一、代谢工程在D-核糖生产中研究现状及应用前景（论文文献综述）
邓琛[1]（2021）在《代谢调控谷氨酸棒杆菌合成乙酰氨基葡萄糖》文中进行了进一步梳理N-乙酰氨基葡萄糖（N-acetylglucosamine,GlcNAc）及其衍生物氨基葡萄糖（Glucosamine,GlcN）、N-乙酰神经氨酸（N-acetylneuraminic acid,Neu5Ac）是当今世界上认可度较高的营养化学品,被广泛应用于保健、医药、农业及化工领域,在许多国家被列为膳食补充剂及医药品行列,具有十分广阔的应用前景。目前生产N-乙酰氨基葡萄糖的方法主要是甲壳素类物质酸水解法、微生物酶转化法和及微生物发酵法。与前两种制备方法相比,微生物发酵法显示出环保、条件温和、原料来源丰富,以及不易致敏等诸多优势。本课题以食品安全级谷氨酸生产菌株谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum S9114）作为出发菌株,通过对GlcNAc的生物合成途径进行深入分析,采用代谢工程以及蛋白质工程等方法平衡了GlcNAc合成途径模块与各个代谢途径模块之间的代谢流分布,构建了一株能够高效合成GlcNAc的C.glutamicum工程菌株。此外,本研究分别开发了适用于C.glutamicum S9114菌株的基因组单碱基编辑工具以及基因表达量调控工具,以便于后续基因组改造以及基因表达量调控工作的开展。主要研究结果分为如下四部分:（1）在对C.glutamicum S9114全基因组测序和关键功能基因模块解析的基础上,引入外源GlcN6P乙酰化酶（Gna1）,完善了GlcNAc在谷氨酸棒杆菌中的合成途径,初步构建了GlcNAc摇瓶发酵产量达到1.7 g/L的重组菌株;之后,使用合成的基因外重复性的回文序列（Repetitive Extragenic Palindromic sequence,REP）增强了Gna1编码基因GNA1的表达,GlcNAc产量达到3.1 g/L;进一步敲除了GlcNAc分解代谢途径相关酶编码基因nag A（乙酰氨基葡萄糖-6-磷酸脱乙酰酶Nag A编码基因）和nag B（氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨基酶Nag B编码基因）,GlcNAc产量提升至4.8 g/L;敲掉ldh（乳酸脱氢酶基因）以及pta（乙酸脱氢酶基因）,阻断副产物乳酸、乙酸的合成,GlcNAc产量提升至5.4 g/L;进一步优化glm S（葡萄糖-6-磷酸合成酶Glm S编码基因）的表达,使GlcNAc的产量提升至6.9 g/L（500 ml摇瓶发酵）,通过补料分批发酵促使GlcNAc在50-L发酵罐中的效价达17.7 g/L。（2）为了开发能在C.glutamicum S9114中可以使用的基因编辑与调控工具,我们通过在C.glutamicum中引入胞嘧啶脱氨酶和腺嘌呤脱氨酶,并通过一系列优化得到了可以在目标位点上游28 bp的核苷酸的编辑窗口内实现C-T、C-G以及A-G碱基转换的单碱基编辑工具,该工具有利于构建C.glutamicum基因组上的突变体文库。同时,开发出一种快速连接将多种sg RNA连接在表达载体上的方法,大大缩短了多种sg RNA靶点与载体连接效率。此外,我们构建了基于CRISPR-d Cpf1（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat sequences and CRISPR‐associated DNase deactivated Cas protein from Prevotella and Francisella 1）的单基因与多基因干扰系统,可以对单个或者同时对多个基因进行表达抑制。总的来说,我们进一步开发了C.glutamicum S9114的基因编辑与调控工具系统,为C.glutamicum S9114细胞工厂的基因组编辑和代谢工程提供了有效的工具来生产各种生物化学品。（3）采用全局性转录调控工程（global transcription machinery engineering,gTME）对C.glutamicum S9114的中心碳氮代谢网络的转录水平进行了全局调整,从而促进了目标代谢产物GlcNAc产量的提升。选取了7种碳代谢转录调控因子和1种氮代谢转录调控因子进行研究。从7种碳代谢调控因子中挑选出对GlcNAc合成的促进效果最明显的全局性转录调控因子RamA,并构建了RamA的两个结构域的突变体文库。分别从两种突变体文库中筛选正向突变体并进行组合突变,最终得到GlcNAc摇瓶产量达16 g/L的突变体菌株。进一步通过转录组分析揭示了突变菌株高产GlcNAc的原因。采用CRISPRd Cpf1基因调控系统对GlcNAc合成的全局性负转录调控因子Lld R以及Amt R的进行表达抑制,使GlcNAc合成量在摇瓶中提升至27.5 g/L,50-L发酵罐中提升至62.6 g/L。（4）辅因子作为氧化还原力的提供者,在调控代谢通量中发挥着重要的作用。然而,重组谷氨酸棒杆菌每合成1 mol的GlcNAc会产生3 mol的NADH,随着细胞GlcNAc合成能力的不断提升,极有可能会导致重组工程菌胞内辅因子失衡。因此本研究确定了GlcNAc在谷氨酸棒杆菌中的合成会造成NADH在胞内的积累,并通过蛋白质理性修饰改变了合成代谢路径中关键脱氢酶的辅因子偏好性,使得胞内NADH水平下降了59.7%,平衡了胞内的氧化还原状态,进而促使目标代谢产物GlcNAc的摇瓶产量提升至36.9g/L,50-L发酵罐中产量提升至104.9 g/L。
张梦雪[2]（2021）在《枯草芽孢杆菌生产核黄素的体内外代谢工程改造及环保生产工艺的建立优化》文中研究表明核黄素目前已经广泛应用于农业、医药和饲料添加剂领域。生物合成法是其主要生产方式,枯草芽孢杆菌是重要的生产菌株之一。为提高核黄素产量并建立环保的核黄素生产工艺,本课题主要进行了三部分工作。第一,通过对发酵过程的分析和调控以提高核黄素的产量。首先,基于10-L发酵罐生理参数的相关性分析,将发酵过程分为4个阶段并分别阐述其特性;随后,针对代谢溢流进行调控,通过将氨基氮浓度维持在1-1.2 g/L,核黄素的产量最终提高了15.3%。第二,通过体内外代谢工程改造以提高核黄素合成前体供应的戊糖磷酸途径的代谢通量。在体外代谢工程改造中,将葡萄糖酸钠代替葡萄糖作为碳源,在摇瓶实验中核黄素产量从636.7 IU/mL提升至873.2 IU/mL,该结果证明菌体利用葡萄糖酸钠作为碳源合成核黄素具有更高的得率;在体内代谢工程改造中,过表达葡萄糖酸透过酶编码基因gntP,使核黄素产量提升至1002.0 IU/mL,该结果证明基因工程改造菌通过提高葡萄糖酸钠利用速率进而增加了核黄素的产量,相应结论也在发酵罐水平得到验证。第三,建立发酵废菌体和废水回用工艺。对发酵废菌体进行酸处理并将其作为下一轮发酵氮源是其最优回用工艺,该工艺可至少循环三次且依然对核黄素合成具有促进作用;用85%发酵废水并添加初始磷酸盐的25%配制培养基是发酵废水的最适回用工艺,该工艺可至少进行一次且不干扰核黄素的合成,以上两种工艺均在摇瓶和发酵罐水平得到验证。本研究基于对枯草芽孢杆菌中核黄素合成途径和发酵过程的分析,通过发酵过程调控和代谢工程改造策略提高了核黄素的产量,同时建立了一种环保的核黄素生产工艺。
马倩,夏利,谭淼,孙全伟,杨蒙雅,张颖,陈宁[3]（2021）在《氨基酸生产的代谢工程研究进展与发展趋势》文中进行了进一步梳理氨基酸发酵是我国发酵工业的支柱产业,近年来,随着代谢工程的快速发展,氨基酸的代谢工程育种蓬勃发展。传统的正向代谢工程、基于组学分析与计算机模拟的反向代谢工程以及借鉴自然进化的进化代谢工程,都有越来越多的应用。在氨基酸的工业生产中涌现出了一系列具有高效生产、抗逆性强等优良性状的菌株。日益剧烈的市场竞争对菌株的选育提出了新的要求,如开发高附加值氨基酸品种、菌株代谢的动态调控、适应新工艺的要求等。文中介绍了氨基酸生产相关的代谢工程研究进展以及未来的发展趋势。
杨志恒[4]（2020）在《改造热葡糖苷酶地芽孢杆菌高效生产核黄素》文中提出相对于嗜温微生物的常温发酵工艺,在工业生产中使用嗜热微生物进行高温发酵生产,具有提高生化反应速率、降低染菌风险、减少发酵冷却能耗等潜在优势。热葡糖苷酶地芽孢杆菌的最适生长温度为60℃,生长代时16分钟,并且能够充分利用木质纤维素水解物,因此是高温微生物发酵的优秀底盘候选菌株。热葡糖苷酶地芽孢杆菌作为生产菌株能够将其耐高温、生长快速、利用廉价碳源等特性,与工业生产中减少冷却水的使用、降低染菌风险、缩短发酵周期和降低发酵原辅料成本等多种需求相互契合,具有极大地开发价值。本论文利用耐热绿色荧光蛋白作为反筛标记,开发了一种快速便捷的地芽孢杆菌遗传操作方法。使用该方法对热葡糖苷酶地芽孢杆菌进行代谢工程改造,实现了产量从无到有,从低到高的高温核黄素生产菌株的开发。在热葡糖苷酶地芽孢杆菌中引入异源核黄素生物合成基因簇,获得第一代核黄素菌株Rib-Gtd,核黄素产量达28.7 mg/L;对ribCGtg进行点突变,获得降低核黄素细胞消耗的第二代核黄素菌株Rib-Gtdl,核黄素产量达84.6mg/L;敲除嘌吟途径的调控蛋白PurRGtg解除对嘌呤途径的抑制,获得第三代核黄素菌株Rib-Gtd2,核黄素产量达110.7mg/L;为了避免嘌呤合成途径的代谢流流向腺嘌呤,进一步敲除了 purAGtg增加前体供应获得第四代核黄素菌株Rib-Gtd3,核黄素产量达171.6 mg/L;敲除ccpNGtg调节中心碳代谢到核黄素的生产获得第五代核黄素菌株Rib-Gtd4,核黄素产量达260±15 mg/L;敲除乳酸脱氢酶基因ldhGtg阻断副产物乳酸的生成获得第六代核黄素菌株Rib-Gtd5,核黄素产量达445.8mg/L。最后,工程化的菌株在葡萄糖-木糖混合物作为碳源的矿物盐培养基中发酵12-h核黄素产量达1034.5 mg/L。本研究通过对热葡糖苷酶地芽孢杆菌进行一系列代谢工程改造,实现核黄素在嗜热菌中的高温发酵生产。该研究表明热葡糖苷酶地芽孢杆菌有望克服常温工艺的天然缺陷,突破目前常温发酵生产核黄素面临的诸多限制因素,成为工业生产中核黄素高温发酵的高产宿主,具有继续深入改造的潜力以及提高我国核黄素产业市场竞争力的前景。
郭伟[5]（2020）在《代谢工程改造酿酒酵母生产酪醇及红景天苷的研究》文中认为天然产物是药物、食品添加剂的主要来源之一,作为高附加值原材料被广泛应用于食品、医药、化妆品行业。目前,植物提取法和化学合成法是在天然产物工业生产中常用的方法。传统的植物提取法效率低、分离工艺复杂,而且,植物的生长受土壤质量、气候以及其他外部因素限制。化学合成法难以实现从头合成、所需的反应条件苛刻、容易造成环境污染。不同于以上两种天然产物获得方法,通过生物合成法可利用微生物细胞工厂以廉价的碳源作为原料生物合成高附加值目标化合物,该法具有低成本、高效、环保及可持续等优势。近年来,生物合成法受到研究者们的广泛关注。在合成生物学理论的指导下,采用分子生物学技术,对微生物细胞进行系统的代谢工程改造,实现微生物细胞工厂高效生产天然产物是满足日益增长的天然产物市场需求的可行策略。迄今为止,实现以微生物作为细胞工厂生物合成芳香类化合物的生产方式在工业化生产中的应用依然面临挑战。酪醇是一种来源于橄榄的芳香类化合物,具有抗氧化、消炎等功效,同时,也是重要心血管药物红景天苷的直接前体。红景天苷被广泛应用于医药、食品、化妆品行业。但是,目前通过代谢工程改造酿酒酵母用于酪醇及红景天苷的生物合成,所获得的总产量小于2 g/L。为了实现酿酒酵母高效生物合成酪醇及红景天苷,在本研究中,我们开发了一系列理性的代谢工程改造策略,并且通过对酿酒酵母工业菌株进行系统的代谢工程改造,显着地提高了酪醇及红景天苷的产量。本论文的主要研究内容及结果如下:（1）代谢工程改造酿酒酵母高效生物合成酪醇比较分析了两条外源的可将酪氨酸转化为酪醇的生物合成途径TDC-TYO途径和PcAAS途径对酿酒酵母生物合成酪醇的影响。研究结果表明,PcAAS途径比TDC-TYO途径更有助于酿酒酵母中酪醇的生物合成,导入PcAAS途径的酿酒酵母菌株的酪醇产量相对于对照菌株提高约1 17倍。由于酿酒酵母存在Crabtree效应,以葡萄糖为碳源培养时会产生大量的副产物乙醇。因此,为了降低乙醇分支途径的碳流量以提高目标化合物酪醇的产量。我们通过敲除酿酒酵母乙醇分支途径的主要丙酮酸脱羧酶基因PDC1,使酪醇产量提高了 18.53%。此外,为了增强莽草酸途径的终产物——分支酸向酪醇生物合成方向的碳流量,我们在pdc1位点分别异源表达了大肠杆菌来源的分支酸变位酶/预苯酸脱氢酶的双功酶基因EctyrA及其酪氨酸反馈抑制不敏感突变体EctyrAM53I/A354V,酪醇产量分别提高了 33.59%和35.18%。为了促进酪醇生物合成的工业化应用进程,实现以酿酒酵母工业菌株作为出发菌株构建高效生物合成酪醇及其衍生物的微生物细胞工厂。首先,为了方便代谢工程改造,我们对多株二倍体酿酒酵母工业菌株进行了单倍体分离实验,获得了 4株来源于不同菌株具有不同配型的单倍体工业菌株。基于菌株的酪醇生产水平,通过筛选获得了酪醇产量较高的单倍体酿酒酵母工业菌株HLF-Dα。与前期实验中使用的酿酒酵母实验菌株相比,酿酒酵母工业菌株的鲁棒性更好,其发酵性能更加稳定。通过将前期构建的代谢工程改造策略应用到了 HLF-Dα中,获得了高产酪醇酿酒酵母工业菌株DA-1,该菌株在72 h摇瓶培养后,酪醇产量达到742.02±22.45mg/L,与出发菌株HLF-Dα相比,提高约11倍。该菌株被作为进一步代谢工程改造酿酒酵母高效生产酪醇的平台菌株。随后,我们对酿酒酵母中酪醇生物合成的前体之一——赤藓糖-4-磷酸（Erythrose-4-phosphate,E4P）的生物合成途径进行了优化。首先,我们尝试通过过表达葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因ZWF1以增强酿酒酵母内源的E4P生物合成途径-磷酸戊糖途径（Pentosephosphatepathway,PP途径）。研究结果显示,过表达ZWF1后,酪醇产量和生物量均没有显着变化。我们推测,由于磷酸戊糖途径较为复杂,并且存在许多已知和未知的限速反应步骤,通过改造内源的E4P生物合成途径很难实现酪醇产量的提高。随后,我们寻找到一条外源的基于磷酸酮醇酶（Phosphoketolase,Xfpk）的E4P生物合成途径——Xfpk途径,通过对两条途径的热动力学参数进行比较分析,我们发现与PP途径相比,以葡萄糖作为碳源生物合成E4P时,通过Xfpk途径仅需4步,其最大反应驱动力约为PP途径的2倍,且不需要耗能及辅因子的参与,并且,其理论转化效率为PP途径的2倍。以上动力学分析结果表明,Xfpk途径是一条潜在的高效的E4P生物合成途径,可被应用于提高酿酒酵母酪醇及其他芳香类化合物的生物合成。通过将来源于青春双歧杆菌的磷酸酮醇酶基因Baxfpk在酿酒酵母的不同位点（PHA2、XKS1、GRE3）进行表达,我们发现,在PHA2位点表达Baxfpk优于XKS1和GRE3位点,更有助于酪醇产率的提高。此外,我们对不同来源的Xfpk酶进行了筛选,分别将来源于短双歧杆菌和牙齿双歧杆菌的磷酸酮醇酶基因Bbxfpk和Bdxfpk在PHA2位点进行了表达,发现Bbxfpk表达菌株的酪醇产率最高。该研究结果表明,Xfpk途径的导入是提高酿酒酵母酪醇的产量的有效策略,与BaXfpk和BdXfpk相比,BbXfpk的导入更有助于提高酿酒酵母酪醇生物合成。由于在Xfpk催化底物果糖-6-磷酸（Fructose 6-phosphate,F6P）生成E4P时,会生成1分子乙酰磷酸（Acetyl-phosphate,AcP）,AcP可被酿酒酵母内源的甘油磷酸酶GPP1p和GPP2p催化生成乙酸,从而造成发酵过程中乙酸的积累。过量的乙酸积累会对酿酒酵母的发酵产生抑制作用。磷酸转乙酰酶Pta可催化AcP可逆地转化为乙酰辅酶A,缓解乙酸积累对菌株发酵产生的抑制作用。因此,我们敲除了酿酒酵母中主要的甘油磷酸酶基因GPP1,并异源表达了来源于克氏梭菌（Clostridium kluyveri）的磷酸转乙酰酶基因Ckpta。但是,研究结果表明,导入Ckpta后不仅无法缓解乙酸积累,而且不利于酪醇的生物合成。由于莽草酸途径的关键酶基因受到产物芳香类化合物的反馈抑制,限制了芳香类化合物产量的进一步提高。因此,我们构建了解除芳香类氨基酸反馈抑制的突变体AR04K229L和AR07G141S,并将其插入在酿酒酵母中ARO3位点进行表达。研究结果表明,通过突变解除芳香类氨基酸对莽草酸途径的反馈抑制后,酪醇产量提高了 27.54%。最终,我们通过葡萄糖分批补料发酵实验,获得了 8.37g/L的酪醇产量,该产量是目前已报道的酿酒酵母生物合成酪醇的最高产量。（2）代谢工程改造酿酒酵母高效生物合成红景天苷酪醇是红景天苷,羟基酪醇等心血管药物合成的直接前体。目前,红景天苷已被广泛应用于医药,食品及化妆品等行业。基于酪醇高产工程菌株DA-9,我们拟通过进一步代谢工程改造,构建高效生产红景天苷的酿酒酵母工程菌株。通过在酪醇高产菌株DA-9的TRP3位点表达来源于拟南芥的葡萄糖苷转移酶基因ugt85a1,构建了酪醇向红景天苷的转化途径,获得了产红景天苷菌株DA-91 菌株。经葡萄糖分批补料发酵实验,该菌株在发酵 216 小时后,其酪醇和红景天苷产量分别达到8.47 g/L和1.82 g/L,这是目前为止,以酿酒酵母为底盘细胞获得的最高产量。
尹梦[6]（2020）在《丁酸梭菌的产氢影响因素及其代谢特性的研究》文中研究说明厌氧发酵生物制氢技术在处理废弃物的同时制取氢气,不仅能够实现废弃物资源化,又能降低产氢成本,是近年来环境保护和能源领域研究热点之一。获得高效产氢菌种,进行产氢影响因素的研究,对了解产氢菌种生理生化特性和提高产氢效率具有重要意义,也是解决厌氧发酵生物制氢工业化的基础。本研究利用改进的Hungate厌氧培养技术,从处理高浓度糖蜜废水的CSTR厌氧发酵制氢反应器中,分离获得一株高效产氢细菌,命名为YM-83。利用LM-1培养基进行间歇实验,连续培养30 h后获得最大单位体积产氢量为4,850 m L/L culture,比产氢率为1.94 mol H2/mol glucose。经过16S r DNA基因序列分析,结果显示该菌株与Clostridium butyricum JCM 7840基因序列同源性达100%,基于电镜扫描形态观察和系统进化分析,确定产氢菌株YM-83为丁酸梭菌（Clostridium butyricum）。通过间歇实验进行各种因素对丁酸梭菌YM-83生长产氢的影响研究,结果显示最适生长和产氢培养温度为35℃;最适生长和产氢初始p H为6.5;最适初始初始葡萄糖浓度为18 g/L;添加L-cys有利于丁酸梭菌YM-83的生长和发酵产氢,基于该菌株的比产氢率和经济性考虑,确定其最适产氢L-cys浓度为0.5 g/L;添加Mg Cl2·6H2O对丁酸梭菌YM-83发酵产氢能力有显着影响,最适生长和产氢的Mg Cl2·6H2O浓度为0.15 g/L;在三种铁元素类型中,对丁酸梭菌YM-83产氢的促进作用从大到小依次为Fe2+>Fe3+>Fe,且最适生长和产氢的Fe Cl2·7H2O浓度为0.2 g/L。确定各种因素对丁酸梭菌YM-83的影响后,选择最适培养条件进行间歇实验,连续培养36 h后获得最大单位体积产气量为9,168 m L/L culture,单位体积产氢量为5,360 m L/L culture,比产氢率为2.15 mol H2/mol glucose,最大细胞干重为1.04 g/L。产氢量与初筛时相比提高了1.11倍。在培养基初始p H为6.5和7.5的条件下,对丁酸梭菌YM-83进行间歇实验测其产氢量,并在30 h时收集菌体进行代谢组学的研究。根据代谢组学分析结果,初始p H 6.5和7.5对比下,共检测到106种差异代谢产物,其中,二甲尿酸和烟酸2种物质的含量显着下调;乳酸、D-核糖-5-磷酸、脯氨酸、组氨酸、鸟嘌呤核苷、十八烷基甘油和血清素等104种物质的含量显着上调。差异代谢物主要富集在谷胱甘肽代谢途径、碳代谢途径、ABC转运蛋白、半乳糖代谢途径、氨基酸的生物合成、果糖和甘露糖代谢途径、赖氨酸降解途径、生物膜的形成、乙醛酸和二羧酸的代谢途径以及甲烷代谢等。综上所述,不同培养基初始p H值对丁酸梭菌YM-83的产氢能力和代谢产生了显着的影响。
覃懿,罗想平,柳春,潘丽珠,倪海明,郭佳文[7]（2018）在《D-核糖的研究进展》文中进行了进一步梳理D-核糖是一种天然戊醛糖,是tRNA、mRNA、rRNA的组成部分,与磷酸作用存在于一切活的生命体中。由于D-核糖能够转化为核黄素和核苷酸,所以被广泛应用于食品、医药、化妆品及动物饲料中。文章综述了D-核糖的生产技术、应用方面的研究进展,并展望了D-核糖的发展前景。
刘金亮[8]（2018）在《一株高效产絮菌的基因组测序及胞外多糖合成组学研究》文中研究表明微生物絮凝剂（Microbial flocculant,MBF）是由微生物产生并分泌到细胞外的聚合物,一般由多糖、蛋白质、核酸等高分子物质构成。由于具有安全高效的特性,微生物絮凝剂已成为国内外广泛使用的水处理剂,但生产成本较高和絮凝效果不稳定等问题,限制了微生物絮凝剂的应用。本研究通过多种检测技术对高效产絮菌A9的生物学和基因组特性,及其在不同碳源培养条件下的转录组和蛋白质组的表达差异等进行了检测分析,从分子水平研究产絮菌的产絮机理,从转录组及蛋白质组学角度研究产絮菌产絮过程差异表达基因、蛋白质及功能调控,为工业化生产微生物絮凝剂提供调控方法。研究结果对揭示产絮菌合成絮凝剂的机制和调控途径,为进一步利用代谢工程等提高微生物絮凝剂的产量,促进微生物絮凝剂资源的开发和利用等提供数据支持和理论依据。应用多种检测技术对产絮菌A9的生理生化、细胞化学组分和16S rRNA基因序列等进行了检测,研究其生物学特性及分类,并对分离提纯的发酵产物进行紫外和红外分析。基于生理生化、细胞化学组分及16S rRNA基因序列等分析结果,产絮菌A9被鉴定为类芽孢杆菌属内的新种。紫外扫描和红外检测等结果表明,产絮菌A9所产絮凝剂的主要成分为多糖类物质,并且吸附架桥是其产生絮凝作用的主要机理。对产絮菌A9生物学特性和絮凝成分的研究,有助于系统的了解产絮菌A9的表型、遗传型、系统发育及其所产絮凝剂的性质,为后续研究产絮菌A9的基因组及絮凝剂合成途径等奠定基础。采用Illumina测序技术对产絮菌A9的DNA进行paired-end测序,研究产絮菌A9基因组、胞外多糖合成相关的功能基因及其代谢途径,并使用分子生物学技术,进行了产絮菌A9胞外多糖合成相关基因的克隆和异源表达。获得产絮菌A9的基因组序列由92个contigs组成,可以组装到67个scaffolds中。应用Glimmer软件成功预测4932个基因,其中有4284个（86.9%）与NCBI-Nr数据库比对到相似序列,共有1,689个蛋白注释到COG家族。通过blastp基于KEGG数据库的功能注释与代谢路径分析,预测了 165条代谢通路,包含糖酵解途径、三羧酸循环、戊糖磷酸途径等产能代谢途径。根据基因组测序分析结果,解析了产絮菌A9在以葡萄糖为碳源时的胞外多糖合成途径,产絮菌A9胞外多糖包含葡萄糖、半乳糖、葡萄糖醛酸、N-乙酰氨基葡萄糖和甘露糖,结果和此前的研究结论一致。参与胞外多糖合成的相关酶包括磷酸葡萄糖变位酶、UDP-葡萄糖焦磷酸化酶、UDP-葡萄糖脱氢酶等。产絮菌A9的全基因组扫描测序为了解其基因组信息和代谢通路,研究其所产絮凝剂胞外多糖的合成途径和功能基因等提供数据支持。产絮菌A9胞外多糖合成相关基因的克隆和异源表达,为研究产絮菌胞外多糖合成基因的特性和功能,以及后续利用其胞外多糖合成基因构建高效微生物絮凝剂工程菌等提供借鉴。利用RNA-Seq技术进行菌株A9转录组测序,研究产絮菌A9在不同碳源培养条件下的转录表达差异。基因表达差异（发酵vs普通）分析表明,表达差异显着的基因有70个。通过转录组分析表明:相对于普通培养基,在葡萄糖培养基的培养条件下,很多糖类合成及代谢的基因都上调表达。产絮菌A9在不同碳源培养条件下的转录组测序及差异表达基因分析,为从RNA水平研究产絮菌的产絮机理,及其合成微生物絮凝剂胞外多糖的代谢调控等提供数据支持。通过蛋白质双向电泳和质谱鉴定技术,对产絮菌A9在普通培养基、葡萄糖培养基和甘露糖培养基培养条件下的蛋白质组进行了分离和检测,研究产絮菌A9在不同碳源培养条件下蛋白质组表达差异。胶图分析结果表明:产絮菌A9在不同碳源培养条件下蛋白质表达有较大差异。通过质谱分析,共有个54蛋白被成功鉴定,包括二氢硫辛酸脱氢酶、磷酸丙糖异构酶、果糖-1,6-二磷酸酶等。这些差异蛋白的功能主要与能量产生和转化,以及碳水化合物的转运和代谢等有关。产絮菌A9在不同碳源培养条件下差异表达蛋白的鉴定分析,为从蛋白质水平研究产絮菌的产絮机理,全面解析和调控产絮菌代谢途径,具有重要的指导意义。在产絮菌A9转录组和蛋白质组检测分析的基础上,通过培养实验,进行产絮菌A9生产微生物絮凝剂胞外多糖的调控研究。建立起培养条件,差异表达基因及蛋白质和产絮变化之间的关系,对工业上生产微生物絮凝剂提出了菌种复壮、底物水平调控、发酵过程参数优化三个层面的调控策略。
曾乐,杨光,郑雄敏,杨希[9]（2015）在《陶瓷膜分离技术在D-核糖发酵液预处理过程中的应用》文中认为为研究陶瓷膜分离技术在D-核糖发酵液预处理工艺中的应用,采用陶瓷膜系统对D-核糖发酵液进行预处理,从时间、温度、顶洗水量以及不同过滤方式综合考察对发酵液膜通量与产品收率的影响。结果表明:D-核糖发酵液在陶瓷膜分离过程中,膜通量呈现前期递减、中期稳定、后期递减现象;膜分离通量在4555℃显着提升;膜分离在顶洗水倍数达到0.5倍后,提取收率趋于稳定;陶瓷膜分离技术较之板框、转鼓过滤在D-核糖发酵液预处理过程中其产品收率高达96%以上。综上结果,陶瓷膜分离技术可以高效地截留发酵液中的菌体、大颗粒蛋白及杂质,使后续的分离纯化工序顺利进行,从而提高D-核糖提取收率。
林振泉[10]（2015）在《重组大肠杆菌生产核黄素和β-胡萝卜素的途径构建与改造》文中研究说明本研究通过核黄素合成途径的构建,中心碳代谢的改造及发酵条件的优化的策略,研究了大肠杆菌生产核黄素的代谢能力;其次,利用基于CRISPR/Cas9系统的基因组编辑技术,在大肠杆菌的基因组上整合β-胡萝卜素合成基因,对MEP途径、中心碳代谢途径进行组合改造,获得高产β-胡萝卜素的工程菌。首先,考察大肠杆菌自身核黄素合成基因在不同拷贝数质粒中表达对核黄素产量的影响,并与枯草芽孢杆菌核黄素合成基因比较。通过发酵验证,发现大肠杆菌自身核黄素合成基因在高拷贝质粒过表达更有利于核黄素的积累。5-磷酸核酮糖是核黄素合成的重要前体物。为了提高5-磷酸核酮糖的供给,本文对氧化磷酸戊糖途径、糖酵解途径以及ED途径（Entner-Doudoroff Pathway）进行了系统地研究。研究发现,过表达来源于谷氨酸棒杆菌的突变型zwf243和gnd361基因不能有效的提高核黄素产量;进一步过表达大肠杆菌内源pgl基因能够进一步提高核黄素的产量;敲除糖酵解途径中pgi基因构建RF02S,使得核黄素的产量提高了72.4%,进一步失活ED途径使得核黄素的产量提高41.8%;过表达acs基因能够有效的降低副产物乙酸的积累,对核黄素的产量没有明显的影响。最终获得工程菌RF05S在以10g/L葡萄糖为底物的LB培养基中能够积累585.2±13.6mg/L核黄素。为了防止过多的核黄素转化为FMN和FAD,在不影响菌体生长的情况下提高核黄素的产量,通过对催化该反应的酶基因ribF的RBS强度进行微调。获得工程菌RF05S-M40的核黄素激酶活性是出发菌株的64.8%,核黄素的产量达到1019.6±25.3mg/L。考察RF05S-M40在不同的发酵条件及发酵培养基对核黄素产量的影响。利用优化的培养基,RF05S-M40能够积累2702.8±89.9 mg/L得率137.5 mg/g glucose,是迄今为止报道的核黄素得率最高工程菌株。本文第二部分利用CRISPR/Cas9系统介导的基因组编辑技术,将β-胡萝卜素合成基因整合到基因组上,对MEP途径进行组合调控以增强IPP和DMAPP的合成,获得工程菌ZF43能够积累21.45±0.46mg/Lβ-胡萝卜素。G3P和Pyr是MEP途径的直接前体物,NADPH是β-胡萝卜素合成的重要辅因子。为了提高这些代谢物的供给,对中心碳代谢、MEP途径及β-胡萝卜素合成途径进行组合优化,获得高产β-胡萝卜素的工程菌ZF237T,高密度发酵能够获得2.02g/Lβ-胡萝卜素。首次在大肠杆菌中将CRISPR/Cas9系统成功的应用于代谢工程改造,并获得高产菌种。
二、代谢工程在D-核糖生产中研究现状及应用前景（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、代谢工程在D-核糖生产中研究现状及应用前景（论文提纲范文）
（1）代谢调控谷氨酸棒杆菌合成乙酰氨基葡萄糖（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词注释表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 N-乙酰氨基葡萄糖概述 |
| 1.1.1 N-乙酰氨基葡萄糖的性质 |
| 1.1.2 N-乙酰氨基葡萄糖的功能与应用 |
| 1.1.3 N-乙酰氨基葡萄糖的生产 |
| 1.2 谷氨酸棒杆菌概述 |
| 1.2.1 谷氨酸棒杆菌的特性与运用 |
| 1.2.2 谷氨酸棒杆菌GlcNAc代谢途径分析 |
| 1.3 微生物细胞工厂的产物合成途径优化策略 |
| 1.3.1 表达元器件工程 |
| 1.3.2 模块化工程 |
| 1.3.3 基因组规模代谢网络模型 |
| 1.3.4 系统代谢工程 |
| 1.3.5 蛋白质工程 |
| 1.3.6 全局性转录调控工程 |
| 1.3.7 辅因子工程 |
| 1.4 本论文的立题依据及主要研究内容 |
| 1.4.1 立题依据和研究意义 |
| 1.4.2 本论文主要研究内容 |
| 第二章 重组谷氨酸棒杆菌生产N-乙酰氨基葡萄糖平台菌株的构建 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 菌株、质粒与培养条件 |
| 2.2.2 分子生物学操作 |
| 2.2.3 重组质粒构建 |
| 2.2.4 基因组测序 |
| 2.2.5 m RNA稳定序列调控Gna1的表达 |
| 2.2.6 敲除GlcNAc胞内降解途径基因及乳酸、乙酸合成基因 |
| 2.2.7 关键酶GlmS的优化表达 |
| 2.2.8 工程菌株的摇瓶发酵 |
| 2.2.9 50-L罐补料分批发酵 |
| 2.2.10 分析方法 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 谷氨酸棒杆菌GlcNAc生产菌株的选择 |
| 2.3.2 谷氨酸棒杆菌S9114基因组分析 |
| 2.3.3 优化表达关键酶Gna1对GlcNAc合成的影响 |
| 2.3.4 阻断GlcNAc降解途径以及副产物乳酸与乙酸合成途径对GlcNAc合成的影响 |
| 2.3.5 优化表达关键酶GlmS对 GlcNAc合成的影响 |
| 2.3.6 重组工程菌在50-L发酵罐中补料分批发酵 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 谷氨酸棒杆菌单碱基编辑系统与基因干扰系统的构建 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 菌株、质粒与培养条件 |
| 3.2.2 重组质粒构建 |
| 3.2.3 谷氨酸棒杆菌单碱基编辑系统的运用 |
| 3.2.4 谷氨酸棒杆菌单基因干扰系统的构建 |
| 3.2.5 谷氨酸棒杆菌多基因干扰系统的构建 |
| 3.2.6 50-L罐补料分批发酵 |
| 3.2.7 分析方法 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 基于腺苷脱氨酶的单碱基编辑系统的构建 |
| 3.3.2 不同启动子的单碱基编辑效率验证 |
| 3.3.3 基于胞嘧啶脱氨酶-腺苷脱氨酶双重单碱基编辑系统的构建 |
| 3.3.4 单碱基编辑工具的运用 |
| 3.3.5 单基因干扰系统抑制单基因的表达 |
| 3.3.6 多基因干扰系统抑制多基因的表达 |
| 3.3.7 重组工程菌在50-L发酵罐中补料分批发酵 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 中心碳代谢与氮代谢优化促进谷氨酸棒杆菌合成N-乙酰氨基葡萄糖 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 菌株、质粒与培养条件 |
| 4.2.2 全局性碳代谢调控转录因子表达菌株的构建 |
| 4.2.3 转录因子RamA突变体文库的构建与筛选 |
| 4.2.4 转录组学分析 |
| 4.2.5 转录因子与glmS基因上游DNA结合位点结合能力的定量分析 |
| 4.2.6 CRISPR-dCpf1基因干扰系统抑制GlcNAc合成负转录调控因子的表达 |
| 4.2.7 qRT-PCR检测关键基因转录水平 |
| 4.2.8 50-L罐补料分批发酵 |
| 4.2.9 分析方法 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 表达不同碳代谢调控转录因子对GlcNAc合成的影响 |
| 4.3.2 RamA转录因子的结构域功能分析以及突变体文库的构建与筛选 |
| 4.3.3 转录组分析RamA/RamAM对谷氨酸棒杆菌S9114代谢途径的影响 |
| 4.3.4 等温滴定量热法测定转录因子和目标基因上游DNA结合位点的亲和力 |
| 4.3.5 抑制GlcNAc 合成负转录调控因子的表达对GlcNAc 合成的影响 |
| 4.3.6 重组工程菌在50-L发酵罐中补料分批发酵 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 辅因子工程平衡胞内还原力代谢促进N-乙酰氨基葡萄糖积累 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 菌株、质粒与培养条件 |
| 5.2.2 NADH氧化酶的整合表达 |
| 5.2.3 GlcNAc合成途径NADP~+依赖型酶的同源建模与理性设计 |
| 5.2.4 定点突变工程菌株的构建与摇瓶发酵验证 |
| 5.2.5 酶动力学参数的测定 |
| 5.2.6 50-L罐补料分批发酵 |
| 5.2.7 分析方法 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 验证GlcNAc生产菌株在发酵过程中是否会在胞内积累NADH |
| 5.3.2 整合表达NADH氧化酶对菌株GlcNAc合成能力的影响 |
| 5.3.3 理性设计与改造NAD~+依赖型甘油醛-3-磷酸脱氢酶 |
| 5.3.4 理性设计与改造NAD~+依赖型苹果酸脱氢酶 |
| 5.3.5 酶动力学参数分析 |
| 5.3.6 重组工程菌在50-L发酵罐中补料分批发酵 |
| 5.4 本章小结 |
| 主要结论与展望 |
| 主要结论 |
| 展望 |
| 论文创新点 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录:作者在攻读博士学位期间发表的论文及专利 |
（2）枯草芽孢杆菌生产核黄素的体内外代谢工程改造及环保生产工艺的建立优化（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 核黄素的性质与合成 |
| 1.1.1 核黄素的理化性质与应用 |
| 1.1.2 核黄素合成方法 |
| 1.2 枯草芽孢杆菌生物合成核黄素的研究现状 |
| 1.2.1 枯草芽孢杆菌数据库和编辑工具 |
| 1.2.2 枯草芽孢杆菌合成核黄素的代谢调控策略 |
| 1.2.3 枯草芽孢杆菌合成核黄素的发酵调控策略 |
| 1.3 碳源代谢与核黄素生物合成的关系 |
| 1.3.1 葡萄糖代谢与核黄素生物合成的关系 |
| 1.3.2 戊糖代谢与核黄素生物合成的关系 |
| 1.3.3 葡萄糖酸代谢与核黄素生物合成的关系 |
| 1.4 发酵菌体和废水的回收利用 |
| 1.4.1 常见的发酵废菌体回收利用方式 |
| 1.4.2 常见的发酵废水回收利用方式 |
| 1.5 核黄素工业生产的挑战与前景 |
| 1.6 本课题的研究目的、意义和内容 |
| 1.6.1 本课题的研究目的及意义 |
| 1.6.2 本课题的研究内容 |
| 第2章 枯草芽孢杆菌产核黄素的多参数分析及发酵调控优化 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 实验菌株 |
| 2.2.2 实验试剂及仪器 |
| 2.2.3 培养基 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 菌体的培养 |
| 2.3.2 发酵实验 |
| 2.3.3 菌体浓度测定 |
| 2.3.4 核黄素浓度测定 |
| 2.3.5 葡萄糖浓度测定 |
| 2.3.6 氨基氮测定 |
| 2.3.7 溶磷测定 |
| 2.3.8 尾气分析 |
| 2.3.9 发酵参数相关性分析实验 |
| 2.3.10 pH调控工艺调整降低无机氮源浓度实验 |
| 2.3.11 降低底料培养基中有机氮源浓度实验 |
| 2.3.12 降低补料培养基中有机氮源浓度实验 |
| 2.3.13 实验重复次数及实验数据处理方式 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 核黄素发酵过程中基本参数特征 |
| 2.4.2 核黄素4个发酵阶段及其特征 |
| 2.4.3 发酵调控氨基氮浓度对核黄素合成的影响 |
| 2.5 本章小结 |
| 第3章 体内外代谢工程改造提高PP途径代谢通量 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 实验菌株、质粒及引物 |
| 3.2.2 实验仪器及试剂 |
| 3.2.3 培养基 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 枯草芽孢杆菌菌体的培养 |
| 3.3.2 发酵实验 |
| 3.3.3 菌体浓度、核黄素浓度和葡萄糖浓度测定 |
| 3.3.4 葡萄糖酸钠浓度测定 |
| 3.3.5 质粒构建 |
| 3.3.6 体外酶促转化葡萄糖为葡萄糖酸实验 |
| 3.3.7 葡萄糖和葡萄糖酸钠共代谢实验 |
| 3.3.8 葡萄糖酸钠代谢速率探究实验 |
| 3.3.9 改造菌株摇瓶验证实验 |
| 3.3.10 改造菌株发酵罐验证实验 |
| 3.3.11 实验重复次数及实验数据处理方式 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 体外酶促转化葡萄糖为葡萄糖酸合成核黄素 |
| 3.4.2 葡萄糖酸钠和葡萄糖共代谢合成核黄素 |
| 3.4.3 菌体利用葡萄糖酸钠速率对核黄素合成的影响 |
| 3.4.4 葡萄糖酸钠代谢途径强化菌株构建 |
| 3.4.5 改造菌株摇瓶验证实验 |
| 3.4.6 改造菌株发酵罐验证实验 |
| 3.5 本章小结 |
| 第4章 发酵菌体和发酵废水回收利用绿色工艺 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 实验菌株 |
| 4.2.2 培养基及实验试剂 |
| 4.2.3 实验仪器 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 发酵后处理以及发酵废菌体和废水的获得 |
| 4.3.2 菌体处理及回用 |
| 4.3.3 废水回收 |
| 4.3.4 实验重复次数及实验数据处理方式 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 发酵结束后菌体营养成分分析 |
| 4.4.2 发酵菌体回用对核黄素生产的影响 |
| 4.4.3 发酵废水回用对核黄素生产的影响 |
| 4.5 本章小节 |
| 第5章 总结与展望 |
| 5.1 总结 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 硕士期间发表论文情况 |
（3）氨基酸生产的代谢工程研究进展与发展趋势（论文提纲范文）
| 1 代谢工程育种 |
| 1.1 基于理性设计的正向代谢工程 |
| 1.2 基于组学分析与计算机模拟的代谢工程 |
| 1.3 进化代谢工程 |
| 2 大宗氨基酸代谢工程育种 |
| 2.1 L-谷氨酸的代谢工程育种 |
| 2.2 L-赖氨酸的代谢工程育种 |
| 2.3 L-苏氨酸的代谢工程育种 |
| 3 分支链氨基酸代谢工程育种 |
| 3.1 分支链氨基酸育种策略 |
| 3.2 L-亮氨酸的代谢工程育种 |
| 4 芳香族氨基酸代谢工程育种 |
| 4.1 芳香族氨基酸育种策略 |
| 4.2 L-色氨酸的代谢工程育种 |
| 5 其他氨基酸代谢工程育种 |
| 6 氨基酸代谢工程育种的发展趋势 |
（4）改造热葡糖苷酶地芽孢杆菌高效生产核黄素（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 核黄素简介 |
| 1.1.1 核黄素性质与功能 |
| 1.1.2 核黄素的生产方法及面临的问题 |
| 1.1.3 核黄素生物合成途径及其代谢调控 |
| 1.2 产核黄素微生物的代谢工程策略 |
| 1.2.1 枯草芽孢杆菌生产核黄素的代谢工程策略 |
| 1.2.2 阿舒氏棉囊酵母(Ashby gossypii的高产菌株策略 |
| 1.3 热葡糖苷酶地芽孢杆菌的研究现状 |
| 1.3.1 热葡糖苷酶地芽孢杆菌特性、系统发育和基因组分析 |
| 1.3.2 热葡糖苷酶地芽孢杆菌发酵的优点 |
| 1.3.3 热葡糖苷酶地芽孢杆菌的遗传操作工具 |
| 1.4 本论文的立题依据、研究内容、目标和意义 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株、质粒和引物 |
| 2.1.2 仪器与试剂 |
| 2.1.3 培养基 |
| 2.1.4 缓冲液 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 分子生物学技术 |
| 2.2.2 微生物的培养与发酵 |
| 2.3 数据处理与统计 |
| 第3章 热葡糖苷酶地芽孢杆菌遗传操作方法改进 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 结果与讨论 |
| 3.2.1 sfGFP是可用的筛选标记 |
| 3.2.2 开发一种便捷DNA编辑方法 |
| 3.3 小结 |
| 第4章 热葡糖苷酶地芽孢杆菌工程改造生产核黄素 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 结果与讨论 |
| 4.2.1 热葡糖苷酶地芽孢杆菌可以作为核黄素生产的高温宿主。 |
| 4.2.2 减少核黄素的细胞消耗 |
| 4.2.3 操纵嘌呤途径以增加前体供应 |
| 4.2.4 CcpN_(Gtg)的缺失可调节中心碳代谢 |
| 4.2.5 消除碳代谢中的主要竞争途径 |
| 4.3 小结 |
| 第5章 总结与展望 |
| 5.1 总结 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士期间发表的学术论文与研究成果 |
| 附录 |
（5）代谢工程改造酿酒酵母生产酪醇及红景天苷的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词 |
| 第一章 研究背景及意义 |
| 1.1 酿酒酵母作为底盘细胞合成天然产物 |
| 1.1.1 酿酒酵母作为微生物细胞工厂的应用 |
| 1.1.2 酿酒酵母中芳香类化合物的生物合成 |
| 1.2 酪醇及其衍生物的研究现状 |
| 1.2.1 酪醇及其衍生物的应用 |
| 1.2.2 酪醇及其衍生物的生产工艺 |
| 1.2.3 酪醇及红景天苷的生物合成途径及研究进展 |
| 1.3 研究内容、思路及意义 |
| 1.3.1 本文的研究内容 |
| 1.3.2 研究思路 |
| 1.3.3 研究意义 |
| 第二章 改造酿酒酵母中心碳代谢途径生产酪醇 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 主要实验材料及耗材 |
| 2.2.2 主要试剂、溶剂及缓冲液 |
| 2.2.3 主要仪器设备 |
| 2.2.4 培养基及培养条件 |
| 2.2.5 质粒、菌株和引物 |
| 2.2.6 实验方法及步骤 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 酿酒酵母Ehrlich途径的重构 |
| 2.3.2 改造酿酒酵母乙醇分支途径提高酪醇产量 |
| 2.3.3 改造酿酒酵母分支酸代谢途径提高酪醇产量 |
| 2.3.4 酿酒酵母工业菌株单倍体的分离及鉴定 |
| 2.3.5 高产酪醇的酿酒酵母工业菌株的构建 |
| 2.3.6 改造酿酒酵母PP途径对酪醇生物合成的影响 |
| 2.3.7 PP途径和Xfpk途径的热动力学参数的比较和分析 |
| 2.3.8 在酿酒酵母中导入Xfpk途径以提高酪醇产量 |
| 2.3.9 葡萄糖补料分批发酵生产酪醇 |
| 2.3.10 减轻来源于Xfpk途径的AcP对酿酒酵母的影响 |
| 2.3.11 改造莽草酸途径提高酪醇产量 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 酿酒酵母中红景天苷的生物合成 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 主要实验材料及耗材 |
| 3.2.2 主要试剂、溶剂及缓冲液 |
| 3.2.3 主要仪器设备 |
| 3.2.4 培养基及培养条件 |
| 3.2.5 菌株、质粒和引物 |
| 3.2.6 实验方法及步骤 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 红景天苷生物合成酿酒酵母工程菌株的构建 |
| 3.3.2 葡萄糖补料分批发酵高产红景天苷 |
| 3.4 本章小结 |
| 附录 |
| 附录1 紫色红曲霉的桔霉素生物合成研究 |
| 附录2 冠突曲霉的遗传操作体系的建立及次级代谢研究初探 |
| 全文总结与展望 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间已(待)发表的学术论文 |
| 致谢 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（6）丁酸梭菌的产氢影响因素及其代谢特性的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 主要缩略语 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 厌氧发酵制氢技术 |
| 1.2.1 厌氧发酵产氢途径 |
| 1.2.2 混合菌群产氢 |
| 1.2.3 纯菌种产氢 |
| 1.3 丁酸梭菌发酵制氢 |
| 1.3.1 丁酸梭菌发酵产氢代谢类型 |
| 1.3.2 丁酸梭菌发酵产氢影响因素 |
| 1.4 代谢组学在生物制氢研究中的应用 |
| 1.4.1 代谢组学 |
| 1.4.2 代谢组学在生物制氢技术中的研究进展 |
| 1.5 课题背景 |
| 1.5.1 课题目的及意义 |
| 1.5.2 课题主要研究内容 |
| 第2章 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料、仪器及反应装置 |
| 2.1.1 实验菌种 |
| 2.1.2 实验药品 |
| 2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.1.4 实验装置 |
| 2.1.5 培养基 |
| 2.2 化学分析项目 |
| 2.2.1 产气量的测定 |
| 2.2.2 氢气含量的测定 |
| 2.2.3 培养液pH值的测定 |
| 2.2.4 菌体细胞干重的测定 |
| 2.2.5 比产氢率的计算 |
| 2.3 厌氧发酵产氢细菌的分离和筛选 |
| 2.3.1 样品采集 |
| 2.3.2 富集培养 |
| 2.3.3 分离纯化 |
| 2.3.4 菌种筛选 |
| 2.3.5 厌氧培养基配制方法 |
| 2.3.6 菌种保存 |
| 2.4 菌种鉴定 |
| 2.4.1 菌株的菌落形态观察 |
| 2.4.2 菌株的染色鉴定 |
| 2.4.3 菌株的扫描电子显微镜观察 |
| 2.4.4 菌株的分子生物学鉴定 |
| 2.5 产氢影响因素实验设置 |
| 2.6 代谢组学分析 |
| 2.6.1 样品制备 |
| 2.6.2 实验前处理 |
| 2.6.3 气相色谱-质谱分析条件 |
| 2.6.4 数据处理及分析 |
| 第3章 厌氧发酵产氢细菌的筛选与鉴定 |
| 3.1 菌株的分离和筛选 |
| 3.2 菌株的形态学观察 |
| 3.3 菌株的分子生物学鉴定 |
| 3.3.1 16SrDNA基因扩增 |
| 3.3.2 16SrDNA基因序列分析 |
| 3.3.3 基于16S r DNA序列的系统发育树 |
| 3.4 丁酸梭菌YM-83 的生长特性 |
| 3.5 本章小结 |
| 第4章 丁酸梭菌YM-83 产氢的影响因素分析 |
| 4.1 温度对YM-83 菌株生长和产氢的影响 |
| 4.1.1 温度对YM-83 菌株产氢的影响 |
| 4.1.2 温度对YM-83 菌株生长的影响 |
| 4.1.3 温度对YM-83 菌株培养液pH值的影响 |
| 4.2 初始pH对 YM-83 菌株生长和产氢的影响 |
| 4.2.1 初始pH对 YM-83 菌株产氢的影响 |
| 4.2.2 初始pH对 YM-83 菌株生长的影响 |
| 4.2.3 初始pH对 YM-83 菌株培养液pH值的影响 |
| 4.3 葡萄糖浓度对YM-83 菌株生长和产氢的影响 |
| 4.3.1 葡萄糖浓度对YM-83 菌株产氢的影响 |
| 4.3.2 葡萄糖浓度对YM-83 菌株生长的影响 |
| 4.3.3 葡萄糖浓度对YM-83 菌株培养液pH值的影响 |
| 4.4 L-cys对 YM-83 菌株生长和产氢的影响 |
| 4.4.1 L-cys浓度对YM-83 菌株产氢的影响 |
| 4.4.2 L-cys浓度对YM-83 菌株生长的影响 |
| 4.4.3 L-cys浓度对YM-83 菌株培养液pH值的影响 |
| 4.5 Mg~(2+)对YM-83 菌株生长和产氢的影响 |
| 4.5.1 Mg~(2+)浓度对YM-83 菌株产氢的影响 |
| 4.5.2 Mg~(2+)浓度对YM-83 菌株生长的影响 |
| 4.5.3 Mg~(2+)浓度对YM-83 菌株培养液pH值的影响 |
| 4.6 铁元素对YM-83 菌株生长和产氢的影响 |
| 4.6.1 铁元素类型对YM-83 菌株产氢的影响 |
| 4.6.2 铁元素类型对YM-83 菌株生长的影响 |
| 4.6.3 铁元素类型对YM-83 菌株培养液pH值的影响 |
| 4.7 Fe~(2+)对YM-83 菌株生长和产氢的影响 |
| 4.7.1 Fe~(2+)浓度对YM-83 菌株产氢的影响 |
| 4.7.2 Fe~(2+)浓度对YM-83 菌株生长的影响 |
| 4.7.3 Fe~(2+)浓度对YM-83 菌株培养液pH值的影响 |
| 4.8 本章小结 |
| 第5章 丁酸梭菌YM-83 代谢组学分析 |
| 5.1 研究对象选择 |
| 5.2 样品质控 |
| 5.3 样品的主成分分析 |
| 5.4 样品的正交偏最小二乘方-判别分析 |
| 5.5 差异代谢物的筛选 |
| 5.6 差异代谢物的聚类分析 |
| 5.7 KEGG代谢途径分析 |
| 5.8 初始pH对丁酸梭菌YM-83 产氢代谢的影响 |
| 5.9 本章小结 |
| 第6章 结论与展望 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 QC、pH6.5和pH7.5 样本代谢总离子流图 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
（7）D-核糖的研究进展（论文提纲范文）
| 1 D-核糖的生产技术研究进展 |
| 1.1 抽取法 |
| 1.2 化学合成法 |
| 1.3 生物发酵法 |
| 1.3.1 野生菌生产D-核糖 |
| 1.3.2 突变菌株生产D-核糖 |
| 1.3.3 基因工程菌生产D-核糖 |
| 2 国内外D-核糖研究及工艺化动态 |
| 2.1 国外D-核糖研究及工业化生产动态 |
| 2.2 国内D-核糖研究及工业化生产动态 |
| 3 D-核糖的应用进展 |
| 3.1 在食品领域的应用 |
| 3.2 在医药领域的应用 |
| 3.3 在其他领域的应用 |
| 4 D-核糖的发展前景 |
（8）一株高效产絮菌的基因组测序及胞外多糖合成组学研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 微生物絮凝剂概述 |
| 1.1.1 微生物絮凝剂的种类 |
| 1.1.2 絮凝剂产生菌 |
| 1.1.3 絮凝机理 |
| 1.1.4 影响絮凝剂产生的因素 |
| 1.1.5 影响絮凝效率的因素 |
| 1.1.6 微生物絮凝剂的研究应用现状 |
| 1.2 细菌胞外多糖概述 |
| 1.2.1 细菌胞外多糖的分类 |
| 1.2.2 细菌胞外多糖的结构 |
| 1.2.3 细菌胞外多糖的生理功能 |
| 1.2.4 细菌胞外多糖的应用 |
| 1.2.5 细菌胞外多糖的合成 |
| 1.3 新兴组学研究进展 |
| 1.3.1 全基因组测序 |
| 1.3.2 基因组学 |
| 1.3.3 转录组学 |
| 1.3.4 蛋白质组学 |
| 1.3.5 代谢组学 |
| 1.4 研究目的和意义 |
| 1.5 本研究主要内容 |
| 1.6 创新点 |
| 第2章 试验材料与方法 |
| 2.1 实验菌株及培养条件 |
| 2.2 主要试剂及实验仪器 |
| 2.2.1 主要化学试剂 |
| 2.2.2 主要生化试剂 |
| 2.2.3 引物及测序分析 |
| 2.2.4 试剂盒 |
| 2.2.5 主要仪器设备 |
| 2.3 菌株产絮凝剂的培养条件优化 |
| 2.3.1 培养条件优化实验 |
| 2.3.2 絮凝率测定方法 |
| 2.4 产絮菌A9生物学特性分析方法 |
| 2.4.1 菌株形态及生理生化分析 |
| 2.4.2 菌株细胞化学组分分析 |
| 2.4.3 16S rRNA基因序列分析 |
| 2.4.4 发酵产物的分离鉴定 |
| 2.5 基因组测序方法 |
| 2.5.1 培养方法 |
| 2.5.2 文库构建 |
| 2.5.3 桥式PCR |
| 2.5.4 Illumina测序 |
| 2.5.5 生物信息分析 |
| 2.5.6 质量剪切步骤 |
| 2.6 转录组测序方法 |
| 2.6.1 培养方法 |
| 2.6.2 总RNA提取步骤 |
| 2.6.3 RNA纯度及浓度检测 |
| 2.6.4 实验步骤 |
| 2.6.5 信息分析流程 |
| 2.7 差异表达蛋白分析方法 |
| 2.7.1 菌株培养方法 |
| 2.7.2 蛋白质的提取 |
| 2.7.3 蛋白质的双向电泳 |
| 2.7.4 双向电泳胶图分析和质谱鉴定 |
| 2.8 核酸纯化及克隆 |
| 2.8.1 基因组DNA提取 |
| 2.8.2 PCR产物纯化 |
| 2.8.3 小量质粒提取 |
| 2.8.4 DNA酶切 |
| 2.8.5 载体与目的片段连接 |
| 2.8.6 大肠杆菌热激转化 |
| 第3章 产絮菌A9的生物学特性及基因组测序 |
| 3.1 产絮菌A9生物学特性 |
| 3.1.1 形态学特征 |
| 3.1.2 生理生化特征 |
| 3.1.3 培养条件优化 |
| 3.1.4 细胞化学组分 |
| 3.1.5 (G+C)含量和DNA同源性分析 |
| 3.1.6 16S rRNA基因序列分析 |
| 3.2 絮凝成分及机理分析 |
| 3.2.1 絮凝成分分析 |
| 3.2.2 絮凝机理分析 |
| 3.3 产絮菌A9基因组测序 |
| 3.3.1 基因组测序数据统计 |
| 3.3.2 基因组拼接 |
| 3.3.3 基因注释 |
| 3.4 产絮菌A9胞外多糖合成途径研究 |
| 3.4.1 产絮菌A9胞外多糖合成过程 |
| 3.4.2 胞外多糖合成相关基因的克隆和异源表达 |
| 3.5 小结 |
| 第4章 产絮菌产絮过程表达差异及生产调控研究 |
| 4.1 不同培养条件下产絮菌A9转录组表达差异分析 |
| 4.1.1 转录组测序数据统计 |
| 4.1.2 与参考基因组比对 |
| 4.1.3 表达量统计及表达差异分析 |
| 4.1.4 基因注释 |
| 4.1.5 产絮菌A9在不同培养条件下差异基因分析 |
| 4.2 不同培养条件下产絮菌A9差异表达蛋白分析 |
| 4.2.1 碳源对菌株产生絮凝剂的影响 |
| 4.2.2 胶图分析结果 |
| 4.2.3 质谱鉴定结果 |
| 4.2.4 差异蛋白质功能分析 |
| 4.3 微生物絮凝剂生产调控研究 |
| 4.3.1 菌种复壮调控方法 |
| 4.3.2 底物水平调控方法 |
| 4.3.3 发酵工艺参数调控方法 |
| 4.3.4 产絮菌胞外多糖合成的代谢工程 |
| 4.4 小结 |
| 第5章 结论 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表的论着、获奖情况 |
| 附录 英文缩略词 |
（9）陶瓷膜分离技术在D-核糖发酵液预处理过程中的应用（论文提纲范文）
| 1材料与方法 |
| 1.1材料与试剂 |
| 1.2仪器与设备 |
| 1.3实验方法 |
| 1.3.1发酵液分离制备 |
| 1.3.2对照实验 |
| 1.3.3D-核糖含量的测定 |
| 1.3.4样品溶液的制备 |
| 1.3.5标准品溶液的制备 |
| 2结果与分析 |
| 2.1陶瓷膜对D-核糖发酵料液渗透性实验 |
| 2.2温度对陶瓷膜通量的影响 |
| 2.3陶瓷膜过滤加水顶洗量对产品收率的影响 |
| 2.4不同预处理方式对产品收率的影响 |
| 2.5陶瓷膜的清洗及膜通量的恢复 |
| 3结论 |
（10）重组大肠杆菌生产核黄素和β-胡萝卜素的途径构建与改造（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 核黄素的概述 |
| 1.2.1 核黄素的理化性质、功能、用途及市场需求 |
| 1.2.2 核黄素的合成 |
| 1.2.3 核黄素生物合成途径及其代谢调节机制 |
| 1.2.4 产核黄素菌株构建的国内外现状 |
| 1.3 β-胡萝卜素的概述 |
| 1.3.1 β-胡萝卜素的理化性质、功能和用途 |
| 1.3.2 β-胡萝卜素合成途径 |
| 1.3.3 E.coli β-胡萝卜素生物合成研究进展 |
| 1.4 大肠杆菌基因组无痕重组技术及策略 |
| 1.4.1 λ-Red重组系统 |
| 1.4.2 归巢核酸内切酶 |
| 1.4.3 成簇间隔短回文重复(CRISPR)编辑系统 |
| 1.5 选题背景及研究内容 |
| 1.5.1 大肠杆菌核黄素产核黄素菌株的构建 |
| 1.5.2 大肠杆菌产β-胡萝卜素的构建 |
| 第二章 核黄素操纵子的构建和比较 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株与质粒 |
| 2.1.2 实验仪器 |
| 2.1.3 实验试剂 |
| 2.1.4 培养基 |
| 2.1.5 溶液 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 大肠杆菌CaCl_2转化法感受态细胞的制备与转化 |
| 2.2.2 大肠杆菌电转化感受态的制备和电转化 |
| 2.2.3 基因组DNA的提取 |
| 2.2.4 大肠杆菌质粒DNA的提取 |
| 2.2.5 DNA片段的PCR扩增 |
| 2.2.6 琼脂糖凝胶电泳 |
| 2.2.7 DNA片段的回收和纯化 |
| 2.2.8 DNA片段的酶切和连接 |
| 2.2.9 菌落PCR验证 |
| 2.2.10 菌体培养与发酵 |
| 2.2.11 发酵液菌体浓度和葡萄糖的测定 |
| 2.2.12 发酵液中核黄素的测定 |
| 2.2.13 蛋白浓度测定 |
| 2.2.14 细胞粗酶液的制备 |
| 2.2.15 GTP环水解酶Ⅱ酶活力测定 |
| 2.2.16 核黄素合成酶酶活力测定 |
| 2.3 实验结果与讨论 |
| 2.3.1 大肠杆菌自身核黄素合成途径的重构 |
| 2.3.2 枯草芽孢杆菌核黄素操纵子的克隆 |
| 2.3.3 枯草芽孢杆菌核黄素操纵子的重构 |
| 2.3.4 系列工程菌株核黄素产量表征 |
| 2.3.5 GTP环水解酶Ⅱ酶和核黄素合成酶活力测定 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 产核黄素大肠杆菌中心碳代谢途径的代谢工程改造 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 菌种和质粒 |
| 3.1.2 实验仪器 |
| 3.1.3 实验试剂 |
| 3.1.4 培养基 |
| 3.1.5 溶液 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 Circular polymerase extension cloning |
| 3.2.2 6-磷酸葡萄糖脱氢酶酶活力测定 |
| 3.2.3 6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶酶活力测定 |
| 3.2.4 Real-Time荧光定量PCR |
| 3.2.5 发酵液中有机酸的检测 |
| 3.2.6 大肠杆菌基于λ-red和Ⅰ-SceⅠ的基因重组 |
| 3.3 实验结果与讨论 |
| 3.3.1 谷氨酸棒状杆菌突变型zwf~(243)和gnd~(361)基因的过表达质粒构建 |
| 3.3.2 氧化磷酸戊糖途径过表达质粒的构建 |
| 3.3.3 pgi基因敲除菌株的构建 |
| 3.3.4 ED途径敲除菌株的构建 |
| 3.3.5 acs基因过表达菌株的构建 |
| 3.3.6 氧化磷酸戊糖途径的改造对核黄素产量的影响 |
| 3.3.7 pgi基因和ED途径的敲除对核黄素产量的影响 |
| 3.3.8 acs基因的过表达对乙酸积累的影响 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 ribF基因的改造及发酵条件的优化 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 菌种和质粒 |
| 4.1.2 实验仪器 |
| 4.1.3 实验试剂 |
| 4.1.4 培养基 |
| 4.1.5 溶液 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 核黄素激酶酶活力测定 |
| 4.3 实验结果与讨论 |
| 4.3.1 ribF基因的改造 |
| 4.3.2 置换ribF基因野生RBS片段的构建 |
| 4.3.3 ribF基因野生RBS的置换 |
| 4.3.4 ribF基因的改造对核黄素产量的影响 |
| 4.3.5 发酵条件的优化 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 基于MEP途径的产β-胡萝卜素大肠杆菌构建 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 菌种和质粒 |
| 5.1.2 实验仪器 |
| 5.1.3 实验试剂 |
| 5.1.4 培养基 |
| 5.1.5 溶液 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 β-胡萝卜素的检测方法 |
| 5.2.2 β-胡萝卜素的发酵实验 |
| 5.2.3 基于CRISPR/Cas9系统λ-red重组 |
| 5.2.4 Golded Gate组装方法 |
| 5.2.5 gRNA质粒的构建 |
| 5.3 实验结果与讨论 |
| 5.3.1 整合β-胡萝卜素合成基因到大肠杆菌EcKan染色体上 |
| 5.3.2 MEP途径调控元件的片段构建 |
| 5.3.3 考察MEP途径单基因调控对β-胡萝卜素合成的影响 |
| 5.3.4 MEP途径的组合优化 |
| 5.4 本章小结 |
| 第六章 中心碳代谢及MEP途径的组合优化对β-胡萝卜素产量的影响 |
| 6.1 实验材料 |
| 6.1.1 菌种和质粒 |
| 6.1.2 实验仪器 |
| 6.1.3 实验试剂 |
| 6.1.4 培养基 |
| 6.1.5 溶液 |
| 6.2 实验方法 |
| 6.2.1 高密度发酵重组大肠杆菌ZF237T |
| 6.3 实验结果与讨论 |
| 6.3.1 中心碳代谢途径操作片段的构建 |
| 6.3.2 考察中心碳代谢单基因调控对β-胡萝卜素合成的影响 |
| 6.3.3 中心碳代谢组合操作对β-胡萝卜素合成的影响 |
| 6.3.4 β-胡萝卜素合成途径及MEP途径的组合操作 |
| 6.3.5 中心碳代谢及MEP途径的组合优化 |
| 6.3.6 高密度发酵产β-胡萝卜素重组大肠杆菌ZF237T |
| 6.4 本章小结 |
| 第七章 结论与展望 |
| 7.1 结论及创新点 |
| 7.1.1 主要结论 |
| 7.1.2 创新点 |
| 7.2 展望 |
| 参考文献 |
| 发表论文及参加科研情况说明 |
| 附录 |
| 致谢 |
四、代谢工程在D-核糖生产中研究现状及应用前景（论文参考文献）
- [1]代谢调控谷氨酸棒杆菌合成乙酰氨基葡萄糖[D]. 邓琛. 江南大学, 2021
- [2]枯草芽孢杆菌生产核黄素的体内外代谢工程改造及环保生产工艺的建立优化[D]. 张梦雪. 华东理工大学, 2021(08)
- [3]氨基酸生产的代谢工程研究进展与发展趋势[J]. 马倩,夏利,谭淼,孙全伟,杨蒙雅,张颖,陈宁. 生物工程学报, 2021(05)
- [4]改造热葡糖苷酶地芽孢杆菌高效生产核黄素[D]. 杨志恒. 华东理工大学, 2020(01)
- [5]代谢工程改造酿酒酵母生产酪醇及红景天苷的研究[D]. 郭伟. 山东大学, 2020(08)
- [6]丁酸梭菌的产氢影响因素及其代谢特性的研究[D]. 尹梦. 上海师范大学, 2020(07)
- [7]D-核糖的研究进展[J]. 覃懿,罗想平,柳春,潘丽珠,倪海明,郭佳文. 大众科技, 2018(07)
- [8]一株高效产絮菌的基因组测序及胞外多糖合成组学研究[D]. 刘金亮. 东北大学, 2018
- [9]陶瓷膜分离技术在D-核糖发酵液预处理过程中的应用[J]. 曾乐,杨光,郑雄敏,杨希. 食品与发酵工业, 2015(06)
- [10]重组大肠杆菌生产核黄素和β-胡萝卜素的途径构建与改造[D]. 林振泉. 天津大学, 2015(08)