一、单纯疱疹病毒I型糖蛋白D酵母表达载体的构建（论文文献综述）
谢晶莹[1]（2021）在《IFITM2抑制PRV增殖及PRV US3对其产生的拮抗机制研究》文中指出伪狂犬病病毒（Pseudorabies virus,PRV）可以感染不同年龄段的猪,并导致母猪繁殖障碍。妊娠母猪感染后常发生流产、产木乃伊胎和死胎等,给养猪业带来极大危害。通过对89个猪流产胎儿进行PRV g E基因的检测,结果发现PRV感染率高达12.4%,而且春冬季的感染率较高,说明PRV与流产关系巨大。但PRV的感染机制以及致流产的机制仍不清楚,因此有必要深入研究PRV引起母猪繁殖障碍的机制,降低胎儿及仔猪的死亡率,确保养猪的经济收益。干扰素诱导的跨膜蛋白（Interferon-induced Transmembane proteins,IFITMs）是一类小分子蛋白,可帮助宿主抵抗病原微生物的感染,并在此过程中发挥生物活性。近年来已有多个研究证明人源和鼠源的IFITMs可以抵御多种RNA病毒的感染,但对于猪源IFITM蛋白抑制病毒感染方面研究较少。因此,本研究主要为了探索猪源IFITM2蛋白在PRV感染宿主细胞过程中扮演的角色,以及PRV US3蛋白拮抗IFITM2抗病毒作用的相关机制。经过一系列研究,获得了如下研究结果:（1）猪源IFITM2蛋白对PRV增殖的影响。在PK15细胞中,IFN-α2a刺激可有效诱导猪源IFITM1、IFITM2和IFITM3蛋白的表达。以刺激后PK15细胞的c DNA为模板,成功扩增得到IFITM1、IFITM2和IFITM3基因,并构建表达载体p CMV-Myc-IFITMs。表达质粒可在PK15细胞中瞬时过表达,然后进行PRV感染实验,做进一步的抗病毒研究。结果发现IFITM蛋白可有效抑制病毒在PK15细胞内的增殖。在对干扰素抗病毒作用研究中,采用RNAi技术下调IFN-α2a诱导的IFITM2蛋白表达,然后进行PRV感染实验,发现病毒感染增强,即IFN的抗病毒作用减弱。这些结果进一步说明猪源IFITM2蛋白可有效抑制PRV在宿主细胞内增殖,同时与IFN的抗病毒作用相关。（2）IFITM2蛋白抑制PRV增殖的机制研究。为了探索IFITM2蛋白抑制PRV增殖的相关机制,进一步研究了IFITM蛋白对PRV吸附和进入过程的影响,发现IFITM1、IFITM2和IFITM3蛋白均可显着抑制PRV的进入过程,其中IFITM2对病毒的吸附过程也发挥抑制作用。RNAi IFITM2蛋白表达对细胞活力无影响,但病毒的吸附和进入过程明显增强,提示IFITM2蛋白在病毒感染时维持细胞的抗病毒活性方面发挥一定的作用。胆固醇消耗剂MβCDX以及抑制剂PF429242处理细胞后,PRV感染降低,说明PRV感染细胞与胆固醇途径有关。应用PF429242处理过表达IFITM2细胞,然后验证对病毒的抑制作用,研究发现IFITM2对病毒吸附、进入以及复制过程的抑制作用明显减弱,说明IFITM2抑制PRV增殖与胆固醇途径有关。（3）PRV及其US3蛋白对I型干扰素信号通路的影响。在PK15细胞中,研究发现PRV对稳定表达的IFITM2无影响,但会抑制IFN-α2a诱导的IFITM2表达,说明PRV可能干扰I型干扰素信号通路。通过对转染poly（I:C）并感染PRV的PK15细胞进行RT-q PCR检测发现PRV感染会抑制poly（I:C）激发的IFN-β的活化。进一步筛选可能抑制IFN-β转录的病毒蛋白,发现病毒蛋白ICP0、UL24、UL26、UL41和US3均对IFN-β转录有明显的抑制作用,其中US3蛋白抑制作用最强。PRV感染宿主细胞,病毒核酸可被c GAS-STING信号通路相关蛋白识别,本研究进一步验证US3蛋白对c GAS、STING、TBK1和IRF3基因以及蛋白水平表达的影响,发现US3可以抑制c GAS、STING和IRF3的m RNA水平和蛋白水平表达。（4）US3蛋白抑制I型干扰素信号通路的机制研究。通过瞬时过表达US3蛋白发现US3抑制c GAS-STING、TBK1和IRF3介导的IFN-β活化,这一结果说明US3靶向IRF3或者IFR3下游因子拮抗IFN-β活化。进一步分析US3是如何抑制IFN-β活化的,Co-IP实验证明US3与IRF3之间存在相互作用,而且核质分离实验发现US3会抑制IRF3入核的过程。IRF3入核需与输入蛋白KPNA3和KPNA4互作,首先验证了US3是否影响输入蛋白的表达,发现US3对KPNA3和KPNA4的表达无影响。Co-IP实验证实IRF3蛋白与KPNA3和KPNA4之间存在相互作用,但在US3存在的情况下,这种相互作用减弱,更有趣的是US3与KPNA4之间存在相互作用。这些结果证实了以下猜想:US3通过与IRF3竞争结合KPNA4抑制IRF3入核进而抑制IFN-β活化以及下游一系列ISGs的表达。综上所述,本研究证明了猪源IFITM1、IFITM2和IFITM3蛋白具有抗病毒作用,并参与IFN-α2a介导的抗病毒防御,而且IFITM2蛋白的抗病毒作用与胆固醇途径相关。并初步探讨了PRV US3蛋白逃逸IFITM2抗病毒的机制,PRV US3蛋白可通过降解c GAS、STING和IRF3抑制c GAS-STING通路介导的IFN-β活化;US3与IRF3竞争结合KPNA4抑制IRF3入核,阻碍I型干扰素的表达。这些结果有助于探讨IFITM2蛋白作为抗病毒药物的潜在应用价值,同时为预防和控制猪繁殖障碍性疾病提供科学资料。
王瑞[2]（2021）在《HSV-1酵母表面展示口服疫苗效果初探》文中指出疱疹病毒是二十面体对称的双链DNA病毒,属于疱疹病毒科。迄今已发现的能感染人的疱疹病毒主要有带状疱疹病毒和单纯疱疹病毒等。单纯疱疹病毒（HSV）感染现已成为世界上第四大传染病。据统计有70%～90%的成年人曾感染过HSV-1。HSV-1最初的感染部位一般是口腔黏膜或者其他相关区域的上皮细胞,并在这些部位发生裂解感染。随后,病毒会沿着神经元轴突传递到宿主的三叉神经节等神经组织中,产生终生性的潜伏感染,还会伴随周期性的重激活。而一旦被重激活会导致患者产生疱疹病毒性角膜炎、疱疹病毒性脑炎及口唇疱疹等疾病。目前,国内外医疗机构针对HSV-1感染的主要治疗手段是药物,而针对HSV-1疫苗研究较少。本实验室前期已经成功采用酵母表面展示技术制备了酵母口服疫苗X-33-PDI-g D,发现该疫苗可以有效地诱导小鼠产生相应的免疫应答。为了进一步探究该疫苗在小鼠暴露于HSV-1的有效性,本研究深入探究了在疫苗接种后,动物的免疫保护性和相关评估实验。本研究以BALB/c小鼠为模型进行口服疫苗接种实验。按照攻毒方式的不同,实验分为两组:第一组小鼠进行口服免疫5周,免疫结束两周后,对该组小鼠以1×106 PFU直接腹腔注射进行病毒攻击,并对小鼠体重、生存率、特异性Ig G以及特异性Ig A等指标进行检测,结果显示疫苗无法对小鼠提供完全保护。第二组小鼠口服免疫9周,免疫结束两周后,对该组小鼠以1×104 PFU进行角膜划痕感染病毒。病毒攻击初期小鼠体重出现明显的下降,当攻击病毒处于潜伏期时小鼠体重状态趋于平稳。我们利用酶联免疫吸附测定检测了小鼠血清中特异性Ig G抗体水平及小鼠粪便中特异性Ig A抗体水平,结果显示实验组Ig G指标显着高于对照组,这表明疫苗诱导小鼠机体产生了体液免疫应答。而实验组小鼠体内产生的特异性Ig A水平显着高于对照组,证明本疫苗诱导小鼠机体产生了黏膜免疫应答。此外,对小鼠小肠冷冻切片后进行免疫荧光实验,结果表明实验组的绿色荧光强于对照组,说明本疫苗靶向小肠上皮微褶细胞,并将抗原蛋白递送至肠内组织产生黏膜免疫。本研究将服用疫苗的小鼠暴露于单纯疱疹病毒,通过实时监测本疫苗对小鼠的保护效果,初步评估了本疫苗保护性,为后续对疫苗的改进实验奠定了基础。本研究的结果也将为其他酵母表面展示口服疫苗的构建提供重要的信息。
沈阳坤[3]（2020）在《HSV-1溶瘤病毒用于肿瘤精准治疗及肿瘤耐受机制的研究》文中认为溶瘤病毒疗法（Oncolytic virus therapy,OVT）作为一种前景广阔的肿瘤治疗手段,具有安全、高效和副作用低的特点,已经成为肿瘤治疗研究中的热点。其中,I型单纯疱疹病毒（Herpes simplex virus type 1,HSV-1）作为研究最为广泛的一类溶瘤病毒,已有几十种候选药物处于临床前或临床研究阶段。然而,多年的临床试验表明,单一的溶瘤病毒疗法只有有限的治疗效果,且具体机制尚不明确。宿主中的一些蛋白质对病毒的侵染、繁殖以及传染至关重要,被称为病毒的宿主依赖因子（Host Dependency Factor,HDF）。已有证据表明,细胞和动物水平HDF的缺陷,会导致病毒的感染失败。然而尽管目前已有针对HSV-1复制周期及HSV-1的免疫机制等方面的深入研究,但对病毒与宿主间的相互作用的理解,特别是涉及病毒感染和裂解复制的细胞质蛋白的作用仍然所知甚少。此外,肿瘤患者体内的HDF突变是否影响HSV-1类溶瘤病毒的治疗尚未见系统研究。本论文研究的目的是探讨HSV-1病毒HDF突变在溶瘤病毒精准治疗中的作用及肿瘤耐受的机制。方法:（1）利用CRISPR/Cas9技术制备ICP34.5基因缺失的HSV-1溶瘤病毒HSV-1-ΔICP34.5、HSV-1病毒受体Nectin1基因缺失的小鼠结肠癌MC38细胞MC38Nectin1-/-和表达NEO-2/15的HSV-1溶瘤病毒HSV-1-NEO-2/15。（2）制备小鼠B16黑色素瘤模型和小鼠MC38结肠肿瘤模型,利用HSV-1-ΔICP34.5溶瘤病毒治疗并评估治疗效果。（3）制备小鼠MC38结肠肿瘤模型,利用HSV-1-ΔICP34.5和HSV-1-NEO-2/15溶瘤病毒治疗并评估治疗效果。（4）利用人类CRISPR全基因组敲除文库结合高通量测序技术筛选HSV-1病毒的HDF。（5）通过统计学、基因富集分析、KEGG通路分析、PANTHER GO分析和基因重叠分析等方法确定HSV-1病毒HDF的候选基因。（6）利用CRISPR/Cas9技术制备Nectin1、ENTPD1、HCFC1R1、EXT1、EXT2、EXTL3、Tm9sf3和B3GALT6等基因的敲除细胞并通过病毒感染、台盼蓝法、细胞计数法、q PCR和Western Blotting检测HDF缺失对病毒感染的影响。（7）通过HSV-1病毒的膜结合实验评估HSV-1病毒的HDF缺失后病毒和宿主细胞的结合能力。（8）通过共聚焦显微镜追踪HSV-1病毒进入细胞的过程。（9）利用TCGA数据库分析临床肿瘤患者体内HSV-1病毒HDF的突变频率。结果:（1）HSV-1-ΔICP34.5溶瘤病毒治疗对小鼠MC38结肠癌治疗效果显着,然而对B16黑色素瘤未见明显效果。接着,我们利用HSV-1-ΔICP34.5溶瘤病毒治疗HSV-1病毒受体Nectin1基因缺失的小鼠结肠癌,结果显示,和对照组相比,Nectin1基因缺失的小鼠肿瘤体积未见明显缩小,证实溶瘤病毒对小鼠MC38-ΔNectin1结肠肿瘤的治疗无效。（2）本研究中,利用CRISPR基因编辑技术,我们成功制备HSV-1-NEO-2/15新型溶瘤病毒。通过对小鼠MC38结肠肿瘤的治疗,我们的研究结果表明,NEO-2/15不仅可以和HSV-1溶瘤病毒同时使用,并且NEO-2/15的整合能够显着增强溶瘤病毒的治疗效果。（3）利用人类CRISPR全基因组敲除文库结合高通量测序技术,结合统计学、基因富集分析、KEGG通路分析、PANTHER GO分析和基因重叠分析等分析方法,我们最终得到了31个HSV-1病毒的候选HDF基因。通个基因敲除验证,我们已经证实细胞水平敲除Nectin1、ENTPD1、HCFC1R1、EXT1、EXT2、EXTL3、Tm9sf3和B3GALT6可以显着增强细胞抵抗HSV-1病毒感染的能力。此外,KEGG分析结果表明EXT1、EXT2、EXTL3和B3GALT6等基因在硫酸乙酰肝素合成通路中扮演重要作用。基因敲除结果表明这些基因的突变不仅能够显着降低HSV-1病毒对宿主的感染水平,而且还能降低病毒与宿主细胞的结合能力。ENTPD1基因的缺失只影响HSV-1病毒进入宿主细胞,并不影响病毒与细胞膜的结合。（4）根据TCGA数据库提供的肿瘤患者基因信息,大部分基因在至少一种肿瘤中存在突变,且部分基因的突变频率高达5%以上,意味着HSV-1溶瘤病毒对这些肿瘤可能得不到很好的治疗效果,暗示HDF的精准检测在溶瘤病毒治疗前的必要性。结论:本研究中,基于HDF突变引起的溶瘤病毒感染失败的现象,我们首次提出溶瘤病毒抵抗（Oncolytic virus resistance）的概念,即当患者体内发生溶瘤病毒HDF的突变,溶瘤病毒的治疗效果就会消失;或者治疗前期溶瘤病毒对肿瘤的效果显着,但是随着肿瘤细胞增殖过程中异质性分化的更加明显,部分肿瘤细胞的HSV-1宿主依赖因子的表达水平降低或者发生基因突变,导致HSV-1病毒的感染减少或者失败,最终影响溶瘤病毒的治疗效果。基于此概念,寻找新的肿瘤治疗药物并用于溶瘤病毒的联合治疗是该治疗领域的一个重要研究方向。因此,我们构建了一种新型HSV-1类溶瘤病毒HSV-1-NEO-2/15,能显着增强肿瘤的治疗效果。此外,利用CRISPR全基因组敲除文库筛选出多个HSV-1的HDF,并深入探讨了部分基因的功能。近年来国内溶瘤病毒治疗的临床研究越来越多,而专门针对溶瘤病毒的精准医疗检测尚未见报道。本研究证实了根据HSV-1病毒HDF的突变与否可以判断患者能否获益于溶瘤病毒的治疗,以减少不当治疗带来的病情延误和资源浪费。未来,通过对这些蛋白的深入研究,将为开发HSV-1类溶瘤病毒耐药检测试剂盒以及为肿瘤患者制定个性化治疗方案提供研究依据。同时依据这些靶点,可以开发出新的抗HSV-1病毒药物,为溶瘤病毒治疗后因病毒残留带来的潜在感染风险提供新的解决方案,把溶瘤病毒治疗的副作用降到最低。
胡好[4]（2020）在《IFIT1负反馈上调Ⅰ型干扰素抗HSV-1病毒或PRV病毒感染》文中研究表明HSV-1（Herpes simple virus-1,HSV-1）病毒是危害人类健康的常见病原体之一,能够通过受损的皮肤或粘膜感染宿主细胞并引起多种疾病。PRV（Pseudorabies virus,PRV）病毒属疱疹病毒科疮疹病毒甲亚科,暂定水痘病毒属。HSV-1和PRV病毒均为双股DNA病毒,研究表明,HSV-1和PRV病毒侵入细胞会激活先天免疫模式识别受体环鸟苷酸-腺苷酸合成酶（cyclic GMP-AMP synthase,c GAS）,产生第二信使环鸟甘酸-腺苷酸（cyclin GMP-AMP,c GAMP）,c GAMP结合干扰素基因刺激因子STING招募TANK结合激酶1,诱导干扰素调节因子3（Interferon regulatory Factor3,IRF3）磷酸化后产生I型干扰素,接着进一步诱导产生干扰素刺激基因（Interferon Stimulating Genes,ISGs）,发挥抗病毒作用。研究ISGs基因如何发挥抗病毒作用具有重要的研究意义和应用前景,近年来,ISGs之一的干扰素诱导蛋白（Interferon-induced proteins with tetratricopeptide repeats,IFITs）家族蛋白因其具有广泛的抗病毒活性而获得大量的关注。目前研究已发现ISG中IFIT3通过招募STING和TBK1（Recombinant TANK Binding Kinase 1）对RIG-I信号通路有正调控作用,加强IRF3与NF-?B通路的活化,促进I型干扰素的表达,限制病毒增殖,最终发挥抗病毒作用。但IFIT基因家族其他基因的抗病毒功能还有待确定。本研究利用CRISPR/Cas9技术构建了小鼠成纤维细胞（L929）IFIT1敲除细胞株,免疫印迹法检测敲除细胞株IFIT1蛋白表达检测敲除效率。转染HT-DNA和Poly（I:C）刺激L929 WT和IFIT1敲除细胞株,实时定量PCR技术和ELISA技术检测发现HT-DNA刺激敲除细胞时,I型干扰素及下游ISGs的表达量显着升高,而高浓度Poly（I:C）刺激无明显变化,表明IFIT1主要是通过DNA信号通路来行使其负反馈调节作用。为进一步研究IFIT1负反馈调节抗病毒的作用,本研究选择HSV-1-VP26-m Cherry病毒和PRV病毒感染WT和IFIT1敲除细胞株。HSV1-VP26-m Cherry病毒是利用CRISPR/Cas9技术将m Cherry基因融合连接至HSV1 VP26基因的C端使VP26-m Cherry融合表达。感染HSV1-VP26-m Cherry病毒后,L929 Ifit1-/-I型干扰素及下游ISGs的表达量显着升高,L929 Ifit1-/-与L929 WT细胞生存活率相比提高了49%（****P<0.0001）,经病毒拷贝测定表明病毒复制能力减弱（在48 h后,与L929 WT细胞相比拷贝数降低了28.6倍,***P<0.001）,表明IFIT1基因缺失有利于细胞抵御HSV-1的侵染。感染PRV病毒后,L929 Ifit1-/-I型干扰素及下游ISGs的表达量显着升高,细胞增殖实验证明感染PRV病毒后,L929 Ifit1-/-细胞死亡率低于L929细胞,而病毒拷贝降低表明IFIT1缺失可增强细胞抗病毒能力。综上所述,实验结果表明IFIT1基因缺失负反馈上调干扰素表达,有利于抵抗HSV-1或PRV病毒的感染。该结果为后续研究开发治疗HSV-1或PRV病毒感染相关的治疗药物提供一个新思路。
祁馨宇[5]（2020）在《Bm65蛋白功能序列的鉴定及其对病毒增殖的影响》文中认为家蚕（Bombyx mori）是我国一种重要的经济昆虫,其吐出的蚕丝具有很高的经济价值,在服饰、医疗和化妆品等方面都有广泛的用途。然而,家蚕杆状病毒容易感染家蚕,引起家蚕群体爆发烈性传染病,导致大量的家蚕死亡并显着减少蚕茧产量,给蚕桑经济带来极大的损失。本课题组前期研究发现:家蚕杆状病毒Bm65蛋白在病毒感染早期表达,其分子量大约为12.2 kDa。Bm65主要分布于细胞核中,与紫外线引起的DNA损伤修复有关,但Bm65蛋白入核机制仍不甚清楚。本论文通过对Bm65蛋白序列中的几个功能序列进行鉴定,阐明它们在Bm65蛋白入核中的作用及其对病毒增殖的影响,为进一步改造并利用杆状病毒提供理论依据。本论文研究的主要结果如下:1.通过对Bm65蛋白序列及其同源序列进行分析,发现33RRIK和76KRKCSK及其C端两个疏水氨基酸簇92PLLL和98FLLA高度保守,推测与Bm65蛋白在核质中的动态转运有关。2.构建了一系列在ie1启动子控制下,并与EGFP融合的Bm65截短突变瞬时表达载体,通过荧光信号研究Bm65的分布,发现76KRKCSK与Bm65的核输入有关,而33RRIK不直接参与Bm65的核输入。为了进一步验证该结果,作者构建Bm65突变体,将其与EGFP融合表达,荧光观察发现:33RRIK突变体与野生型Bm65定位一样,而76KRKCSK序列突变后,Bm65蛋白入核受阻,主要累积在细胞质中,说明76KRKCSK在Bm65入核中起重要作用。作者通过对其进行单点突变,发现78K和81K是76KRKCSK序列中起关键作用的氨基酸残基。3.Bm65截短突变体的瞬时表达表明92PLLLHKFLL可能与Bm65的核输出有关。为了鉴定92PLLLHKFLL是否为Bm65蛋白的出核信号,分别将该序列中的两段疏水氨基酸进行突变,并与EGFP融合构建瞬时表达载体,通过观察荧光信号的分布可知:92PLLL和98FLLA序列分别突变后,Bm65蛋白全部聚集在细胞核中,在细胞质中几乎看不到绿色荧光,因此,我们认为92PLLL和98FLLA两段序列发挥Bm65蛋白出核信号的作用。4.构建融合Flag标签的Bm65重组病毒,对病毒感染的BmN细胞总蛋白进行Western blot分析,发现Bm65在病毒感染的细胞中以四聚体的形式存在;作者将Bm65序列中三个半胱氨酸残基C12、C46和C79同时突变为丙氨酸,Western blot分析发现:这些突变并没有改变Bm65的四聚体形式,但影响了Bm65四聚体的稳定性。另外,将EGFP标签融合在Bm65蛋白的C端或N端,发现该融合蛋白表达均以单体的形式存在,说明融合EGFP序列标签会影响Bm65四聚体的形成。5.76KRKCSK序列突变导致Bm65入核受阻,并不影响Bm65四聚体的形成,但极大地降低了子代感染性病毒粒子的产量。该突变病毒皮下注射家蚕后,与野生型病毒相比,其在家蚕体内的增殖效率也明显降低,延缓了家蚕致病或致死。
柳蕾[6]（2020）在《HSV-2突变株的构建及其生物学特性分析》文中研究表明迄今为止,我们已发现了与人类疾病相关的8种疱疹病毒,其中单纯疱疹病毒2型（HSV-2）作为α疱疹病毒家族的一员,是引起生殖器疱疹的主要病原体。该病毒是嗜神经性病毒,其可沿神经轴突逆行至骶背根神经节建立潜伏感染,在体内环境出现特定变化时,该潜伏感染病毒可出现重激活。HSV-2能够编码多种蛋白,这些蛋白在病毒的原发性感染、潜伏感染以及复发感染中都有着重要的生物学意义。其中,ICP34.5蛋白是由HSV-2的RL1基因编码的重要功能性分子,可通过其神经毒力特点和抑制细胞诱导的应激性翻译阻滞功能参与病毒的病理过程。病毒的LAT基因与其潜伏相关,具有抑制神经细胞凋亡,提高神经细胞存活的能力,对HSV-2在神经组织中潜伏感染的形成、维持以及重激活起到了关键作用。而LAT基因的miRNA对应RL1基因的反义链,可调控RL1基因的表达。除此之外,目前还没有对以上两种嗜神经性基因之间相互作用关系的相关报道。本论文的工作围绕HSV-2病毒对神经细胞的感染能力以及病毒感染过程中相关的调控机制进行,首先我们选择“神经毒力因子”RL1基因,构建缺失突变株RL1-HSV-2,并对该突变株的增殖动力学及其在动物模型上的临床病理表现、诱导的细胞应激反应、增殖特性以及RL1基因参与病毒相关基因的调控过程做了相应的探索研究。在缺失RL1的基础上,我们又构建同时缺失LAT基因的RL1-LAT-HSV-2,并基于缺失LAT基因的LAT-HSV-2的生物学特征,对RL1-LAT-HSV-2在细胞和动物水平的增殖能力,在小鼠模型的急性感染、潜伏感染及所引起的免疫反应做了分析。在第一部分工作中,与野毒株HSV-2感染相比,缺失RL1基因的HSV-2突变株RL1-HSV-2感染小鼠导致更严重的临床病理表现,表现为类恶病质样综合征。但是,这种病理特征不是由于组织中的病毒增殖所致,RL1-HSV-2在小鼠组织中的病毒载量远低于野毒株感染组。我们的实验观察提示,ICP34.5蛋白的缺失很可能导致了宿主过度的应激反应,该应激反应使得某些组织的炎症反应和趋化因子水平上调,从而导致感染动物的全身衰竭。此外,ICP34.5蛋白的缺失使得病毒按照α、β、γ基因的陆续下调的事实表明,ICP34.5对病毒稳定增殖所必需的转录调控起重要作用。这些实验结果对ICP34.5的功能提出了新的认识。在第二部分工作中,我们观察到HSV-2突变株LAT-HSV-2和RL1-LAT-HSV-2表现了不同的生物学特性。RL1-LAT-HSV-2在神经细胞中的增殖能力明显降低,且在Vero细胞中形成的蚀斑小于LAT-HSV-2突变株和野毒株。对两个突变株以及野毒株感染小鼠的临床观察比较表明,与野生型毒株相比,突变株RL1-LAT-HSV-2具有减毒表型,其在急性感染和潜伏感染的中均具有较低的致病性,并可诱导更强的特异性免疫反应。然而在感染LAT基因缺失的LAT-HSV-2突变株的小鼠中未发现明显的减毒作用。进一步的观察提示RL1和LAT基因的同时缺失并不能完全限制病毒在神经细胞中的增殖,说明HSV-2病毒中存在其它基因参与病毒在神经细胞中的复制和感染。以上结果表明,HSV-2的RL1基因和LAT基因在病毒的感染增殖过程均具有涉及病毒致病机制的生物学特性,二者可能存在着某种相互制衡的关系,在相互调控的过程中亦在病毒与细胞相互作用的过程中表现了特定的病理学意义,使病毒与宿主之间呈现出共平衡的生存状态。这也是在HSV-2的嗜神经特性感染机制研究中对RL1和LAT基因之间相互作用关系的首次发现和探索。
张霞[7]（2020）在《基于酵母的疱疹病毒疫苗的设计和制备》文中提出阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）是一种神经退行性疾病,它的发生、发展过程与遗传、表观修饰、环境等因素有关,关于阿尔茨海默病的学说有很多种,主要包括“胆碱功能障碍假说”、“淀粉样蛋白级联假说”、“tau蛋白假说”、“病毒感染假说”等。一直以来,对于AD药物的研发重点都放在消除Aβ的沉积,以期望改善患者的认知功能障碍,但有关药物研发的相继失败证明此途径行不通。近两年提出的“病毒感染假说”是指AD是由1型单纯疱疹病毒（Herpes simplex virus 1,HSV-1）感染引起的,而这一假说的提出使得HSV重新进入人们的视野中。单纯疱疹病毒可以引起Aβ的沉积和tau蛋白的过度磷酸化,而这两者是AD的主要神经病理学特征。一直以来,人们普遍认为Aβ沉积所形成的老年斑是AD的罪魁祸首,因此Aβ一度成为众矢之的,但是Aβ也是抗菌肽,具有抗细菌、抗真菌以及抗病毒的作用。研究表明Aβ可以包裹疱疹病毒,以保护神经元不受损伤。目前,对于HSV-1的治疗是使用一些抗病毒药物,如阿昔洛韦等,但这些抗病毒药物也只是缓解患者的疼痛程度及降低发生频率,并不能达到治愈的目的。所以对于HSV-1的感染,最有效的方法就是预防,也就是接种疫苗。实验室的前期研究结果表明,蛋白质二硫键异构酶（Protein disulfide isomerase,PDI）可以增加外源蛋白在毕赤酵母中的表达量,所以本研究采用过表达PDI的毕赤酵母X-33-PDI作为外源蛋白的表达菌株,以增加外源蛋白的表达量。从疫苗的角度出发,考虑到目前疫苗主要是注射型疫苗,而这种疫苗研发过程中需要蛋白纯化,成本高,而且运输过程中必须保证全程冷链,使用时也需要专业的医护人员才可以操作,所以我们采用酵母表面展示技术构建酵母口服疫苗,酵母展示体系包含三部分:M细胞特异性配体,起到靶向性作用;HSV-1包膜糖蛋白D,病原体蛋白,即抗原;α凝集素,锚定蛋白。酵母表面展示菌株构建成功后,我们利用荧光显微镜观察了目的蛋白在酵母表面的定位情况,发现与对照组相比,实验组菌株的表面可以观察到绿色荧光,而对照组菌株无绿色荧光,证明目的蛋白已经被成功诱导表达,且被展示在酵母表面上;同时利用免疫印迹实验验证了目的蛋白的表达情况,提取酵母细胞壁蛋白做western blot实验,结果发现在实验组的细胞壁中检测到目的蛋白,而胞外产物中不含有目的蛋白,这再次验证了目的蛋白已被表达且定位在酵母细胞壁上,并未出现泄漏的情况,同时对照组的细胞壁蛋白及胞外产物中均未检测到目的蛋白。以上验证成功的菌株经过目的蛋白的诱导表达后,给BALB/c鼠口服饲喂使用,饲喂时间分别为第1、3、5、7、9、11周,每周饲喂5天,然后定期收集小鼠血液样本及粪便样本,血样样本经离心后获得血清,粪便样本处理成匀浆后离心获得上清,采用ELISA的方法验证特异性抗体浓度,结果表明,血液样本中的特异性抗体IgG,粪便样本中的特异性抗体IgA随着时间的延长逐渐增多,与对照组小鼠相比,实验组小鼠具有显着性差异,证明可以有效引起体液免疫应答及粘膜免疫应答,这为HSV-1的疫苗研发奠定了实验基础,有望用于单纯疱疹病毒感染的预防,同时也可能为AD的干预打开一扇新的大门。
马小静[8]（2020）在《牛病毒性腹泻和牛传染性鼻气管炎二联核酸疫苗的构建及其免疫效应研究》文中研究表明牛病毒性腹泻（BVD）和牛传染性鼻气管炎（IBR）是危害牛和其他反刍动物的两种重大疾病,病原分别为牛病毒性腹泻病毒（BVDV）和牛传染性鼻气管炎病毒（IBRV）。BVDV和IBRV常混合感染牛群,引起腹泻、出血综合征、流产、肺炎、脑炎、鼻炎、眼炎等临床症状,给养牛业带来了巨大经济损失。目前,对这两类疫病的防控主要依靠灭活疫苗或弱毒疫苗,但在实际应用中存在免疫持续期短、病毒毒力易返强、保存和运输成本高等诸多缺陷。因此,具有持久免疫应答、制备工艺简单、应用安全等优点的核酸疫苗成为了当下疫苗研制的热点。本研究将BVDV和IBRV的优势抗原基因插入到pVAX1真核表达载体中,获得能同时表达两种抗原基因的重组载体并研究其免疫效果,旨在研制一种能有效预防BVD及IBR的核酸疫苗。主要工作如下:1.BVDV E0与IBRV gD目的基因的克隆及生物信息学分析:根据GenBank收录的BVDV和IBRV参考序列设计引物,PCR扩增BVDV E0基因和IBRV gD基因并测序;利用生物信息学方法对目的蛋白进行分析。结果表明扩增的BVDV E0基因、IBRV gD基因符合预期大小,其蛋白具有较好的免疫原性,可作为核酸疫苗的候选抗原基因。2.pVAX1-E0-IRES-gD真核表达载体的构建:PCR扩增IRES序列;将IRES、BVDVE0、IBRV gD基因片段依次连接至pVAX1载体中,构建pVAX1-E0-IRES-gD重组质粒。重组质粒经双酶切及DNA测序鉴定,结果显示,成功构建本研究所需真核表达载体pVAX1-E0-IRES-gD。3.重组质粒pVAX1-E0-IRES-gD中目的基因体外表达的检测:将质粒pVAX1-E0-IRES-gD用脂质体法转染至293T细胞中,48 h后采用一抗（BVDV、IBRV阳性血清）和二抗（兔抗牛IgG-FITC）进行间接免疫荧光检测。结果显示,荧光显微镜下可观察到绿色荧光,证明目标蛋白E0和gD在293T细胞中成功表达并具有良好反应原性。4.pVAX1-E0-IRES-gD二联核酸疫苗免疫效果研究:将pVAX1-E0-IRES-gD二联核酸疫苗以不同剂量免疫小鼠,首免14d后加强免疫一次。采用ELISA方法检测小鼠血清中抗E0、gD抗体水平以及IFN-γ、IL-4含量,MTT法检测小鼠脾淋巴细胞增殖能力。结果显示,在抗体和细胞因子水平以及脾淋巴细胞增殖能力这三个指标方面,核酸疫苗组均高于空载体和阴性对照组且差异极显着,200 μg高剂量免疫组优于100μg、50μg中、低剂量组;另外,200μg高剂量核酸疫苗免疫组与BVD-IBR灭活疫苗组相比无显着性差异。本研究成功构建了BVD-IBR二联核酸疫苗,体外表达检测证明目的蛋白具有良好反应原性,动物免疫试验证明其能刺激机体产生良好免疫应答,以上试验结果都为BVD-IBR二联核酸疫苗的研制提供了可靠的数据及理论支持。
李兆龙[9]（2019）在《HSV-1囊膜蛋白gL逃逸宿主天然免疫反应及介导宿主损伤的机制》文中认为单纯疱疹病毒Ⅰ型（Herpes simplex virus,HSV）属于疱疹病毒科（Herpesviridae）疱疹病毒亚科成员。它传染性高,危害性大,常引起或诱发人粘膜疱疹,母体流产、胎儿畸形、传染性单核细胞增多症、脑炎、肿瘤和阿尔兹海默症等疾病。因病毒基因组庞大,结构复杂,很多病毒蛋白以不同方式参予逃逸宿主免疫反应和介导宿主组织器官损伤。gL囊膜蛋白则以g H/gL复合二聚体介导病毒入侵,但gL囊膜蛋白是否参予逃逸宿主天然免疫反应和介导宿主损伤,迄今为止未见相关报道。为探讨并阐明gL囊膜蛋白逃逸宿主天然免疫反应和介导宿主损伤机制。我们采用过表达gL蛋白,研究它对宿主天然免疫信号通路中Ⅰ型干扰素（Type-Ⅰinterferon,IFN）和干扰素诱导基因产物（Interferon stimulated gene,ISG）的调控,结果发现UL1基因编码的gL囊膜蛋白能明显抑制干扰素IFN-β和干扰素诱导基因产物ISG15的转录。为进一步验证gL在宿主天然免疫抗病毒信号通路中的作用靶点,我们分别采用过表达、RNA干扰和CRISPR/Cas9基因编辑等方法研究了gL蛋白对IFN-β上游的天然免疫信号通路接头蛋白和各转录因子转录和翻译的作用。我们通过CRISPR/Cas9技术进行基因编辑修饰获得了一个gL单氨基酸缺失的突变毒株即HSV1-gL（Δ11V）。结果发现gL并不影响IFN-β上游抗病毒信号通路中相关接头蛋白和各转录因子的转录和翻译。为进一步研究gL对IFN-β和ISG转录抑制的具体机制,我们运用共聚焦显微镜研究了NF-κB中磷酸化p65入核情况,结果发现gL囊膜蛋白明显抑制磷酸化p65入核,而通过RNA干扰gL后磷酸化p65又恢复入核。为了揭示p65和gL的具体作用靶点,我们分段表达p65和gL蛋白,经免疫共沉淀和共定位发现gL的N端序列（1-77氨基酸）能够结合在p65的RHD端,因此,这一结合有可能覆盖住磷酸化p65的入核引导序列,从而抑制了磷酸化的p65入核,最终抑制了IFN-β和ISG刺激因子的转录,协助病毒逃逸宿主天然免疫反应。病毒有多种逃逸宿主的天然免疫反应方式,其中还包括调控细胞周期,诱导细胞损伤和抑制促炎症因子表达,以及调控细胞的溶氧量等。为了进一步揭示gL是否存在其它逃逸宿主天然免疫反应机制,我们通过流式细胞技术、实时定量PCR和宿主细胞ROS活性检测等方法,研究过表达gL囊膜蛋白介导的其它天然免疫抗病毒机制。结果发现gL蛋白能通过抑制细胞凋亡,并下调促炎症因子TNF-α和IL-6来抵制宿主的抗病毒方式。但gL蛋白对细胞周期和细胞ROS调控的抗病毒模式,并没有明显的抑制作用。此外,为了进一步揭示gL囊膜蛋白介导宿主损伤的初步机制,我们将带有gL单氨基酸缺失突变的病毒感染小鼠,比较带有该gL缺失的病毒和野生型病毒,对小鼠组织器官的细胞凋亡、病理损伤和病毒增殖调控。结果发现带有该gL缺失突变的病毒缓解了对小鼠小脑微管蛋白的破坏,也下凋了其它组织器官的细胞凋亡率、减轻了病理损伤并下调了病毒增殖。这结果表明gL蛋白介导了宿主损伤。
徐逸飞[10]（2019）在《伪狂犬病毒UL12基因的克隆、表达及其相关功能研究》文中研究说明伪狂犬病毒（Pseudorabies virus,PRV）作为猪的一种重要病原体,在全球广泛传播。长期以来,PRV受到兽医学家、病毒学家以及神经生物学家的广泛关注及研究,目前对PRV的研究已经为疱疹病毒发病机制提供了相当全面的参考依据。2018年中国上海报道了首例人类感染PRV的情况,引起相关研究学者们强烈重视。单纯疱疹病毒（Herpes Simplex Virus,HSV）UL12基因编码一种碱性核酸酶（Alkaline nuclease,AN）,AN由疱疹病毒科基因组中共同保守序列编码。有研究报道HSV UL12诱导的mtDNA应激反应引发先天性抗病毒反应,本研究以PRV UL12基因为研究对象,对其相关功能做出初步探究。主要内容为:1.pEGFP-N1-UL12重组质粒的构建与PRV UL12蛋白生物信息学分析参考GenBank中PRV UL12基因序列设计特异性引物,以PRV-XJ株为模板,PCR扩增UL12目的基因并成功构建pEGFP-N1-UL12重组质粒;通过生物信息学方法针对PRV UL12氨基酸的序列进行分析预测。2.PRV UL12真核表达及其细胞定位将pEGFP-N1-UL12转染至BHK21细胞中表达,Western blot验证UL12蛋白成功表达,且培养液上清及细胞中均检测到目的蛋白;通过细胞定位检测UL12-GFP融合蛋白,结果显示UL12基因产物同时分布于细胞核与胞浆中。3.PRV UL12基因的相关功能研究相同方法转染表达PRV UL12后,观察UL12-GFP绿色荧光蛋白;流式细胞术检测细胞凋亡情况;以β-actin为内参,相对荧光定量测定细胞caspase-3基因表达水平;绝对荧光定量测定转染表达UL12的BHK21细胞接毒PRV后gB表达水平,绘制一步生长曲线以监测PRV增殖动态。结果显示实验组细胞的荧光形态相较于空载组显着变圆;实验组细胞凋亡率明显升高;caspase-3无显着差异表达;实验组病毒含量较对照组轻微降低。综上所述,本研究首次以PRV-XJ株为模板扩增UL12基因,构建了pEGFP-N1-UL12重组质粒,对PRV UL12基因相关功能做出初步研究,同时亦为HSV UL12基因未来的探索方向提供部分参考依据。
二、单纯疱疹病毒I型糖蛋白D酵母表达载体的构建（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、单纯疱疹病毒I型糖蛋白D酵母表达载体的构建（论文提纲范文）
（1）IFITM2抑制PRV增殖及PRV US3对其产生的拮抗机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| SUMMARY |
| 英文缩略表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 伪狂犬病病毒概述 |
| 1.1 伪狂犬病病毒基因组结构 |
| 1.1.1 衣壳蛋白 |
| 1.1.2 皮层蛋白 |
| 1.1.3 包膜蛋白 |
| 1.2 伪狂犬病病毒的复制周期 |
| 1.3 伪狂犬病的流行情况 |
| 1.4 伪狂犬病病毒检测技术 |
| 1.4.1 病毒分离鉴定 |
| 1.4.2 血清学检测 |
| 1.4.3 分子生物学检测 |
| 1.5 伪狂犬病病毒免疫逃逸相关机制研究 |
| 2 固有免疫 |
| 2.1 TLR信号通路 |
| 2.2 RLR信号通路 |
| 2.3 c GAS-STING信号通路 |
| 3 干扰素诱导的抗病毒蛋白 |
| 3.1 Viperin |
| 3.2 ISG15 |
| 3.3 IFITs |
| 3.4 IFITM蛋白 |
| 4 本研究的目的和意义 |
| 第二章 猪源IFITM2 蛋白抑制PRV增殖作用研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 样品采集及处理 |
| 1.2 细胞和毒株 |
| 1.3 载体与引物 |
| 1.4 试剂与设备 |
| 1.5 PRV的检测 |
| 1.5.1 各样品组织DNA的提取 |
| 1.5.2 PCR扩增 |
| 1.6 Myc-IFITM载体构建及蛋白表达验证 |
| 1.6.1 细胞总RNA的提取 |
| 1.6.2 Myc-IFITM载体的构建 |
| 1.6.3 p CMV-Myc-IFITM质粒转染PK15 细胞 |
| 1.6.4 IFITM蛋白表达验证 |
| 1.7 荧光定量PCR检测PRV基因组DNA拷贝数 |
| 1.8 IFN诱导对内源性IFITM表达的影响 |
| 1.9 PRV感染对IFITM表达的影响 |
| 1.9.1 病毒感染实验 |
| 1.9.2 RT-q PCR检测IFITM m RNA转录 |
| 1.10 过表达IFITM蛋白对PRV吸附和进入的影响 |
| 1.11 细胞基因组DNA提取 |
| 1.12 TCID_(50)测定病毒滴度 |
| 1.13 CCK-8 实验 |
| 1.14 统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 病原检测结果 |
| 2.2 IFITM基因的扩增与Myc-IFITM载体鉴定 |
| 2.3 IFITM蛋白在PK15 细胞内表达验证 |
| 2.4 IFN-α2a诱导下内源IFITM蛋白的表达 |
| 2.5 PRV感染对IFITM基因转录的影响 |
| 2.6 IFITM2 蛋白抑制PRV增殖效果初探 |
| 2.7 IFITM对 PRV吸附和进入的影响 |
| 2.8 IFITM对 IFN-β表达的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三章 猪源IFITM2 蛋白抑制PRV增殖机制研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 细胞和毒株 |
| 1.2 试剂与设备 |
| 1.3 PRV对 IFN-α2a敏感性实验 |
| 1.4 siRNA干扰实验 |
| 1.5 RNAi IFITM2 表达对IFN抗病毒作用的影响 |
| 1.6 RNAi IFITM2 蛋白表达对PRV吸附和进入的影响 |
| 1.7 MβCDX处理PK15 细胞对PRV增殖的影响 |
| 1.8 PF429242 处理PK15 细胞对PRV增殖的影响 |
| 1.9 PF429242 处理对IFITM2 抗病毒作用的影响 |
| 1.10 荧光定量PCR检测PRV基因组DNA拷贝数 |
| 1.11 TCID_(50)测定病毒滴度 |
| 1.12 CCK-8 实验 |
| 1.13 统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 PRV对 IFN-α2a敏感性实验 |
| 2.2 靶向IFITM2 基因的si RNA敲低效果检测 |
| 2.3 RNAi IFITM2 蛋白对IFN-α2a抗病毒作用的调节 |
| 2.4 RNAi IFITM2对PRV吸附和进入的影响 |
| 2.5 MβCDX处理PK15 细胞抑制PRV增殖 |
| 2.6 PF429242 处理对IFITM2 抗病毒作用的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第四章 PRV US3蛋白对I型干扰素信号通路的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 细胞和毒株 |
| 1.2 载体与引物 |
| 1.3 试剂与设备 |
| 1.4 PRV感染对IFN诱导的IFITM2 表达的影响 |
| 1.5 PRV感染对I型 IFN表达的影响 |
| 1.6 PRV编码蛋白对I型 IFN表达的影响 |
| 1.7 US3对c GAS-STING信号通路相关因子m RNA表达的影响 |
| 1.8 US3 对内源性c GAS-STING信号通路相关因子表达的影响 |
| 1.9 PRVUS3 蛋白对c GAS-STING、TBK1和IRF3(5D)激活的IFN-β表达的影响 |
| 1.10 细胞RNA提取及RT-q PCR检测 |
| 1.10.1 细胞总RNA的提取 |
| 1.10.2 RT-q PCR |
| 1.11 CCK-8 实验 |
| 1.12 统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 PRV感染对I型 IFN诱导的IFITM2 表达的影响 |
| 2.2 PRV感染对poly(I:C)激活的I型干扰素表达的影响 |
| 2.3 PRV编码蛋白对poly(I:C)激活的I型干扰素表达的影响 |
| 2.4 US3 蛋白对PK15 细胞活力的影响 |
| 2.5 US3对poly(d A:d T)激活的I型 IFN表达的影响 |
| 2.6 US3 对内源性c GAS-STING信号通路相关因子表达的影响 |
| 2.7 US3 抑制c GAS-STING、TBK1和IRF3(5D)介导的IFN-β表达 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第五章 US3 蛋白拮抗I型干扰素信号通路的机制研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 细胞和毒株 |
| 1.2 载体与引物 |
| 1.3 试剂与设备 |
| 1.4 US3 抑制IRF3 表达的验证 |
| 1.5 细胞核蛋白与胞质蛋白的分离 |
| 1.6 Co-IP |
| 1.7 细胞总蛋白提取及免疫印迹检测 |
| 1.7.1 细胞总蛋白的提取 |
| 1.7.2 Western blot |
| 1.8 细胞RNA提取及RT-q PCR检测 |
| 1.8.1 细胞总RNA的提取 |
| 1.8.2 RT-q PCR |
| 1.9 US3 蛋白对下游ISGs m RNA表达的影响 |
| 1.10 CCK-8 实验 |
| 1.11 统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 US3 与IRF3 之间互作验证 |
| 2.2 蛋白酶体途径参与US3 诱导的IRF3 蛋白水平降低 |
| 2.3 US3 对IRF3 入核的影响 |
| 2.4 US3 对核输入蛋白KPNA3和KPNA4 表达的影响 |
| 2.5 US3 与核输入蛋白KPNA3和KPNA4 之间的互作验证 |
| 2.6 US3 对下游ISGs转录的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 博士期间发表论文情况 |
| 导师简介 |
（2）HSV-1酵母表面展示口服疫苗效果初探（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 0.1 单纯疱疹病毒的简介 |
| 0.2 单纯疱疹病毒结构 |
| 0.3 单纯疱疹病毒1型(HSV-1)的复制周期 |
| 0.3.1 单纯疱疹病毒1型(HSV-1)基因组和命名 |
| 0.3.2 病毒进入 |
| 0.3.3 病毒DNA复制 |
| 0.3.4 病毒颗粒的组装及迁出细胞 |
| 0.4 包膜糖蛋白D(gD) |
| 0.5 HSV-1相关防治策略 |
| 0.6 酵母表面展示技术 |
| 0.7 黏膜免疫 |
| 0.8 实验室前期研究进展 |
| 0.9 研究目的及意义 |
| 第1章 腹腔注射方式病毒感染后疫苗免疫效果的检测 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 实验仪器 |
| 1.1.2 实验试剂 |
| 1.1.3 实验动物 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 菌株活化 |
| 1.2.2 诱导表达外源蛋白 |
| 1.2.3 提取酵母细胞壁蛋白 |
| 1.2.4 Western blot验证蛋白表达情况 |
| 1.2.5 口服免疫小鼠 |
| 1.2.6 腹腔注射方式感染病毒 |
| 1.2.7 记录小鼠体重和生存率变化 |
| 1.2.8 ELISA检测小鼠体液免疫应答及黏膜免疫应答 |
| 1.2.9 数据统计分析 |
| 1.3 实验结果 |
| 1.3.1 细胞壁蛋白验证结果 |
| 1.3.2 腹腔注射组小鼠体重变化 |
| 1.3.3 腹腔注射组小鼠生存率变化 |
| 1.3.4 腹腔注射组小鼠体液免疫应答的结果(IgG) |
| 1.3.5 腹腔注射组小鼠黏膜免疫应答的结果(IgA) |
| 1.4 本章小结 |
| 第2章 角膜划痕方式病毒感染后疫苗免疫效果的检测 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验仪器 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.1.3 实验动物 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 口服疫苗接种 |
| 2.2.2 角膜划痕感染病毒 |
| 2.2.3 小鼠体重和生存率变化 |
| 2.2.4 ELISA检测小鼠体液免疫应答及黏膜免疫应答 |
| 2.2.5 绝对定量PCR |
| 2.2.6 免疫荧光 |
| 2.2.7 实验数据的统计分析 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 角膜划痕组小鼠体重变化 |
| 2.3.2 角膜划痕组小鼠生存率变化 |
| 2.3.3 角膜划痕组小鼠体液免疫应答的结果(IgG) |
| 2.3.4 角膜划痕组小鼠黏膜免疫应答的结果(IgA) |
| 2.3.5 角膜划痕组小鼠ICP27基因拷贝数的统计结果 |
| 2.3.6 角膜划痕组小鼠小肠免疫荧光实验结果 |
| 2.4 本章小结 |
| 第3章 结论和展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的学术论文及参加科研情况 |
（3）HSV-1溶瘤病毒用于肿瘤精准治疗及肿瘤耐受机制的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 绪论 |
| 1 疱疹病毒概述 |
| 1.1 疱疹病毒的分类 |
| 1.2 单纯疱疹病毒 |
| 2 溶瘤病毒研究进展 |
| 2.1 溶瘤病毒的种类 |
| 3 CRISPR/Cas9 系统概述 |
| 3.1 CRISPR/Cas9 系统的分子机制 |
| 3.2 CRISPR/Cas9 系统在HSV-1 病毒基因改造中的应用 |
| 4 研究的目的和意义 |
| 第一章 HSV-1 溶瘤病毒治疗小鼠恶性肿瘤 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 仪器耗材 |
| 1.2.1 主要仪器 |
| 1.2.2 材料 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.3.1 细胞培养 |
| 1.3.2 细胞转染 |
| 1.3.3 HSV-1 病毒的扩增与保存 |
| 1.3.4 HSV-1 对细胞增殖影响的曲线制备 |
| 1.3.5 HSV-1 对细胞存活影响的曲线制备 |
| 1.3.6 利用CRISPR/Cas9 系统构建基因改造溶瘤病毒 |
| 1.3.7 图像分析和数据统计 |
| 1.4 结果 |
| 1.4.1 制备ICP34.5 缺失的HSV-1 溶瘤病毒 |
| 1.4.2 HSV-1-ΔICP34.5 病毒对小鼠黑色素瘤的治疗效果 |
| 1.4.3 多种细胞系对HSV-1-ΔICP34.5 病毒的敏感性分析 |
| 1.4.4 HSV-1-ΔICP34.5 病毒对小鼠结肠癌的治疗效果 |
| 1.4.5 Nectin1 缺失抵抗HSV-1-ΔICP34.5 病毒对小鼠结肠癌的治疗 |
| 1.4.6 HSV-1-NEO2/15 溶瘤病毒制备 |
| 1.4.7 HSV-1-NEO-2/15 溶瘤病毒对小鼠结肠癌的治疗效果 |
| 1.5 讨论 |
| 第二章 利用全基因组CRISPR-Cas9敲除文库进行HSV-1宿主依赖因子的筛选及富集 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 仪器耗材 |
| 2.2.1 主要仪器 |
| 2.2.2 材料 |
| 2.2.4 主要溶液的配制 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 利用CRISPR/Cas9 系统构建基因敲除细胞 |
| 2.3.3 Western Blot验证敲除细胞株 |
| 2.3.4 细胞免疫荧光 |
| 2.3.5 慢病毒包装 |
| 2.3.6 细胞总RNA提取 |
| 2.3.7 cDNA的合成 |
| 2.3.8 cDNA的普通PCR反应 |
| 2.3.9 病毒结合实验 |
| 2.3.10 图像分析和数据统计 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 制备L929 全基因组细胞敲除文库 |
| 2.4.2 利用全基因组敲除库筛选抗HSV-1 的细胞 |
| 2.4.3 筛选后抗病毒细胞对HSV-1 病毒的敏感性分析 |
| 2.4.4 筛选过程中sg RNA以及其靶向基因的动力学变化 |
| 2.4.5 PANTHER GO富集度分析 |
| 2.4.6 富集HSV-1 病毒的宿主依赖因子 |
| 2.4.7 临床肿瘤患者体内HSV-1 病毒HDF的突变频率分析 |
| 2.5 讨论 |
| 第三章 HSV-1 宿主依赖因子候选基因的验证与分析 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 仪器耗材 |
| 3.3 方法 |
| 3.3.1 利用CRISPR/Cas9 系统构建基因敲除细胞 |
| 3.3.2 利用PANTHER网站分析基因功能 |
| 3.3.3 利用KEGG网站分析目的基因通路关系 |
| 3.3.4 图像分析和数据统计 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 Nectin1和ENTPD1 基因缺失对病毒的抵抗 |
| 3.4.2 ENTPD1 基因是一个HSV-1 病毒新的宿主依赖因子 |
| 3.4.3 敲除ENTPD1对HSV-1 感染后病毒增殖的影响 |
| 3.4.4 ENTPD1 缺失抵抗HSV-1 感染不依赖I型干扰素通路 |
| 3.4.5 ENTPD1 缺失阻止HSV-1 病毒进入细胞,但不影响病毒和细胞膜结合 |
| 3.4.6 BGC-823 细胞缺失ENTPD1 基因抵抗HSV-1 感染 |
| 3.4.7 其他HSV-1 病毒HDF候选基因验证与分析 |
| 3.4.8 硫酸乙酰肝素合成途径对HSV-1 进入细胞至关重要 |
| 3.4.9 KEGG通路分析 |
| 3.4.10 确定硫酸乙酰肝素合成途径候选基因 |
| 3.5 讨论 |
| 第四章 结论 |
| 附录 Ⅰ |
| 附录 Ⅱ |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间承担的科研任务与主要成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（4）IFIT1负反馈上调Ⅰ型干扰素抗HSV-1病毒或PRV病毒感染（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 绪论 |
| 第一节 Ⅰ型单纯疱疹病毒 |
| 1.1 单纯疱疹病毒简介 |
| 1.2 HSV-1 感染及复制机制 |
| 1.3 HSV-1 病毒的危害 |
| 第二节 猪疱疹病毒1 型 |
| 2.1 PRV病毒基本特征 |
| 2.2 PRV病毒结构 |
| 2.3 PRV病毒感染引起免疫反应 |
| 第三节 干扰素与干扰素刺激基因(ISG)的抗病毒作用 |
| 3.1 干扰素与干扰素信号通路 |
| 3.2 cGAS-STING通路 |
| 3.3 IFIT家族 |
| 第一章 L929 IFIT1 基因敲除细胞株的构建 |
| 第一节 实验材料 |
| 1.1.1 细胞系 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.1.3 实验仪器 |
| 1.1.4 主要溶液的配制 |
| 1.1.5 引物的设计与合成 |
| 1.1.6 主要质粒及图谱 |
| 第二节 实验方法 |
| 1.2.1 CRISPR/Cas9 敲除IFIT1 载体构建 |
| 1.2.2 L929 敲除细胞系构建 |
| 1.2.3 敲除细胞基因组水平验证 |
| 1.2.4 敲除细胞蛋白水平验证 |
| 第三节 实验结果与分析 |
| 1.3.1 IFIT1 基因敲除载体构建 |
| 1.3.2 流式分选GFP结果 |
| 1.3.3 IFIT1 敲除细胞鉴定 |
| 第二章 IFIT1 负反馈上调IFN-β及ISGs的表达 |
| 第一节 实验材料 |
| 2.1.1 主要试剂及设备 |
| 2.1.2 细胞 |
| 2.1.3 主要引物 |
| 第二节 实验方法 |
| 2.2.1 HT-DNA和 poly(I:C)刺激细胞 |
| 2.2.2 细胞RNA的提取 |
| 2.2.3 RNA逆转录至cDNA |
| 2.2.4 RT-qPCR检测基因的相对表达量 |
| 2.2.5 酶联吸附测定(ELISA) |
| 2.2.6 免疫印迹法检测IFIT1 敲除对c GAS-STING通路蛋白的影响 |
| 第三节 实验结果 |
| 2.3.1 cGAS-STING通路的激活提高部分ISGs的表达 |
| 2.3.2 cGAS或 STING敲除完全抑制IFIT1 的表达 |
| 2.3.3 IFIT1 的敲除显着提高细胞IFN-β及其他ISGs的 mRNA水平 |
| 2.3.4 IFIT1 的敲除显着提高HT-DNA刺激细胞的IFN-β蛋白表达 |
| 2.3.5 IFIT1 的缺失不影响高浓度的 poly(I:C)刺激细胞的 IFN-β及ISGs表达 |
| 第三章 IFIT1 负反馈上调Ⅰ型干扰素抗HSV-1 病毒感染 |
| 第一节 实验材料 |
| 3.1.1 主要试剂及设备 |
| 3.1.2 毒株 |
| 3.1.3 细胞 |
| 3.1.4 引物 |
| 第二节 实验方法 |
| 3.2.1 实时定量PCR测定HSV-1-VP26-mCherry病毒的拷贝数 |
| 3.2.2 HSV-1 病毒的扩增 |
| 3.2.3 IFIT1 敲除细胞抵抗病毒感染 |
| 3.2.4 细胞挽救及HSV-1 感染 |
| 第三节 实验结果与分析 |
| 3.3.1 HSV1-VP26-mCherry病毒浓度测定 |
| 3.3.2 IFIT1 基因缺失抑制HSV1-VP26-mCherry病毒的增殖 |
| 3.3.3 IFIT1 基因缺失提高HSV1-VP26-mCherry病毒感染的细胞活率 |
| 3.3.4 IFIT1 基因缺失抑制HSV1-VP26-mCherry病毒的拷贝数 |
| 3.3.5 IFIT1 基因缺失显着提高HSV1-VP26-mCherry病毒感染细胞的干扰素及下游ISGs的 mRNA水平 |
| 3.3.6 在L929 Ifit1~(-/-)细胞株过表达IFIT1 蛋白显着抑制干扰素及ISGs的表达,促进HSV1-VP26-mCherry病毒的增殖,降低细胞活率 |
| 第四章 IFIT1 负反馈上调I型干扰素抗PRV病毒感染 |
| 第一节 实验材料 |
| 4.1.1 主要试剂及设备 |
| 4.1.2 毒株 |
| 4.1.3 细胞 |
| 4.1.4 引物 |
| 第二节 实验方法 |
| 4.2.1 病毒滴度的测定 |
| 第三节 实验结果 |
| 4.3.1 IFIT1 基因缺失可提高PRV病毒感染的细胞活率 |
| 4.3.2 IFIT1 基因缺失显着提高PRV病毒感染细胞的干扰素及下游ISGs的mRNA水平 |
| 4.3.3 在L929 Ifit1~(-/-)细胞株过表达IFIT1 蛋白显着抑制干扰素及ISGs的表达,降低PRV病毒感染的细胞活率 |
| 第五章 实验结果与讨论 |
| 第一节 基因敲除IFIT1 抗病毒效果研究 |
| 第二节 基因敲除IFIT1 抗病毒效果研究 |
| 第三节 总结 |
| 附录1 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间承担的科研任务与主要成果 |
| 致谢 |
| 索引 |
| 个人简历 |
（5）Bm65蛋白功能序列的鉴定及其对病毒增殖的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 杆状病毒分子生物学研究进展 |
| 1.1.1 杆状病毒概述 |
| 1.1.2 杆状病毒特征及生活史 |
| 1.1.3 杆状病毒的分类 |
| 1.2 杆状病毒的应用 |
| 1.2.1 一种高效的真核表达载体 |
| 1.2.2 可用作生物杀虫剂 |
| 1.2.3 杆状病毒在表面展示系统中的应用 |
| 1.2.4 杆状病毒在基因治疗载体中的应用 |
| 1.3 家蚕杆状病毒Bm65功能研究进展 |
| 1.4 蛋白核质运输的分子机制 |
| 1.4.1 核定位信号(NLS)介导靶蛋白入核转运 |
| 1.4.2 核输出信号(NES)介导靶蛋白出核转运 |
| 1.5 蛋白质聚集体及其影响 |
| 1.5.1 蛋白质聚集体及其产生的原因 |
| 1.5.2 蛋白质聚集体对生物体的影响 |
| 1.6 研究目的与意义 |
| 1.7 主要研究内容与技术路线 |
| 1.7.1 研究内容 |
| 1.7.2 技术路线 |
| 第二章 家蚕杆状病毒Bm65蛋白序列分析 |
| 2.1 分析软件及方法 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 Bm65基因序列分析 |
| 2.2.2 Bm65与杆状病毒同源序列比对 |
| 2.2.3 Bm65序列中信号序列预测分析 |
| 2.2.4 Bm65蛋白二级及三级结构的预测分析 |
| 2.3 讨论与总结 |
| 第三章 Bm65蛋白核定位信号及核输出信号的鉴定 |
| 3.1 材料和试剂 |
| 3.1.1 细胞、病毒、质粒和菌株 |
| 3.1.2 实验试剂 |
| 3.1.3 试剂配制 |
| 3.1.4 仪器设备 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 构建融合EGFP的 Bm65截短突变体瞬时表达载体 |
| 3.2.2 转染 |
| 3.2.3 激光共聚焦显微镜观察 |
| 3.2.4 Bm65氨基酸序列突变重组质粒构建 |
| 3.2.5 Bm65序列中76KRKCSK突变重组病毒的制备 |
| 3.2.6 免疫组化实验 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 Bm65截短突变体融合EGFP瞬时表达载体构建 |
| 3.3.2 截短突变影响Bm65蛋白在BmN细胞中的分布 |
| 3.3.3 ~(33)RRIK和~(76)KRKCSK突变对Bm65蛋白在BmN细胞中分布的影响 |
| 3.3.4 ~(76)KRKCSK序列突变抑制Bm65蛋白的入核 |
| 3.3.5 ~(76)KRKCSK序列突变重组病毒的免疫荧光观察 |
| 3.3.6 Bm65蛋白通过细胞自噬途径进行降解 |
| 3.3.7 Bm65蛋白核输出信号的初步鉴定 |
| 3.3.8 ~(92)PLLL和~(98)FLLA序列突变对Bm65蛋白定位的影响 |
| 3.4 讨论与总结 |
| 第四章 Bm65四聚体的形成及其分子机制探究 |
| 4.1 材料和试剂 |
| 4.1.1 细胞、病毒、质粒和菌株 |
| 4.1.2 实验试剂 |
| 4.1.3 试剂配制 |
| 4.1.4 仪器设备 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 构建融合有Flag标签的Bm65瞬时表达载体 |
| 4.2.2 重组病毒的获取 |
| 4.2.3 蛋白表达分析 |
| 4.2.4 氨基酸突变 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 重组蛋白Bm65-Flag的表达分析 |
| 4.3.2 半胱氨酸突变对Bm65四聚体形成的影响 |
| 4.3.3 Bm65入核受阻对其四聚体形成的影响 |
| 4.3.4 融合EGFP对 Bm65蛋白四聚体的影响 |
| 4.4 讨论与总结 |
| 第五章 Bm65蛋白入核受阻对病毒增殖的影响 |
| 5.1 材料和试剂 |
| 5.1.1 细胞、病毒、质粒和菌株 |
| 5.1.2 实验试剂 |
| 5.1.3 实验仪器 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 病毒滴度测定 |
| 5.2.2 统计分析 |
| 5.2.3 家蚕306 的添毒与检测 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 Bm65蛋白入核受阻抑制病毒的增殖 |
| 5.3.2 Bm65蛋白入核受阻影响感染性病毒粒子的产生 |
| 5.3.3 重组病毒vBm~(Bm65(M2)-Flag-GFP)和 Bm~(WT-GFP)感染家蚕分析 |
| 5.5 讨论与总结 |
| 第六章 结论与展望 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在学期间发表的学术论文及其他科研成果 |
（6）HSV-2突变株的构建及其生物学特性分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| HSV-2概述 |
| HSV-2的基因组及其病毒生活史 |
| HSV感染引起的免疫反应以及免疫逃逸 |
| “神经毒力因子”ICP34.5 |
| ICP34.5介导宿主关闭蛋白合成的逆转 |
| ICP34.5可抑制Ⅰ型干扰素的产生 |
| ICP34.5抑制细胞自噬 |
| 潜伏相关转录因子—一LAT |
| HSV感染细胞引起应激颗粒形成 |
| HSV感染的动物模型 |
| HSV感染动物引起类似恶病质的临床症状 |
| 实验思路 |
| 第一部分 HSV-2突变株RL1-HSV-2的构建及其引起的类恶病质临床症状和相关的转录调控功能分析 |
| 1. 材料和方法 |
| 1.1. 材料 |
| 1.1.1 病毒 |
| 1.1.2 细胞 |
| 1.1.3 实验动物 |
| 1.1.4 质粒与载体 |
| 1.1.5 抗体 |
| 1.1.6 溶液和商品化试剂 |
| 1.1.7 主要设备仪器 |
| 1.1.8 主要耗材 |
| 1.1.9 引物 |
| 1.1.10 主要溶液及配置 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 细胞培养 |
| 1.2.1.1 细胞复苏 |
| 1.2.1.2 细胞传代 |
| 1.2.1.3 细胞计数 |
| 1.2.1.4 细胞冻存 |
| 1.2.2 病毒培养 |
| 1.2.2.1 病毒扩增及收获 |
| 1.2.2.2 病毒滴度测定 |
| 1.2.3 质粒构建 |
| 1.2.3.1 PX330质粒构建 |
| 1.2.3.2 pEGFP-RL1质粒的构建 |
| 1.2.3.3 pcDNA3.1(+)-RL1-/pcDNA3.1(+)-RL1质粒的构建 |
| 1.2.3.4 pGL-ICP0, pGL-ICP4, pGL-ICP22, pGL-US11质粒的构建 |
| 1.2.3.5 pGEM(?)-T-US4质粒的构建 |
| 1.2.3.6 感受态大肠杆菌转化 |
| 1.2.3.7 筛选目的单菌落 |
| 1.2.3.8 无内毒素质粒小量提取 |
| 1.2.3.9 质粒转染 |
| 1.2.4 HSV-2突变株RL1-HSV-2的构建和纯化 |
| 1.2.4.1 病毒感染 |
| 1.2.4.2 病毒收获 |
| 1.2.4.3 病毒基因组提取 |
| 1.2.4.4 病毒基因组PCR鉴定 |
| 1.2.4.5 分离病毒克隆 |
| 1.2.5 RL1-HSV-2补偿病毒的构建 |
| 1.2.5.1 质粒转染 |
| 1.2.5.2 病毒感染 |
| 1.2.5.3 补偿病毒中RL1分子表达量的检测 |
| 1.2.6 突变株RL1-HSV-2在细胞水平的生物学特性分析 |
| 1.2.6.1 病毒增殖动力学检测 |
| 1.2.6.2 Vero、VK2细胞蚀斑形态分析 |
| 1.2.6.3 VK2细胞中细胞因子、应激反应因子以及RL1相关病毒基因转录水平检测 |
| 1.2.6.4 突变株RL1-HSV-2细胞凋亡检测 |
| 1.2.7 突变株RL1-HSV-2以及野毒株HSV-2编码的RL1蛋白对基因ICP0,ICP4,ICP22,US11启动子的调控作用分析 |
| 1.2.8 突变株RL1-HSV-2在动物水平的生物学特性分析 |
| 1.2.8.1 突变毒株RL1-HSV-2的急性感染能力分析 |
| 1.2.9 统计方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 HSV-2突变株RL1-HSV-2的构建和纯化 |
| 2.2 RL1-HSV-2突变株的生物学特性 |
| 2.2.1 RL1-HSV-2在细胞中的增殖动力学分析 |
| 2.2.2 RL1-HSV-2在VK2细胞和Vero细胞中的蚀斑形态分析 |
| 2.3 RL1-HSV-2补偿病毒的构建及其RL1分子表达量的分析 |
| 2.4 RL1-HSV-2感染动物后的临床病理特征 |
| 2.4.1 RL1-HSV-2感染动物后的临床表现 |
| 2.4.2 RL1-HSV-2感染小鼠后的组织病理分析 |
| 2.4.3 RL1-HSV-2感染小鼠后阴道周围肌肉组织的电镜分析以及神经组织和主要器官的组织化学分析 |
| 2.5 RL1-HSV-2引起的类似恶病质反应 |
| 2.5.1 RL1-HSV-2可引起类似恶病质的临床症状 |
| 2.5.2 RL1-HSV-2引起的类似恶病质的炎性因子及血生化水平分析 |
| 2.6 RL1-HSV-2感染细胞后的应激反应 |
| 2.7 RL1- HSV-2感染小鼠后急性感染期器官组织的病毒载量分析 |
| 2.8 ICP34.5参与病毒基因的转录 |
| 3 讨论 |
| 第二部分 HSV-2突变株LAT-HSV-2和RL1-LAT-HSV-2的构建及其生物学特性分析 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 本部分所用病毒、细胞、实验动物、质粒与载体、细胞培养、细胞培养用溶液、商品化试剂与溶液、主要溶液、耗材和设备同第一部分,与第一部分不同的内容如下 |
| 1.1.2 病毒 |
| 1.1.3 抗体 |
| 1.1.4 试剂盒 |
| 1.1.5 引物及肽段 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 本部分所用细胞培养、病毒培养、质粒构建、质粒转化及转染、突变株的构建、突变株在细胞水平的生物学特性分析均同第一部分,与第一部分不同的内容如下 |
| 1.2.2 病毒突变株LAT基因组PCR鉴定 |
| 1.2.3 突变株RL1-LAT-HSV-2以及LAT-HSV-2在动物水平的生物学特性分析 |
| 1.2.3.1 突变株感染小鼠后的急性感染能力分析 |
| 1.2.3.2 突变株感染小鼠后的潜伏感染能力分析 |
| 1.2.4 小鼠脾脏淋巴细胞的分离 |
| 1.2.5 CD3+T细胞检测 |
| 1.2.6 IFN-γ Elispot检测 |
| 1.2.7 骶背根神经节离体重激活分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 HSV-2突变株LAT-HSV-2以及RL1-LAT-HSV-2的构建 |
| 2.2 突变株LAT-HSV-2以及RL1-LAT-HSV-2在细胞水平的生物学特性 |
| 2.2.1 突变株LAT-HSV-2以及RL1-LAT-HSV-2在细胞的增殖动力学 |
| 2.2.2 突变株LAT-HSV-2以及RL1-LAT-HSV-2在Vero细胞的蚀斑形态分析 |
| 2.3 突变株LAT-HSV-2以及RL1-LAT-HSV-2在动物水平的急性感染生物学特性 |
| 2.3.1 突变株LAT-HSV-2以及RL1-LAT-HSV-2在小鼠模型上的急性感染的临床表现特征 |
| 2.3.2 突变株LAT-HSV-2以及RL1-LAT-HSV-2在小鼠模型上的急性感染的组织病理分析 |
| 2.3.3 突变株LAT-HSV-2以及RL1-LAT-HSV-2在小鼠模型上感染部位的炎性因子水平变化 |
| 2.3.4 突变株LAT-HSV-2以及RL1-LAT-HSV-2在小鼠模型上急性感染的组织载量分析 |
| 2.4 突变株LAT-HSV-2以及RL1-LAT-HSV-2在动物水平的潜伏感染能力分析 |
| 2.4.1 突变株LAT-HSV-2以及RL1-LAT-HSV-2在动物水平的潜伏感染期的组织载量分析 |
| 2.4.2 突变株LAT-HSV-2以及RL1-LAT-HSV-2在动物水平的潜伏感染期的组织病理结果分析 |
| 2.4.3 突变株LAT-HSV-2以及RL1-LAT-HSV-2在动物水平的潜伏感染期的骶背根神经节重激活能力分析 |
| 2.5 突变株LAT-HSV-2以及RL1-LAT-HSV-2在动物水平的特异性免疫反应 |
| 2.5.1 突变株LAT-HSV-2以及RL1-LAT-HSV-2感染小鼠后脾脏淋巴细胞中CD3+T淋巴细胞数量的变化 |
| 2.5.2 突变株LAT-HSV-2以及RL1-LAT-HSV-2感染小鼠后脾脏淋巴细胞中IFN-γ特异性T淋巴细胞数量的变化 |
| 3 讨论 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 论文综述 单纯疱疹病毒2型疫苗的研究进展 |
| 参考文献 |
| 附录 论文中突变毒株的突变基因序列 |
| 缩略词表 |
| 致谢 |
| 研究生个人简历 |
（7）基于酵母的疱疹病毒疫苗的设计和制备（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 引言 |
| 0.1 阿尔茨海默病 |
| 0.2 单纯疱疹病毒与AD |
| 0.3 病毒疫苗 |
| 0.4 粘膜免疫 |
| 0.5 酵母表面展示技术 |
| 0.6 研究目的及意义 |
| 第一章 构建毕赤酵母表面展示重组菌株 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 质粒、引物及菌株 |
| 1.1.2 化学药品、试剂及仪器 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 试剂的配置 |
| 1.2.2 构建过表达PDI的毕赤酵母重组菌株 |
| 1.2.3 构建HSV-1酵母表面展示菌株 |
| 1.3 实验结果 |
| 1.3.1 构建过表达PDI的重组菌株的酵母直接PCR结果 |
| 1.3.2 构建过表达PDI的重组菌株的酵母基因组PCR结果 |
| 1.3.3 构建表面展示重组菌株的酵母直接PCR结果 |
| 1.3.4 构建表面展示重组菌株的酵母基因组PCR结果 |
| 1.3.5 空白对照菌株的酵母直接PCR结果 |
| 1.4 本章小结 |
| 第二章 诱导并验证酵母表面展示菌株中的蛋白 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验相关试剂 |
| 2.1.2 实验相关仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 实验试剂的配置 |
| 2.2.2 诱导外源蛋白表达 |
| 2.2.3 荧光显微镜观察蛋白表达情况 |
| 2.2.4 提取酵母细胞壁蛋白 |
| 2.2.5 western blot验证蛋白表达情况 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 荧光显微镜观察蛋白表达结果 |
| 2.3.2 western blot验证蛋白表达情况 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 动物实验并评估小鼠免疫应答反应 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验动物 |
| 3.1.2 实验试剂 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 口服免疫小鼠 |
| 3.2.2 ELISA检测体液免疫应答及粘膜免疫应答 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 体液免疫应答结果 |
| 3.3.2 粘膜免疫应答结果 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 结论与展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的学术论文及参加科研情况 |
（8）牛病毒性腹泻和牛传染性鼻气管炎二联核酸疫苗的构建及其免疫效应研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 牛病毒性腹泻(BVD)研究进展 |
| 1.1.1 BVD的病原学 |
| 1.1.2 BVD的流行病学 |
| 1.1.3 BVD疫苗研究进展 |
| 1.2 牛病毒性腹泻病毒(BVDV)研究进展 |
| 1.2.1 BVDV基因组结构 |
| 1.2.2 BVDV编码的结构蛋白及功能 |
| 1.3 牛传染性鼻气管炎(IBR)研究进展 |
| 1.3.1 IBR的病原学 |
| 1.3.2 IBR的流行病学 |
| 1.3.3 IBR疫苗研究进展 |
| 1.4 牛疱疹病毒1型(BHV-1)研究进展 |
| 1.4.1 BHV-1的基因组结构 |
| 1.4.2 BHV-1编码的结构蛋白及其功能 |
| 1.5 内部核糖体进入位点(IRES)研究进展 |
| 1.5.1 IRES简介 |
| 1.5.2 IRES结构特点及其在载体表达中的应用 |
| 1.6 试验目的及意义 |
| 第二章 BVDV E0和IBRV gD基因的克隆与生物信息学分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 毒株、菌株与细胞 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 BVDV E0与IBRV gD基因的克隆 |
| 2.1.5 BVDV E0与IBRV gD基因生物信息学分析 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 目的片段PCR扩增结果 |
| 2.2.2 目的基因测序结果 |
| 2.2.3 生物信息学分析 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 BVDV E0基因的选择 |
| 2.3.2 IBRV gD基因的选择与扩增 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 pVAX1-E0-IRES-gD真核表达载体的构建与体外表达检测 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 菌株、质粒和细胞 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.1.4 重组表达载体的设计 |
| 3.1.5 重组载体pVAX1-IRES的构建 |
| 3.1.6 重组载体pVAX1-EO-IRES的构建 |
| 3.1.7 重组载体pVAX1-E0-IRES-gD的构建 |
| 3.1.8 pVAX1-E0-IRES-gD载体中目的基因体外表达的检测 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 pVAX1-IRES真核表达载体的构建 |
| 3.2.2 pVAX1-E0-IRES真核表达载体的构建 |
| 3.2.3 pVAX1-E0-IRES-gD真核表达载体的构建 |
| 3.2.4 真核表达载体pVAX1-E0-IRES-gD在293T细胞中的表达情况 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 重组质粒的构建 |
| 3.3.2 目的蛋白的表达 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 pVAX1-E0-IRES-gD二联核酸疫苗免疫效果研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 质粒和二联灭活苗 |
| 4.1.2 实验动物 |
| 4.1.3 主要试剂 |
| 4.1.4 主要仪器 |
| 4.1.5 大量抽提质粒DNA |
| 4.1.6 小鼠的分组与免疫 |
| 4.1.7 样品采集 |
| 4.1.8 免疫小鼠血清中E0抗体检测 |
| 4.1.9 免疫小鼠血清中gD抗体检测 |
| 4.1.10 细胞因子检测 |
| 4.1.11 脾淋巴细胞增殖实验(MTT法) |
| 4.1.12 数据处理 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 免疫小鼠血清中E0抗体检测结果 |
| 4.2.2 免疫小鼠血清中gD抗体检测结果 |
| 4.2.3 免疫小鼠血清中IFN-γ检测结果 |
| 4.2.4 免疫小鼠血清中IL-4检测结果 |
| 4.2.5 免疫小鼠脾淋巴细胞增殖情况 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 小鼠免疫试验后抗E0和gD IgG抗体含量变化 |
| 4.3.2 小鼠免疫试验后细胞因子含量变化 |
| 4.3.3 脾淋巴细胞反应 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（9）HSV-1囊膜蛋白gL逃逸宿主天然免疫反应及介导宿主损伤的机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 绪论 |
| 1 HSV-1病毒的概述 |
| 1.1 病毒的病原学特点 |
| 1.2 病毒基因组特点 |
| 1.3 流行病学特点及致病性 |
| 1.4 病毒的入侵机制 |
| 1.5 HSV-1病毒的在体内复制及致病机制 |
| 1.6 HSV-1病毒的危害性 |
| 2 宿主的固有免疫 |
| 2.1 宿主的固有免疫概述 |
| 2.2 NF-κB信号通路 |
| 3 HSV-1逃逸宿主抵抗的机制 |
| 4 病毒囊膜蛋白gL的功能 |
| 4.1 病毒囊膜蛋白 |
| 4.2 gL囊膜蛋白 |
| 5 病毒对宿主的损伤 |
| 第一章 HSV-1的gL囊膜蛋白逃逸宿主天然免疫反应机制 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 细胞、病毒与质粒 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.1.3 主要仪器与设备 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 UL1-UL8等多个基因编码蛋白的过表达载体构建 |
| 1.2.2 质粒的提取转染及poly(I:C)、HT DNA刺激 |
| 1.2.3 实时定量PCR检测IFN-β和ISG |
| 1.2.4 抗病毒DNA/RNA信号通路接头蛋白及转录因子的实时定量PCR |
| 1.2.5 CRISPR-Cas9 基因修饰HSV-1的gL囊膜蛋白系统构建 |
| 1.2.6 HSV-1病毒的增殖及gL囊膜蛋白修饰毒株的筛选及验证 |
| 1.2.7 HSV-1 gL囊膜蛋白的基因RNA干扰系统的构建 |
| 1.2.8 HSV-1 gL囊膜蛋白的基因RNA干扰系统的验证 |
| 1.2.9 CRISPR-Cas9 敲除INKIT与 p65 系统构建 |
| 1.2.10 Western Blot试验 |
| 1.2.11 免疫荧光 |
| 1.2.12 免疫共沉淀试验 |
| 1.2.13 统计分析方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.3.1 HSV-1的UL1-UL8 对免疫信号通路分子IFN-β和 ISG调控 |
| 1.3.2 HSV-1的gL对 IFN-β效应蛋白ISG15\MX1/MX2 的转录调控 |
| 1.3.3 过表达gL囊膜蛋白对抗病毒DNA/RNA信号通路分子调控 |
| 1.3.4 gL囊膜蛋白信号肽氨基酸缺失毒株对抗病毒 DNA/RNA信号通路接头蛋白和转录因子的调控 |
| 1.3.5 gL囊膜蛋白对NF-κB和 INKIT的 p65,p50 信号通路分子调控 |
| 1.3.6 gL囊膜蛋白对NF-κB和 INKIT抗病毒信号通路中p65 入核调控 |
| 1.3.7 gL分段表达对抗病毒信号通路中各接头蛋白和转录因子的调控 |
| 1.3.8 p65和gL囊膜蛋白共表达对p65敲除细胞抗病毒信号通路中转录因子IFN-β的转录调控 |
| 1.3.9 运用siRNA抑制gL蛋白的表达进一步验证gL和p65互作关系 |
| 1.3.10 运用共聚焦显微镜验证gL蛋白和p65的共定位 |
| 1.3.11 分段过表达gL蛋白与p65前后序列(RHD和TAD)的免疫共沉淀 |
| 1.3.12 运用共聚焦显微镜研究gL蛋白和p65的RHD部分的共定位 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第二章 HSV-1gL囊膜蛋白逃逸宿主抵抗的其它途径 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 细胞、病毒与质粒 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器与设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞培养及细胞周期及凋亡的测定 |
| 2.2.2 细胞凋亡通路实时定量 |
| 2.2.3 细胞ROS的测定方法 |
| 2.2.4 统计分析方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 HSV-1的gL囊膜蛋白对细胞周期的调控 |
| 2.3.2 HSV-1的gL囊膜蛋白对细胞凋亡的调控 |
| 2.3.3 HSV-1的gL囊膜蛋白对细胞内ROS的调控 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 HSV-1的gL囊膜蛋白介导病毒对宿主损伤 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 细胞、病毒与质粒 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器与设备 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 细胞炎症因子的实时定量PCR方法 |
| 3.2.2 小鼠攻毒实验 |
| 3.2.3 小鼠攻毒后组织器官的细胞凋亡实验 |
| 3.2.4 小鼠攻毒后各组织器官实时定量及HE染色验证 |
| 3.2.5 统计分析方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 HSV-1的gL囊膜蛋白对宿主组织器官细胞凋亡的调控 |
| 3.3.2 gL囊膜蛋白调控HSV-1病毒在宿主体内分布 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 结论 |
| 附录1 |
| 附录2 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间承担的科研任务与主要成果 |
| 致谢 |
| 索引 |
| 个人简历 |
（10）伪狂犬病毒UL12基因的克隆、表达及其相关功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词对照表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 伪狂犬病毒研究进展 |
| 1.1 病原学 |
| 1.2 病毒分子生物学特征 |
| 1.3 病毒复制过程 |
| 1.3.1 病毒穿入 |
| 1.3.2 核内反应 |
| 1.3.3 病毒释放 |
| 1.4 潜伏与神经侵染 |
| 1.5 病毒凋亡基因抑制 |
| 1.6 UL12 基因研究进展 |
| 2 细胞凋亡 |
| 2.1 形态和生化特征 |
| 2.2 细胞凋亡信号通路 |
| 2.2.1 外源性细胞凋亡途径 |
| 2.2.2 内源性细胞凋亡途径 |
| 2.2.3 其他凋亡途径 |
| 3 研究目的及意义 |
| 第二章 PRV UL12 基因的克隆及生物信息学分析 |
| 1.实验材料 |
| 1.1 病毒、菌株与细胞 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 伪狂犬病毒UL12 基因的扩增 |
| 2.1.1 特异性引物设计 |
| 2.1.2 PRV增殖 |
| 2.1.3 PRV DNA抽提 |
| 2.1.4 PCR扩增 |
| 2.1.5 目的片段纯化回收 |
| 2.2 构建PEGFP-N1-UL12 重组质粒 |
| 2.2.1 目的片段与pEGFP-N1 真核表达载体双酶切 |
| 2.2.2 双酶切目的片段回收 |
| 2.2.3 目的片段连接至pEGFP-N1 真核表达载体 |
| 2.2.4 制备DH5α大肠杆菌感受态细胞 |
| 2.2.5 连接产物转化大肠杆菌DH5α |
| 2.2.6 重组质粒鉴定 |
| 2.3 PRV UL12 生物信息学分析 |
| 2.3.1 PRV UL12 蛋白理化性质分析 |
| 2.3.2 PRV UL12 蛋白跨膜区域结构预测 |
| 2.3.3 PRV UL12 蛋白信号肽分析 |
| 2.3.4 PRV UL12 蛋白相关位点预测 |
| 2.3.5 PRV UL12 蛋白二级结构预测 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 PRV UL12 基因扩增 |
| 3.2 PEGFP-N1-UL12 重组质粒的构建及鉴定 |
| 3.3 PRV UL12 蛋白生物信息分析 |
| 3.3.1 PRV UL12 蛋白理化性质分析 |
| 3.3.2 PRV UL12 蛋白跨膜区域结构预测 |
| 3.3.3 PRV UL12 蛋白信号肽分析 |
| 3.3.4 PRV UL12 蛋白磷酸化位点预测 |
| 3.3.5 PRV UL12 蛋白N端糖基化位点预测 |
| 3.3.6 PRV UL12 蛋白O-糖基化位点预测 |
| 3.3.7 PRV UL12 蛋白二级结构预测 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第三章 PRV UL12 基因的真核表达及细胞定位 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 主要试剂 |
| 1.2 细胞 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 主要溶液配置 |
| 2 方法 |
| 2.1 PEGFP-N1-UL12 去内毒素质粒抽提 |
| 2.2 PEGFP-N1-UL12 重组质粒转染BHK21 细胞 |
| 2.3 样品制备 |
| 2.4 WESTERN BLOT检测 |
| 2.5 UL12-GFP融合蛋白细胞定位 |
| 3 结果 |
| 3.1 GFP绿色荧光蛋白表达 |
| 3.2 WESTERN BLOT检测结果 |
| 3.3 PRV UL12在BHK21 细胞中的定位 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第四章 PRV UL12 基因在BHK21 细胞凋亡中的作用及其对PRV增殖的影响 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 主要试剂 |
| 1.2 病毒 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 绿色荧光蛋白表达差异分析 |
| 2.2 流式细胞术检测BHK21 细胞凋亡率 |
| 2.3 QPCR测定CASPASE-3 凋亡因子表达情况 |
| 2.3.1 引物设计 |
| 2.3.2 细胞样品总RNA抽提 |
| 2.3.3 RT-PCR反应 |
| 2.3.4 qPCR测定caspase-3 凋亡因子 |
| 2.4 体外表达PRV UL12对PRV增殖的影响 |
| 3 结果 |
| 3.1 GFP绿色荧光蛋白表达 |
| 3.2 流式细胞术检测结果 |
| 3.3 CASPASE-3 凋亡因子表达情况 |
| 3.4 体外表达PRV UL12对PRV增殖的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
四、单纯疱疹病毒I型糖蛋白D酵母表达载体的构建（论文参考文献）
- [1]IFITM2抑制PRV增殖及PRV US3对其产生的拮抗机制研究[D]. 谢晶莹. 甘肃农业大学, 2021
- [2]HSV-1酵母表面展示口服疫苗效果初探[D]. 王瑞. 辽宁大学, 2021(12)
- [3]HSV-1溶瘤病毒用于肿瘤精准治疗及肿瘤耐受机制的研究[D]. 沈阳坤. 福建师范大学, 2020(12)
- [4]IFIT1负反馈上调Ⅰ型干扰素抗HSV-1病毒或PRV病毒感染[D]. 胡好. 福建师范大学, 2020(12)
- [5]Bm65蛋白功能序列的鉴定及其对病毒增殖的影响[D]. 祁馨宇. 江苏大学, 2020(02)
- [6]HSV-2突变株的构建及其生物学特性分析[D]. 柳蕾. 北京协和医学院, 2020(05)
- [7]基于酵母的疱疹病毒疫苗的设计和制备[D]. 张霞. 辽宁大学, 2020(01)
- [8]牛病毒性腹泻和牛传染性鼻气管炎二联核酸疫苗的构建及其免疫效应研究[D]. 马小静. 宁夏大学, 2020
- [9]HSV-1囊膜蛋白gL逃逸宿主天然免疫反应及介导宿主损伤的机制[D]. 李兆龙. 福建师范大学, 2019(04)
- [10]伪狂犬病毒UL12基因的克隆、表达及其相关功能研究[D]. 徐逸飞. 四川农业大学, 2019(01)