常的患者肌钙蛋白水平必须升高到0.04 g/L的才能满足AMI的诊断标准。肌钙蛋白T水平正常且典型的静息性心绞痛,或者先前稳定的心绞痛发作突然加重,或心脏运动试验阳性或心脏导管检查显示冠状动脉狭窄70%的情况下,诊断为UA。既往有过心脏方面的病史,但不包括冠状动脉症状（例如,心包心肌炎,快速性心律失常）和非心脏症状。如果急诊科排除了急性心肌梗死,但没有足够的临床证据来进一步明确诊断,则将此类归类为来源不明的胸痛患者。通过对纳入者问卷调查的方式收集有关健康的信息。对与吸烟有关的问题分类为当前,以前或从不吸烟。肌酐通过Jaffe法测定,每日变异系数为3.5%。在山东大学齐鲁医院的检验科,对所有纳入者进行了非禁食血清的检测,得到了总胆固醇,高密度脂蛋白胆固醇和甘油三酯的数值。健康队列中的临床检查由训练有素的护士进行,包括血压,体重,身高以及腰围和臀围的标准化测量。健康的参与者（志愿献血者）均来自山东大学齐鲁医院济南院区。3.2血清ILF3和hs-cTnI的测定ELISA法测定人外周静脉血血清中ILF3和hs-cTnI的水平。3.3临床样本收集我们从山东省红十字捐赠的遗体标本中筛选患有动脉粥样硬化疾病和健康对照者的冠状动脉组织标本（每组三个以上样本）进行了评估。从在山东大学齐鲁医院因严重颈动脉狭窄行内膜切除术的患者中获得颈动脉斑块,总计15例患者（男9例,女6例）。在收集样本之前,每位患者均签署书面知情同意书,并获得了山东大学齐鲁医院伦理委员会的伦理学批准。利用颈动脉超声确定颈动脉粥样硬化损伤程度,颈动脉内膜切除术获得动脉粥样硬化病变的人颈动脉节段,固定在中性福尔马林溶液中,通过石蜡包埋后进行免疫组织化学分析。3.4免疫组织化学和免疫荧光染色分别用苏木精&伊红和Masson三色染色对8微米厚组织切片进行了染色,观察了动脉粥样斑块的形态和胶原蛋白含量。同时还进行了 3,3-二氨基联苯胺染色,(将石蜡包埋的组织切片脱蜡并用抗体染色,然后用生物素偶联的二抗（1:1000）染色,然后用辣根过氧化物酶偶联的链霉亲和素染色（Dianova,Rodeo,CA）。使用抗Mac-3（鼠类巨噬细胞标记物）鉴定巨噬细胞。为行免疫荧光染色,将切片脱蜡并用特异性抗体染色,然后用荧光标记的第二抗体染色。细胞核用4’,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）进行复染。通过激光扫描共聚焦显微镜（LSM710,卡尔·蔡司,德国）获得特定的荧光成像。3.5统计分析在发现队列中,我们比较了至少一根主要的冠状动脉存在70%狭窄的患者和冠状动脉没有达到70%狭窄患者的基线特征。使用Fisher精确检验比较了 AMI,UA和健康对照组之间的二分变量（性别,糖尿病史等）。使用Wilcoxon秩和检验比较连续变量（BMI,生物标志物等）。确定了 ILF3和hs-cTnI的预测概率的受试者工作特征（ROC）曲线,并使用逻辑回归模型评估疾病风险。为了评估ILF3和hs-cTnI的诊断价值,使用发现队列ROC曲线以至少85%的敏感性选择了临界点。使用验证队列确定相应的敏感性,特异性和准确性。为了消除数据的多重共线性,我们对生物标志物的值进行了对数转换,并删除了具有较大方差膨胀因子的变量。所有实验至少独立进行三次,所有的分析均使用带有pROC 23和ggplot2软件包的R版本3.5.0软件24（R统计学计算基金会,维也纳,奥地利）。所有测试均为双面测试,显着性差异性设置为0.05。4结果4.1研究流程入选的526名ACS病人和210名健康对照人群分为回顾性研究队列和前瞻性研究队列。回顾性研究队列包括150名UA病人,150名AMI病人,和85名健康对照人群。我们将通过回顾性研究队列构建ILF3变化对ACS的诊断系,筛选出最佳诊断阈值后,在前瞻性研究队列人群验证。前瞻性研究队列包括155名UA病人,75名AMI病人和125名健康对照人群。所有的入选招募的患者来自四个不同急诊科,并采集了血液样本。测量了生物标志物,并将其与最终诊断和随后的住院过程相关联。具体流程见相关流程见（图1）4.2 ILF3的水平的变化研究发现,与健康对照人群相比,ACS患者血清中的ILF3清浓度明显高于健康对照组,增加了 23倍以上,存在显着的差异。其中急性冠脉综合征患者中有155位不稳定型心绞痛（UA）和71位急性心肌梗塞（AMI）患者,尽管UA患者的ILF3水平略高于AMI患者,但差异无统计学意义。在四个诊断中心中,患者的ILF3水平在诊断组中的相对差异基本一致。没有不确定的结果,也没有限制异常值。4.3 ILF3预测ACS发生的准确性通过ROC曲线下面积（AUC）来量化血清ILF3的预测准确性,对于所有ACS患者、UA患者和AMI患者,ILF3的预测的准确性都很高。ILF3联合hs-cTnI（ILF3+hs-cTnI）预测ACS的准确度为0.99,明显高于单纯hs-cTnI的准确度（P<0.001）。ILF3+hs-cTnI联合诊断的曲线下面积（AUC）分析显示ILF3+hs-cTnI联合诊断的UA的准确性要显着高于单独应用hs-cTnI预测UA风险的AUC。ILF3、hs-cTnI和ILF3+hs-cTnI预测AMI的准确性相似。根据ROC曲线确定最佳临床决策限值。ACS的ILF3和hs-cTnI 阳性诊断值。然后将这些诊断值应用于对验证队列患者中ACS、UA和AMI的预测,在所有ACS病例中显示出高的敏感性（>84%）和100%的特异性;除敏感性外,ILF3对ACS的预测性能指标均不低于hs-cTnI。更重要的是,ILF3对ACS的阴性预测值也高于hs-cTnI。4.4 ACS患者血清ILF3水平的升高与心肌损伤无显着相关性。与血清hs-cTnI相比,ACS患者血清ILF3水平的变化没有随着胸痛发作时间的延长而进行性升高,说明ACS患者血清ILF3的升高与心肌细胞坏死的严重程度无关,表明ILF3不是心肌细胞坏死特异性的生物标志物。4.5 ACS患者血清ILF3含量与冠状动脉粥样硬化的严重程度无显着相关性我们评估了 ACS患者的血清ILF3水平升高是否与血管造影冠状动脉病变程度的相关性。在发现队列中,通过对300例ACS患者血管造影资料分析其血管狭窄的程度,及单支病变、双支病变和多支病变的程度发现:血清ILF3水平也与冠状动脉病变狭窄程度（通过Genisi评分）和病变血管支数无显着的相关性。这些数据表明,ACS患者血清ILF3水平的升高不能反映冠状动脉粥样硬化的严重程度,而可能反映冠状动脉粥样硬化斑块的炎症水平。4.6 ILF3含量与炎症因子显着相关为了确定血清ILF3和hs-cTnI升高的临床意义,我们采用logistic多元回归分析方法来评估其与动脉粥样硬化血管的危险因素如:年龄、性别、吸烟、血清总胆固醇和一些炎症细胞因子的相关性。结果显示:ACS患者血清hs-cTnT的升高与与冠心病和IL6密切相关,而ILF3的升高与性别、糖尿病、他汀类药物治疗、IL1β、IL6和TNFα密切相关。这些结果提示ACS患者血清hs-cTnT升高是心肌损伤的标志,而ILF3的升高更可能与AS斑块内的炎症程度相关。4.7 ILF3特异性在动脉粥样硬化斑块的M1巨噬细胞表达升高。人冠状动脉的免疫荧光和免疫组织化学染色显示,与非动脉粥样硬化的血管组织相比,ILF3在人动脉粥样硬化斑块中表达明显升高,并且在坏死核心区域大量表达。此外,我们在人颈动脉斑块中在巨噬细胞中观察到ILF3和iNOS（Ml巨噬细胞生物标志物）的共定位,表明ILF3是在斑块的炎性M1巨噬细胞中表达。5结论ILF3可能作为一种新的预测动脉粥样硬化斑块易破裂的生物标志物,对急性冠脉综合征的患者提供早期的诊断作用。1研究背景冠状动脉内的易损斑块,是指不稳定的、易形成血栓的,而突然导致急性心脏事件发生的斑块。易损斑块导致血栓形成是急性冠脉综合征（acute coronary syndrome,ACS）的重要发病机制。它可以表现为斑块破裂继发血栓形成,或是斑块侵蚀或钙化结节等病变诱发血栓形成等。斑块破裂在病理上为脂质斑块的纤维帽缺损并延伸到脂质核心,常有血小板及纤维蛋白构成的非闭塞性血栓。破裂的脂质斑块常伴有薄纤维帽及较大的脂质核心,纤维帽中有大量的巨噬细胞浸润,而脂质核心中富含胆固醇结晶。目前的研究表明,巨噬细胞是ACS发病的中心环节。巨噬细胞对纤维帽基质降解是斑块易损性的重要因素,测定纤维帽中巨噬细胞的含量,可以评估动脉粥样硬化斑块是否稳定。白介素增强子结合因子3（ILF3）是一种双链RNA结合蛋白,目前研究表明可调节细胞代谢的过程,包括转录调控以及mRNA加工和定位。最近的研究发现其在ACS中可能的生理作用,包括早期心肌损伤、血栓形成、中风、炎症和血脂异常。然而,人们对其在动脉粥样硬化斑块易损性中的作用知之甚少。在前期研究中,我们发现ACS患者的血清ILF3水平明显升高,在动脉粥样硬化斑块中ILF3表达明显升高,并且定位于巨噬细胞中,我们通过巨噬细胞特异性过表达ILF3小鼠和小鼠原代巨噬细胞来阐明ILF3对动脉粥样硬化斑块易损性的潜在影响,进一步探讨动脉粥样斑块易损性的机制。2目的（1）建立巨噬细胞特异性过表达ILF3的ApoE-/-小鼠AS模型,观察ILF3对AS斑块的形成及易损性的作用;（2）阐明过表达ILF3的巨噬细胞在动脉粥样硬化发生及发展中的作用及相关机制。3方法3.1巨噬细胞特异性过表达ILF3小鼠的构建所有动物实验均根据山东大学实验动物使用和管理机构委员会批准的方案进行。载脂蛋白E（ApoE-/-）敲除的小鼠来自北京大学健康科学中心实验动物科学系。LyzMCre转基因小鼠由山东大学张文程教授惠赠。ILF3条件性过表达小鼠（ILF3 Tg）及ILF3条件性敲除小鼠（ILF3KO）由北京唯尚立德公司构建合成。ILF3条件性小鼠与ApoE-/-小鼠交配,经鼠尾基因鉴定得到ApoE-/-ILF3Tg与ApoE-/-ILF3Tg小鼠,ApoE-/-ILF3Tg与ApoE-/-ILF3Tg小鼠继续与 LyzMCre小鼠交配,经鼠尾基因鉴定得到巨噬细胞特异性过表达ILF3小鼠（ApoE-/-ILF3M-Tg）与巨噬细胞特异性敲除ILF3小鼠（ApoE-/-ILF3M-KO）。野生型小鼠为对照小鼠,所有小鼠背景均为C57/B6背景。3.2动脉粥样硬化不稳定斑块模型的诱导与治疗8周龄的雄性ApoE-/-小鼠和ApoE-/-ILF3M-Tg小鼠高脂喂养（WD,Teklad调整卡路里 88137:21%（wt/wt）脂肪;0.15%（wt/wt）胆固醇;19.5%（wt/wt）酪蛋白;无胆酸钠）4周;在右颈动脉周围植入套管,继续高脂喂养12周。在处死前一周向小鼠腹膜内（i.p.）注射脂多糖（LPS;Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,美国）或对照盐水（每只小鼠每天5ugLPS,每组N=15）。3.3巨噬细胞分离和油红O染色腹膜内注射100%石蜡油7天后,从WT和ILF3M-Tg小鼠的腹腔灌洗中收获腹膜巨噬细胞。将细胞在磷酸盐缓冲液（PBS）中洗涤,在Dulbecco改良的Eagle培养基（含10%胎牛血清）中培养过夜,并用氧化低密度脂蛋白（oxLDL;50 g/ml;北京联合生物有限公司）刺激24小时,以评估巨噬细胞上ILF3的表达是否受脂蛋白调节。4%多聚甲醛固定细胞,PBS洗涤,并在37℃下用Oil-red-O染色20分钟。各组间油红O含量通过Image-Pro plus软件进行定量。3.4免疫组织化学和免疫荧光染色分别用苏木精&伊红和Masson三色染色对8微米厚组织切片进行了染色,观察了动脉粥样斑块的形态和胶原蛋白含量。同时还进行了 3,3-二氨基联苯胺染色,将石蜡包埋的组织切片脱蜡并用抗体染色,然后用生物素偶联的二抗（1:1000）染色,然后用辣根过氧化物酶偶联的链霉亲和素染色（Dianova,Rodeo,CA）。使用抗Mac-3（鼠类巨噬细胞标记物）鉴定巨噬细胞。为行免疫荧光染色,将切片去石蜡并用特异性抗体染色,然后用荧光标记的第二抗体染色。用4’,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）对细胞核进行复染。通过激光扫描共聚焦显微镜（LSM710,卡尔·蔡司,德国）获得特定的荧光成像。3.5免疫印迹分析首先用10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质,然后将其转移到硝酸纤维素膜上。用含0.1%Tween-20的5%脱脂牛奶封闭1小时,脱脂牛奶用PBS配置,然后一抗孵育1小时,再在室温下与辣根过氧化物酶偶联的二抗孵育1小时。通过化学发光（Milipore,Billerica,MA,美国）检测结合的第一抗体,并通过Image J软件（NIH,Bethesda,MD,美国）定量。所有表达水平标准化于对照。3.6实时定量PCR使用Trizol试剂（Invitrogen）提取总RNA,然后反转录为cDNA。使用序列检测器系统（IQ5实时PCR循环仪,Bio-Rad实验室,加利福尼亚州,美国）进行基于SYBR Green的实时定量PCR。表达水平标准化于β-actin。3.7流式细胞术有研究表明oxLDL触发巨噬细胞的M1极化,从而诱导和促进动脉粥样硬化中的炎症反应。因此用50μg/ml oxLDL处理腹膜巨噬细胞,并通过流式细胞术评估M1和M2亚型的标志物。将腹膜巨噬细胞（2×105/孔）铺板,加入ox-LDL孵育24小时。为了分析ILF3过表达后激活的CD86和CD209阳性细胞,将小鼠单克隆的抗CD86抗体和抗CD209抗体（1:1000）（Abcam,剑桥,英国）在4℃避光情况下孵育30分钟。用PBS洗涤3次后,在4℃用二抗抗小鼠PerCP-Cy5-5-A和APC-A（Abcam,剑桥,英国）孵育30分钟。洗涤并收集标记的细胞,并使用FACS流式细胞仪系统进行分析。3.8精氨酸酶1启动子荧光报告表达载体的构建通过ensemble网站进行查询Arg-1启动子序列,选取-560 bp至-210 bp这一部分启动子序列进行分析,采用逐段删除法将Arg-1启动子片段合成后构建入报告基因载体 PGL3-basic 中,顺序分别为:-260 bp,-310 bp,-360 bp,-410 bp,-460 bp,-510 bp,-560 bp。3.9双荧光报告基因检测技术首先制备细胞裂解液,在冰上加入裂解液进行裂解细胞,然后离心,转移细胞裂解产物于新的离心管备用。然后按照荧光素酶试剂盒说明书进行处理细胞裂解液,并及时用光度计进行检测。结果分析:计算firely luciferase活性值与内参β-gal活性值的比值,利用T检验进行数据分析,P<0.05为具有统计学意义。3.10 染色质免疫共沉淀技术（Chromatin immunoprecipitation,ChIP）（1）细胞准备根据试剂盒要求准备一定量的细胞用于CHIP实验（2）CHIP实验,按照MilliporeCHIP试剂盒的说明书逐步完成实验。3.11 ILF3干扰慢病毒载体的构建由 博尚 生物公 司 负责合 成构 建,干扰 序列 为GCCAATGGACTGAAGTCATGT,loop 采用 TTCAAGAGA。3.12统计分析所有数据均使用SPSS19.0软件包进行统计分析,所有的实验至少重复3次。计量资料用均数±标准差表示,计数资料用数值和百分比表示。两组之间比较采用采用独立样本的t检验。P<0.05被认为差异具有统计学意义。4结果4.1巨噬细胞特异性过表达ILF3小鼠建立如图所示,将公司合成的ILF3全身loxp小鼠与巨噬细胞cre（Lyz2-cre）小鼠经过杂交而得到ILF3M-Tg小鼠,将该小鼠与ApoE-/-小鼠杂交而得到ApoE-/ILF3M-Tg 小鼠。4.2巨噬细胞特异性过表达ILF3小鼠鉴定经鉴定成功构建ApoE-/-ILF3M-Tg小鼠,基因鉴定结果。4.3 ILF3促进泡沫细胞形成在野生型腹膜巨噬细胞中,ILF3的蛋白水平随oxLDL的剂量和处理时间的升高而升高。油红O染色显示ApoE-/-ILF3M-Tg小鼠的巨噬细胞较ApoE-/-对照小鼠的巨噬细胞对oxLDL的摄取能力明显增强。与野生型小鼠相比,ApoE-/-ILF3 M--Tg小鼠的巨噬细胞脂质吞噬相关基因HMGCR,CD36及ABCA1的表达明显升高。4.4巨噬细胞特异性过表达ILF3加剧小鼠动脉粥样硬化的形成与喂养12周的ApoE-/-小鼠相比,ApoE-/-ILF3 M-Tg小鼠在主动脉窦和主动脉部位的动脉粥样硬化明显加重。4.5巨噬细胞特异性过表达ILF3加剧动脉粥样硬化斑块的易损性斑块的形态分析结果表明:ApoE-/-ILF3M-Tg小鼠的动脉粥样硬化斑块包含较大的坏死核心,胶原蛋白含量和平滑肌细胞数量明显降低,在ApoE-/-ILF3 M-Tg小鼠的斑块中有更多的巨噬细胞浸润。4.6巨噬细胞特异性过表达ILF3加剧动脉粥样硬化斑块中的血管生成与ApoE-/-小鼠泡沫细胞区域相比,ILF3过表达区域显示出VEGF的大量表达。然而,在ILF3高表达的区域内,每单位面积的微血管数量明显增加。4.7 ILF3上调增强了 oxLDL诱导的促炎性M1巨噬细胞极化流式结果表明,ILF3M-Tg巨噬细胞中CD86阳性细胞（M1）的百分比显着增加。oxLDL处理后未检测到CD209阳性细胞（M2）发生明显变化。4.8 ILF3过表达加剧动脉粥样硬化斑块中的炎症表达。免疫组化染色显示,与ApoE-/-小鼠相比,ILF3M-Tg动脉粥样硬化斑块的iNOS表达增加,但Argl表达下降,表明ILF3过表达的巨噬细胞,oxLDL促进其向促炎性M1巨噬细胞极化。4.9 ILF3过表达加剧巨噬细胞中炎症因子的表达。利用oxLDL刺激腹膜巨噬细胞24小时,随后对RNA进行实时定量PCR分析,结果表明,抗炎相关基因、促炎基因的转录均增加。与野生型对照相比,ILF3过表达的巨噬细胞中Argl和IL-10的mRNA水平显着降低（P<0.001或0.01）,而IL-6、TNF-α、iNOS和IL-1β表达显着增加。4.10 ILF3调控精氨酸酶1的转录表达结果显示,ILF3过表达成功,siILF3干扰效果明显,ILF3过表达或ILF3干扰时影响p65及statl活性的影响并影响ARG1的表达;ILF3过表达及ILF3干扰后对ARGI在mRNA水平的影响与蛋白水平一致;双荧光报告基因显示,ILF3调控ARG-1启动子-460～-410区域的活性;染色质免疫共沉淀（ChIP）结果显示,ILF-3可以直接与精氨酸酶1启动子结合。5结论（1）巨噬细胞特异性过表达ILF3促进了对oxLDL的摄取能力,并促进了泡沫细胞的形成与动脉粥样硬化。（2）巨噬细胞特异性过表达ILF3上调促炎细胞因子的表达,同时抑制抗炎细胞因子的表达,从而促进动脉粥样硬化的发生发展。（3）巨噬细胞中ILF3过表达的通过促进其自身滞留,而促进了动脉粥样硬化斑块的形成和斑块的易损性。（4）巨噬细胞中ILF3可以直接与精氨酸酶1的启动子区域结合,从而抑制ARG1的转录表达,而调控巨噬细胞Ml型的极化,促进AS斑块的易损性。1研究背景腹主动脉瘤（abdominal aortic aneurysm,AAA）作为一种慢性退行性血管疾病,其主要特征是血管壁进行性扩张和重塑,导致主动脉破裂引起致死,尤其是在老年人中[1-2]。然而,AAA的发病机制至今尚无定论。尽管AAA和动脉粥样硬化之间有一些共同的特征,但是治疗冠状动脉疾病的方法并不能降低人的AAA形成或扩张,目前的主要治疗手段仍然是外科手术干预[3]。最近的证据表明,慢性炎症在AAA发病过程中起到了关键作用,抑制炎症反应可能成为预防AAA的一种有效的治疗方法[4]。环氧合酶-2（cyclooxygenase-2,COX-2）是前列腺素（prostaglandin synthetase,PGs）合成的关键调节酶,可催化花生四烯酸向PGs的转化。COX-2调节促炎性趋化因子的表达,从而影响细胞的增殖和功能[5-7]。在大多数人体组织中通常无法检测到COX-2,但炎症刺激后可迅速诱导产生(例如脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）或血管紧张素 Ⅱ（Angiotensin Ⅱ,AngⅡ）[8-9]。在慢性炎性疾病（如动脉粥样硬化）中,COX-2表达明显升高[10]。基因敲除COX-2可显着减轻急性炎症,并降低前列腺素E2（prostaglandin E2,PGE2）水平[11]。目前的研究证明免疫系统参与了许多心血管疾病的发病过程[12]。CD4+CD25+调节性T细胞（regulatory T cells,Tregs）作为免疫系统的重要组成部分,在免疫稳态和耐受性中具有重要的保护作用,防止过度的免疫反应[13]。Tregs的功能受损或缺乏会导致免疫失调和自身免疫性疾病[13]。据报道,Tregs在许多心血管疾病中具有保护作用,包括动脉粥样硬化、高血压、心肌炎和扩张型心肌病等[14]。最近,Tregs被证明能够抑制Ang Ⅱ诱导的小鼠AAA的发生发展[15-16]。然而目前,关于AAA中Treg和COX-2之间的相关性报道甚少。因此,利用AAA模型,我们尝试探索AAA潜在的机制,并寻找其可能的免疫治疗方法。2目的（1）研究Tregs能否抑制AAA的发病;（2）在体内体外实验中,阐明Tregs对COX-2表达的影响,以期明确Tregs发挥保护作用的具体机制;3方法3.1动物模型与干预所有动物实验经山东大学伦理委员会批准,并符合中国卫生部《动物管理规定》的指导原则。从北京大学动物研究中心（中国北京）购买10只C57BL/6J野生型小鼠（雄性,8周龄）,用作Tregs细胞的供体。根据试剂说明书要求,使用CD4+CD25+调节性T细胞分离试剂盒（Miltenyi Biotec,德国）从C57BL/6J小鼠的脾细胞中获得Treg细胞。将纯化的Treg细胞悬浮在磷酸盐缓冲液（PBS,200ul）中以进一步注射。在无菌条件下饲养30只C57BL/6J背景的雄性ApoE-/-小鼠（3个月大）,并保持12小时光照/12小时黑暗的昼夜节律。在整个实验期间,ApoE-/-小鼠均给予高脂饮食（0.25%的胆固醇和15%的可可脂）,并保证足够的食物和水。实验小鼠随机分为三组（每组10只）:对照组（未干预）,PBS组（尾静脉注射PBS）和Tregs组（尾静脉注射106 Treg）。注射一天后,通过皮下置入微量泵连续泵入Ang Ⅱ（1000ng/kg/min）28天,在实验开始2周时再次给予尾注射PBS和Treg[15.17]。实验结束后,对所有小鼠进行安乐死并收集其主动脉组织,储存于-80℃冰箱或用4%多聚甲醛固定以备用。3.2组织学分析小鼠安乐死后,用生理盐水经心脏灌注以清除血管腔中的血液,留取主动脉,用4%多聚甲醛固定。首先,通过测量腹主动脉的最大外径来评估AAA的形成,AAA定义为比正常值扩张至少50%[2]。然后,将腹主动脉包埋在OCT化合物中制作冰冻切片,每张5μm厚,通过苏木精和伊红（H&E）染色及免疫组化染色以评估COX-2的表达（1:500,Abcam,MA,USA）。最后,利用计算机自动辅助图像分析系统（Image Pro Plus 6.0,Media Cybernetics,美国）计算COX-2的表达量。3.3免疫荧光首先将冰冻切片用BSA封闭30分钟,然后将AAA切片与兔抗COX-2（1:100,abcam,MA,USA）,小鼠抗CD68（1:100,abcam,MA,美国）或小鼠抗α-SM-actin（1:100,Sigma-Aldrich,MO,USA）在4℃孵育过夜。随后在室温条件下将切片与二抗孵育,最后使用含DAPI的抗淬灭封片剂（Vector Laboratories,CA,美国）封片。通过激光扫描共聚焦显微镜（LSM 710,Zeiss,德国）获得图像。3.4细胞共培养和处理在体外研究的第一部分中,在37℃下,用DMEM培养基（含有10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 g/ml链霉素）培养RAW264.7小鼠巨噬细胞（美国弗吉尼亚州马纳萨斯）。巨噬细胞分别与以下三组共培养:对照组,CD25-组（CD4+CD25-T 细胞,5×105）和 Tregs 组（CD4+CD25+T 细胞,5×105）,先用抗CD3抗体刺激细胞48小时（50ng/ml）,然后用AngⅡ（1μM）刺激24h。最后丢弃漂浮的T细胞,并收集巨噬细胞以进一步分析。在体外研究的第二部分中,培养的小鼠主动脉平滑肌细胞（SMC,ATCC,美国）,分别与以下三组共培养:对照组,CD25-组（CD4+CD25-T细胞,5×105）,和Tregs组（5×105）。首先用抗CD3抗体（50ng/ml）刺激48小时,然后再用AngⅡ（1μM）刺激24h。最后丢弃漂浮的T细胞,并收获SMC用于进一步分析。3.5 ELISA收集细胞培养基的上清液,并按照ELISA试剂盒（BlueGene Biotech,上海,中国）的说明书测定PGE2的浓度。3.6 MTT通过MTT测定法（Beyotime,北京,中国）确定SMC的活力。操作步骤如下,首先将SMC以5000个细胞/孔的密度接种到96孔板中,给予相应刺激后每孔加入10 μl MTT（5mg/ml）,并在37℃下孵育4小时。小心弃去上清液,再每孔加入75μl的二甲基亚砜（DMSO）。最后使用Varioskan Flash多功能酶标仪（Thermo Scientific,Waltham,MO,美国）在 570 nm 处分析样品。3.7实时定量PCR根据试剂的说明书,首先使用Trizol试剂（Invitrogen,Carlsbad,CA）从腹主动脉和收获的细胞中提取总RNA,然后使用iScript cDNA合成试剂盒（Bio-Rad,Hercules,美国）用1μgRNA作为模板,逆转录合成cDNA,最后进行实时荧光定量PCR以确定CD68,诱导型一氧化氮合酶（iNOS）,精氨酸酶-1（Arg-1）,趋化因子配体9（CCL-9）,COX-2和β-actin mRNA的表达。其中,β-actin用作内参。该研究中使用的引物序列见表1。3.8蛋白质印迹分析首先从腹部主动脉或细胞中提取总蛋白。将各组等量的蛋白质加样,在10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶上电泳,然后将目的蛋白电转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。在5%脱脂牛奶中室温下孵育2小时后,将膜与COX-2（1:500,Abcam,MA,USA）和β-actin（1:1000,CST,美国）的一抗在4℃下孵育过夜。随后,用TBST洗涤3次,将膜与辣根过氧化物酶偶联的二抗室温下孵育2小时。最后,使用增强的化学发光检测系统（美国皮尔斯）拍摄图像。其中,β-actin表达量作为内参。3.9统计分析使用SPSS15.0（SPSS Inc,美国伊利诺伊州芝加哥）软件进行统计分析。数值以平均值±标准差表示,并采用LSD事后分析的单向ANOVA检验进行多次比较。P<0.05被认为具有统计学意义。4结果4.1体内注射Tregs降低了 Ang Ⅱ诱导小鼠AAA的发病率利用AngⅡ持续微量泵入ApoE-/-小鼠以诱导AAA的实验动物模型[17-18],目前已被广泛应用。与既往的研究结果一致,我们的实验发现,在ApoE-/-小鼠中持续泵入AngⅡ可以成功诱导AAA。如图1所示,对照组和PBS组的AAA发生率分别为80%（8/10）和80%（8/10）,而体内注射Tregs（106个细胞）后AAA的发生率只有30%（3/10）,提示Tregs可以明显降低AAA的发生率（P<0.05,图1A和1C）。此外,H&E染色显示,持续泵入Ang Ⅱ显着增加了腹主动脉直径并引起内出血,而注射Treg改善了此现象（P<0.05,图1B和1D）。这些结果证实了以往的研究,即Tregs可以防止AAA的发生和发展。4.2体内注射Tregs降低了小鼠的COX-2表达现有的研究发现,与正常对照小鼠相比,AAA小鼠中COX-2mRNA的表达显着增加[19]。在体内实验中,为了阐明Treg对腹主动脉组织中COX-2表达的潜在影响,我们进行了免疫组织化学染色。与对照组和PBS组相比,Tregs组的COX-2表达明显减弱（P<0.05,图2A和2B）。此外,RT-PCR和蛋白印迹分析还显示,Tregs可显着降低腹主动脉组织中COX-2的mRNA和蛋白质表达（P<0.05,图2C至2E）。4.3 Tregs治疗可降低小鼠SMC和巨噬细胞中COX-2的表达为了观察COX-2在SMC或巨噬细胞中的表达,我们进行了免疫荧光染色。如图3A所示,SMC与COX-2表达共定位,而在AngⅡ+Treg组中,SMC中COX-2的表达明显减少（图3A）。同时,图3B显示在AngⅡ组和AngⅡ+PBS组的巨噬细胞中有COX-2表达,而Treg能够显着降低巨噬细胞中COX-2的表达（图3B）。4.4 Tregs刺激巨噬细胞和SMC后,减少了细胞中COX-2和PGE2的表达已有研究显示在炎性刺激（例如AngⅡ）诱导下COX-2表达明显升高[9]。在内皮细胞中,Ang Ⅱ刺激后,COX-2表达显着增加[20-21]。由巨噬细胞和SMC合成的前列腺素E2（PGE2）可以增加基质金属蛋白酶（MMP）的产生并导致血管壁的降解[22]。先前的研究表明巨噬细胞和SMCs可能是Tregs靶向治疗AAA的主要细胞[15]。因此,在我们的实验中,相继用Tregs和AngⅡ处理巨噬细胞和SMCs,结果发现与对照组相比,Tregs处理可显着降低巨噬细胞中COX-2和PGE2的表达,而CD4+CD25-T细胞对COX-2和PGE2的表达影响不大（P<0.05,图4A至4C）。此外,与对照组相比,Tregs治疗还显着降低了 SMCs中COX-2和PGE2的表达（P<0.05,图4D至4F）。以上结果表明,Tregs治疗可降低Ang Ⅱ诱导的巨噬细胞和SMC中COX-2和PGE2的表达。4.5 Tregs治疗增加SMCs的活力并诱导巨噬细胞表型的转变随后我们研究了 Treg对SMCs活力和巨噬细胞表型的影响。如图5AMTT结果所示,与AngⅡ组相比,Treg治疗增加了 SMC的活性,而CD4+CD25-T细胞没有改变SMC的活性。此外,RT-PCR显示,Tregs刺激后诱导了巨噬细胞表型的转变,表现为M1相关基因（CD86和iNOS）表达下调和M2相关基因（Arg-1和CCL-9）表达上调（P<0.05,图5B至5E）。这些结果表明,Tregs增加了 SMCs的活性并诱导巨噬细胞表型从M1型转变为M2型。5结论在AAA的体内和体外实验中,Tregs治疗均可显着降低AngⅡ诱导的COX-2的表达,这表明Tregs可能通过抑制COX-2的表达对AAA发挥保护作用,该研究可能为AAA的免疫治疗提供启示。

任加以^[6]（2020）在《血管内超声在冠心病痰瘀证候患者冠脉临界病变中的应用研究》文中认为目的:基于冠脉血管内超声技术,探讨“痰和瘀”这两种病邪与CHD冠脉临界病变斑块内在的病理特性及联系,为指导识别CHD高风险人群的中医辨证治疗提供客观理论支持。方法:统计2017年10月至2018年12月期间在我院心血管内科病区住院的患者,行冠脉造影诊断为冠心病冠脉临界病变且行冠脉血管内超声检查的124例患者。入选患者由高级职称医师进行辨证分组,经过纳入排除标准及剔除与脱落标准,最终纳入98例;其中痰浊证32、血瘀证25、痰瘀互结证41。然后分析三组患者的血管外弹力膜面积、斑块面积、重构指数、斑块偏心指数、斑块最大厚度、斑块最小厚度、斑块脂质比等以及血脂水平、C反应蛋白、心脏射血分数、再发心绞痛例数、经皮冠状动脉介入术例数,冠脉照影与冠脉内超声狭窄率等的差异。所有数据处理分析均采用SPSS 22.0软件进行统计学分析,以P<0.05为差异有统计学意义,图形应用Graphpad绘制。结果:1、痰浊证组、血瘀证组及痰瘀互结证组患者在基本临床资料、生化指标水平及心脏射血分数的比较中未得出明显差异（P>0.05）;2、血管内超声测量值的对比分析中,痰瘀互结证组患者在血管外弹力膜面积、斑块面积、斑块负荷及重构指数均大于痰浊证组及血瘀证组患者（P<0.05）;而痰浊证组患者与血瘀证组患者在血管外弹力膜面积、斑块面积、斑块负荷及重构指数的比较均无明显差异（P>0.05）;在IVUS显示狭窄率、最小管腔面积、脂质池面积、斑块脂质比、斑块最大厚度、斑块最小厚度、平均管腔直径、斑块偏心指数等的对比中,痰浊证、血瘀证和痰瘀互结证三组人群结果无明显差异（P>0.05）;3、痰瘀互结证组患者相比较于痰浊证及血瘀证组患者,发生心绞痛的例数更多（P<0.05）,而痰浊证组与血瘀证组患者在发生心绞痛的例数的比较中无统计学意义（P>0.05）;4、痰瘀互结证组患者发生急性冠脉事件需要再入院行经皮冠状动脉介入术治疗例数多于痰浊证组及血瘀证组（P<0.05）,而痰浊证组与血瘀证组患者间的比较无统计学差异（P>0.05）;5、痰瘀互结证组患者的IVUS显示冠脉狭窄率高于CAG显示冠脉狭窄率（P<0.05）,而痰浊证组与血瘀证组患者间的比较无统计学意义（P>0.05）。结论:在冠心病冠脉临界病变患者中,血管内超声检查提示痰瘀互结证患者冠脉斑块不稳定性大,发生心血管事件的危险性高,临床中应更加重视防治。

齐晶晶^[7]（2020）在《VH-IVUS分析冠状动脉斑块易损性与Lp-PLA2、hs-CRP及NT-proBNP的关系》文中研究说明目的研究生物学标志物脂蛋白相关磷脂酶A2（Lipoprorein-assoeiated phosphohpase A2,Lp-PLA2）、超敏C-反应蛋白（High sensitive C reaction protein,hs-CRP）及氨基末端脑钠肽前体（N terminal pro B type natriuretic peptide,NT-proBNP）与冠状动脉斑块易损性之间的关系及对斑块易损性的预测诊断价值,以期为临床工作中筛选冠心病（Coronary heart disease,CHD）高风险人群,提供新的临床证据。方法1选择2018年1月-2019年6月在唐山市工人医院心内一科住院的拟行冠状动脉造影（Coronary angiography,CAG）的患者,符合入选标准的139例患者作为本研究的对象。依据CAG结果将139例患者划分为冠心病组（104例）,对照组（35例）。2依据VH-IVUS结果将104例冠心病组患者分为不稳定性斑块组（57例）和稳定性斑块组（47例）。3所有入选患者均行Lp-PLA2、hs-CRP及NT-proBNP等生物学标志物检测。4分析生物学标志物Lp-PLA2、hs-CRP及NT-proBNP与冠状动脉易损斑块的关联性。结果1将不稳定性斑块组、稳定性斑块组及对照组患者的临床基本资料进行比较三组中年龄、性别、BMI指数、合并高血压、糖尿病的比例、合并吸烟、饮酒史,差异无统计学意义（P>0.05）。2将不稳定性斑块组、稳定性斑块组及对照组患者的一般生化指标进行比较,不稳定性斑块组患者的TC、TG、LDL-C等一般生化指标高于稳定性斑块组及对照组,差异无统计学意义（P>0.05）。3三组患者的生物学标志物中Lp-PLA2、hs-CRP及NT-proBNP,不稳定性斑块组及稳定性斑块组均明显高于对照组,且不稳定性斑块组明显高于稳定性斑块组,差异有统计学意义（P<0.01）。4不稳定性斑块组病变处从斑块面积、斑块负荷、管腔面积、外弹力膜面积均高于稳定斑块组,不稳定斑块组的血管重塑指数、坏死核心面积及纤维脂肪组织面积百分比均高于稳定性斑块组,而钙化组织面积及纤维组织面积百分比均低于稳定性斑块组,差异有统计学意义（P<0.05）。5 Logistic分析结果显示,在消除年龄、性别、BMI指数、吸烟史、饮酒史、糖尿病、高血压等指标的影响后,Lp-PLA2的OR值为1.026,hs-CRP的OR值为2.083及NT-proBNP的OR值为1.006均大于1,说明Lp-PLA2、hs-CRP及NT-proBNP为冠心病不稳定斑块的危险因素,差异有统计学意义（P<0.01）。6 ROC曲线下面积显示Lp-PLA2、hs-CRP及NT-proBNP曲线下面积分别为0.727,0.734和0.717均大于0.5差异有统计学意义,当ROC曲线下面积在0.7-0.9时说明是具有一定准确性的,即Lp-PLA2、hs-CRP及NT-proBNP对易损斑块均有预测诊断价值。结论1冠心病患者的hs-CRP、LP-PLA2及NT-proBNP明显升高,说明hs-CRP、LP-PLA2及NT-proBNP与冠心病具有明显的相关性。2 Lp-PLA2、hs-CRP及NT-proBNP与冠状动脉易损斑块的不稳定性具有相关性。3 Lp-PLA2、hs-CRP及NT-proBNP为冠心病不稳定斑块的危险因素,对易损斑块的预测诊断具有一定的价值。图1幅;表5个;参135篇。

夏晓东^[8]（2020）在《温控射频消融血管成形术对动脉粥样硬化的影响》文中认为目的:1.使用温控射频消融球囊对兔正常动脉血管进行纵向线性消融,探讨不同温度射频对兔正常动脉的损伤情况,观察温控射频球囊及单纯球囊对正常血管内膜损伤,增生及纤维组织增生情况,并测量动脉管腔面积,探索射频消融动脉血管合适温度。2.使用温控射频球囊对兔动脉粥样硬化血管进行纵向线性消融,探讨温控射频消融球囊对动脉粥样硬化斑块的影响,并了解其对动脉粥样硬化斑块血管管腔面积影响,测量炎性因子,凋亡因子及TGF-β通路,探索温控射频球囊线性消融动脉粥样硬化血管后血管组织学变化,并探索温控射频球囊消融动脉粥样硬化血管后,促炎细胞因子,抑炎细胞因子,凋亡因子及TGF-β/Smad-2炎症通路变化情况,为临床治疗动脉粥样硬化提供新思路。方法:1.将正常健康家兔分为4组,即单纯球囊扩张对照组,45℃温控射频球囊扩张组,50℃温控射频球囊扩张组,55℃温控射频球囊扩张组。温控射频球囊在扩张后1h,3d,7d留取兔动脉标本,甲醛固定,并进行HE,Masson染色,观察血管增生,胶原纤维变化情况并测量血管腔面积。2.动脉硬化建模:球囊拉伤兔腹主动脉内膜,并联合高脂饮食喂养,建立动脉粥样硬化模型,并在12w时随机处死2只大兔以检验动脉粥样硬化造模是否成功。3.将造模成功的大兔随机分为2组,即使用55℃射频消融扩张及单纯球囊扩张兔动脉粥样硬化血管,在1小时,7天,14天以及28天留取动脉标本,行HE及MASSON染色,进行病理组织学切片观察,了解温控射频球囊及单纯球囊扩张对动脉粥样硬化血管影响。并应用免疫组化,western blot及荧光定量PCR等方法,检测组织中促炎因子,抑炎因子,凋亡因子及TGF-β/Smad-2通路蛋白水平及组织中m RNA水平的变化。结果:1.与单纯球囊扩张组及对照组比较,应用45℃,50℃,55℃线性消融正常兔动脉血管时,血管管腔面积各统计组之间无统计学差异。2.使用55℃射频扩张粥样硬化血管,在相同时间点,温控射频球囊组血管管腔面积大于单纯球囊扩张组,而随时间延长温控射频消融球囊组及单纯球囊扩张组两组组内血管管腔面积变化不大。温控射频球囊组各组之间管壁厚度无统计学差异。3.组织水平上,在1小时,7天,14天,28天的时间点,温控射频球囊扩张组IL-1β,IL-17,Bax,IFN-γ,TGF-β,Smad-2以及Caspase3表达明显高于单纯球囊扩张组。温控射频消融球囊扩张组表达IL-10及Bcl-2少于单纯球囊扩张组。4.转录水平与蛋白水平,在1小时,7天,14天,28天的时间点,温控球囊扩张组兔子动脉血管中Bcl-2的整体表达量要明显低于单纯球囊扩张组。但是,温控射频球囊扩张组兔子动脉血管中Bax,TGF-β,Smad-2以及Caspase3的整体表达量要明显高于单纯球囊扩张组。结论:1.使用温控射频消融球囊消融兔正常血管时,45℃,50℃,55℃均可对正常血管造成损伤,但与单纯扩张组比较,血管管腔面积变化不大。虽然随温度升高,血管壁损伤范围也相应扩大,但即使是使用55℃对正常血管进行30s消融,仍然是安全的。2.使用55℃射频消融球囊扩张兔动脉粥样硬化血管,可使动脉粥样硬化血管管腔面积增大,可能与球囊挤压斑块,射频能量对血管造成线性损伤,血管顺应性增加,在动脉血压的作用下,扩张动脉粥样硬化血管。3.射频消融动脉粥样硬化血管时,消融部位动脉粥样硬化斑块可发生纤维化,可有助于动脉粥样硬化斑块稳定。4.射频消融可使消融部位促炎症细胞因子表达增加,抑炎细胞因子表达减少,凋亡受到抑制,同时TGF-β/smad2通路被激活。这也提示,虽然射频消融能增加血管面积,但同时炎症通路也被激活,如应用于临床,应同时应用抑制炎症反应药物。维持射频消融球囊扩张远期效果。

李占华^[9]（2020）在《宝石能谱CT对不稳定型心绞痛冠状动脉粥样硬化斑块的应用研究》文中研究指明目的:1、通过宝石能谱CT冠状动脉扫描,研究、分析70例不稳定型心绞痛患者不同类型冠状动脉粥样硬化斑块的构成情况、分布情况、以及各类斑块与管腔狭窄程度及重构情况的相互关系;2、定量分析不同类型冠状动脉粥样硬化斑块的长度、面积等,分析其规律;3、分析不同年龄组及冠状动脉四大分支的钙化积分情况。评价宝石能谱CT对不稳定型心绞痛冠状动脉粥样硬化斑块的应用价值,为临床开展对不稳定型心绞痛的风险分层和干预治疗提供相应的理论依据。方法:1、收集内蒙古医科大学第四附属医院2017年8月-2019年12月在我院行宝石能谱CT冠状动脉扫描且临床确诊为不稳定型心绞痛的患者共70例,其中男性42例（60%）,女性28例（40%）。运用宝石能谱CT冠状动脉扫描并经工作站进行后处理,根据CT值,将冠状动脉粥样硬化斑块分为易损斑块（CT值﹤40HU）、混合斑块（密度混杂的斑块）、纤维斑块（CT值介于40HU和130HU之间）、钙化斑块（CT值>130HU）四类。对所选取的右冠状动脉近段（RCA1）、右冠状动脉中段（RCA2）、左冠状动脉主干（LM）、左前降支近段（LAD1）、左前降支中段（LAD2）、第一对角支（D1）、左回旋支近段（LCX1）、钝缘支（OM）这冠状动脉8个节段的每个节段（按美国心脏协会15段划分方法）进行斑块类型及分布情况的综合分析。斑块所在血管管腔重构分为正性重构和负性重构。管腔狭窄程度分为四种:正常或轻微狭窄、轻度狭窄、中度狭窄、重度狭窄。对这四类斑块所造成的冠状动脉管腔重构情况及管腔狭窄程度进行分析和比较。将70例不稳定型心绞痛患者分为﹤60岁和≥60岁两个年龄组,采用钙化积分对两个年龄组及冠状动脉四大分支（LM、LAD、LCX、RCA）进行钙化程度的分析评估。结果1、冠状动脉的四大分支:左主干（LM）、左前降支（LAD）、左回旋支（LCX）、右冠状动脉（RCA）,70例UAP患者中,冠状动脉两支病变占比最多为44.29%（31例）,多支病变占比次之为30.00%（21例）,单支病变占比最少为25.71%（18例）。2、共检测到70例UAP患者冠状动脉粥样硬化斑块191个,易损斑块数目占比最多为43.98%（84个）,混合斑块占比为27.23%（52个）,钙化斑块占比为20.42%（39个）,纤维斑块占比最少为8.37%（16个）。3、70例UAP患者各类冠状动脉粥样硬化斑块在所选择的8个冠状动脉各节段上的分布差异有统计学意义（X2=36.049,P<0.05）。其中,斑块分布数目较多的节段为左前降支近段（LAD1）（27.23%）,其次为右冠状动脉近段（RCA1）（17.80%）,左回旋支近段（LCX1）（16.75%）,斑块分布数目较少的节段为左主干（LM）和第一对角支（D1）（同样为4.71%）。另外,易损斑块、混合斑块、纤维斑块在所选择的8个冠状动脉各节段的分布也存在较大差异,且有统计学意义（P<0.05）。易损斑块主要分布于LAD1（占总易损斑块的46.43%）和RCA1（占总易损斑块的15.48%）,混合斑块主要分布于RCA1（占总混合斑块的23.08%）和LCX1（占总混合斑块的21.15%）,纤维斑块主要分布于OM（占纤维斑块的37.50%）。4、70例UAP患者各类斑块长度、面积比较:易损斑块的长度高于混合斑块、钙化斑块,纤维斑块的长度高于其余斑块;纤维斑块的面积大于易损斑块、大于混合斑块、大于钙化斑块。5、在70例UAP患者所有冠状动脉的不同程度狭窄中,轻度狭窄最多（31.94%）,正常或轻微狭窄次之（30.37%）,而中度狭窄和重度狭窄较少（分别为20.42%、17.27%）。易损斑块和混合斑块导致管腔不同狭窄程度差异有统计学意义（P<0.05）。易损斑块主要引起血管管腔正常或轻微狭窄（41.67%）、轻度狭窄（36.90%）。混合斑块主要引起血管管腔重度狭窄（36.54%）和中度狭窄（26.92%）。6、70例UAP患者各类斑块所导致冠状动脉管腔的重构率比较,差异有统计学意义（X2=17.476,P<0.05）。易损斑块和混合斑块易使管腔发生正性重构,正性重构率分别为65.47%、53.85%。钙化斑块和纤维斑块易使管腔发生负性重构,正性重构率分别为26.64%、43.75%。7、70例UAP患者,60岁以下及60岁以上（含60岁）两个年龄组钙化积分相比较,差异有统计学意义（P<0.05）,且≥60岁组的钙化积分和钙化程度高于<60岁组。冠状动脉四大分支（LM、LAD、LCX、RCA）钙化发生率及钙化程度有所差异。LAD钙化发生率最高,其次是RCA。RCA钙化程度最重,其次是LAD。结论:1、宝石能谱CT通过测量CT值对UAP冠状动脉粥样硬化斑块进行分类,进而可以较准确的分析评价UAP其各类冠状动脉斑块的构成和分布情况、形态等,从而进一步判别各类斑块的稳定性,还可以分析各类斑块与管腔不同狭窄程度及重构情况的关系及临床意义,进而指导UAP临床风险分层以及临床干预、治疗,降低急性心血管事件的发生率。2、宝石能谱CT冠脉成像可以较清晰的显示UAP冠状动脉各大分支,并能较好的显示其病变情况,尤其是能谱CT应用了动态变焦和新迭代算法重建数据等技术,大大抑制了钙化斑块的硬化效应减少了高密度硬化束伪影,从而提高了对钙化斑块及所在管腔狭窄程度的诊断及分析能力。

赵东明^[10]（2020）在《同型半胱氨酸水平与冠状动脉粥样硬化病变关系》文中指出目的:探讨同型半胱氨酸与冠状动脉粥样硬化病变及其严重程度和斑块稳定性之间的关系。方法:选取自2017年9月至2019年9月以来,符合入选标准并于宁夏回族自治区人民医院心血管内科行冠脉造影患者共220例。收集这些患者的一般临床资料、血清同型半胱氨酸浓度及冠状动脉造影结果。根据行冠脉造影检查结果分为非冠心病组（91例）及冠心病组（129例）,冠心病组根据斑块的稳定性分为急性冠脉综合征组（ACS组）和稳定性冠心病（SCAD组）。冠心病组根据冠脉造影结果计算Gensini评分。比较冠心病组和非冠心病组的一般临床资料及同型半胱氨酸浓度有无差异,并将一般资料中有统计学差异的因素及同型半胱氨酸进行多因素logistic回归分析。比较冠心病两个分组间一般临床资料及同型半胱氨酸水平的差异,将一般资料中有统计学差异的因素进行多因素logistic回归分析,同型半胱氨酸与Gensini评分进行相关性分析。结果:1.冠心病组与非冠心病组之间有统计学差异的是:性别、吸烟史、Hcy、总胆固醇、尿酸、BMI（P<0.05）;2.多元logistic回归分析显示Hcy、总胆固醇、性别与冠心病的发病有关,是冠心病的独立危险因素;3.ACS组与SCAD组之间有统计学差异的是:吸烟史、Gensini评分、总胆固醇（P<0.05）,两组间血清Hcy水平并无差异（P>0.05）;4.多元logistic回归分析显示Gensini评分、总胆固醇与冠状动脉粥样硬化斑块稳定性有关且是它的独立危险因素;5.血Hcy水平与代表冠状动脉粥样硬化严重程度的Gensini评分呈低度正相关并且有明显的统计学意义（rs=0.177,P<0.05）。结论:1.血清Hcy与冠状动脉粥样硬化病变的发生呈正相关,是它的危险因素,并且血清Hcy水平与Gensini评分呈正相关,提示Hcy可能与冠状动脉粥样硬化病变的严重程度有关;2.ACS组与SCAD组间的血清Hcy水平并无差异,提示血清Hcy水平可能与冠状动脉粥样硬化病变斑块稳定性无关,但总胆固醇水平可能是影响冠状动脉粥样硬化病变斑块稳定性的危险因素。

二、不稳定性冠状动脉粥样硬化斑块的研究进展（论文开题报告）

（1）论文研究背景及目的

此处内容要求：

首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。

写法范例：

本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。

（2）本文研究方法

调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。

观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。

实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。

文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。

实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。

定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。

定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。

跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。

功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。

模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。

三、不稳定性冠状动脉粥样硬化斑块的研究进展（论文提纲范文）

（1）基于血管内超声探讨MHR与斑块稳定性的相关性研究（论文提纲范文）

（2）脂肪细胞来源外泌体在糖尿病动脉粥样硬化疾病中的作用及机制研究（论文提纲范文）

（3）基于高分辨率磁共振对动脉粥样硬化不稳定斑块诊疗的临床及实验研究（论文提纲范文）

（4）基于人参皂苷Rg3与瑞舒伐他汀不同内皮保护机制的二者联用抗动脉粥样硬化作用研究（论文提纲范文）

（5）炎症微环境的免疫调控与血管重构分子机制的研究（论文提纲范文）

（6）血管内超声在冠心病痰瘀证候患者冠脉临界病变中的应用研究（论文提纲范文）

（7）VH-IVUS分析冠状动脉斑块易损性与Lp-PLA2、hs-CRP及NT-proBNP的关系（论文提纲范文）

（8）温控射频消融血管成形术对动脉粥样硬化的影响（论文提纲范文）

（9）宝石能谱CT对不稳定型心绞痛冠状动脉粥样硬化斑块的应用研究（论文提纲范文）

（10）同型半胱氨酸水平与冠状动脉粥样硬化病变关系（论文提纲范文）

四、不稳定性冠状动脉粥样硬化斑块的研究进展（论文参考文献）

• [1]基于血管内超声探讨MHR与斑块稳定性的相关性研究[D]. 林朋. 蚌埠医学院, 2021(01)
• [2]脂肪细胞来源外泌体在糖尿病动脉粥样硬化疾病中的作用及机制研究[D]. 陈芳芳. 山东大学, 2021(10)
• [3]基于高分辨率磁共振对动脉粥样硬化不稳定斑块诊疗的临床及实验研究[D]. 史张. 中国人民解放军海军军医大学, 2021(01)
• [4]基于人参皂苷Rg3与瑞舒伐他汀不同内皮保护机制的二者联用抗动脉粥样硬化作用研究[D]. 耿嘉男. 吉林大学, 2020(01)
• [5]炎症微环境的免疫调控与血管重构分子机制的研究[D]. 刘斌. 山东大学, 2020(01)
• [6]血管内超声在冠心病痰瘀证候患者冠脉临界病变中的应用研究[D]. 任加以. 广西中医药大学, 2020(02)
• [7]VH-IVUS分析冠状动脉斑块易损性与Lp-PLA2、hs-CRP及NT-proBNP的关系[D]. 齐晶晶. 华北理工大学, 2020(02)
• [8]温控射频消融血管成形术对动脉粥样硬化的影响[D]. 夏晓东. 天津医科大学, 2020(06)
• [9]宝石能谱CT对不稳定型心绞痛冠状动脉粥样硬化斑块的应用研究[D]. 李占华. 内蒙古医科大学, 2020(03)
• [10]同型半胱氨酸水平与冠状动脉粥样硬化病变关系[D]. 赵东明. 西北民族大学, 2020(08)

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