一、腺病毒介导胸苷激酶基因治疗肝癌的实验研究(论文文献综述)
刘旭昇[1](2020)在《肝癌靶向载体scrAAV3介导基因治疗可视化的实验研究》文中认为背景:癌症已逐渐成为世界范围内一种重大的疾病,全球范围内每年大约有70万人因肝癌去世,其中约55%发生在中国,仅次于肺癌。但通过手术、放化疗后容易再复发或不能取得理想的疗效以及传统抗癌药物普遍存在药效短、需要多次给药等问题使得肿瘤治疗遇到很多难题,而基因治疗的出现打破了这种局限性,为肝癌诊疗开拓了一种新的方法并有望提升肝癌患者的生存率。然而,缺乏肿瘤靶向性和目的基因在体表达比较低是传统肿瘤基因治疗临床转化所面临的主要问题,所以寻找安全、可靠的高肿瘤靶向性载体是目前肿瘤基因治疗研究的重中之重。同时,如何了解在体肿瘤细胞治疗基因的表达分布情况,如何对靶向治疗效果进行早期诊断以及后期进行动态监测,药物与靶向如何结合等问题依然是亟待解决的难题。目的:评估scrAAV3载体靶向肝癌并用于非侵入性监测肝癌基因治疗的可行性。方法:将具有报告基因作用的疱疹病毒胸苷激酶(HSV1-TK)和具有治疗基因作用的人内源性血管生成抑制剂(Kallistatin)共同构建在具有靶向肝癌能力的scrAAV3载体上,构建靶向肝癌的自身互补重组腺相关病毒重组体scrAAV3-HSV1-TK-Kallistatin(ATK)。将病毒转染HepG2细胞,实验共设为三组,分为实验组(ATK组),阴性对照组(scrAAV3-EGFP组)和对照组(Control组)。使用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)和蛋白质印迹(Western Blot)分析鉴定三组细胞中HSV1-TK与Kallistatin的mRNA和蛋白质表达水平。细胞增殖实验观察三组HepG2细胞的增殖能力。构建裸鼠肝癌皮下移植瘤模型,实验组裸鼠尾静脉注射ATK基因,对照组注射同积体的PBS,2周后行18F-FHBG PET/CT扫描。显像结束后取出皮下移植瘤,使用HE染色观察移植瘤肿瘤切片,使用免疫荧光,RT-qPCR和Western Blot分析鉴定移植瘤中HSV1-TK与Kallistatin的mRNA和蛋白质表达水平。结果:在细胞实验中,RT-qPCR和Western Blot分析表明,与两对照组相比,实验组HSV1-TK与Kallistatin的mRNA和蛋白质表达水平均增高(P<0.05),而不同对照组间表达无差异。MTS细胞增殖实验结果表明,实验组细胞的增殖能力明显低于两对照组(P<0.05),而不同对照组间细胞增殖能力无差异。在动物实验中,与对照组相比,ATK组PET/CT图像的放射性明显升高。ATK和对照组裸鼠左前腿的18F-FHBG摄取值分别为0.591±0.151%和0.017±0.011%ID/g(n=5)(P<0.05)。注射ATK基因药物后,成功在皮下异种移植瘤中检测到HSV1-TK和Kallistatin的mRNA及蛋白表达。体外分析表明,ATK和对照组HSV1-TK和Kallistatin的表达差异有显着性(P<0.05)。结论:细胞实验证明ATK基因药物能够有效转染HepG2细胞,并对其增殖产生抑制作用。动物实验结果表明scrAAV3载体具有明显的肝癌靶向性,ATK基因药物可用作靶向和非侵入性监测肝癌基因治疗。
宋秋灵[2](2017)在《增强型胸苷激酶基因表达载体的构建及其杀伤性的研究进展》文中指出目的探讨人端粒酶催化亚单位(h TERT)启动子及巨细胞病毒原核(CMV)增强子联合调控胸苷激酶基因增强型表达载体的改良构建及其在杀伤鼻咽癌细胞中的效应与安全性评价。方法对链接h TERT启动子及CMV增强子、胸苷激酶基因进行酶切(模板为p GL3空载体),以构建增强型表达载体;选取h TERT启动子单调控胸苷激酶基因的表达载体作为对照组。另选用人鼻咽癌细胞(端粒酶阳性,实验组)、人乳腺癌细胞(对照组)及正常人脐静脉内皮细胞(端粒酶阴性)为标本,分别对其采用荧光显微镜观察荧光蛋白表达、聚合酶链式反应(PCR)检测胸苷激酶基因m RNA的表达、Telochaser法检测细胞端粒酶活性,同时分析鼻咽癌细胞增殖及抑制受增强型载体的影响作用。结果 h TERT启动子及CMV增强子对胸苷激酶基因的增强型表达载体进行联合调控,可以成功改良构建;通过荧光显微镜下观察显示人鼻咽癌细胞和人乳腺癌细胞均有荧光表达,但后者较前者在表达数量及强度方面有所加强,且对照组的人乳腺癌细胞亦有荧光表达存在,但ECV-304细胞无荧光表达。在PCR定量检测方面,结果显示增强型载体组(实验组)的胸苷激酶基因m RNA的表达量显着强于对照组的单启动载体(P<0.05)。在细胞端粒酶活性方面,ECV-304细胞为阴性,肿瘤细胞端粒酶活性均为阳性。四甲基偶氮唑蓝(MMT)检测结果显示,增强型载体组可明显抑制鼻咽癌细胞的体外增殖,其细胞存活率较对照组显着降低(P<0.05)。动物体内实验结果显示改良重建的增强型载体对裸鼠鼻咽癌移植瘤生长具有明显抑制作用(抑瘤率为56.5%),显着高于单启动子载体组(抑瘤率为43.3%)(P<0.05);实验组与其他对照组抑瘤率比较差异均有统计学意义(P<0.05)。实验组裸鼠肝肾病理检查显示,肝、肾组织结构正常,均无明显损害。结论以h TERT启动子及CMV增强子对胸苷激酶基因的增强型表达载体进行联合调控,成功改良构建后能够靶向及高效地杀伤鼻咽癌细胞及体外移植瘤,且应用后在动物模型体内未见明显的毒副反应。
谭成光[3](2017)在《双自杀基因与芪三酚对人肝癌HepG2细胞系的杀伤作用及协同效应研究》文中研究表明肝癌系原发于人类肝脏组织及脏器的癌症,也是发生于肝细胞与肝内胆管上皮细胞的恶性病变,是临床肿瘤中最常见的恶性肿瘤之一,也是世界卫生组织公布的十大恶性肿瘤之一。肝癌细胞具有极强的浸润性,其恶性程度极高,预后极差,且临床确诊患者超过80%以上已是晚期不适宜再进行手术切除,尤其是肝癌患者常出现对多种药物抗药性与耐药性,故对目前放疗和化疗均不敏感。因此,目前临床一线及二线治疗的疗效大多并不满意和理想,致使其发病早期便可发生癌症的肝转移,生存率极低。目的:为了更加深入和系统地探寻和创建更加安全、更有疗效、更有特色、更具实用价值的临床中西医结合抗肝癌疗法,本课题希望通过建立双自杀基因逆转录病毒转移体系在转染人肝癌细胞HepG2的实验研究,观察它们对人肝癌HepG2细胞系的抑制及杀伤作用;同时,本课题还希望探索研究天然药物芪三酚对人肝癌HepG2细胞系的抑制及杀伤作用以及它可否共济协同双功能融合自杀基因CDglyTK,以提高和增加它们之间联合增效的抗癌作用效果;而且,本课题也希望通过此实验研究,探寻天然药物芪三酚共济协同双功能融合自杀基因CDglyTK的最佳作用时间和剂量效应,为中西医结合应用在临床对人肝癌的有效治疗和早期干预提供新的研究思路和科学依据。方法:1、双自杀基因逆转录病毒转移体系的建立及共稳定感染肝癌细胞HepG2的实验研究的方法是:采用基因工程技术构建pWZLneoCDglyTK质粒,并将其转导至DH5α感受态菌中,再将扩增获得的大量质粒提取并通过脂质体载体进行介导,将含双自杀基因的逆转录病毒载体pWZLneoCDglyTK导入至病毒包装细胞PA317中,经过G418筛选带病毒PA317/CD+TK阳性克隆细胞株,进行扩增培养后收集培养液中病毒上清液进行浓缩,随后再在Polybrene介导下转染人肝癌细胞株HepG2;然后经过G418的再次筛选阳性克隆、并进行扩增培养,以获得稳定表达双自杀基因的HepG2/CD+TK细胞株及建立稳定转染双自杀基因的HepG2细胞系,再采用RT-PCR检测双自杀基因的表达情况。2、双功能融合自杀基因CDglyTK对人肝癌HepG2细胞系的杀伤作用及芪三酚协同增强杀伤效应的实验研究的方法:分别采用不同浓度的一种或两种联合的自杀基因前体药物(GCV和/或5-FC)、芪三酚、以及自杀基因前体药物(GCV和/或5-FC)与芪三酚组合物分次处理人肝癌HepG2细胞和人肝癌HepG2细胞转染有双自杀基因的HepG2/CD+TK细胞,分别采用光镜和电镜观察其细胞形态学改变,采用凋亡小体细胞形态学、DNA Ladder、原位末端标记法(TUNEL)、凋亡相关基因检测、流式细胞检测观察其细胞凋亡情况;采用MTT检测和细胞克隆形成实验观察细胞增殖状况;采用流式细胞检测观察细胞周期变化,以综合观察、分析和评价它们分别或联合对人肝癌HepG2细胞和HepG2/CD+TK细胞的杀伤效果及其共济协同与联合增效的生物学作用。结果:第一部分:双自杀基因逆转录病毒转移体系建立及其稳定感染人肝癌细胞HepG2结果:1.双自杀基因逆转录病毒转移体系构建与稳定表达的结果:(1)pWZLneoCDglyTK质粒DNA含Amp抗性基因,其转化阳性菌株可在含Amp琼脂上生长,未转化菌无Amp抗性则不能生长,证实是含单一细菌克隆的转化菌落。(2)质粒pWZLneoCDglyTK经提取其DNA并纯化后检测清晰可见有质粒DNA存在。(3)含pWZLneoCDglyTK的质粒经BamH I单酶切后可形成1.19kb和6.9kb的两条电泳条带;经EcoR I单酶切后可形成8.09kb的一条电泳条带;经BamH I和EcoR Ⅰ双酶切后可形成1.19kb、1.31kb和5.59kb的三条电泳条带,证实此质粒为pWZLneoCDglyTK。另以提取的质粒DNA为模板,以CD和TK引物进行PCR扩增,可见扩增的CD和TK的阳性条带,证实此质粒是含CD和TK基因为pWZLneoCDglyTK质粒。构建的双自杀基因经DNA测序并与genebank标准序列比对后证明其序列正确。对质粒pWZLneoCDglyTK阳性转化菌大量扩增培养提取质粒后进行电泳分析,结果有明亮的阳性条带,证明该质粒大量提取成功,对大量提取pWZLneoCDglyTK质粒纯度及浓度测定计算,DNA浓度(μ g/μ 1)=5.25,DNA纯度=1.81,其与理论预估值1.80基本一致。(4)逆转录病毒载体转入病毒包装细胞PA317后第2天即有80%细胞贴壁,生长状态良好,增殖旺盛,细胞形态呈成纤维样,可见分裂相,细胞透明,细胞内无颗粒。用脂质体将pWZLneoCDglyTK质粒及pLXSN.GFP质粒转入PA317细胞48h后可见对照组细胞有绿色荧光产生,证明质粒转染成功,其转染效率在20-30%。(5)对未转染细胞PA317及转染细胞PA317CD+TK的基因组DNA电泳,清晰可见DNA电泳条带;CD、TK基因PCR扩增的电泳结果,PA317/CD+TK细胞CD基因PCR产物730bp处有一特异性条带,TK基因PCR产物650bp处有一特异性条带,而PA317细胞CD、TK基因均为阴性,证明CD、TK基因已整合到PA317细胞的基因组上。(6)对提取转染PA317细胞的总RNA进行电泳,有RNA电泳条带存在,证明RNA提取成功;RNA逆转录后PCR扩增的电泳结果,PA317/CD+TK细胞CD基因RT-PCR产物在730bp处有一特异性条带,TK基因RT-PCR产物在650bp处有一特异性条带,而PA317细胞CD,TK基因均为阴性,证明CD,TK基因已在PA317细胞中有表达。(7)将pWZLneoCDglyTK质粒以脂质体包裹后导入病毒包装细胞PA317,电镜可见培养上清液中有病毒颗粒散在或聚集成堆呈圆球形,边缘呈波状,直径约100nm大小,说明其逆转录病毒包装成功。2.双自杀基因逆转录病毒感染人肝癌细胞HepG2的结果:(1)人肝癌HepG2细胞复苏第2天可见大部分细胞贴壁,细胞生长良好,形态呈上皮样,多见分裂相,细胞较透明,高倍镜可见细胞内有少许颗粒及细胞器。(2)荧光显微镜下观察,转有对照组病毒上清液中人肝癌HepG2细胞可见大量绿色荧光产生,感染效率达60-70%。(3)对PA317/CD+TK细胞培养上清液中逆转录病毒感染HepG2细胞镜检,该细胞形态未变,用G418筛选,第2天有少数细胞皱缩、死亡、脱落、形成细胞碎片,继续用G418加压培养,存活细胞持续增殖,形成多个细胞克隆,且细胞克隆密切相连。(4)提取未转染人肝癌细胞HepG2及转染细胞HepG2/CD+TK的DNA,电泳后清晰可见DNA电泳条带,证明其基因组DNA提取成功。进行CD、TK基因PCR扩增电泳,HepG2/CD+TK细胞CD基因PCR产物730bp处有一特异性条带,TK基因PCR产物650bp处有一特异性条带,未经转染HepG2细胞CD、TK基因均为阴性,证明CD、TK基因已整合到HepG2细胞的基因组上。(5)对提取转染细胞的总RNA电泳,有RNA电泳条带存在,证明其RNA提取成功;将RNA逆转录后PCR扩增后电泳,HepG2/CD+TK细胞CD基因RT-PCR产物730bp处有一特异性条带,TK基因RT-PCR产物650bp处有一特异性条带,而HepG2细胞CD、TK基因均为阴性,证明CD、TK基因已在HepG2/CD+TK细胞中得到了表达。3.人肝癌HepG2/CD+TK细胞与HepG2细胞的生物学性状比较结果:将转染双自杀基因的HepG2/CD+TK细胞及空白对照HepG2细胞进行传代、冻存、复苏后镜检,处于对数生长期的这两种细胞一般形态学基本相同,均呈上皮样生长,且它们的生长曲线也基本一致,无显着性差异(p>0.05)。流式细胞仪对这两种细胞的细胞周期检测,发现它们的细胞周期分布也无明显差异(p>0.05)。第二部分:双自杀基因前体药物联合芪三酚对人肝癌细胞HepG2细胞及转染双自杀基因的HepG2/CD+TK细胞的杀伤作用的实验研究结果1.双自杀基因前体药物分别作用人肝癌HepG2及HepG2/CD+TK细胞24h镜检结果:双自杀基因前体药物GCV和/或5-FC无论单用或联用均对未转染自杀基因的人肝癌HepG2细胞无作用,但对转染自杀基因的HepG2/CD+TK细胞均有一定作用,联用效果较单一效果更好,且作用效果随前体药物浓度增加而增加,但不同自杀基因前体药物浓度作用HepG2/CD+TK细胞后尚未见死亡细胞增多。2.芪三酚作用于人肝癌HepG2及HepG2/CD+TK细胞24h后镜检结果:不同浓度芪三酚对人肝癌HepG2及HepG2/CD+TK细胞均有作用,且其作用效果随着芪三酚作用浓度而增加,杀伤作用呈剂量相关性和浓度依赖性,但相同浓度芪三酚分别作用两类靶细胞,其细胞形态及细胞死亡情况未见明显不同和差异。3.芪三酚联合自杀基因前体药物(GCV和/或5-FC)分别作用于人肝癌HepG2及HepG2/CD+TK细胞24h后镜检结果:应用双自杀基因前体药物(GCV和/或5-FC)和芪三酚联合对人肝癌HepG2细胞作用,其作用效果随药物浓度增加而增加,并与单用芪三酚作用无明显差别。应用双自杀基因前体药物(GCV和/或5-FC)和芪三酚联合对转染双自杀基因HepG2/CD+TK细胞作用效果更明显,且影响程度也呈剂量效应和浓度依赖性。4.自杀基因前体药物(GCV和/或5-FC)作用于人肝癌HepG2及HepG2/CD+TK细胞72h后镜检结果:(1)未转染自杀基因的HepG2细胞,在分别或联合应用自杀基因前体药物(GCV和/或5-FC)作用72h与作用24h时的情况基本相同;而对转染双自杀基因的HepG2/CD+TK细胞在分别或联合应用自杀基因前体药物GCV和/或5-FC作用72h比作用24h时损伤目的细胞加重,且GCV和5-FC联合应用较两者单独作用的效果更好。5.芪三酚分别作用人肝癌HepG2及HepG2/CD+TK细胞72h后的镜检结果:与24h作用相比,芪三酚作用72h对两类靶细胞损伤和杀伤均加重,且随药物浓度增加而增加。但芪三酚在同一浓度分别作用两类靶细胞,其细胞形态及死亡情况未见明显差异。6.芪三酚联合自杀基因前体药物(GCV和/或5-FC)分别作用于人肝癌HepG2及HepG2/CD+TK细胞后72h后的镜检结果:与24h相比,应用自杀基因前体药物(GCV和/或5-FC)和芪三酚联合对HepG2细胞作用72h的效果更明显,且随着药物浓度增加而增加,但与单用芪三酚作用HepG2时无明显差别。但应用自杀基因前体药物(GCV和/或5-FC)和芪三酚联合对HepG2/CD+TK细胞作用72h与作用24h相比,随着药物浓度增加,HepG2/CD+TK细胞形态和生长状态更差,细胞数量更减少,死亡细胞增多更明显等,且它们之间关系呈剂量效应和浓度依赖性。7.自杀基因前体药物和芪三酚对人肝癌细胞HepG2及HepG2/CD+TK的生长抑制作用:(1)分别单用或合用GCV或/和5-FC对人肝癌HepG2细胞作用时,对其生存与增殖影响不明显,而对HepG2/CD+TK细胞的抑制作用则随药物浓度增加而增加。合用GCV和5-FC对该细胞生长抑制作用更明显。(2)应用芪三酚对HepG2和HepG2/CD+TK细胞的抑制作用均随药物浓度增加而增加,但抑制程度在这两类细胞间无显着性差异。(3)应用芪三酚和GCV或5-FC对HepG2细胞的抑制作用也随药物浓度增加而增加,但芪三酚联合GCV与芪三酚联合5-FC应用,对该细胞增殖影响无明显差异,均与单独用芪三酚对该细胞增殖抑制情况相似。应用芪三酚和GCV或5-FC对HepG2/CD+TK细胞的抑制作用也随药物浓度增加而增加,芪三酚联合GCV与芪三酚联合5-FC,对该细胞增殖抑制无明显差异,但细胞抑制情况均明显高于单独应用芪三酚组。8.凋亡细胞的瑞氏染色光镜观察结果:分别或联合加入GCV和/或5-FC对HepG2细胞作用,该细胞生长与增殖均未受影响,也未见该细胞出现凋亡,且GCV、5-FC、GCV+5-FC之间以及各药物浓度间均未见HepG2细胞凋亡现象。加入低浓度芪三酚后也未见HepG2细胞凋亡;但随芪三酚浓度增加,HepG2细胞凋亡现象逐渐明显。芪三酚和自杀基因前体药物联用与单独使用芪三酚的结果基本类似。而分别或联合加入低浓度GCV和/或5-FC对HepG2/CD+TK细胞作用与干预后,未见HepG2/CD+TK细胞出现凋亡;但随自杀基因前体药物作用浓度增加,HepG2/CD+TK细胞出现明显凋亡;尤其是GCV+5-FC合用,该细胞凋亡较单用GCV或5-FC更明显。加入低浓度芪三酚作用未见HepG2/CD+TK细胞凋亡,但随芪三酚浓度增加,HepG2/CD+TK细胞凋亡逐渐明显。同时加入芪三酚和前体药物作用,HepG2/CD+TK细胞凋亡非常明显,即使在低浓度下亦可出现凋亡现象,且随药物浓度增加,凋亡细胞数增加。9.凋亡细胞DNA Ladder检测结果:加入不同浓度GCV(8μg/ml和4μg/ml)和/或5-FC(160μg/ml和80μg/ml)作用HepG2细胞72h,只在加样孔附近发现DNA条带,但未见有DNA Ladder条带产生。而加入低浓度(0.04mmol/L)和高浓度(0.08mmol/L)芪三酚作用,可见微弱的HepG2细胞DNA Ladder产生,且随芪三酚浓度增加DNA Ladder更明显。同时加入芪三酚和前体药物与单独加入芪三酚作用效果类似。而在HepG2/CD+TK细胞中加入不同浓度的 GCV(8μg/ml、4μg/ml)和/或 5-FC(160μg/ml、80μg/ml)72h 后,均可见DNA Ladder产生,随自杀基因前体药物浓度增加,HepG2/CD+TK细胞DNA Ladder更明显,且GCV+5-FC较单用GCV或5-FC效果更明显。加入低浓度(0.04mmol/L)和高浓度(0.08mmol/L)芪三酚,可见有微弱的HepG2/CD+TK细胞DNA Ladder产生,且随药物浓度增加DNA Ladder更明显。同时加入芪三酚和自杀基因前体药物作用HepG2/CD+TK细胞,其DNA Ladder较单用芪三酚或自杀基因前体药物更明显。10.TUNNEL法检测细胞凋亡结果:在人肝癌HepG2中分别加入不同浓度GCV(8μg/ml 和 4 μ g/ml)和/或 5-FC(160 μ g/ml 和 80 μ g/ml)作用 72h,TUNEL 结果为阴性。加入芪三酚作用,TUNEL结果为弱阳性;同时加入芪三酚和前体药物共同作用,HepG2细胞大部分为弱阳性,最高浓度时有部分HepG2细胞为阳性。而HepG2/CD+TK中加入不同浓度 GCV(8μg/ml、4ug/ml)和/或 5-FC(160μg/ml、80ug/ml)作用,TUNEL 结果显示每种低浓度前体药物可使大部分HepG2/CD+TK细胞为弱阳性,但每种高浓度前体药物作用均可使少部分细胞为阳性;采用两种前体药物联用,细胞大部分为阳性。加入芪三酚有部分HepG2/CD+TK细胞的为弱阳性,高浓度芪三酚作用,其细胞核黄色加深。同时加入芪三酚和前体药物,HepG2/CD+TK细胞均为阳性,且在高浓度时为强阳性。11.流式细胞检测细胞凋亡结果:在HepG2细胞中分别加入前体药物GCV(8μg/ml)或5-FC(160μg/ml)作用72h后,其细胞凋亡率分别为5.43%和5.49%,结果基本相同;而当二者联用时,其细胞凋亡率可达到11.09%,这可能与自杀基因前体药物联合应用后的非特异性毒性有关。而当加入浓度为0.08mmol/L的芪三酚后,与前体药物组相比,HepG2细胞凋亡率可升至12.02%,说明芪三酚可引起HepG2细胞的凋亡。但当同时加入芪三酚和前体药物后,HepG2细胞凋亡率比单用芪三酚有增高,HepG2细胞的凋亡率为16.32%。而在HepG2/CD+TK细胞中分别加入前体药物GCV(8μg/ml)或5-FC(160μg/ml)作用72h,与HepG2细胞相比,细胞凋亡率明显增加,分别为11.11%和14.37%;当二者联用时,细胞凋亡率为17.89%。加入芪三酚后,HepG2/CD+TK细胞凋亡率为15.81%,稍高于HepG2。同时加入芪三酚和前体药物作用,HepG2/CDTK细胞凋亡率明显增高,可达到22.64%。12.细胞克隆形成的实验结果:在HepG2细胞中分别加入不同浓度前体药物GCV(8 u g/ml 和 4 u g/ml)和/或 5-FC(160 μ g/ml 和 80 μ g/ml)72h,各孔 HepG2 细胞克隆形成率均在90%以上,各孔间无显着差异,细胞克隆较大,每一克隆有数百细胞,且细胞克隆间距离近,有些紧密相连。加入芪三酚后与前体药物相比,HepG2细胞克隆形成率明显减少,且随浓度增加克隆形成率降低。芪三酚浓度0.08mmol/L时,细胞克隆形成率近50%,每一细胞克隆均明显缩小,每一细胞克隆内仅有100-200个细胞。同时加入芪三酚和前体药物与单独加入芪三酚的差别不大,在高浓度时的HepG2细胞克隆形成率近50%,细胞克隆内细胞数仅数十个。而在HepG2/CD+TK细胞中分别加入不同浓度前体药物 GCV(8μg/ml,4μg/ml)和/或 5-FC(160μg/ml,80μg/ml)作用 72h,与 HepG2 细胞相比,HepG2/CD+TK克隆形成率明显减少,随前体药物随浓度增加,克隆形成率降低;当增至高浓度时,细胞克隆形成率近50%;两种药物联用,克隆形成率降低更明显,仅为400%,且克隆内细胞数量也逐渐减少,当GCV8μg/ml+5-FC160μg/ml时,细胞数仅数十个。与HepG2细胞实验相似,加入芪三酚后,HepG2/CD+TK细胞克隆形成率明显减少,且随浓度增加,克隆形成率降低,在芪三酚浓度为0.08mmol/L时,细胞克隆形成率近50%,细胞克隆也明显缩小,每一克隆仅有100-200个细胞。同时加入芪三酚和前体药物作用的HepG2/CD+TK细胞克隆形成率明显降低,当三者联用高浓度时,未见有细胞克隆产生。13.对相关基因表达水平影响的检测结果:HepG2细胞中分别加入GCV(8μg/ml)、5-FC(160μg/ml)及二者联用,对HepG2细胞凋亡抑制基因c-fos的表达水平影响不大,而bax基因几无表达,二者联用时仅有微弱bax基因表达;而加入芪三酚后的c-fos基因表达明显降低,而bax基因表达明显增高;但前体药物与芪三酚联用与芪三酚单用相比,c-fos基因表达水平变化不大,而bax基因均有较明显表达,但与单用芪三酚结果相比,无显着性差别(P>0.05)。在HepG2/CD+TK细胞中加入GCV(8μg/ml),5-FC(160μg/ml)后,c-fos基因表达水平均降低,bax基因表达水平均增高。两种前体药物联用的c-fos基因表达降低更明显,而bax基因表达均高于其中任何单一前药使用;加入芪三酚后的c-fos基因表达水平与其对HepG2作用相差不大;但前体药物与芪三酚联用与单用芪三酚相比,c-fos基因表达降低更明显;当三者联用时,c-fos基因几乎无表达。加入芪三酚后,bax基因表达也明显增高;前体药物与芪三酚联用,bax基因表达水平有更明显升高,而三者联用时的bax基因表达水平最高。14.细胞迁移实验的观察结果:在HepG2细胞中分别加入GCV和/或5-FC作用72h,对该细胞迁移影响较小;加入芪三酚后可抑制HepG2细胞迁移。芪三酚和前体药物联用的细胞划痕间距与单用芪三酚差别不大,对HepG2细胞起不到协同抑制细胞迁移的效果。而在HepG2/CD+TK细胞中分别加入GCV和/或5-FC作用72h,该细胞划痕间距明显增大;当两种前药联用时,细胞划痕间距明显大于单种前药。同样,加入芪三酚后对HepG2/CD+TK细胞划痕间距加大,细胞形态变差。芪三酚和前体药物联用的细胞划痕间距明显增大,细胞形态更差;当三者联用时的细胞划痕周围几乎无状态良好的细胞。15.流式细胞检测细胞周期结果:在HepG2细胞中分别加入GCV或5-FC作用72h,该细胞 G1、S、G2 期细胞比例分别为 22.95%、68.14%、8.91%或 30.31%、67.19%、2.50%,统计学处理差别不显着(P>0.05),且S期细胞所占比例最多;二者联用,该细胞G1、S、G2期细胞比例分别为32.68%、64.51%、2.82%,差别均无显着性意义(P>0.05)。加入芪三酚后该细胞G1、S、G2期细胞比例分别为66.61%、33.39%、0%,S期细胞比例明显减少,而G1期细胞比例增多。芪三酚和单一前体药物联用,该细胞G1、S、G2期细胞比例分别为91.83%、8.17%、0%,比单用芪三酚的G1期细胞比例有所增高;三者联用,该细胞G1、S、G2期细胞比例分别为92.23%、5.72%、2.04%。HepG2/CD+TK细胞中分别加入GCV或5-FC作用72h,该细胞G1、S、G2期细胞比例分别为33.62%、47.32%、19.06%和39.22%、58.85%、1.96%,与HepG2细胞相比,S期细胞明显降低,G1期细胞明显增多;两种前药联用,该细胞G1、S、G2期细胞比例分别为47.57%、49.24%、3.19%,虽S期变化不大,但G1期细胞明显增多,说明两种前体药物联用可使更多HepG2/CD+TK细胞阻止在G1期,不能进一步合成DNA。加入芪三酚后,该细胞G1、S、G2期细胞比例分别为76.78%、23.22%、0%,该细胞DNA合成抑制。芪三酚和单一前体药物联用,该细胞G1、S、G2期细胞比例分别为97.77%、2.23%、0%,三者联用时,该细胞G1、S、G2期细胞比例分别为99.93%、0.07%、0%,该细胞被阻止在G1期,几乎无DNA合成。16.细胞亚结构观察结果:在HepG2细胞中应用GCV和/或5-FC后,多数HepG2细胞表面光滑,无明显结构改变,且两种前体药物联合对HepG2细胞形态学影响不明显。应用芪三酚后的HepG2细胞表面微绒毛增粗,变成长而粗的细丝,说明HepG2细胞有凋亡。同时应用GCV和/或5-FC后的HepG2/CD+TK细胞膜上出现许多囊性小泡,说明HepG2/CD+TK细胞有凋亡现象。应用芪三酚后的HepG2/CD+TK细胞表面出现很多囊性小泡,说明HepG2/CD+TK细胞有凋亡产生。联合应用前体药物和芪三酚的HepG2细胞膜表面出现一些穿孔现象,说明HepG2/CD+TK细胞有凋亡现象。联合应用自杀基因前体药物和芪三酚后,HepG2/CD+TK细胞出现更加明显的凋亡小体。结论:1.自杀基因前体药物作用于未转染有双自杀基因的人肝癌HepG2细胞,在本实验设计的浓度剂量和作用时间等条件下,均未能表现出明显的杀癌或抑癌的生物学作用。2.以逆转录病毒为载体将双自杀基因转染至人肝癌HepG2细胞后,再使用双自杀基因前体药物作用,可分别对人肝癌HepG2细胞转染有双自杀基因的HepG2/CD+TK细胞发生不同程度的损伤和杀伤,从而有效控制人肝癌细胞的增殖性进展。3.自杀基因前体药物均能有效地抑制或杀伤人肝癌HepG2细胞转染有双自杀基因的HepG2/CD+TK细胞的增殖性生长,并呈现明显的浓度依赖性,即在本实验条件下,其作用浓度越高,则效果越显着。4.自杀基因前体药物能诱导人肝癌HepG2细胞转有双自杀基因的HepG2/CD+TK细胞的凋亡,且自杀基因前体药物联合应用对肝癌细胞的抑制与杀伤效果更好,表现出明显的协同增效作用,即与单独使用GC V或5-FC比较,联合使用GCV和5-FC能是人肝癌细胞存活率明显降低,表明双自杀基因较单自杀基因有更强的抑癌效果。5.芪三酚能影响人肝癌HepG2细胞和人肝癌HepG2细胞转有双自杀基因的HepG2/CD+TK细胞的形态学,使其发生破坏性改变;同时,它还能有效抑制这两类细胞的生长增殖,并呈浓度依赖性;且芪三酚能诱导这两类细胞的凋亡。6.自杀基因前体药物GCV和/或5-FC与芪三酚Res联合应用对人肝癌HepG2细胞具有单独使用芪三酚的生物学作用及类似细胞形态学改变;而它们联合应用对人肝癌HepG2细胞转有双自杀基因的HepG2/CD+TK细胞能发生更明显的杀伤及破坏性改变,并呈现明显的浓度依赖性,即在本实验条件下,浓度越高效果越显着,且表现出双自杀基因前体药物与芪三酚联合应用后更好杀伤效果,呈现出明显的协同增效作用。7.双自杀基因前体药物GCV和/或5-FC与芪三酚合理应用,特别是联合应用不仅能减低自杀基因前体药物的用量及副作用,还能发挥相互之间的协同效应,并且能发挥更好的效果,这很可能为今后中西医结合及天然抗癌药物与自杀基因及其前体药物的综合应用提供一种更加适应于临床肝癌治疗的新思路、新技术和新方法。
潘昱[4](2016)在《杆状病毒-腺相关病毒融合病毒介导核素报告基因监测干细胞移植的研究》文中提出目的:在活体条件下实现无创和定量的干细胞监测对优化干细胞移植治疗具有重要意义。本研究通过构建和制备新型的杆状病毒(BV)-腺相关病毒(AAV)融合病毒(BV-AAV),探讨以此作为转基因载体介导核素报告基因进行干细胞移植监测的可行性,并进一步利用睡美人转座子基因(SB100×)改良BV,评估其介导报告基因进行长期显像的潜力。方法:将增强型绿色荧光蛋白(eGFP)报告基因或人钠碘同向转运体(hNIS)报告基因,构建于一组AAV来源的末端反向重复序列(ITRs)之间,以此制备BV-AAV(分别命名为BIeV和BIhV)。利用BIeV感染大鼠骨髓来源的间充质干细胞(rBM-MSCs)和人脐带血来源的间充质干细胞(hUCB-MSCs)等多种干细胞,测定感染效率、转基因表达水平和持续时间,以及对干细胞的细胞毒性/增殖的影响等。在对BIhV感染的干细胞摄取125I-的特性进行体外研究后,将感染的干细胞移植入裸鼠体内进行hNIS核素报告基因显像。在此基础上引入SB100×以改良BV,利用含不同结构的BV感染肿瘤细胞,经体外对比实验来检验SB100×延长转基因表达时间的功能,并进一步分别利用含eGFP或胰高血糖素样肽-1受体(GLP-1R)报告基因的SB100×改良BV病毒(BSeNV或BSGNV)介导报告基因进行肿瘤细胞移植后的长期显像研究;同时利用含GLP-1R报告基因的BV-AAV(BIGV)感染hUCB-MSCs,并进行移植后的报告基因显像监测。结果:通过杆状病毒表达系统可较快速地制备高滴度病毒(均在108 pfu/mL以上)。体外研究显示,BIeV感染rBM-MSCs和hUCB-MSCs后,介导表达eGFP的阳性细胞比例(eGFP+%)在病毒感染复数(MOI)为200时分别可达到84.25±1.38%和76.73±3.75%,eGFP+%分别在19 d或11 d内逐渐降至10%以下,且BV-AAV对两者的感染未表现出细胞毒性和对细胞增殖的影响。BIhV感染的rBM-MSCs和hUCB-MSCs均可在体外摄取125I-,且均在30 min达到摄取最高峰,该125I-摄取可被高氯酸钠抑制。此外,体外相关性研究显示BIhV感染的干细胞数量与其摄取的125I-放射性计数呈显着的相关性(分别为R2=0.9026和R2=0.9940)。经125I-显像剂和小动物micro-SPECT/CT显像表明,BIhV感染的两类干细胞移植部位均清晰显像,靶/本比高,移植部位放射性信号在120 min内逐渐降低。进一步构建和制备含不同结构的BV并感染肿瘤细胞(FTC-133细胞和U87细胞),通过流式细胞术等方法对比研究表明,经SB100×改良BV感染和药物筛选获得的肿瘤细胞系(FTC-133-eN细胞和U87-eN细胞)可表达eGFP达180 d;将U87-eN细胞移植入裸鼠后的小动物荧光显像表明,移植部位的细胞可通过eGFP报告基因显像进行35 d的长期监测;将筛选获得的稳定表达GLP-1R的肿瘤细胞系(FTC-133-GN细胞)移植入裸鼠后,经[18F]AlF-NOTA-MAL-Cys39-exendin-4显像剂和小动物micro-PET显像同样获得50 d的GLP-1R报告基因显像监测,肿瘤移植部位清晰显像,靶/本比高,显像剂注射后120 min内未见明显的肿瘤移植部位放射性信号降低;同时,利用携带GLP-1R报告基因的BV-AAV(BIGV)感染hUCB-MSCs,移植后进行小动物micro-PET显像同样可见较理想的显像效果。结论:BV-AAV对rBM-MSCs和hUCB-MSCs的感染效率较高,且无细胞毒性,可介导hNIS报告基因显像监测移植的干细胞,因此利用BV-AAV介导核素报告基因监测干细胞移植具有可行性。同时,经SB100×改良的BV可以介导报告基因长期表达,从而实现移植细胞的长期体内监测;此外,GLP-1R核素报告基因显像效果理想,是具有发展潜力的核素报告基因显像系统。
黄暨生[5](2016)在《木犀草素、芹菜素及槲皮素对黑色素瘤自杀基因治疗的增效研究》文中提出恶性肿瘤是21世纪以来严重危害人类健康的主要疾病之一,是目前导致人类死亡的主要原因之一。随着细胞生物学和分子生物学日新月异的发展,基因治疗对恶性肿瘤的治疗有着重要作用,特别是自杀基因治疗,已经成为继传统治疗手段(如手术治疗、放疗、化疗等)后一种治疗肿瘤最具希望和挑战的措施。本研究通过构建重组慢病毒介导的绿色荧光示踪蛋白单纯疱疹病毒胸苷激酶HSV-tk/GCV自杀基因治疗系统基因载体,获得重组活病毒并感染人黑色素瘤细胞A375,在确定黄酮类中药活性成分木犀草素、芹菜素及槲皮素对细胞缝隙连接功能(GJIC)的促进作用,进一步将中药活性成分与自杀基因治疗系统组成联合治疗方案,研究中药活性成分联合自杀基因治疗系统的增效作用,通过本研究探讨将自杀基因联合中药方药活性成分的中西医结合基因治疗肿瘤方案的可行性。一、方法(一)人黑色素瘤细胞A375 HSVl-tk/GCV肿瘤自杀基因治疗系统的构建1绿色荧光蛋白示踪的HSV1-tk/GCV系统重组慢病毒载体的构建设计引物,提取HEK293细胞总RNA, PCR反应扩增tk基因后,产物进行1%琼脂糖凝胶电泳,切胶回收。对tk基因PCR扩增产物及CD511B质粒分别进行双酶切,T4 DNA连接酶连接;将连接产物转化大肠杆菌DH5a,提取质粒。重组质粒使用限制性内切酶消化进行鉴定及序列测定;将构建含有HSV1-tk、GFP融合基因的重组慢病毒质粒命名为pLV-tk/GFP。2人黑色素瘤细胞A375 HSV1-tk/GCV肿瘤自杀基因治疗系统的构建用该重组质粒pLV-tk/GFP与包装质粒共转染包装细胞HEK293T,获得重组活病毒并感染人黑色素瘤细胞A375,用嘌呤霉素筛选获得稳定表达细胞株;使用荧光显微镜观察GFP基因的表达,GCV杀伤实验验证tk-GFP基因的活性。将筛选获得稳定表达细胞命名为A375-tk/GFP.(二)木犀草素、芹菜素及槲皮素对人黑色素瘤细胞缝隙连接通讯功能的作用1 MTT法检测人黑色素瘤细胞A375生长曲线。2 MTT法检测0~100μmol/L木犀草素、芹菜素、槲皮素对A375细胞生长的影响,以确定用于研究的药物浓度。3荧光显微镜观察及流式细胞仪荧光示踪法分析缝隙连接通讯(GJIC)功能变化。用预标记双染料传输流式细胞术检测0~20μmol/L木犀草素、0-10μmol/L芹菜素及0~20μmol/L槲皮素对A375细胞GJIC功能的影响,并用荧光显微镜拍照记录实验结果。检测并计算单绿色荧光细胞数量与荧光双阴性细胞数量的比值,作为评价GJIC功能的指标;比值越大表示细胞间形成GJIC功能越强。4 Western Blot检测0~20μmol/L木犀草素、芹菜素及槲皮素对A375细胞缝隙连接蛋白Cx43、Cx26表达的影响,对图像进行扫描分析。(三)木犀草素、芹菜素及槲皮素对人黑色素瘤细胞自杀基因的增效作用1 MTT法检测0、2、5μmol/L GCV对0、20%、40%、60%、80%、100% A375-tk/GFP(tk+)细胞混合A375(tk-)细胞作用72h生长的影响,以确定联合作用GCV浓度和tk+细胞的混合比例。2 MTT法检测杀伤效应。将tk+细胞按20%比例混合tk-细胞接种到96孔板。混合细胞分为空白组、GCV组、木犀草素组、芹菜素组、槲皮素组、木犀草素联合GCV组、芹菜素联合GCV组和槲皮素联合GCV组。培养24h后根据分组给药,72h后以MTT检测各组杀伤效应。3荧光显微镜观察及流式细胞仪PI单染分析细胞凋亡。将tk+细胞按20%比例混合tk-细胞接种到12孔板。混合细胞分为空白组、GCV组、木犀草素组、芹菜素组、槲皮素组、木犀草素联合GCV组、芹菜素联合GCV组和槲皮素联合GCV组。培养24h后根据分组给药,72h后以PI单染,流式细胞仪检测各组细胞凋亡的情况,并用荧光显微镜拍照记录实验结果。二、结果(一)人黑色素瘤细胞A375 HSVl-tk/GCV肿瘤自杀基因治疗系统的构建1绿色荧光蛋白示踪的HSV1-tk/GCV系统重组慢病毒载体的构建重组慢病毒质粒pLV-tk/GFP分子量约为10.0kb,经限制性酶切鉴定和DNA序列测定分析显示,证明目的基因tk已经成功连接到载体正确位置,测序结果与原始载体序列比对,相应序列100%完全一致,证明携带目的基因HSV1-tk的质粒pLV-tk/GFP构建成功。2人黑色素瘤细胞A375 HSV1-tk/GCV肿瘤自杀基因治疗系统的构建pLV-tk/GFP感染A375细胞用0 .5μg/mL嘌呤霉素维持筛选浓度2周,荧光显微镜观察GFP的表达随着时间的延长而逐渐增多、荧光增强,最终获得重组基因整合到染色体上的稳定表达细胞株,命名为A375-tk/GFP。采用MTT法检测GCV对A375细胞、A375-tk/GFP细胞进行杀伤试验,GCV作用72h的细胞存活率结果显示,GCV对A375-tk/GFP细胞有明显的杀伤作用,而对未感染重组慢病毒的对照组A375细胞无明显细胞毒作用。结果表明重组质粒经包装后产生上清液含具有感染性的病毒颗粒,感染细胞后筛选的阳性抗性克隆细胞A375-tk/GFP能正常表达tk/GFP基因,表达产物具有生物活性。(二)木犀草素、芹菜素及槲皮素对人黑色素瘤细胞缝隙连接通讯功能的作用1木犀草素、芹菜素、槲皮素对A375细胞生长有较为明显的抑制效应,6.25~100μmol/L木犀草素、芹菜素及槲皮素对A375细胞杀伤作用呈时间和剂量依赖关系;本研究主要探讨木犀草素、芹菜素及槲皮素通过GJIC或细胞凋亡机制增强对A375-tk/GCV自杀基因治疗系统的旁观者效应,故选用2.5~20μmol/L木犀草素、芹菜素及5~40μmol/L槲皮素进行后续试验。2流式细胞术及Western Blot检测细胞缝隙连接功能和缝隙连接蛋白的表达,结果发现木犀草素、芹菜素及槲皮素可以通过提高肿瘤细胞缝隙连接蛋白的Cx43和Cx26表达水平,促进缝隙连接通讯的功能从而起到与自杀基因治疗系统的协同增效作用,旁观者效应也可能是通过GJIC机制发生的。(三)木犀草素、芹菜素及槲皮素对人黑色素瘤细胞自杀基因的增效作用1 MTT法检测2、5μmol/LGCV对20%~100% A375-tk/GFP细胞混合比例作用72h后,对显着的杀伤作用,为了观察木犀草素、芹菜素及槲皮素联合tk/GCV治疗系统,通过缝隙连接机制或细胞凋亡机制增强对A375-tk/GCV自杀基因治疗系统的旁观者效应,故选用5μmol/L GCV和20% A375-tk/GFP细胞混合比例进行后续实验验。2木犀草素、芹菜素及槲皮素联合tk/GCV组对肿瘤细胞的抑制率明显比相应浓度单药组和单纯tk/GCV组高(P<0.05),说明木犀草素、芹菜素及槲皮素联合tk/GCV系统能显着提高tk+和tk-混合细胞对GCV的敏感性。5、10μmol/L木犀草素联合tk/GCV组,5、10、20μmol/L芹菜素联合tk/GCV组,10、20μmol/L槲皮素联合tk/GCV组,Q值均≥1.15,说明5、10μmol/L木犀草素、5、10、20μmol/L芹菜素及10、20μmol/L槲皮素具有协同性增强tk/GCV系统杀伤效应的作用。3 PI单染检测细胞凋亡结果显示,各中药活性成分联合tk/GCV组的细胞凋亡率均高于单纯中药活性成分组,PI单染法检测结果各组细胞凋亡率的趋势与MTT结果一致,实验证明,木犀草素、芹菜素及槲皮素对A375-tk/GFP自杀基因治疗系统具有增效作用。三、结论及展望上述实验结果表明:①我们已成功构建了绿色荧光示踪蛋白慢病毒介导的HSV-tk/GCV肿瘤自杀基因治疗系统;②中药活性成分木犀草素、芹菜素及槲皮素可以通过提高缝隙连接蛋白的表达水平促进细胞间缝隙连接功能;③将中药活性成分和自杀基因疗法组成联合治疗方案,对人黑色素瘤自杀基因治疗系统具有协同增效作用。通过对人恶性黑色素瘤治疗的实验研究,表明自杀基因疗法联合中药方药活性成分,能够通过促进缝隙连接机制发挥协同抗肿瘤作用,中药方药活性成分能够提高肿瘤自杀基因治疗的效果。初步证明了建立自杀基因联合中药方药活性成分的中西医结合基因治疗肿瘤方案具有可行性。将中药方药活性成分与肿瘤自杀基因治疗联合,体外实验对自杀基因治疗系统旁杀伤效应的研究结果显示,中药方药活性成分能协同增强肿瘤自杀基因旁杀伤效应的效果,其可能机制与中药方药活性成分通过促进细胞间缝隙连接通讯功能(即缝隙连接机制)发挥作用。进一步可以将其他的中药方药活性成分或旁杀伤效应的其他增效机制,以及体内实验研究做为我们今后研究工作方向的重点。目前肿瘤自杀基因治疗尚未成熟,但通过将祖国传统医学与现代医学结合,联合自杀基因治疗的增效作用的研究、建立及优化工作将大有可为。
邵丹[6](2015)在《多功能纳米粒子在肝癌诊治一体化中的应用研究》文中研究表明肝癌是严重危害我国人民健康的恶性肿瘤之一,尽管以手术切除为基础、并辅助化疗、热疗等综合治疗部分改善了肝癌的治疗效果,但是肝癌患者的长期存活率仍然较低。由于大多数原发性肝癌患者的病情隐匿、潜伏期长、肿瘤生长迅速导致早期诊断困难,而且治疗后的耐药、复发和转移成为了肝癌患者死亡的主要原因。因此,早期精确诊断、提高药物的靶向性、降低治疗的毒副作用成为目前肝癌诊治的挑战。近年来,纳米技术的兴起为攻克临床上肝癌诊治的难题带来了新的机遇,而作为纳米技术和生物医学的结晶,纳米医学已成为当前最具有转化潜力的交叉学科之一。纳米药物载体是为纳米医学领域研究的热点,其中无机纳米粒子作为纳米材料领域的后起之秀,以其独特的纳米结构和性能以及良好的稳定性、高产量、低成本等优势备受纳米医学工作者的关注。目前整合了诊断和治疗特点的多功能纳米平台引起了研究者们的广泛关注,此类多功能无机纳米材料须具备以下三个特点:(1)通过多种分子影像学手段实现对肿瘤的早期精确诊断。(2)联合多种治疗手段协同治疗肿瘤,在提高治疗效果的同时降低副作用。(3)对药物的肿瘤靶向运输、释放和治疗效果进行实时示踪,指导并调整给药剂量,实现肿瘤的个体化治疗。基于无机纳米材料的上述优点,本博士论文紧绕改善肝癌诊治效果这一中心目标,针对临床肝癌诊治中早期诊断难、传统化疗毒性大、效果差以及基因治疗靶向性差三大挑战,分别以量子点和磁性介孔二氧化硅两种无机纳米粒子为基础,发展智能分子设计、纳米特性控制、靶向分子修饰等纳米药物技术,构筑高效、安全的多功能纳米平台,开发具有靶向肝癌的基因治疗和降低肝癌化疗毒副作用的新型纳米药物,揭示其选择性杀伤肝癌细胞的分子机制;利用分子影像学技术对药物在体内的运输和释放过程进行实时示踪,并对肝癌治疗效果与生物安全性进行系统性评价;终而实现肝癌的诊治一体化。本论文主要创新性研究成果概括如下:(1)为了实时示踪HSV-TK/GCV自杀基因系统,我们成功的将量子点偶联TK基因,证实生物偶联既不影响量子点的发光特性,也不影响TK基因的生物学活性,实时示踪发现TK基因于转染24h进入胞核并表达TK蛋白,确定24h为GCV的最佳给予时间,并在体内外成功对HSV-TK/GCV自杀基因系统的抗肝癌效果进行监测,提示量子点可以作为示踪HSV-TK/GCV自杀基因系统的理想载体。(2)为了实现自杀基因的靶向肝癌治疗,我们成功构筑叶酸脂质体担载量子点自杀基因复合体(FL/QD-TK),证实其可在体外靶向和选择性杀伤叶酸受体高表达肝癌细胞,并可在体内外可视化示踪TK基因运输和治疗效果,同时具备了较好的生物安全性,提示FL/QD-TK作为一种潜在的高效低毒的纳米基因药物有望应用于肝癌的诊治一体化。(3)为了驾驭镉系量子点的生物毒性用于肝癌治疗,我们成功的制备出量子点脂质复合体(QD-LC),证实其可通过巨胞饮途径大量内吞进入肝癌细胞产生大量的ROS,通过线粒体依赖的Caspase凋亡途径选择性杀伤肝癌细胞。QD-LC还可抑制肝癌微小瘤灶的形成,并在实现肝癌荷瘤有效治疗的同时具备了较好的生物安全性,提示可利用镉系量子点内源性毒性实现肝癌的选择性治疗。(4)为了提高化疗药物治疗肝癌的有效性并降低毒副作用,我们通过优化反应条件制备出粒径合适、形貌均一的Janus型磁性介孔二氧化硅纳米粒子(M-MSNs),担载化疗药物DOX得到的Janus型M-MSNs-DOX具备了外加磁场介导的作用,证实Janus型M-MSNs-DOX可在体内外实现选择性肝癌治疗的效果,并具备了较好生物安全性。我们还证实外加磁场可增强Janus型M-MSNs-DOX的肝癌细胞内吞作用和在肿瘤部位的富集,且不影响其生物安全性。最后我们在体内外成功实现了肝癌诊治一体化的目标,提示Janus型M-MSNs有望解决肝癌化疗靶向性差、毒副作用大的弊端,实现肝癌的诊治一体化。综上所述,本论文通过构筑多功能纳米诊治平台,对肝癌靶向自杀基因治疗的监测、利用纳米毒性选择性治疗肝癌以及实现高效低毒的肝癌化疗策略进行了系统而又深入的研究,不仅成功实现了肝癌的诊治一体化,也为早日实现肝癌的早期诊断和个体化治疗提供新方法和新思路。
朱瑞东,李宁[7](2014)在《腺病毒介导的胸苷激酶基因治疗肝癌的研究进展》文中指出肝癌是我国常见的恶性肿瘤,针对肝癌的传统治疗方法疗效欠佳、患者预后较差。近10余年来,随着分子生物学技术的发展,肝癌的基因治疗成为该领域新的研究方向和热点,其中以腺病毒为载体的单纯疱疹病毒胸苷激酶自杀基因系统(ADV-tk)对肝癌的治疗研究开展得最早也最为广泛。其原理是把单纯疱疹病毒胸苷激酶基因通过腺病毒导入细胞内,利用其产生的酶将无毒的药物前体更昔洛韦(GCV)转变成细胞毒性产物,从而杀死肝癌细胞。多项动物实验和临床研究结果表明:ADV-tk/GCV系统是治疗肝癌的有效方法。本文总结近年来ADV-tk/GCV系统在肝癌治疗中取得的研究进展,分别从载体的发展过程、基因的作用机制、导入方式、增强杀伤效力、降低肝毒性以及相关动物模型的改进等几个方面进行综述。
李玢[8](2014)在《薯蓣皂苷通过GJ机制发挥对B16细胞自杀基因的增效作用》文中进行了进一步梳理一、研究的目的及意义自杀基因疗法因存在旁杀伤效应的独特机制而成为具有广泛应用前景的肿瘤治疗新方法,增强自杀基因治疗的效果成为研究热点。课题组前期研究表明,体外较低浓度薯蓣皂苷可促进人肾癌786-0细胞缝隙连接的通讯功能,但其作用机制尚未明确。本研究在确定薯蓣皂苷(Dio)具有对小鼠B16HSV-tk/GCV自杀基因治疗系统的增效作用后,通过构建促进/抑制缝隙连接通讯(GJIC)功能的细胞模型,以进一步研究可能是薯蓣皂苷对自杀基因治疗系统发挥增效作用的重要机制——缝隙连接机制。二、方法(一)薯蓣皂苷对小鼠黑色素瘤细胞缝隙连接通讯功能的影响1MTT法检测0-8μMDio对B16细胞生长的影响,以确定用于研究GJIC功能的Dio浓度。2预标记双染料传输流式细胞术检测0-4μMDio对B16细胞GJIC功能的影响,用流式细胞仪分析预先以药物处理及染色标记细胞的缝隙连接功能,检测并计算单绿色荧光细胞数量与荧光双阴性细胞数量的比值,作为评价缝隙连接功能的指标;比值越大表示细胞间形成的缝隙连接细胞间通讯功能越强。3qPCR检测0-4μMDio对B16细胞Cx43、Cx32、Cx26基因转录的影响,结果用2-ΔΔct法进行相对定量分析Cx43、Cx32、Cx26mRNA水平。4Western Blot检测0-4μMDio对B16细胞Cx43、Cx32、Cx26蛋白表达的影响,对图像进行扫描和分析。(二)薯蓣皂苷对B16HSV-tk/GCV自杀基因治疗系统的增效作用1MTT法检测杀伤效应。将B16与B16HSV-tk细胞按3:2比例混合接种到96孔板。混合细胞分为空白组、RA阳性对照组、GCV组、Dio组、Dio+GCV联合组。培养24h后根据分组给药,48h后以MTT法检测各给药组杀伤效应。2Annexin V单染法检测细胞凋亡。将B16与B16HSV-tk细胞按3:2比例混合接种到6孔板。混合细胞分为空白组、RA阳性对照组、GCV组、Dio组、Dio+GCV联合组。培养24h后根据分组给药,48h后AnnexinV单染,流式细胞仪检测各给药组细胞凋亡情况。(三)阻断缝隙连接功能对薯蓣皂苷在自杀基因治疗系统中增效作用的影响1构建pLVmCterry-Cx43慢病毒载体质粒:设计引物,提取HEK293细胞总RNA, PCR反应后扩增产物行1%琼脂糖凝胶电泳,切胶回收。对Cx43PCR扩增产物及pLVmCherry质粒分别进行双酶切,T4DNA连接酶连接;将连接产物转化大肠杆菌DH5α,提取质粒。重组质粒电泳及测序鉴定。所构建的质粒命名为pLVmCherry-Cx43。2构建pLVmCherry-Cx43G21R、pLVmCherry-Cx43G138R基因定点突变慢病毒载体质粒:利用定点突变技术,设计包含一对突变位点的引物,以前期构建的pLVmCherry-Cx43为模版扩增质粒全长,产物用Dpn I消化后转化大肠杆菌DH5α。挑单克隆测序鉴定,所构建基因定点突变阳性克隆质粒命名为pLVmCherry-Cx43G21R、pLVmCherry-Cx43G138R。3构建过表达野生型Cx43、突变型Cx43G21R、突变型Cx43G138R的B16细胞株:提取pLVmCherry-Cx43、pLVmCherry-Cx43G21R, pLVmCherry-Cx43G138R重组慢毒质粒,以293T细胞包装病毒感染B16细胞,5d后观察mCherry表达。所获细胞放大培养后用BD公司FACSJazz型流式细胞仪分选红色荧光细胞,获得稳定过表达细胞株。Western Blot法检测所获稳定株Cx43蛋白表达情况。4荧光示踪法分析缝隙连接功能:供体细胞用5μM的Calcein-AM孵育30min。将供体细胞按1:100比例接种到受体细胞上,继续培养6小时,待形成稳定的GJ后,用荧光显微镜观察分析GJIC功能。实验组与对照组平均每个供体细胞周围发绿色荧光的受体细胞个数的比值,作为评价GJ功能的指标。5MTT法检测过表达野生型Cx43、突变型Cx43G21R、突变型Cx43G138R对B16HSV-tk/GCV自杀基因治疗系统的影响:将B16与B16HSV-tk细胞按3:2比例混合接种到96孔板,混合细胞分为空白组、GCV组、GCV联合薯蓣皂苷组;B16-Cx43与B16HSV-tk按3:2比例混合接种到96孔板,混合细胞分为空白组、GCV组;B16-Cx43G21R与B16HSV-tk、B16-Cx43G138R与B16HSV-tk分别按3:2比例混合接种到96孔板,混合细胞分为空白组、GCV组、GCV联合薯蓣皂苷组。上述混合细胞培养24小时后加药,终浓度为GCV25μM、Dio4μM,每孔培养液总体积200μl,置于37℃、体积分数5%CO2的培养箱培养。48小时后MTT法检测杀伤效应。三、结果(一)薯蓣皂苷对小鼠黑色素瘤细胞缝隙连接通讯功能的影响1MTT法检测不同浓度Dio对B16细胞生长的影响:0-4μM Dio处理B16细胞48小时对其生长无明显影响。2预标记双染料传输流式细胞术检测0-4μM Dio对B16细胞GJIC功能的影响:与对照组相比,B16细胞经各浓度梯度Dio处理48小时后,单绿荧光细胞与双阴细胞的比值随加药浓度的升高而增大,表明体外较低浓度Dio能有效促进B16细胞缝隙连接功能,且存在明显的剂量效应关系。3qPCR检测不同浓度Dio对B16细胞Cx43、Cx32、Cx26基因转录的影响:Dio处理细胞48小时,对Cx43及Cx32的RNA转录无明显影响、对Cx26的RNA转录有明显促进作用;4μM Dio处理细胞48小时,明显促进Cx43及Cx32的RNA转录、对Cx26的RNA的转录有明显抑制作用。4Western Blot检测Dio对B16细胞Cx43、Cx32、Cx26蛋白表达的影响:与对照组相比,经0-4μM Dio处理48小时后,Cx43与Cx26蛋白的表达量随加药浓度的升高而增加、Cx32的表达量随加药浓度的升高而减少,表明Dio能有效促进B16细胞缝隙连接蛋白Cx43及Cx26的表达、抑制Cx32的表达。(二)薯蓣皂苷对B16HSV-tk/GCV自杀基因治疗系统的增效作用1MTT实验表明联合用药组对60%B16与40%B16/tk混合细胞的抑制率明显高于其他组,25μM GCV+2μM Dio组实际抑制率为49.2%,25μMGCV+4μMDio组实际抑制率为56.5%显着高于理论抑制率(32.4%,35.3%),且与25μM GCV组抑制率存在显着统计学差异;金正钧Q值分别为1.52、1.60,均大于1.15,说明Dio与GCV具有协同增效作用,Dio对B16HSV-tk/GCV自杀基因治疗系统具有增效作用。2AnnexinV单染检测细胞凋亡结果显示,联合用药组的细胞早期凋亡率均高于单药组,其中以4μM Dio+25μM GCV组细胞早期凋亡率最高(61.09%)。AnnexinV单染法检测各组细胞凋亡率的趋势与MTT结果一致。(三)阻断缝隙连接功能对薯蓣皂苷在自杀基因治疗系统中增效作用的影响1构建pLVmCherry-Cx43’慢病毒载体质粒:对质粒pLVmCherry-Cx43的DNA酶切电泳,可见约8kb(空载体pLVmCherry大小8.2kb)和1kb大小两条带,符合预期结果;pLVmCherry-Cx43中Cx43测序结果与NM000165序列完全一致。2构建pLVmCherry-Cx43G21R、 pLVmCherry-Cx43G138R基因定点突变慢病毒载体质粒:对质粒pLVmCherry-Cx43-G21R、pLVmCherry-Cx43-G138R的DNA酶切电泳,均可见约8kb和lkb大小两条带;重组质粒pLVCx43-mCherry-G21R测序结果显示,其按引物设计第61位鸟嘌呤突变为腺嘌呤,其余序列完全一致;pLVmCherry-Cx43-G138R测序结果显示,其按引物设计第412位鸟嘌呤突变为腺嘌呤、第414位胸腺嘧啶突变为鸟嘌呤,其余序列完全一致。3构建过表达野生型Cx43、突变型Cx43G21R、突变型Cx43G138R的B16细胞株:将重组质粒包装病毒,感染B16细胞5d后荧光显微镜下即可见细胞有mCherry表达;mCherry的表达随着时间的延长而逐渐增多、荧光增强。Western Blot检测稳定株缝隙连接蛋白,过表达野生型Cx43、突变型Cx43G21R、突变型Cx43G138R的B16细胞Cx43蛋白表达量明显高于对照组。4荧光示踪法分析缝隙连接功能:过表达野生型Cx43后B16细胞间钙黄绿素传递较正常组增强,过表达突变型Cx43G21R、Cx43G138R后B16细胞间钙黄绿素传递缝隙连接功能较正常组减弱。5MTT法检测过表达野生型Cx43、突变型Cx43G21R、突变型Cx43G138R对B16HSV-tk/GCV自杀基因治疗系统的影响:混合细胞培养24小时、48小时生长情况无明显差异;培养72小时,B16-Cx43混合组生长情况较其他混合细胞缓慢。GCV组B16与B16HSV-tk混合细胞抑制率为27.46%,B16-Cx43与B16HSV-tk混合细胞抑制率为46.32%(P<0.05vs B16与B16HSV-tk混合细胞),B16-Cx43G21R与B16HSV-tk混合细胞抑制率为25.07%, B16-Cx43G138R混合细胞抑制率为26.44%;GCV+Dio联合组B16与B16HSV-tk混合细胞抑制率为54.78%,B16-Cx43G21R与B16HSV-tk混合细胞抑制率为32.08%(P<0.05vs B16与B16HSV-tk混合细胞),B16-Cx43G138R混合细胞抑制率为33.21%(P<0.05vsB16与B16HSV-tk混合细胞)。GCV对混合细胞含过表达野生型Cx43的B16细胞株抑制率,高于混合细胞含普通B16细胞组;Dio与GCV联合组,对混合细胞含过表达突变型Cx43G21R或过表达突变型Cx43G138R的B16细胞株抑制率,低于含普通B16细胞组,且与单纯GCV组无明显统计学差异。四、结论与展望(一)0-4μM Dio处理B16细胞48小时对其生长无明显影响;体外低浓度Dio对B16细胞GJIC功能具有促进作用,且呈量效关系。其作用机制可能由于Dio可促进部分Cx蛋白的表达,从而促进GJIC功能。(二)Dio对B16HSV-tk/GCV自杀基因治疗系统具有增效作用。(三)成功构建野生型Cx43、突变型Cx43G21R、突变型Cx43G138R慢病毒载体质粒;获得稳定过表达野生型Cx43、过表达突变型Cx43G21R以及过表达突变型Cx43G138R的B16细胞株。过表达野生型Cx43可促进B16细胞株GJIC功能,过表达突变型Cx43G21R, Cx43G138R可抑制其GJIC功能。(四)旁杀伤效应的缝隙连接机制,是Dio发挥对B16HSV-tk/GCV自杀基因治疗系统增效作用的重要机制。本研究将中药单体与自杀基因联合应用,在证实体外较低浓度薯蓣皂苷具有促进B16细胞GJIC功能、可增强自杀基因治疗系统旁杀伤效应的基础上,构建过表达Cx43功能正常及功能缺陷细胞株,通过促进及阻断缝隙连接通讯的方式进一步研究自杀基因疗法旁杀伤效应的缝隙连接机制,为中药方药对自杀基因治疗系统增效作用及机制等相关研究奠定更好的实验基础。
田宇飞[9](2013)在《表达新城疫病毒血凝素—神经氨酸基因溶瘤腺病毒的抑瘤作用》文中研究说明虽然近年来治疗技术有了长足的进步,但恶性肿瘤仍然是世界性难题。基于腺病毒载体的基因治疗进展迅速,并已经开展了大量的临床前和临床研究,其中CRCA受到了广泛的关注。由于CRCA具有肿瘤特异性复制的功能,此类溶瘤腺病毒还可以扩散到毗邻的肿瘤细胞。另外,研究表明CRCA的应用还能够刺激机体产生抗肿瘤免疫反应,从而对放、化疗起到辅助作用。更重要的是,配合恰当的抑癌基因,CRCA具有治疗原发和转移肿瘤的作用。肿瘤治疗的成功不仅取决于其清除肿瘤细胞的有效性,特异性也是关键的指标之一。基于NDV的疫苗已在畜禽养殖业和兽医领域取得了瞩目的社会和经济效益,另外,这种病毒还具有抗肿瘤作用。Cassel早在19世纪60年代就发现NDV的抑癌作用,并在临床应用NDV73T进行了恶性黑色素瘤的实验性治疗研究。HN蛋白是NDV最主要的结构蛋白之一,通过疏水N端连接病毒囊膜。HN蛋白同时具有血凝素活性和类似流感病毒的神经氨酸酶活性,具有通过与靶细胞表面NAcneu相互作用调节病毒感染与复制的功能。与流感病毒不同的是,HN的NA和HA存在于同一功能结构域中。因此,HN糖蛋白不仅可以介导受体的识别,并且能够发挥NA活性裂解NAcneu等受体。以往的研究表明,做为抗肿瘤免疫佐剂,HN蛋白具有活化DC、单核细胞、NK、激活IL-12受体p链和稳定活化的T细胞的作用。另外,HN能够刺激DC等PBMC产生大量的IFN-α,其分泌量可高于其他血细胞1000倍以上。在IL-12和IFN-α的协同作用下,HN能够激活T细胞、诱导产生迟发型免疫反应、CTL和Thl型细胞免疫反应。HN诱导产生的IFN-a还能够上调系列与抗原识别、细胞相互作用、细胞黏附和细胞作用相关的功能因子。目前,人类基因治疗领域的研究中有27%应用腺病毒载体。最常见的是第一代腺病毒载体,此类载体是E1基因缺失型的复制缺陷型载体。E1基因在腺病毒感染宿主细胞后即开始表达,并参与病毒基因表达、宿主细胞蛋白和病毒复制相关蛋白表达调控。其中E1A与E1B的功能与肿瘤抑制基因Rb和p53的激活有关。在第一代腺病毒载体出现后,又出现了其他腺病毒载体(E1和E3缺失、E2缺失、E4缺失、E2和E4缺失、E1/E2/E4缺失等)。研究表明,E3基因与病毒感染和宿主免疫调控有关。E2和E4基因则与转录调节、DNA重组和病毒装配等过程有关。许多腺病毒载体候选药物,如ONYX-015(d11520),已开展了体内、外研究,甚至已进入临床研究阶段。但是,由于出现腺病毒相关临床实验副反应的报道,腺病毒载体候选药物的安全性受到了质疑。由于腺病毒载体半衰期较短,并存在抗载体免疫的问题,因此,人们试图通过加大药物剂量提高其抗肿瘤作用,但这种方法存在产生肝毒性和免疫副反应的可能。基于以上原因,腺病毒载体候选药物的系统应用受到了限制。为克服上述缺陷,人们开展了大量研究,这包括利用其他血清型腺病毒制备腺病毒载体、改造腺病毒载体衣壳蛋白、制备病毒/非病毒杂交载体等。本研究中,我们利用以往构建的重组腺病毒Ad-HN-PEG3p-E1a,开展了抗肿瘤作用研究。该重组病毒通过PEG3p启动子实现了肿瘤特异性复制,通过NDVHN实现了肿瘤特异性杀伤。MTT实验结果表明,当Ad-HN-PEG3p-E1a作用于人肝癌细胞HepG-2时,其抑瘤作用在48h时开始显现,当感染剂量为100MOI或10MOI时,其抑瘤作用在4d后已十分明显,但感染剂量为1MOI时,抑瘤作用相对较弱。在L02细胞的情况与HepG-2细胞实验组不同,Ad-HN-PEG3p-E1a对其未产生明显的抑制作用。另外,annexin V染色实验结果表明,虽然Ad-HN-PEG3p-E1a实验组、Ad-EGFP-PEG3p-E1a实验组和Ad-HN实验组均出现不同程度的抑瘤现象,但Ad-HN-PEG3p-E1a细胞凋亡比例稍高。上述实验说明,Ad-HN-PEG3p-E1a能够通过诱导HepG-2肿瘤细胞凋亡实现对HepG-2肿瘤细胞的抑制作用。本研究还对Ad-HN-PEG3p-E1a的体内抑瘤作用进行了研究,结果进一步验证了体外实验的结果。实验证明,虽然Ad-HN-PEG3p-E1a不能完全清除模型动物体内实体肿瘤,但却明显延缓了实体肿瘤的发展。另外,实验还表明,Ad-HN-PEG3p-E1a感染的HepG-2肿瘤细胞能够刺激NK产生抗肿瘤细胞因子,并增强NK细胞对HepG-2肿瘤的杀伤。体内的研究并未发现Ad-HN-PEG3p-E1a对模型动物的明显毒副作用。因此,Ad-HN-PEG3p-E1a具有应用于肿瘤治疗和研究领域的潜质。
周世骥[10](2012)在《高强度聚焦超声联合载HSV1-TK自杀基因超声微泡造影剂治疗肝癌的实验研究》文中研究指明肝细胞癌(Hepatocellular Carcinoma,HCC)在我国发病率高,危害性大,目前仍以手术为主的综合治疗,虽然外科手术如肝叶切除或肝脏移植,能提供一个较好的远期预后,但诸多因素使得适合和接受手术者仅为20%左右。近十年来,HCC局部治疗手段,特别是高强度聚焦超声(High intensity focused ultrasound, HIFU)的应用愈发广泛,因其适应证宽,对患者全身情况要求不高,对巨块型,多结节型肝癌均可治疗并能取得了较好的疗效,目前已成为最有前途的肝癌辅助治疗方法之一。但因诸多因素如肋骨遮挡、呼吸运动、肿瘤丰富的血供等影响,使得HIFU在治疗肝癌时存在肿瘤组织残存的缺陷。为了解决这一难题,目前使用的方法即联合其他的治疗手段如联合化疗、基因治疗、介入等,以弥补该方法的缺陷,使HIFU治疗肝癌更加的彻底。目前肝癌的基因治疗根据肝癌的发病机制分为免疫基因治疗、抑癌基因治疗、反义基因治疗、自杀基因治疗、抗肿瘤血管生成基因治疗、多药耐药基因治疗等,而自杀基因疗法尤其是其中单纯疱疹病毒Ⅰ型胸苷激酶/更昔洛韦(Herpes simplexvirus type1thymidine kinase/Gancyclovir, HSV1-TK/GCV)自杀基因治疗系统成为了目前肝癌基因治疗中最有前途的治疗方法之一。HSV1-TK/GCV自杀基因系统作为肝癌基因治疗的手段之一,其主要是通过TK蛋白将无毒的前药GCV经过多次磷酸化转变成细胞毒性的三磷酸化合物(Ganciclovir triphosphate, GCV-TP), GCV-TP能抑制DNA聚合酶活性,阻止DNA自我复制,从而杀灭肿癌细胞;同时该系统还能将毒性产物通过细胞间隙连接或直接分泌到细胞外,通过诱导癌细胞凋亡或免疫介导等途径杀死周边未被转染的瘤细胞而发挥“旁观者效应”,而与其他治疗基因一样,外源基因载体系统的选择成为基因治疗亟待解决的问题之一。目前基因载体系统包括两大类,即病毒载体和非病毒载体。病毒载体包括腺病毒、慢病毒、逆转录病毒等,其主要优点为转染效率高,但是其安全性有待进一步提高;非病毒载体包括脂质体、质粒DNA等,其优点是安全性较高、可反复利用,但是其转染效率较低、缺乏主动靶向性,因而限制其临床应用。超声靶向微泡破坏(Utrasound-targeted microbubble destruction,UTMD)技术是新近出现的一种基因或药物靶向递送系统。该技术通过体外超声靶向破坏经血液循环到靶组织携带有药物或外源基因的超声微泡造影剂使药物或外源基因靶向释放,实现药物或治疗基因的靶向递送。当超声波击碎超声微泡时产生的空化效应能使肿瘤毛细血管通透性增高,增加血管内皮间隙使外源基因更容易进入肿瘤组织内,提高了外源基因的转染率,同时该技术使用的低频超声不但不会对外源基因产生任何破坏,还能增加外源基因的转染率,从而提高基因治疗肿瘤的效果。超声微泡合成材料为脂质材料,脂溶性好,对生物体的安全性高且低免疫原性,可重复使用。而超声微泡造影剂作为基因载体的同时本身具备超声造影的功能,能提高肝癌的检出率,提高治疗基因的靶向性和精准性。基于上述超声靶向微泡破坏技术的各种优势,本课题通过制备载HSV1-TK自杀基因超声造影剂,将其应用于H22小鼠肝癌皮下移植瘤模型中观察其靶向性及治疗效果,同时为了进一步观察其联合HIFU治疗效果,将HIFU联合载HSV1-TK基因超声微泡治疗VX2肝癌,观察联合治疗效果及HSV1-TK/GCV自杀基因系统的作用机理,为HIFU和基因联合治疗肝癌方面提供可靠的实验依据。本课题研究内容主要包括以下三个部分:第一部分载HSV1-TK基因脂质超声微泡造影剂的制备目的:构建携HSV1-TK自杀基因质粒并实现超声微泡造影剂与HSV1-TK基因的连接,评价其物理性质、携带基因的能力及体内显影效果。方法:通过选用真核表达载体pIRES2-EGFP和TK通过酶切、PCR扩增、重组、鉴定、测序合成pIRES2-EGFP-TK;采用静电吸附原理将TK基因吸附于自制的超声微泡造影剂上,检测微泡的大小、分布、电荷、形态、携基因量及体内显影效果。结果:重组质粒经酶切及PCR反应后电泳结果显示约1024bp附近有一特异条带,与目的基因的长度相近,测序鉴定结果与Genbank中序列相比对完全一致;载基因微泡粒径大小、分布情况、电荷情况均满足超声造影剂的要求;内体造影效果显示,载基因微泡能明显增强小鼠H22肝癌的显影,且持续时间较长,约25min。结论:成功构建pEGFP-TK质粒并实现了自制超声微泡造影剂与目的基因之间的连接,同时还实现了体内的造影需求,为后续的实验奠定了较好的基础。第二部分超声辐照微泡介导HSV1-TK自杀基因治疗小鼠肝癌的实验研究目的:观察超声辐照介导的单纯疱疹病毒Ⅰ型胸苷激酶基因(HSV1-TK)在小鼠肝癌细胞H22移植瘤组织中的表达情况及结合前药更昔洛韦(GCV)后对肿瘤的杀伤效果。方法:建立小鼠肝癌(H22)皮下移植瘤模型40只,随机分成四组,即A.对照组(PBS);B.单纯质粒组(HSV1-TK);C.质粒+超声辐照组(HSV1-TK+US)④质粒+超声辐照+微泡组(HSV1-TK+US+MB)。分别经鼠尾静脉注入PBS、HSV1-TK、HSV1-TK、HSV1-TK+微泡,每次注射200μl,每隔3d注射一次,共注射3次,C、D组分别给予1MHz,2W/cm2,5min超声辐照,48h后各治疗组分别经腹腔注射GCV0.2ml(100mg·kg-1·d-1)连续注射14天。48h后活杀一批荷瘤鼠采用Western-blot检测肿瘤组织中TK蛋白的表达情况,监测肿瘤大小及生存时间,分别绘制肿瘤生长曲线及生存曲线图,检测肿瘤细胞凋亡情况及生物学形态。结果:治疗组中均有TK蛋白的表达,其中D组表达量明显高于其他各组(P<0.05);各组荷瘤鼠经治疗后A组、B组、C组、D组抑瘤率分别是0%,3.90%±1.80%,22.70%±2.86%,41.25%±3.20%。四组肿瘤体积比较,D组与其他各治疗组比较抑瘤效应更加明显,且D组与C组LSD-t=161.29,P<0.05;D组与B组LSD-t=323.71,P<0.01;C组与B组LSD-t=162.43,P<0.05;A组与B组LSD-t=28.96,P>0.05;从生存时间曲线图可以看出微泡载基因组能明显改善荷廇鼠的生存时间;TUNEL染色D组肿瘤细胞凋亡指数明显比其他各组高(P<0.05);HE染色D组较A组坏死病变明显。结论:超声破坏包裹HSV1-TK基因的微泡定位释放,即增加了肝癌基因治疗的靶向性,又提高了外源基因的转染率,从而增强了自杀基因对小鼠肝癌的杀伤效果,这为肝癌的基因治疗提供了一个新的策略。第三部分高强度聚焦超声联合载HSV1-TK自杀基因超声微泡治疗VX2兔肝癌的实验研究目的:探讨联合载HSV1-TK自杀基因超声微泡能否增强高强度聚焦超声(HIFU)治疗肝癌的杀伤效果。方法:建立75只VX2兔肝癌模型,随机分成①HIFU治疗组;②HIFU+HSV1-TK组;③HIFU+HSV-TK+US组;④HIFU+HSV-TK+US+MB组;⑤HSV-TK+US+MB组。前四组均行HIFU治疗,治疗参数:频率1.0MHz,焦距156mm,辐照声功率150W。HIFU治疗结束后,分别经新西兰大白兔耳缘静脉注射生理盐水、HSV1-TK、HSV1-TK+MB,注射完后使用超声基因转染仪进行辐照,辐照参数为300KHz,2W/cm2,辐照方式为脉冲式,即辐照10s,间歇10s,持续20分钟。辐照结束24h后开始经荷瘤兔后腿肌注前药GCV,剂量为100mg·kg-1·d-1,持续注射10d。转染HSV1-TK48h后活杀一批荷瘤兔检测其TK mRNA及蛋白表达情况,监测荷瘤兔肿瘤大小及荷瘤兔生存时间,治疗结束后使用TUNEL法检测肿瘤细胞凋亡情况,HE染色检测肿瘤生物学形态。结果:HIFU+HSV-TK+US+MB组与HSV-TK+US+MB组中TK mRNA表达及GFP蛋白的表达无统计学意义,而与其他各组比较均高于其他各组,且有统计学意义(P<0.05)。HIFU+HSV-TK+US+MB组抑瘤效应明显高于其他各组(P<0.05),且能明显改善荷廇兔的生存时间;TUNEL染色HIFU+HSV-TK+US+MB组肿瘤细胞凋亡指数明显比其他各组高(P<0.05);结论:HIFU联合载HSV1-TK自杀基因超声微泡治疗VX2兔肝癌能明显抑制其肿瘤细胞的生长,明显改善荷瘤兔的生存时间,为HIFU联合基因治疗肝癌提供了较为可靠的实验依据。
二、腺病毒介导胸苷激酶基因治疗肝癌的实验研究(论文开题报告)
(1)论文研究背景及目的
此处内容要求:
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景,再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题,并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例:
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
(2)本文研究方法
调查法:该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法:用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法:通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法:通过调查文献来获得资料,从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法:依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法:对研究对象进行“质”的方面的研究,这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法:通过具体的数字,使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法:运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法:这是社会科学用来分析社会现象的一种方法,从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法:通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、腺病毒介导胸苷激酶基因治疗肝癌的实验研究(论文提纲范文)
(1)肝癌靶向载体scrAAV3介导基因治疗可视化的实验研究(论文提纲范文)
中文摘要 |
Abstract |
主要英文缩略词表 |
一、引言 |
二、材料与方法 |
2.1 材料 |
2.2 方法 |
三、结果 |
3.1 pdsAAV-HSV1-TK-Kallistatin重组质粒与ATK病毒重组体的构建和鉴定 |
3.2 三组HepG2 细胞报告基因与治疗基因的m RNA和蛋白表达水平 |
3.3 ATK对 HepG2 细胞增殖能力的影响 |
3.4 ~(18)F-FHBG的制备及鉴定 |
3.5 ~(18)F-FHBG PET/CT成像 |
3.6 裸鼠~(18)F-FHBG摄取生物分布图 |
3.7 裸鼠移植瘤组织HE染色检测 |
3.8 免疫荧光检测移植瘤中报告基因与治疗基因表达 |
3.9 裸鼠移植瘤中报告基因与治疗基因的mRNA和蛋白表达水平 |
四、讨论 |
五、结论 |
六、参考文献 |
七、文献综述 |
参考文献 |
八、附录 攻读硕士学位期间的科研成果 |
九、致谢 |
(2)增强型胸苷激酶基因表达载体的构建及其杀伤性的研究进展(论文提纲范文)
1 资料与方法 |
1.1 一般材料 |
1.2 方法 |
1.2.1 荧光蛋白表达分析及荧光定量PCR检测基因m RNA的表达水平 |
1.2.2 端粒酶的活性检测 |
1.2.3 Boyden小室试验 |
1.2.4 四甲基偶氮唑蓝 (methyl thiazolyl tetrazolium, MTT) 实验分析 |
1.2.5 体内实验 |
1.3 统计学方法 |
2 结果 |
2.1 荧光显微镜下观察胸苷激酶基因绿色荧光蛋白表达 |
2.2 荧光定量PCR检测胸苷激酶基因m RNA表达 |
2.3 端粒酶活性检测结果 |
2.4 MTT检测结果 |
2.5 Boyden小室侵袭实验结果 |
2.6 动物体内实验结果 |
3 讨论 |
(3)双自杀基因与芪三酚对人肝癌HepG2细胞系的杀伤作用及协同效应研究(论文提纲范文)
摘要 |
Abstract |
引言 |
第一部分 相关文献研究 |
第一章 肝癌 |
1.1 原发性肝癌的病因学与病理学: |
1.2 原发性肝癌的治疗手段与技术方法 |
1.2.1 肝癌的外科手术治疗(术疗) |
1.2.2 肝癌的化学药物治疗(化疗) |
1.2.3 肝癌的放射治疗(放疗) |
1.2.4 肝癌的生物学疗法 |
1.2.5 肝癌的分子靶向治疗 |
1.2.6 肝癌的射频消融治疗 |
1.2.7 肝癌的中医中药学疗法 |
1.2.8 肝癌的中西医结合疗法 |
第二章 芪三酚 |
2.1 芪三酚的结构及性质 |
2.2 芪三酚的抗癌作用 |
2.2.1 诱导肿瘤细胞凋亡 |
2.2.2 抑制肿瘤细胞增殖 |
第三章 自杀基因 |
3.1 自杀基因的种类 |
3.2 自杀基因的作用及机制 |
3.3 自杀基因增效疗法 |
第四章 结语 |
第二部分 实验研究 |
第一章 双自杀基因逆转录病毒转移体系的建立及其稳定感染肝癌细胞HepG2的实验研究 |
1.1 实验材料 |
1.1.1 菌株、质粒 |
1.1.2 实验试剂 |
1.1.3 实验器材 |
1.2 实验方法 |
1.2.1 技术路线 |
1.2.2 具体操作方法 |
1.2.3 统计学方法: |
1.3 实验结果 |
1.3.1 质粒的转化、扩增及鉴定 |
1.3.2 逆转录病毒的包装、浓缩、鉴定 |
1.3.3 逆转录病毒感染HepG2肝癌细胞 |
1.3.4 感染细胞的鉴定 |
1.3.5 HepG2/CDTK细胞与HepG2细胞的生物学性状比较 |
1.4 讨论 |
第二章 双自杀基因联合芪三酚对肝癌细胞HepG2细胞杀伤作用的实验研究 |
2.1 实验材料 |
2.1.1 实验研究细胞 |
2.1.2 实验研究试剂 |
2.1.3 实验器材 |
2.2 实验方法 |
2.2.1 技术路线 |
2.2.2 实验方法 |
2.2.3 细胞克隆形成率检测 |
2.2.4 凋亡相关基因检测 |
2.2.5 细胞迁移能力实验—细胞划痕法 |
2.2.6 流式细胞仪检测细胞周期 |
2.2.7 细胞亚结构 |
2.2.8 统计学方法: |
2.3 实验结果 |
2.3.1 一般形态学 |
2.3.2 MTT法测定双自杀基因和芪三酚对肝癌细胞的生长抑制情况 |
2.3.3 细胞凋亡指标检测结果 |
2.3.4 细胞克隆形成实验结果 |
2.3.5 凋亡基因检测结果 |
2.3.6 细胞迁移实验结果 |
2.3.7 流式细胞检测细胞周期结果 |
2.3.8 细胞亚结构 |
2.4 讨论 |
2.4.1 芪三酚对人肝癌HepG2细胞的杀伤作用 |
2.4.2 肝癌自杀基因对人肝癌HepG2细胞的杀伤作用 |
2.4.3 肝癌双自杀基因与芪三酚联合应用对人肝癌HepG2细胞的杀伤作用 |
2.4.4 展望 |
结论 |
参考文献 |
附录 |
致谢 |
(4)杆状病毒-腺相关病毒融合病毒介导核素报告基因监测干细胞移植的研究(论文提纲范文)
摘要 |
abstract |
英文缩写词对照表 |
绪论 |
第一部分 杆状病毒-腺相关病毒融合病毒介导人钠碘同向转运体报告基因监测大鼠骨髓间充质干细胞移植治疗的研究 |
1.引言 |
2.材料和方法 |
2.1.主要设备和仪器 |
2.2.主要试剂和材料 |
2.3.pFB-CMV-hNIS-ITR质粒DNA的构建 |
2.4.获取pFBGFPR和 pFB-CMV-hNIS-ITR bacmid DNA |
2.5.BV-AAV的制备及滴度测定 |
2.6.rBM-MSCs的分离、培养和鉴定 |
2.7.BV-AAV感染rBM-MSCs后的体外实验研究-非放射性实验部分 |
2.8.BIhV感染rBM-MSCs后的体外实验研究-放射性实验部分 |
2.9.BIhV感染rBM-MSCs后的体内显像实验研究 |
2.10.使用软件及统计学方法 |
3.结果 |
3.1.pFB-CMV-hNIS-ITR质粒DNA的构建 |
3.2.BIeV和 BIhV病毒的制备及空斑实验测定滴度 |
3.3.rBM-MSCs的分离、培养和鉴定 |
3.4.BV-AAV感染rBM-MSCs后的体外实验研究-非放射性实验部分 |
3.5.BIhV感染rBM-MSCs后的体外实验研究-放射性实验部分 |
3.6.BIhV感染rBM-MSCs后的体内显像实验研究 |
4.讨论 |
第二部分 杆状病毒-腺相关病毒融合病毒介导人钠碘同向转运体报告基因监测人类干细胞移植治疗的研究 |
1.引言 |
2.材料和方法 |
2.1.主要设备和仪器 |
2.2.主要试剂和材料 |
2.3.Bac-eGFP病毒(BeV)的构建和制备 |
2.4.人类干细胞的培养和鉴定 |
2.5.BV-AAV感染人类干细胞后的体外实验研究-非放射性实验部分 |
2.6.BIhV感染hUCB-MSCs后的体外实验研究-放射性实验部分 |
2.7.BIhV感染hUCB-MSCs后的体内显像实验研究 |
2.8.使用软件及统计学方法 |
3.结果 |
3.1.pFB-eGFP质粒DNA的构建及Be V病毒的制备 |
3.2.人类干细胞的培养 |
3.3.BV-AAV感染人类干细胞后的体外实验研究-非放射性实验部分 |
3.4.BIhV感染hUCB-MSCs后的体外实验研究-放射性实验部分 |
3.5.BIhV感染hUCB-MSCs后的体内显像实验研究 |
4.讨论 |
第三部分 睡美人转座子延长杆状病毒介导报告基因表达及体内监测的研究 |
1.前言 |
2.材料和方法 |
2.1.主要设备和仪器 |
2.2.主要试剂和材料 |
2.3.多种结构BV的制备和哺乳动物细胞G418 药物最佳筛选浓度的检测 |
2.4.不同结构的BV感染哺乳动物细胞后的体外生物学特性研究 |
2.5.BSeNV感染哺乳动物细胞后的体内显像研究 |
2.6.BSGNV或 BIGV感染哺乳动物细胞后的体内显像研究 |
2.7.使用软件及统计学方法 |
3.结果 |
3.1.质粒的构建和不同结构BV的制备 |
3.2.不同结构的BV感染哺乳动物细胞后的体外生物学特性研究 |
3.3.BSeNV介导e GFP报告基因进行长期显像的研究 |
3.4.BSGNV或 BIGV介导GLP-1R核素报告基因显像的研究 |
4.讨论 |
全文结论 |
参考文献 |
致谢 |
攻读学位期间发表的学术论文目录 |
(5)木犀草素、芹菜素及槲皮素对黑色素瘤自杀基因治疗的增效研究(论文提纲范文)
摘要 |
Abstract |
引言 |
第一部分 研究背景 |
第一章 肿瘤基因治疗概述 |
一、 基因沉默疗法 |
二、 抑癌基因疗法 |
三、 免疫基因疗法 |
四、 自杀基因治疗 |
五、 抗肿瘤血管生成基因疗法 |
六、 肿瘤多药耐药基因疗法 |
第二章 肿瘤自杀基因治疗研究进展 |
一、 自杀基因及自杀基因治疗系统 |
二、 自杀基因疗法的旁杀伤效应及机制 |
三、 肿瘤自杀基因疗法的增效方法 |
第三章 中医学对肿瘤的认识及治疗法则 |
第四章 木犀草素、芹菜素及槲皮素药理作用及抗肿瘤作用 |
一、 木犀草素与肿瘤的相关研究 |
二、 芹菜素与肿瘤的相关研究 |
三、 槲皮素与肿瘤的相关研究 |
第二部分 实验研究 |
第一章 人黑色素瘤细胞HSV1-tk/GCV肿瘤自杀基因治疗系统的构建 |
第一节 材料 |
第二节 方法 |
一、 RT-PCR扩增人tk读码框 |
二、 慢病毒载体质粒pLV-tk/GFP的构建和鉴定 |
三、 细胞培养、传代、冻存、复苏 |
四、 重组慢病毒的包装与感染 |
五、 A375细胞感染及稳定表达株的筛选 |
六、 A375-tk/GFP活性检测 |
七、 统计分析 |
第三节 结果 |
一、 绿色荧光蛋白示踪的HSV1-tk/GCV系统重组慢病毒载体的构建 |
二、 A375细胞感染及稳定表达株的筛选 |
三、 A375-tk/GFP活性检测 |
第四节 讨论 |
一、 绿色荧光蛋白示踪的HSV1-tk/GCV系统重组慢病毒载体的构建 |
二、 人黑色素瘤细胞A375 HSV1-tk/GCV肿瘤自杀基因治疗系统的构建 |
第二章 木犀草素、芹菜素及槲皮素对人黑色素瘤细胞间缝隙连接通讯的作用 |
第一节 材料 |
第二节 方法 |
一、 A375生长曲线绘制 |
二、 木犀草素、芹菜素及槲皮素对A375的生长的影响 |
三、 荧光示踪法和流式细胞技术观察GJIC功能 |
四、 Western Blot检测Cx43、Cx26表达 |
五、 统计方法 |
第三节 结果 |
一、 A375细胞的增殖测定 |
二、 木犀草素、芹菜素及槲皮素对A375的生长的影响 |
三、 荧光示踪法及流式细胞术检测药物对A375细胞GJIC功能的影响 |
四、 Western Blot检测Cx43、Cx26表达 |
第四节 讨论 |
第三章 木犀草素、芹菜素及槲皮素对人黑色素瘤细胞自杀基因的增效作用 |
第一节 材料 |
第二节 方法 |
一、 确定tk混合比例 |
二、 检测木犀草素、芹菜素及槲皮素对自杀基因治疗系统的增效作用 |
三、 PI单染法检测细胞凋亡 |
四、 统计分析 |
第三节 结果 |
一、 确定tk混合比例 |
二、 检测木犀草素、芹菜素及槲皮素对自杀基因治疗系统的增效作用 |
三、 PI单染法检测细胞凋亡 |
第四节 讨论 |
结论 |
参考文献 |
附录 |
附件Ⅰ:本论文中使用的缩略语 |
附件Ⅱ:pLXSN-tk质粒中tk基因测序图 |
附件Ⅲ:已在国内外学术期刊上发表的相关论文 |
致谢 |
统计学审核证明 |
详细摘要 |
(6)多功能纳米粒子在肝癌诊治一体化中的应用研究(论文提纲范文)
中文摘要 |
Abstract |
英文缩写词表 |
第1章 绪论 |
1.1 引言 |
1.2 肝癌的诊治现状 |
1.3 基于纳米平台的肿瘤诊治一体化 |
1.4 选题依据和研究思路 |
1.5 参考文献 |
第2章 量子点标记自杀基因靶向治疗肝癌的体内外研究 |
2.1 引言 |
2.1.1 肝癌的自杀基因治疗 |
2.1.1.1 自杀基因治疗的分类及原理 |
2.1.1.2 HSV-TK 自杀基因治疗的应用 |
2.1.1.3 自杀基因治疗肝癌的挑战 |
2.1.2 量子点的在基因治疗中的应用 |
2.1.2.1 量子点的性质、修饰和标记 |
2.1.2.2 量子点示踪基因的运输和表达 |
2.1.2.3 量子点在诊治一体化的肿瘤基因治疗中的应用 |
2.1.3 叶酸脂质体在肿瘤基因治疗中的应用 |
2.1.3.1 叶酸受体的分布和性质 |
2.1.3.2 叶酸脂质体的特性和靶向策略 |
2.1.3.3 叶酸脂质体在基因治疗中的应用 |
2.1.4 肝癌自杀基因治疗中当前尚未解决的问题与面临的挑战 |
2.1.5 本部分论文的研究目的、研究内容和创新性 |
2.1.5.1 研究目的 |
2.1.5.2 研究内容 |
2.1.5.3 创新性 |
2.2 材料与方法 |
2.2.1 实验材料 |
2.2.1.1 主要药品和试剂 |
2.2.1.2 仪器 |
2.2.1.3 试剂配制 |
2.2.2 实验方法 |
2.2.2.1 CdTe/CdS 核壳 QD 的合成 |
2.2.2.2 JM109 感受态细胞的制备 |
2.2.2.3 HSV-TK 质粒的转化与提取 |
2.2.2.4 QD-TK 的偶联 |
2.2.2.5 FL/QD-TK 的制备 |
2.2.2.6 QD-TK 和 FL/QD-TK 的表征 |
2.2.2.7 细胞培养 |
2.2.2.8 分组给药和细胞活性检测 |
2.2.2.8.1 细胞转染 |
2.2.2.8.2 CdTe/CdS 核壳量子点细胞毒性的分组和给药 |
2.2.2.8.3 CdTe/CdS QD-TK 联合 GCV 抗肿瘤的分组和给药 |
2.2.2.8.4 近红外量子点细胞毒性的分组和给药 |
2.2.2.8.5 近红外 QD-TK 联合 GCV 抗肿瘤的分组和给药 |
2.2.2.8.6 FL/QD-TK 细胞毒性的分组和给药 |
2.2.2.8.7 FL/QD-TK 联合 GCV 抗肝癌的分组和给药 |
2.2.2.8.8 MTT 法检测细胞活性 |
2.2.2.9 激光共聚焦荧光显微镜检测细胞内吞和治疗效果 |
2.2.2.9.1 激光共聚焦荧光显微镜检测 QD-TK 细胞内吞 |
2.2.2.9.2 激光共聚焦荧光显微镜检测 FL/QD-TK 内吞 |
2.2.2.9.3 激光共聚焦荧光显微镜观察 QD-TK 联合 GCV 抗肿瘤作用 |
2.2.2.10 流式细胞术定量检测细胞凋亡率 |
2.2.2.11 Western Blot 法分析 TK 蛋白表达 |
2.2.2.12 动物饲养和裸鼠肝癌皮下移植瘤模型的构建 |
2.2.2.12.1 动物饲养 |
2.2.2.12.2 BALB/c 裸小鼠人肝癌皮下荷瘤模型的建立 |
2.2.2.13 HepG2 微小瘤灶形成实验 |
2.2.2.14 Bel-7402 荷瘤裸鼠活体成像及生物分布检测 |
2.2.2.15 Bel-7402 皮下移植瘤模型的分组和给药 |
2.2.2.16 Bel-7402 皮下移植瘤模型的分组治疗效果和安全性评价 |
2.2.2.16.1 Bel-7402 皮下移植瘤模型的分组治疗效果 |
2.2.2.16.2 Bel-7402 皮下移植瘤模型的安全性评价 |
2.2.2.17 统计学分析 |
2.3 结果与讨论 |
2.3.1 CdTe/CdS QD-TK 的合成和表征 |
2.3.2 CdTe/CdS QD-TK 的细胞毒性研究 |
2.3.3 CdTe/CdS QD-TK 联合 GCV 对 Hela 细胞的杀伤作用研究 |
2.3.4 细胞水平监测 CdTe/CdS QD-TK 对 Hela 细胞的杀伤作用 |
2.3.5 近红外 QD-TK 的合成、表征和细胞毒性 |
2.3.6 近红外 QD-TK 的细胞分布和表达研究 |
2.3.7 细胞水平评价和监测近红外 QD-TK 联合 GCV 抗肝癌作用 |
2.3.8 整体水平监测和评价近红外 QD-TK 联合 GCV 抗肝癌作用 |
2.3.9 FL/QD-TK 的合成和表征 |
2.3.10 FL/QD-TK 的细胞毒性作用检测 |
2.3.11 FL/QD-TK 的肝癌细胞靶向性研究 |
2.3.12 FL/QD-TK 联合 GCV 选择性杀伤肝癌细胞的研究 |
2.3.13 FL/QD-TK 体内肝癌靶向成像和生物分布研究 |
2.3.14 FL/QD-TK 联合 GCV 体内靶向抗肝癌作用和生物安全性研究 |
2.4 本章小结 |
2.5 参考文献 |
第2章 量子点脂质复合体选择性治疗肝癌的体内外研究 |
3.1 引言 |
3.1.1 镉系量子点与生物系统的相互作用 |
3.1.1.1 镉系量子点的暴露途径 |
3.1.1.2 镉系量子点的生物分布、代谢、排泄过程 |
3.1.1.3 镉系量子点的细胞内吞和分布 |
3.1.2 镉系量子点的生物毒性和分子机制 |
3.1.2.1 镉系量子点的细胞毒性 |
3.1.2.2 镉系量子点的体内毒性 |
3.1.2.3 镉系量子点的毒性机制 |
3.1.2.4 展望和小结 |
3.1.3 利用纳米粒子内源毒性治疗肿瘤 |
3.1.3.1 肿瘤细胞——微环境的同与不同 |
3.1.3.2 纳米粒子——打破肿瘤微环境平衡 |
3.1.3.3 以毒攻毒——肿瘤治疗的新策略 |
3.1.4 利用量子点选择性治疗肝癌当前尚未解决的问题与面临的挑战 |
3.1.5 本部分论文的研究目的、研究内容和创新性 |
3.1.5.1 研究目的 |
3.1.5.2 研究内容 |
3.1.5.3 创新性 |
3.2 材料与方法 |
3.2.1 实验材料 |
3.2.1.1 主要药品和试剂 |
3.2.1.2 仪器 |
3.2.1.3 试剂配制 |
3.2.2 实验方法 |
3.2.2.1 QD-LC 的合成和表征 |
3.2.2.2 细胞培养 |
3.2.2.3 分组给药和细胞活性检测 |
3.2.2.4 激光共聚焦荧光显微镜检测细胞内吞 |
3.2.2.5 流式细胞术定量检测细胞内吞 |
3.2.2.6 流式细胞术定量检测细胞凋亡率 |
3.2.2.7 ELISA 定量检测 ROS 水平 |
3.2.2.8 Western Blot 法分析蛋白表达 |
3.2.2.9 动物饲养和小鼠肝癌皮下移植瘤模型的构建 |
3.2.2.9.1 动物饲养 |
3.2.2.9.2 ICR 小鼠肝癌 H22 皮下荷瘤模型的建立 |
3.2.2.10 H22 微小瘤灶形成实验 |
3.2.2.11 激光共聚焦荧光显微镜研究 QD-LC 在 H22 皮下移植瘤重分布研究 |
3.2.2.12 H22 皮下移植瘤模型的分组和给药 |
3.2.2.13 H22 皮下移植瘤模型的分组治疗效果和安全性评价 |
3.2.2.13.1 H22 皮下移植瘤模型的分组治疗效果 |
3.2.2.13.2 H22 皮下移植瘤模型的安全性评价 |
3.2.2.14 统计学分析 |
3.3 结果与讨论 |
3.3.1 QD-LC 的合成和表征 |
3.3.2 QD-LC 的细胞毒性作用研究 |
3.3.3 QD-LC 对细胞的内吞作用和机制研究 |
3.3.4 QD-LC 对杀伤肝癌细胞机制研究 |
3.3.5 QD-LC 对微小瘤灶生长影响的研究 |
3.3.6 QD-LC 对小鼠肝癌 H22 皮下移植瘤的治疗作用研究 |
3.3.7 QD-LC 治疗小鼠肝癌 H22 皮下移植瘤的安全性评估 |
3.4 本章小结 |
3.5 参考文献 |
第4章 磁性介孔二氧化硅在肝癌诊治一体化中的应用 |
4.1 引言 |
4.1.1 M-MSNs 的分类和合成 |
4.1.1.1 核壳 M-MSNs |
4.1.1.2 空心 M-MSNs |
4.1.1.3 卫星 M-MSNs |
4.1.1.4 沉积 M-MSNs |
4.1.2 M-MSNs 与成像 |
4.1.2.1 M-MSNs 与核磁共振 T1 加权成像 |
4.1.2.2 M-MSNs 与核磁共振 T2 加权成像 |
4.1.2.3 M-MSNs 与多模式成像 |
4.1.3 M-MSNs 与治疗 |
4.1.3.1 M-MSNs 用于磁靶向输送药物 |
4.1.3.2 M-MSNs 用于可控释放药物 |
4.1.3.2.1 基于磁核的 M-MSNs 磁热响应性释药 |
4.1.3.2.2 基于介孔表面功能化的 pH、酶、氧化还原响应性释药 |
4.1.3.2.3 基于 M-MSN 外表面的质子泵响应释药 |
4.1.3.3 M-MSNs 用于磁热治疗 |
4.1.3.4 M-MSNS 用于诊治一体化 |
4.1.4 Janus 型 M-MSNs |
4.1.4.1 Janus 型纳米粒子 |
4.1.4.2 Janus 型 M-MSNs |
4.1.5 肝癌化疗中当前尚未解决的问题与面临的挑战 |
4.1.6 本部分论文的研究目的、研究内容和创新性 |
4.1.6.1 研究目的 |
4.1.6.2 研究内容 |
4.1.6.3 创新性 |
4.2 材料与方法 |
4.2.1 实验材料 |
4.2.1.1 主要药品和试剂 |
4.2.1.2 仪器 |
4.2.2 实验方法 |
4.2.2.1 Fe3O4纳米粒子的合成 |
4.2.2.1.1 Fe3O4纳米粒子的合成原理 |
4.2.2.1.2 Fe3O4纳米粒子的合成步骤 |
4.2.2.2 Janus 型 M-MSNs 的合成 |
4.2.2.2.1 Janus 型 M-MSNs 的合成原理 |
4.2.2.2.2 Janus 型 M-MSNs 的合成步骤 |
4.2.2.3 FITC 标记的 Janus 型 M-MSNs 的合成达 |
4.2.2.4 羧基化的 JANUS 型 M-MSNS 的合成 |
4.2.2.5 PEG 化的 Janus 型 M-MSNs 的合成 |
4.2.2.6 药物吸附、释放和浓度测定 |
4.2.2.6.1 DOX 吸附实验 |
4.2.2.6.2 DOX 释放试验 |
4.2.2.6.3 DOX 浓度测定 |
4.2.2.6.4 DOX 与 M-MSNs-PEG 作用测定 |
4.2.2.7 Janus 型 M-MSNs-DOX 表征 |
4.2.2.8 细胞培养 |
4.2.2.9 分组给药和细胞活性检测 |
4.2.2.9.1 M-MSNS 的分组和给药 |
4.2.2.9.2 M-MSNs-DOX 的分组和给药 |
4.2.2.9.3 SRB 法检测细胞活性 |
4.2.2.10 激光共聚焦荧光显微镜检测细胞内吞和药物释放 |
4.2.2.10.1 激光共聚焦荧光显微镜检测细胞内吞 |
4.2.2.10.2 激光共聚焦荧光显微镜检测 DOX 释放 |
4.2.2.11 流式细胞术检测细胞内吞和药物释放 |
4.2.2.11.1 流式细胞术定量检测细胞内吞 |
4.2.2.11.2 流式细胞术检测细胞内吞机制 |
4.2.2.11.3 流式细胞术检测定量 DOX 的释放 |
4.2.2.12 普鲁士蓝染色法检测细胞内吞 |
4.2.2.13 生物透射电镜研究细胞内吞 |
4.2.2.14 动物饲养和小鼠肝癌模型的构建 |
4.2.2.14.1 动物饲养 |
4.2.2.14.2 BALB/c 裸小鼠人肝癌 HepG2 皮下荷瘤模型的建立 |
4.2.2.14.3 ICR 小鼠肝癌 H22 原位荷瘤模型的建立 |
4.2.2.15 小鼠肝癌核磁共振成像 |
4.2.2.16 小鼠肝癌模型的分组和给药 |
4.2.2.16.1 BALB/c 裸小鼠肝癌 HepG2 皮下荷瘤模型的分组和给药 |
4.2.2.16.2 ICR 小鼠肝癌 H22 原位荷瘤模型的分组和给药 |
4.2.2.17 小鼠肝癌模型治疗效果的评价 |
4.2.2.17.1 BALB/c 裸小鼠肝癌 HepG2 皮下荷瘤模型治疗效果的评价 |
4.2.2.17.2 ICR 小鼠肝癌 H22 原位荷瘤模型治疗效果的评价 |
4.2.2.18 BALB/c 裸小鼠肝癌 HepG2 皮下荷瘤模型安全性评价 |
4.2.2.19 BALB/c 裸小鼠肝癌 HepG2 皮下荷瘤模型的生物分布检测 |
4.2.2.19.1 普鲁士蓝染色法检测组织脏器铁分布 |
4.2.2.19.2 ICP-OES 检测组织脏器铁含量 |
4.2.2.19.3 激光共聚焦荧光显微镜检测 M-MSN-FITC 组织脏器分布 |
4.2.2.19.4 激光共聚焦荧光显微镜检测 DOX 组织脏器分布 |
4.2.2.20 M-MSN-DOX 溶血性评价 |
4.2.2.21 统计学分析 |
4.3 结果与讨论 |
4.3.1 不同形貌 M-MSNs 的生物分布和溶血性研究 |
4.3.2 M-MSNs-PEG 的合成与表征 |
4.3.3 M-MSNs-PEG 的细胞毒性作用检测 |
4.3.4 M-MSNs-PEG 的细胞内吞作用检测和机制研究 |
4.3.5 磁场增强 M-MSNs-PEG 的细胞内吞研究 |
4.3.6 M-MSNs-PEG 的载药和释药研究 |
4.3.7 磁场增加 M-MSNS-DOX 体外抗肿瘤作用研究 |
4.3.8 M-MSNs-DOX 增强肝癌体内 MR 成像效果研究 |
4.3.9 磁场增强 M-MSNs-DOX 治疗裸鼠肝癌皮下移植瘤的效果研究 |
4.3.10 M-MSNs-DOX 治疗肝癌皮下移植瘤的安全性评价和生物分布研究 |
4.3.11 磁场增强 M-MSNs-DOX 治疗小鼠原位肝癌的效果和药物分布研究 |
4.4 本章小结 |
4.5 参考文献 |
第5章 全文总结与研究展望 |
5.1 全文总结 |
5.2 不足之处 |
5.3 研究展望 |
作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
作者简介 |
在学期间发表的学术论文 |
在学期间主要承担和参与的项目 |
在学期间获得的专利 |
在学期间获得的奖励 |
在学期间参加的会议和活动 |
致谢 |
(8)薯蓣皂苷通过GJ机制发挥对B16细胞自杀基因的增效作用(论文提纲范文)
摘要 |
Abstract |
目录 |
引言 |
第一章 背景研究 |
第一节 肿瘤基因疗法概述 |
第二节 自杀基因疗法研究进展 |
一、自杀基因的定义 |
二、自杀基因疗法的旁杀伤效应及机制 |
三、肿瘤自杀基因疗法的增效方法 |
第三节 缝隙连接蛋白Cx43的相关研究 |
一、Cx43结构 |
二、调控Cx43的影响因素 |
三、Cx43与相关疾病的研究 |
第四节 中医学对肿瘤的认识及治疗法则 |
第五节 薯蓣皂苷及苷元的相关研究 |
一、薯蓣皂苷的相关研究 |
二、薯蓣皂苷元与肿瘤的相关研究 |
第二章 实验研究 |
第一部分 薯蓣皂苷对小鼠黑色素瘤细胞缝隙连接功能的影响 |
第一节 材料 |
第二节 方法 |
一、细胞培养、传代、冻存、复苏 |
二、MTT法测定薯蓣皂苷对小鼠B16细胞生长影响 |
三、流式细胞仪分析缝隙连接通讯功能 |
四、荧光定量PCR分析Cx43、Cx32和Cx26转录 |
五、Western blot检测Cx43、Cx32和Cx26表达 |
六、统计学分析 |
第三节 结果 |
一、MTT法检测薯蓣皂苷对B16细胞生长的影响 |
二、流式细胞术检测薯蓣皂苷对B16细胞株缝隙连接通讯功能的影响 |
三、荧光定量PCR检测薯蓣皂苷对B16细胞株缝隙连接蛋白基因转录的影响 |
四、Western Blot检测薯蓣皂苷对B16细胞株缝隙连接蛋白表达的影响 |
第四节 讨论 |
一、缝隙连接细胞间通讯与肿瘤的关系 |
二、相关实验方法技术原理简介 |
三、薯蓣皂苷对小鼠黑色素瘤缝隙连接功能的影响 |
第二部分 薯蓣皂苷对小鼠B16HSV-tk/GCV自杀基因治疗系统增效作用的研究 |
第一节 材料 |
第二节 方法 |
一、确定GCV浓度 |
二、确定TK比例 |
三、MTT法检测薯蓣皂苷对B16HSV-tk/GCV自杀基因治疗系统的增效作用 |
四、AnnexinV单染法检测细胞凋亡 |
五、统计学分析 |
第三节 结果 |
一、MTT法检测薯蓣皂苷对B16HSV-tk/GCV自杀基因治疗系统的增效作用 |
二、AnnexinV单染法检测细胞凋亡 |
第四节 讨论 |
第三部分 阻断缝隙连接功能对薯蓣皂苷在自杀基因治疗系统中增效作用的影响 |
第一节 材料 |
第二节 方法 |
一、RT-PCR扩增人Cx43读码框 |
二、慢病毒载体质粒pLVmCherry-Cx43的构建及鉴定 |
三、pLVmCherry-Cx43G21R和pLVmCherry-Cx43G138R基因定点突变慢病毒载体质粒的构建与鉴定 |
四、重组慢病毒的包装与转染 |
五、Western blot检测Cx43表达 |
六、荧光示踪法观察GJIC功能 |
七、MTT法检测过表达野生型及突变型Cx43细胞株对B16HSV-tk/GCV自杀基因治疗系统的影响 |
第三节 结果 |
一、构建过表达野生型Cx43、突变型Cx43G21R、突变型Cx43G138R的B16细胞株 |
二、Western Blot检测Cx43蛋白表达 |
三、荧光示踪检测Cx43功能 |
四、薯蓣皂苷对过表达野生型Cx43及突变型Cx43G21R、突变型Cx43G138R的B16细胞株自杀基因治疗系统的影响 |
第四节 讨论 |
一、过表达及Cx43基因的选择 |
二、主要病毒载体的优缺点 |
三、本次实验的结果 |
结语 |
参考文献 |
附录 |
致谢 |
附件 |
详细摘要 |
(9)表达新城疫病毒血凝素—神经氨酸基因溶瘤腺病毒的抑瘤作用(论文提纲范文)
中文摘要 |
Abstract |
英文缩略词表 |
绪论 |
第一篇 文献综述 |
第1章 溶瘤病毒研究进展 |
1.1 病毒感染和癌症治疗 |
1.2 肿瘤病毒疗法 |
1.3 癌症病毒疗法的优势 |
1.4 病毒疗法实施 |
1.5 全身施用病毒制剂的免疫学考量 |
1.6 临床应用 |
1.7 肿瘤选择性机制 |
1.8 优化有抗肿瘤潜质的溶瘤病毒 |
1.9 使用治疗基因改造溶瘤病毒 |
1.10 肿瘤微环境和溶瘤病毒 |
1.11 调整宿主免疫应答以宜于溶瘤病毒 |
第2章 新城疫病毒在癌症治疗中的安全性及其临床应用 |
2.1 NDV毒力的测定 |
2.2 新城疫病毒 |
2.3 病毒侵入蛋白:主要的毒力决定因素 |
2.4 免疫逃避与毒性 |
2.5 复制和毒力 |
2.6 非编码区 |
2.7 病毒治疗学 |
2.8 免疫治疗 |
2.9 NDV |
2.10 NDV在肿瘤治疗中的应用前景 |
2.11 NDV的免疫刺激特性 |
2.12 NDV不同毒株的临床应用 |
2.13 肿瘤溶解剂NDV73-T毒株 |
2.14 自体肿瘤细胞疫苗(ATV)与NDV Ulster毒株 |
2.15 PV701毒株 |
2.16 由Herfordshire毒株衍生而来的MTH-68/H毒株 |
2.17 其他新城疫病毒株 |
2.18 NDV毒株的转基因技术 |
2.19 有关马来西亚分离NDV毒株在肿瘤方面的研究 |
2.20 NDV作为抗癌剂运用的安全性 |
第二篇 研究内容 |
第1章 重组溶瘤腺病毒对人肝癌细胞HepG-2的抑制作用 |
1.1 材料与方法 |
1.2 结果 |
1.3 讨论 |
1.4 小结 |
第2章 重组溶瘤腺病毒对人肝癌细胞HepG-2的抑制方式 |
2.1 材料与方法 |
2.2 结果 |
2.3 讨论 |
2.4 小结 |
第3章 重组溶瘤腺病毒对人肝癌细胞HepG-2的抑制途径 |
3.1 材料与方法 |
3.2 结果 |
3.3 讨论 |
3.4 小结 |
第4章 重组溶瘤腺病毒对体内HepG-2实体肿瘤的作用 |
4.1 材料与方法 |
4.2 结果 |
4.3 讨论 |
4.4 小结 |
结论 |
参考文献 |
攻读学位期间发表的学术论文及取得的科研成果 |
导师及作者简介 |
致谢 |
(10)高强度聚焦超声联合载HSV1-TK自杀基因超声微泡造影剂治疗肝癌的实验研究(论文提纲范文)
英汉缩略语名词对照 |
摘要 |
ABSTRACT |
前言 |
参考文献 |
第一部分 载HSV1-TK基因脂质超声微泡造影剂的制备 |
材料和方法 |
结果 |
讨论 |
参考文献 |
附图 |
第二部分 超声辐照微泡介导HSV1-TK自杀基因系统治疗小鼠肝癌的实验研究 |
材料和方法 |
结果 |
讨论 |
参考文献 |
附图 |
第三部分 高强度聚焦超声联合载HSV1-TK自杀基因超声微泡治疗VX2 兔肝癌的实验研究 |
材料和方法 |
结果 |
讨论 |
参考文献 |
附图 |
全文总结 |
文献综述 |
参考文献 |
致谢 |
攻读学位期间主要的研究成果 |
四、腺病毒介导胸苷激酶基因治疗肝癌的实验研究(论文参考文献)
- [1]肝癌靶向载体scrAAV3介导基因治疗可视化的实验研究[D]. 刘旭昇. 湖北医药学院, 2020(04)
- [2]增强型胸苷激酶基因表达载体的构建及其杀伤性的研究进展[J]. 宋秋灵. 中国医学工程, 2017(10)
- [3]双自杀基因与芪三酚对人肝癌HepG2细胞系的杀伤作用及协同效应研究[D]. 谭成光. 广州中医药大学, 2017(05)
- [4]杆状病毒-腺相关病毒融合病毒介导核素报告基因监测干细胞移植的研究[D]. 潘昱. 上海交通大学, 2016
- [5]木犀草素、芹菜素及槲皮素对黑色素瘤自杀基因治疗的增效研究[D]. 黄暨生. 广州中医药大学, 2016(11)
- [6]多功能纳米粒子在肝癌诊治一体化中的应用研究[D]. 邵丹. 吉林大学, 2015(08)
- [7]腺病毒介导的胸苷激酶基因治疗肝癌的研究进展[J]. 朱瑞东,李宁. 中华消化外科杂志, 2014(08)
- [8]薯蓣皂苷通过GJ机制发挥对B16细胞自杀基因的增效作用[D]. 李玢. 广州中医药大学, 2014(01)
- [9]表达新城疫病毒血凝素—神经氨酸基因溶瘤腺病毒的抑瘤作用[D]. 田宇飞. 吉林大学, 2013(05)
- [10]高强度聚焦超声联合载HSV1-TK自杀基因超声微泡造影剂治疗肝癌的实验研究[D]. 周世骥. 重庆医科大学, 2012(11)