一、甲型肝炎病毒克隆抗体细胞株的建立及应用（论文文献综述）
刘燕,汤承,岳华,王远微[1]（2021）在《交叉中和血清1型和血清3型鸭甲肝病毒单克隆抗体的制备与鉴定》文中指出鸭甲型肝炎（duck hepatitis A, DHA）是危害养鸭业的主要疾病之一,是一种雏鸭的急性、高度致死性传染病。本研究旨在研制一种对我国流行的鸭甲型肝炎血清1型（DHAV-1）和血清3型（DHAV-3）病毒具有交叉中和作用的单克隆抗体（monoclonal antibody, McAb）。人工合成12条DHAV-1和DHAV-3的VP1蛋白共有的抗原表位肽,分别与钥孔血蓝蛋白（keyhole limpet hemocyanin, KLH）载体偶联作为免疫抗原,免疫BALB/c小鼠制备McAb。通过检测McAb与DHAV-1和DHAV-3的交叉反应性,测定McAb对病毒增殖的抑制效率、中和效价以及攻毒保护率等来筛选McAb。本研究共获得了12株稳定分泌McAb的杂交瘤细胞株,其中6株（C1、C4、C7、C12、C13、C16）分泌的McAb同时与DHAV-1和DHAV-3发生特异性交叉反应;C1、C4、C7、C16可以抑制DHAV-1和DHAV-3在鸭胚中的增殖,抑制率在75.34%～100.00%不等;对DHAV-1和DHAV-3的中和效价:C1（1∶3&1∶5）、C4（1∶3&1∶3）、C7（1∶10&1∶11）和C16（1∶9&1∶9）;C7和C16对DHAV-1和DHAV-3攻毒雏鸭的保护率较高,分别为"70%、80%"和"100%、60%"。本研究成功研制出对DHAV-1和DHAV-3具有交叉中和活性的McAb 4株,其中2株对病毒的感染具有良好的预防效果,为DHA的防控提供了新材料和新思路。
佟相慧[2]（2020）在《MHC单倍型鸭胚肝间充质干细胞的建立及应用》文中研究说明为了解决多种鸭病病毒没有适合的传代细胞系的现实问题,本论文利用无特定病原体（Specific pathogen free,SPF）鸭开展了鸭胚肝间充质干细胞（Duck embryo liver mesenchymal stem cells,Du LMSC）的研究。抗原相关转运体（Transporter associated with antigen processing,TAP）基因（Tap1和Tap2）和主要组织相容性复合体（Major histocompatibility complex,MHC）I类分子重链编码基因（UAA）位于鸭MHC的核心区域,且位置比邻。本研究测定了Tap1和Tap2序列纯合的4个鸭品系（B1、B2、B3和B4）的UAA编码区序列,确定了各品系内UAA序列同源。利用此4个品系,采用Ⅳ型胶原酶消化法从鸭胚肝脏中分离DuLMSC,体外可传代培养至50代。细胞形态稳定呈长梭形贴壁生长,不表达造血干细胞分子标记,能够向成骨细胞和成脂细胞分化,且前35代细胞对裸鼠无致瘤性。将4个细胞株,分别命名为DuLMSC/1、DuLMSC/2、DuLMSC/3和DuLMSC/4。为比较鸭肠炎病毒（Duck enteritis virus,DEV）对4个细胞株的适应性,我们将DEV C-K CE株分别接种到4个细胞株上并连续传10代。结果显示F1至F10代病毒接种细胞后,均产生典型的细胞病变（Cytopathic effect,CPE）;F1至F10代病毒均能特异性地扩增出DEV的UL2基因片段,且F1、F5和F10代病毒的UL2基因核苷酸序列与原种毒完全同源;接毒24 h的细胞的细胞浆、细胞核和细胞间隙内存在典型的疱疹病毒样粒子;DEV在4个细胞株上的一步生长曲线表明DuLMSC/4上的各个时间点对应的病毒滴度都高于或接近其他3个细胞株;另外,F1至F10代的病毒滴度从F5代开始趋于稳定,Du LMSC/3或DuLMSC/4上的病毒滴度比DuLMSC/1或Du LMSC/2高约0.5个TCID50,且在4个细胞株上前五代的病毒滴度平均值始终比在CEF细胞上高0.5个TCID50左右。在分析鸭甲型肝炎病毒（Duck hepatitis A virus,DHAV）1型弱毒株和DHAV-3弱毒株对D uLMSC/4的适应性时,DHAV-1连续传代至F8代时产生CPE,F1至F15代病毒均能特异性地扩增出DHAV-1的3D基因片段且F1、F7和F15代的3D基因核苷酸序列与原种毒完全同源;DHA V-3连续传代至F3代时产生CPE,F1至F15代病毒均能特异性地扩增出DHAV-3的VP1基因片段且F1、F7和F15代的VP1基因核苷酸序列与原种毒完全同源。病毒增殖曲线结果显示DHAV-1核酸相对拷贝数范围为1-30,而DHAV-3核酸相对拷贝数在10-120之间。利用B3系鸭UAA部分α2和完整α3区的大肠杆菌表达产物制备了鸭MHC I类分子特异性鼠源单抗G1。G1的重链为IgM,轻链为Kappa型。G1对B4鸭外周血细胞和对SPF白来航鸡外周血细胞的流式细胞术检测结果分别为70.3%和19.4%。DEV感染Du LMSC/4后,细胞表面MHC I类分子的表达量先下调后上调,而细胞内MHC I类分子转录水平始终上调,推测DEV感染早期能抑制MHC I的递呈。本研究建立的DuLMSC/4,能支持DEV和DHAV增殖,能用于MHC I相关的基础研究,是鸭病防控技术研发的良好实验材料。
常艳燕[3]（2020）在《猪源唾液酸黏附素介导PRRS病毒感染Marc145细胞的适应性研究》文中认为猪繁殖与呼吸障碍综合征（PRRS,俗称蓝耳病）是由猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒（PRRSV）引起的一种严重危害养猪业的免疫抑制性疾病。疫苗接种是预防本病的重要手段之一。但是,由于PRRSV具有严格的细胞嗜性,原代易感细胞如猪肺泡巨噬细胞（PAM）等难以满足大规模生产的需求,而继代细胞如非洲绿猴肾上皮细胞（Marc145）等因缺乏唾液酸黏附素（Sn）受体限制了某些PRRSV田间流行株的体外增殖,这十分不利于现有PRRS疫苗免疫效果的持续性评价及其疫苗种子库的建立,阻碍了PRRS疫情的防控实践。故此,迫切需要构建PRRSV易感的重组细胞系来解决这一瓶颈性问题。【目的】本论文拟借助CRISPR/Cas9技术对Marc145细胞的基因组进行修饰和改造,构建稳定表达猪源Sn（p Sn）的Marc145细胞株（p Sn-Marc145）,以期提高PRRSV的细胞吸附能力及其适应性和感染性,为PRRSV的基础与应用研究提供可靠的细胞平台支撑。【方法】本论文选择Marc145细胞第11号染色体RACGAP1和ASIC1基因之间的内含子序列作为打靶区域。首先,利用生物学软件设计单向导RNA（sg RNA）并构建Cas9打靶质粒,通过软件分析和Surveyor检测试剂盒筛选脱靶效率较低的sg RNA;并利用编码增强型绿色荧光蛋白（e GFP）的供体质粒进行同源重组修复,借助荧光显微镜观察、Junction PCR、Southern Blotting等方法来确定外源基因是否可以特异性重组至靶向区域并有效表达。随后,根据所选sg RNA,构建并比较不同Cas9突变体打靶质粒的切割效率;选择脱靶效率低、切割效率和同源重组较高的Cas9打靶质粒用于p Sn-Marc145细胞的构建:在CRISPR/Cas9系统的介导下,将p Sn基因序列经供体质粒整合至Marc145细胞基因组中。嘌呤霉素加压条件下,挑取单克隆细胞并扩大培养;对经Junction PCR、Southern Blotting、Western Blotting、间接免疫荧光试验鉴定为阳性的克隆进行核型分析、细胞形态观察以及生长周期活性评估。最终,在正常的Marc145和p Sn-Marc145细胞上,比对研究制苗用PRRSV（VR2332、CH1R、R98、JXA1）和野生型PRRSV（GSWW2018和GSKL）的生物学特性。【结果】本论文共设计合成了5种sg RNA（sg RNA-3、-17、-23、-24、-33）,其中sg RNA-24的脱靶效率最低;该打靶质粒能够将供体质粒携载的e GFP定点整合于RACGAP1和ASIC1基因之间的内含子中并检测到特异性绿色荧光。3种Cas9突变体（p Sp Cas9、Cas9n、e Cas9）中,Cas9n（含双sg RNA）打靶质粒的切割效率最高;将Cas9n（含双sg RNA）打靶质粒和p Sn供体质粒转染正常的Marc145细胞后,获得了2株靶向单一整合的p Sn-Marc145重组细胞（24-15-7、24-15-9）,单细胞阳性克隆在保持正常Marc145细胞遗传特征和细胞形态的同时,表现出更优的生长活性。通过蚀斑形成试验、间接免疫荧光试验、病毒生长曲线的绘制、Western Blotting和实时荧光定量PCR检测发现,尽管p Sn的表达对PRRSV疫苗生产用毒种在Marc145细胞中的毒力和复制能力影响不大,但显着提高高致病性PRRSV（HR-PRRSV,JXA1）的吸附能力;通过传代培养、遗传变异分析、实时荧光定量PCR、蚀斑形成试验和病毒生长曲线的绘制发现,2株野生型PRRSV在p Sn-Marc145细胞上具有明显强于其在正常Marc145细胞上的适应性和感染性。【结论】综上所述,本论文研究结果表明:一、Marc145细胞基因组中第11号染色体RACGAP1和ASIC1基因之间的内含子区域可作为外源基因定点打靶的有效位点。二、利用CRISPR/Cas9系统构建的p Sn-Marc145细胞株在HP-PRRSV疫苗生产和野生型PRRSV分离过程中具有良好的应用潜力。
刘燕[4]（2019）在《交叉中和基因A型和基因C型鸭甲肝病毒单克隆抗体的制备与鉴定》文中认为鸭甲型肝炎（Duck hepatitis A,DHA）是危害养鸭业的主要疾病之一,可引起雏鸭的急性、高度致死性的传染病。根据其基因序列的差异,分为三个基因型（DHAV-A、DHAV-B和DHAV-C）,目前我国主要流行DHAV-A和DHAV-C,两种基因型病毒缺乏有效的交叉中和作用,严重影响本病的防控。研究表明,针对保守中和抗原表位的广谱中和抗体是应对这种情况的新策略。本研究拟针对DHAV-A和DHAV-C共同保护性抗原的保守序列研制单克隆抗体（Monoclonal antibody,McAb）,进而筛选出针对这两种基因型DHAV的广谱中和抗体,取得如下成果:1研制出与DHAV-A和DHAV-C具有交叉反应性的单克隆抗体根据DHAV-A和DHAV-C的VP1蛋白共有的氨基酸序列,利用生物信息学软件设计筛选出评分最高的12条长度为14肽的抗原表位,人工合成各肽段,分别与KLH载体蛋白偶联作为免疫抗原,免疫BALB/c小鼠制备McAb,获得了12株稳定分泌McAb的杂交瘤细胞株。间接ELISA检测结果显示,其中6株McAb（C1、C4、C7、C12、C13、C16）同时与DHAV-A和DHAV-C发生交叉反应,而不与鸭瘟病毒（DPV）、新城疫病毒（NDV）和禽流感病毒（AIV）反应,为广谱中和McAb的筛选奠定了基础。2筛选出具有交叉中和活性的单克隆抗体2.1 McAb在鸭胚中的交叉中和活性为评价McAb的中和活性,将具有交叉反应性McAb分别与200ELD50DHAV-A和DHAV-C等体积混,接种12日龄SPF鸭胚绒毛尿囊腔,0.2mL/胚,进行中和试验,每个处理组5枚鸭胚,以鸭β-actin基因作为内参,采用Real-time PCR方法测定病毒荷载量,用2-△△CT法进行相对定量,评价6株具有交叉反应性的McAb对DHAV-A和DHAV-C的在鸭胚上的中和活性,并测定其中和效价。结果显示,6株McAb对DHAV-A和DHAV-C增殖的抑制率依次为:C1（84.4%&82.69%）、C4（90.79%&75.34%）、C7（86.23%&99.83%）、C12（14.74%&25.26%）、C13（38.87%&2.06%）和C16（99.61%&100%）。鸭胚中和试验结果中,6株McAb对DHAV-A、DHAV-C的中和效价分别为:C1（1:3&1:5）、C4（1:3&1:3）、C7（1:10&1:11）、C12（0&0）、C13（0&0）和C16（1:9&1:9）。据此筛选出4株（C1、C4、C7、C16）具有交叉中和活性的McAb。2.2 McAb对雏鸭的预防效果为了解4株对DHAV-A、DHAV-C具有交叉中和活性McAbs对雏鸭的交叉预防效果,1日龄雏鸭分组肌肉注射McAb,1mL/只,24 h后分别肌注DHAV-A、DHAV-C,100ELD50/只,每个处理组5只雏鸭。结果显示,4株McAb对DHAV-A、DHAV-C的保护率分别为:C1（30%&40%）、C4（40%&40%）、C7（70%&80%）、C16（100%&60%）。本研究结果显示,4株McAbs对两种不同基因型毒株均具有不同程度的交叉预防效果,其中C7、C16对DHAV-A和DHAV-C的攻击具良好的交叉预防作用,保护率达60%以上。
杨燕羽[5]（2019）在《甲肝病毒YN5株在Walvax-2细胞上适应的遗传稳定性研究》文中提出[目的]甲型病毒性肝炎简称甲型肝炎,是由甲型肝炎（HepatitisAvirus）感染人体引起的一种以肝脏损伤为主的急性传染病。临床表现为恶心、腹泻、皮肤发黄、发烧和腹痛。其发病季节带有地区性特征,流行具有周期性,与国家或地区的发达程度包括经济、卫生水平有关,甲肝已成为世界卫生的重点关注问题。预防甲肝可使用甲肝减毒活疫苗或灭活疫苗,二者相比,甲肝灭活疫苗具有更强的免疫原性,免疫后能诱发高水平的体液免疫,无病毒返祖,疫苗稳定性好,易于保存、运输和使用。目前国内批准生产的灭活疫苗均是采用人二倍体细胞（KMB17和2BS细胞株制备的）,因体制原因两株细胞仅能在少数单位使用,鉴于此云南沃森生物技术股份有限公司（下称“沃森生物”）自己建立了一株背景来源清晰、质量检测合格的新的人胚胎二倍体细胞Walvax-2,该细胞系无外源因子污染,各代次细胞检测指标符合《中华人民共和国药典2015版三部》规定。沃森生物原有甲型肝炎灭活疫苗（Vero细胞）产品,由于Vero细胞基质制备的疫苗存在潜在致瘤性的风险,公司拟将疫苗制备的细胞基质替换成人二倍体细胞Walvax-2,对产品进行升级换代。本研究旨在筛选建立甲肝病毒YN5株在Walvax-2细胞上的适应株,并根据新药研发政策和《中华人民共和国药典2015版三部》对适应株的质量标准与遗传稳定性进行研究[1],为后期使用Walvax-2细胞进行甲肝灭活疫苗的制备提供依据。[方法]将甲肝毒株YN5适应到Walvax-2细胞上并于35℃连续培养,对适应株的工作种子批（第29代）进行鉴别实验、病毒滴定、无菌检查和支原体检查这四项检定;再取其中5个代次（第24、27、29、35和40代）进行RNA提取、RT-PCR特异扩增等步骤,最后采用生物信息学软件DNAMAN、Vector NTI、BioEdit等进行序列分析,从而判断Walvax-2细胞作为一株新的人源二倍体细胞株用于甲肝灭活疫苗开发的可行性。[结果]甲型肝炎病毒毒种YN5株的工作种子批经检定,并报送中国食品药品检定研究院检验,结果表明鉴别实验、无菌检查和支原体检查均符合规定,病毒滴度为7.67lgCCID50/ml;适应株5个代次全基因之间核苷酸序列同源性为100%,它们与标准株HM175全基因组核苷酸序列同源性均为99.4%;P24在5’-NCR（101-200bp）发生部分变异,表现为124位和152位发生突变、134～137bp缺失,之后该突变稳定遗传;5个代次病毒在2A（3012～3210bp）区段发生2处突变;所有代次的毒株与野毒株HM175为同一基因型,即IB型;5个代次病毒的主要抗原位点与HM175完全一致。[结论]经检定,甲肝病毒YN5株在Walvax-2细胞上适应培养获得的工作种子批符合企业质检规程和《中华人民共和国药典2015版三部》相关要求,说明Walvax-2细胞不仅可以满足公司甲肝疫苗品种的细胞替换要求,而且有潜力作为其他病毒疫苗研发和生产用细胞基质;通过研究甲型肝炎病毒YN5株在Walvax-2细胞连续传代后的遗传特性,发现Walvax-2细胞安全性良好,可以很好的替代Vero细胞,为以Walvax-2细胞为细胞基质,制备甲肝灭活疫苗提供了新药申报的数据支持。
张捷[6]（2019）在《柯萨奇A组10型病毒株的传代适应及其代表株的生物学特性分析》文中进行了进一步梳理目的 柯萨奇病毒A组10型（Coxsackievirus A10,CVA10）是近年来引起手足口病（Hand,foot and mouth disease HFMD）的主要病原体之一。而目前尚未有CVAI0特异性抗病毒药物和疫苗。疫苗是预防和控制的有效措施,但CVA10难以在非洲绿猴肾（African green monkey kidney,Vero）细胞等人用疫苗生产细胞基质中增殖培养的特性严重阻碍了 CVA10疫苗的相关研究。本研究通过筛选出Vero 细胞或人胚肺二倍体（Human embryonic lung diploid cell,KMB17）细胞适应的CVA10毒株,并对代表株进行一步生长曲线、乳鼠致病性以及灭活疫苗免-疫原性等部分生物学特性的初步探究,为CVA10疫苗及其相关作用机制的研究提供研究基础。方法1.通过收集2009年～2015年云南昆明地区及2017年湖北襄阳地区手足口病（hand,foot and mouth disease,HFMD）病人粪便及肛拭子临床标本（共327份）,并利用人横纹肌肉瘤（Rhabdomyosarcoma,RD）细胞、Vero细胞、KMB17细胞进行分离培养,对鉴定为CVA10的分离株进行基于全长VP1核酸序列的种系进化分析。2.分别在Vero细胞、KMB17细胞上对RD细胞分离株进行连续传代适应。3.选取病毒滴度高,且能代表不同基因亚型的四个病毒适应株进行蚀斑克隆纯化后,用微量组织培养技术（Micro tissue culture technique,MCT）检测接种细胞后不同时间点的病毒滴度,分别绘制四个代表株在Vero细胞和KMB17细胞上一步生长曲线。4.在3天龄BalB/C乳鼠模型中,以105TCID50颅腔攻毒后,记录乳鼠体重、临床打分、生存曲线,并取临床打分为3的乳鼠各组织进行病毒载量的检测（Real-time PCR Taqman探针法绝对定量）和组织石蜡切片的苏木精-伊红（Hematoxylin-eosin,HE）染色、免疫组化等分析。5.超滤浓缩β-丙内酯灭活的V6-19/XY/CHN/2017病毒抗原后,免疫6～8周龄BalB/C成鼠,测定小鼠抗血清对不同代表株的中和抗体效价。6.在Vero细胞上连续传代代表毒株V6-19/XY/CHN/2017,并比较第1、5、10、15代全基因序列。7.通过RT-PCR分别扩增覆盖病毒株的全基因片段,确定四个代表株全基因核酸（氨基酸）序列。结果1.经三种细胞分离,仅在RD细胞获得14株CVA10分离株（检出率为5.2%）,均为C基因型。2.经过Vero细胞和KMB17细胞分别传代适应,最终获得了 2株Vero细胞适应的CVA10毒株和11株KMB17细胞适应株。3.V6-19/XY/CHN/2017适应株对Vero细胞和KMB17细胞均具有较强敏感性,感染性滴度分别能达107.63TCID50/mL和107 32TCID50/mL。4.四个代表株均具有强烈的噬肌肉性,但毒力不同（K1554/YN/CHN/2015>V6-19/XY/CHN/2017>K975/YN/CHN/2010>K136/YN/CHN/2013）。5.用Vero细胞作为细胞基质制成的V6-19/XY/CHN/2017灭活疫苗能诱导成鼠体内产生较高效价的中和抗体（GMT=462）,且对另三个KMB17代表株具有良好的交叉保护能力（GMT为266.4～401.7）。6.V6-19/XY/CHN/2017在Vero细胞上增殖15代内遗传稳定性良好。7.全基因核酸（氨基酸）的比较结果显示,四个代表株间核酸（氨基酸）同源性为91.5%～96.0%（98.4%～98.9%）,而5’UTR和3’UTR同源性差别较大,分别为90.5%～97.4%和88.4%～97.6%,且编码的氨基酸序列中存在多个氨基酸位点差异。结论1.本研究中的CVA10分离株均为C基因型,与近几年中国内地流行株基因型一致。2.筛选到2株Vero细胞适应株和11株KMB17细胞适应的CVA10毒株。3.CVA10病毒株具有肌肉组织噬性。4.Vero细胞适应株V6-19/XY/CHN/2017具有良好的免疫原性,且遗传稳定性良好。本研究为CVA10疫苗研究及其相关作用机制的揭示提供了重要参考信息。
杨旸[7]（2016）在《同时识别1和3型鸭甲肝病毒的单抗及胶体金试纸条研究》文中研究指明鸭甲型肝炎病毒（DHAV）可引起雏鸭发生急性、高度致死性传染病。主要感染3周龄以下的雏鸭,其中1周龄以内的雏鸭死亡率高达95%,主要特征病变为患病鸭的肝脏肿大和出血。本试验开展了DHAV病毒单克隆抗体及胶体金试纸条制备和快速诊断等研究,结果如下：1.DHAV单克隆抗体的制备及初步鉴定用血清1型鸭甲型肝炎病毒（DHAV-1） X株病毒尿囊液接种鸭胚,收集24-72h死亡的鸭胚尿囊液,将含DHAV-1病毒的尿囊液与等量的氯仿混合,抽提3次,除去脂类以及一些杂蛋白,然后在40000 r/min离心2 h,用PBS重悬病毒并使病毒蛋白含量为0.5 mg/mL,作为制备单克隆抗体的抗原免疫6周龄的BALB/c雌性小鼠。取免疫后小鼠的脾细胞与SP2/0小鼠骨髓瘤进行了细胞融合、筛选,再用有限稀释法对杂交瘤细胞进行3次亚克隆,最终得到5株可以稳定分泌特异性抗体的阳性杂交瘤细胞,分别命名为1#、2#、3#、4#}和5#杂交瘤细胞株。经鉴定,1#单克隆抗体类型属于IgM,2#单克隆抗体类型属于IgG1,3#单克隆抗体类型属于IgG2b,4#和5#单克隆抗体类型属于IgG2a。纯化后单抗腹水的效价均在2×105以上;5株杂交瘤细胞株稳定性均较好,经过体外传代以及细胞冻存复苏仍能稳定分泌抗体。5株单克隆抗体的相对亲和常数都在109数量级以上,具有较好的抗原结合能力,其中3#单克隆抗体的亲和力更高。2.胶体金试纸条的研制及应用用纯化的2#单克隆抗体进行胶体金标记制备成金标抗体,经过试验条件的优化,确定了胶体金与抗原的最佳标记量为34μg/mL,最佳标记的pH值确定0.1mol/L K2CO3加入量为12μL/mL;将纯化的兔抗DHAV-1多抗包被于NC膜的T线上作为检测线,羊抗鼠IgG包被于NC膜的C线上作为对照线,制成双抗体夹心法检测DHAV的胶体金免疫层析试纸条。对胶体金试纸条T线和C线浓度的优化,确定检测线上的兔抗DHAV-1多抗的最佳标记量为1 mg/mL,对照线上羊抗鼠IgG最佳标记量为1 mg/mL。在特异性试验中,检测4株DHAV-1和6株DHAV-3呈阳性反应,对鸭常见的其它致病病原（鸭瘟病毒、鸭大肠杆菌、鸭坦布苏病毒、鸭沙门氏菌、鸭疫里默氏杆菌等）检测均为阴性；对DHAV-1最低检出量为0.9μg, DHAV-3最低检出量为1.8 μg。试纸条在4℃、室温和37℃至少可以保存3个月；批间和批内试纸条对样品检测的重复性较好。本试验制备的试纸条与RT-PCR同时检测临床样本的阳性符合率为96.5%（111/115）,阴性符合率为97.9%（46/47）。该胶体金试纸条具有较好灵敏度、特异性、重复性和稳定性。
黄剑梅[8]（2016）在《鸭1型甲肝病毒亚型VP3蛋白间接ELISA方法的建立及其单克隆抗体的制备》文中认为近些年,DHAV-1出现了新的致病特点,主要表现为胰腺出血和发黄,不同于经典型肝脏出血的特征性病变,其发病率为42.8%,病死率达77.8%。对2011年从浙江采集的典型样品进行了病原分离纯化鉴定、病毒全基因组序列测定与分析、致病性试验,确定其病原为鸭1型甲肝病毒,我们又通过鸭胚血清交叉中和试验测定并分析其与经典的DHAV-1的抗原相关性,结果表明胰腺炎型与经典的DHAV-1的R值为0.62,因此证明胰腺炎型DHAV-1属于鸭1型甲肝病毒的亚型（DHAV-1a）。本实验根据GenBank上已发表的DHAV-1a基因序列设计一对特异性引物,以DHAV-1a MPZJ1206株为模板,采用RT-PCR方法扩增VP3基因,将VP3基因克隆至pEASY-Blunt Zero载体上,转化大肠杆菌Trans5α,用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定及PCR鉴定,筛选出阳性重组克隆质粒,并测序。对测序结果进行分析,发现DHAV-1a VP3基因与鸭1型甲肝病毒ZJ株（EF382778.1）的核苷酸同源性为94.8%,氨基酸同源型为99.2%;与鸭1型甲肝病毒CE3（EU687756.1）的核苷酸同源性为94.7%,氨基酸同源性为97.9%。将构建的DHAV-1a VP3基因阳性重组克隆质粒,进行双酶切,回收VP3基因片段,与pET-32a（+）表达载体连接,重组成pET-32a-VP3,转化E.coli BL21（DE3）感受态细胞,用浓度为1.0 mmol/L IPTG于37℃诱导表达,经SDS-PAGE分析表明VP3蛋白于大肠杆菌中成功表达,融合蛋白分子量约47 kDa。经融合蛋白的可溶性分析知VP3蛋白以包涵体的形式存在。使用GE health公司生产的His Trap HP纯化柱纯化VP3蛋白。Western-blot分析知纯化的VP3蛋白能被鸭1型甲肝病毒亚型的阳性高免血清所识别,表明鸭1型甲肝病毒亚型的VP3蛋白具有良好的反应原性。以纯化的VP3蛋白作为抗原包被ELISA板,建立检测鸭1型甲肝病毒亚型抗体的间接ELISA诊断方法。实验结果表明:以VP3蛋白为抗原的最佳包被浓度为1:800（蛋白浓度1.5 ug/mL）,血清最佳稀释度为1:160,最佳血清反应时间为90 min,HRP标记的羊抗鸭酶标二抗最佳稀释浓度为1:4000,HRP标记的羊抗鸭酶标二抗最佳反应时间为90 min,最佳显色时间为20 min。经特异性试验、重复性试验知所建立的ELISA检测方法具有特异性强、重复性良好的特点。利用所建立的ELISA检测方法对84份鸭血清进行检测,阳性检出率为32.14%,与以纯化浓缩鸭1型甲肝病毒为包被抗原的间接ELISA方法相比,两者的符合率为87.1%。以纯化的DHAV-1a VP3蛋白为抗原,免疫6只Blab/c雌性小鼠,用于细胞融合。细胞融合后,用VP3蛋白所建立的间接ELISA方法筛选,再进行4次亚克隆后筛选到2株阳性杂交瘤细胞,命名为1C9和2C9,亚类鉴定均为IgG1（κ）,腹水效价分别为1:1024000和1:512000。
刘伟[9]（2015）在《胰腺炎型鸭1型甲肝病毒VP1蛋白单克隆抗体的制备》文中提出本试验病原为胰腺炎型DHAV-1（MPZJ1206株）,其所引起的病变与典型的DHAV-1有所不同,主要引起雏番鸭发生病变,发病的雏番鸭胰腺可见发黄和出血。将胰腺炎型DHAV-1与GenBank中登录的DHAV-1相比,发现其VP1基因核苷酸同源性在94.1%与99.1%之间,VP1基因推导氨基酸残基的同源性在96.8%与97.5%之间。本实验根据MPZJ1206株的VP1基因设计一对特异性引物,并采用RT-PCR法将目的VP1基因扩增,扩增产物回收纯化后,将其连接到克隆载体pMD18-T上,构建克隆载体pMD18-T-VP1,并将其转化到感受态细胞E.coli Trans5α。挑取单菌落,双酶切鉴定并测序,将鉴定为阳性的菌落提取质粒进行双酶切,回收VP1片段,将其与表达载体pGEX-6P-1进行连接。并将连接产物转化到大肠杆菌BL21感受态细胞中,鉴定同上,将鉴定为阳性的菌落经IPTG诱导后,进行SDS-PAGE电泳,并对其进行了鉴定。在此基础上对VP1蛋白的表达条件进行了优化。结果表明,表达的目的蛋白大小为53kDa,与预期相符,且具有反应原性,37℃诱导表达5h蛋白表达量达到最大,主要以包涵体的形式存在。将诱导表达的VP1蛋白作为抗原免疫BALB/C、鼠,共免疫四次。同时建立检测小鼠抗VP1抗体的间接ELISA检测方法。最后一次免疫后72h内取处于对数期生长的SP2/0骨髓瘤细胞与免疫小鼠脾细胞进行融合。融合后的杂交瘤细胞采用间接ELISA筛选阳性克隆,并进行亚克隆,结果共获得的2株杂交瘤细胞株均能稳定分泌抗DHAV-1的VP1蛋白单克隆抗体,分别命名为1A2、5G3,并对其稳定性,小鼠腹水的效价等进行检测。本实验表明,两株单克隆抗体具有稳定性好,效价较高,特异性良好的特点。1A2株效价可达1：25×103,5G3株效价可达1：211×103。亚类鉴定结果显示,两株细胞均为IgG1、κ链抗体。Western-blot表明两株单克隆抗体是针对DHAV-1的VP1蛋白。本实验获得的单克隆抗体为DHAV-1的治疗以及研制试剂盒对其进行检测打下了基础。
黄建锋,邓德坚,张晓琼[10]（2011）在《甲型肝炎病毒单克隆抗体细胞株的建立及鉴定》文中指出目的探讨建立和鉴定甲型肝炎（HAV）病毒单克隆抗体（McAb）细胞株的方法,为临床提供抗体来源。方法通过McAb杂交瘤细胞培养方法进行甲型肝炎病毒单克隆抗体细胞株的培养后,选取实验培养的具有稳定性的McAb杂交瘤细胞后编号,对各细胞株进行特异性、效价的测定,并进行比对。结果 McAb杂交瘤细胞与甲肝病毒抗原的结合特异性效价在1（:10 00080 000）间,提示McAb与甲肝病毒抗原的结合具有特异性;McAb细胞培养上清液效价在1（:2 04816 824）间。结论通过McAb杂交瘤方法建立的甲型肝炎病毒单克隆抗体细胞株具有较好的稳定性和特异性,且其效价较高,对临床甲型肝炎的诊断和疫苗的培养接种具有十分重要的作用。
二、甲型肝炎病毒克隆抗体细胞株的建立及应用（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、甲型肝炎病毒克隆抗体细胞株的建立及应用（论文提纲范文）
（1）交叉中和血清1型和血清3型鸭甲肝病毒单克隆抗体的制备与鉴定（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 病毒株及血清 |
| 1.1.2 实验动物与细胞株 |
| 1.1.3 主要试剂 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 抗原表位肽的设计合成和偶联 |
| 1.2.2 动物免疫 |
| 1.2.3 阳性杂交瘤细胞的筛选与克隆 |
| 1.2.4 小鼠腹水的制备及效价测定 |
| 1.2.5 腹水中单抗交叉反应活性的鉴定 |
| 1.2.6 McAb特异性鉴定 |
| 1.2.7 McAb体亚型鉴定 |
| 1.2.8 McAb对DHAV-1和DHAV-3抑制率的测定 |
| 1.2.9 McAb中和效价的测定 |
| 1.2.10 McAb对DHAV-1和DHAV-3的攻毒保护率测定 |
| 2 结 果 |
| 2.1 设计合成的抗原肽 |
| 2.2 杂交瘤细胞株的筛选 |
| 2.3 小鼠腹水效价 |
| 2.4 McAb交叉反应性鉴定以及亚型鉴定 |
| 2.5 McAb的特异性 |
| 2.6 McAb对DHAV在鸭胚中增殖的影响 |
| 2.6.1 McAb对DHAV-1增殖的影响 |
| 2.6.2 McAb对DHAV-3增殖的影响 |
| 2.6.3 McAb对DHAV-1和DHAV-3的交叉中和活性 |
| 2.7 McAb的中和效价 |
| 2.8 McAb攻毒保护率 |
| 3 讨 论 |
| 4 结 论 |
（2）MHC单倍型鸭胚肝间充质干细胞的建立及应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 提出问题 |
| 1.2 选题背景和意义 |
| 1.3 文献综述 |
| 1.3.1 HBW-SPF鸭概述 |
| 1.3.2 间充质干细胞概述 |
| 1.3.3 鸭病毒性肠炎概述 |
| 1.3.4 鸭病毒性肝炎概述 |
| 1.4 论文结构安排 |
| 第二章 鸭胚肝间充质干细胞的建立与鉴定 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 细胞、实验动物 |
| 2.1.2 主要试剂与仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 鸭胚肝源细胞的分离及传代培养 |
| 2.2.2 表面标记分子RT-PCR检测 |
| 2.2.3 诱导分化及鉴定 |
| 2.2.4 致瘤性检测 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 鸭胚肝来源干细胞的分离及传代 |
| 2.3.2 表面标记分子RT-PCR检测结果 |
| 2.3.3 诱导分化及鉴定结果 |
| 2.3.4 致瘤性检测结果 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 DEV C-KCE株在DULMSC中的生物学特性检测 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 细胞、毒株 |
| 3.1.2 主要试剂与仪器 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 DEV在4种Du LMSC上的连续传代 |
| 3.2.2 细胞病变观察 |
| 3.2.3 UL2基因的PCR检测 |
| 3.2.4 细胞切片电镜观察 |
| 3.2.5 DEV在4个Du LMSC细胞株上的一步生长曲线的绘制 |
| 3.2.6 DEV在4个Du LMSC细胞株上病毒滴度的比较 |
| 3.2.7 DEV在 CEF细胞上连续传代病毒滴度的测定 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 细胞病变观察 |
| 3.3.2 UL2基因的PCR检测 |
| 3.3.3 细胞切片电镜观察 |
| 3.3.4 DEV在4个Du LMSC细胞株上的一步生长曲线 |
| 3.3.5 DEV在4个Du LMSC细胞株上的病毒滴度 |
| 3.3.6 DEV在 Du LMSC与 CEF细胞上病毒滴度的比较 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 DHAV弱毒在DULMSC/4 上的增殖特性 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 细胞、毒株 |
| 4.1.2 主要试剂与仪器 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 DHAV-1与DHAV-3在Du LMSC/4 上的接种与传代 |
| 4.2.2 细胞病变观察 |
| 4.2.3 病毒基因的PCR检测 |
| 4.2.4 DHAV-1和DHAV-3在Du LMSC/4 上增殖情况检测 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 细胞病变观察 |
| 4.3.2 病毒基因PCR检测 |
| 4.3.3 标准曲线的绘制 |
| 4.3.4 DHAV-1和DHAV-3在Du LMSC/4 上增殖情况检测 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 DEV感染DULMSC/4对MHC I类分子的影响 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 细胞、毒株和实验动物 |
| 5.1.2 主要试剂与仪器 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 B1、B2、B3、B4鸭UAA基因完整编码区序列的测定 |
| 5.2.2 免疫原的制备 |
| 5.2.3 鸭MHCI类分子特异性单抗的制备 |
| 5.2.4 DEV感染对MHC I类分子的影响 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 B1、B2、B3、B4鸭UAA基因完整编码区序列的扩增 |
| 5.3.2 p ET-UAAα2α3 原核表达重组质粒的构建 |
| 5.3.3 诱导表达及纯化条件的优化 |
| 5.3.4 单抗细胞的筛选 |
| 5.3.5 腹水的亚型鉴定 |
| 5.3.6 G1的特异性分析结果 |
| 5.3.7 Du LMSC/4 表面MHC I流式细胞术检测方法的建立 |
| 5.3.8 DEV感染对细胞表面MHC I类分子表达的影响 |
| 5.3.9 DEV感染对MHC I类分子转录的影响 |
| 5.4 讨论 |
| 第六章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录A |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（3）猪源唾液酸黏附素介导PRRS病毒感染Marc145细胞的适应性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Summary |
| 缩略词表 |
| 第一章 CRISPR/ Cas9 技术在哺乳动物细胞中的应用 |
| 1.1 CRISPR/ Cas9技术的研究进展 |
| 1.1.1 CRISPR/ Cas9技术的发展历程 |
| 1.1.2 CRISPR/ Cas分类 |
| 1.1.3 CRISPR/ Cas9 技术及其作用的基本原理 |
| 1.1.4 CRISPR/ Cas9 的基因修复路径 |
| 1.2 CRISPR/ Cas9技术在生产病毒性疫苗哺乳动物细胞株的应用 |
| 1.2.1 病毒性疫苗用哺乳动物细胞系的简介 |
| 1.2.2 CRISPR/ Cas9技术在病毒性疫苗哺乳动物细胞的应用 |
| 第二章 猪源唾液黏附素受体研究进展 |
| 1.1 Sn受体结构 |
| 1.2 PRRSV与 Sn受体作用机理 |
| 1.2.1 PRRSV流行现状 |
| 1.2.2 PRRSV与 Sn受体的相互作用 |
| 1.2.3 Sn受体与PRRSV的免疫作用机理 |
| 第三章 Marc145细胞基因组打靶位点的筛选及验证 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 细胞和载体 |
| 1.1.2 仪器设备 |
| 1.1.3 试剂 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 打靶质粒构建 |
| 1.2.2 eGFP供体质粒构建 |
| 1.2.3 转染 |
| 1.2.4 Surveyor核酸酶检测 |
| 1.2.5 Junction PCR检测 |
| 1.2.6 Southern Blotting检测 |
| 2 结果 |
| 2.1 Marc145 细胞基因组打靶位点的选择和sgRNA的设计及筛选 |
| 2.2 打靶质粒和供体质粒的构建 |
| 2.3 Cas9切割效率检测 |
| 2.4 阳性细胞克隆鉴定 |
| 3 讨论 |
| 4 本章小结 |
| 第四章 不同Cas9在Marc145 细胞的切割效率及重组效率分析 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 打靶载体 |
| 1.1.2 仪器设备 |
| 1.1.3 试剂 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 eSpCas9 打靶质粒构建 |
| 1.2.2 Cas9n双打靶质粒构建 |
| 1.2.3 pSpCas9、Cas9n(双打靶)和e Cas9 打靶质粒的转染 |
| 1.2.4 Surveyor核酸酶检测三种打靶质粒的切割效率 |
| 1.2.5 Junction PCR检测同源重组效率 |
| 2 结果 |
| 2.1 三种打靶质粒的构建 |
| 2.2 三种打靶质粒的切割效率 |
| 2.3 Junction PCR检测同源重组效率 |
| 3 讨论 |
| 4 本章小结 |
| 第五章 稳定表达猪源唾液酸黏附素Marc145细胞系的建立 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 载体 |
| 1.1.2 仪器设备 |
| 1.1.3 试剂 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 嘌呤霉素浓度滴定 |
| 1.2.2 猪源Sn供体质粒构建 |
| 1.2.3 猪源Sn供体质粒与Cas9n(双sgRNA)质粒共转染 |
| 1.2.4 压力筛选阳性克隆 |
| 1.2.5 阳性细胞克隆鉴定 |
| 1.2.6 pSn-Marc145 单克隆细胞的生物学特性分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 猪源Sn供体质粒构建 |
| 2.2 阳性细胞克隆鉴定 |
| 2.2.1 Junction PCR结果 |
| 2.2.2 Western Blotting结果 |
| 2.2.3 间接免疫荧光检测结果 |
| 2.2.4 Southern Blotting结果 |
| 2.3 单克隆Marc145细胞生物学特性鉴定 |
| 2.3.1 阳性克隆核型分析结果 |
| 2.3.2 细胞形态观察及生长特性分析结果 |
| 3 讨论 |
| 4 本章小结 |
| 第六章 pSn-Marc145 细胞对PRRS疫苗毒株生物学特性的影响 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 细胞及PRRSV毒株 |
| 1.1.2 仪器设备 |
| 1.1.3 试剂 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 病毒传代 |
| 1.2.2 蚀斑形成试验 |
| 1.2.3 间接免疫荧光 |
| 1.2.4 病毒生长曲线 |
| 1.2.5 Western Blotting |
| 2 结果 |
| 2.1 不同PRRSV在 Marc145和pSn-Marc145 细胞的蚀斑表型 |
| 2.2 间接免疫荧光检测结果 |
| 2.2.1 VR2332 |
| 2.2.2 CHIR |
| 2.2.3 JXA1 |
| 2.2.4 R98 |
| 2.3 病毒生长曲线的绘制结果 |
| 2.3.1 VR2332 |
| 2.3.2 CHIR |
| 2.3.3 JXA1 |
| 2.3.4 R98 |
| 2.4 Western Blotting结果 |
| 3 讨论 |
| 4 本章小结 |
| 第七章 PRRSV对 pSn-Marc145 细胞的感染性研究 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 细胞及PRRSV毒株 |
| 1.1.2 仪器设备 |
| 1.1.3 试剂 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 病毒的传代培养 |
| 1.2.2 PRRSV遗传变异分析 |
| 1.2.3 实时荧光定量PCR |
| 1.2.4 蚀斑形成试验 |
| 1.2.5 病毒生长曲线 |
| 2 结果 |
| 2.1 PRRSV传代培养 |
| 2.2 PRRSV遗传变异分析结果 |
| 2.3 实时荧光定量qPCR检测结果 |
| 2.4 蚀斑形成试验结果 |
| 2.5 病毒生长曲线检测结果 |
| 3 讨论 |
| 4 本章小结 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 导师简介 |
| 导师简介 |
（4）交叉中和基因A型和基因C型鸭甲肝病毒单克隆抗体的制备与鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 鸭甲肝病毒及其单克隆抗体的研究进展 |
| 1 鸭甲肝病毒的分类及流行情况 |
| 1.1 鸭甲肝病毒的分类 |
| 1.2 鸭甲肝病毒的流行情况 |
| 2 鸭病毒性肝炎的临床症状及病理变化 |
| 3 鸭甲肝病毒单克隆抗体的研究进展 |
| 3.1 单克隆抗体的概念 |
| 3.2 McAb在 DHAV诊断中的应用 |
| 3.3 McAb用于DHAV感染机制的研究 |
| 3.4 McAb用于DHAV防治 |
| 4 本研究的目的及意义 |
| 第二章 鸭甲肝病毒单克隆抗体的制备 |
| 1 材料 |
| 1.1 病毒株及血清 |
| 1.2 实验动物与细胞株 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 仪器设备 |
| 1.5 试剂的配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 抗原表位肽的设计 |
| 2.2 抗原表位肽的合成和偶联 |
| 2.3 免疫抗原制备及动物免疫 |
| 2.4 细胞融合 |
| 2.5 杂交瘤细胞的筛选 |
| 2.6 阳性杂交瘤细胞的冻存 |
| 2.7 杂交瘤细胞株的复苏与传代培养 |
| 2.8 小鼠腹水的制备 |
| 2.9 腹水抗体效价的测定 |
| 2.10 腹水中Mc Ab活性的鉴定 |
| 2.11 McAb体亚型鉴定 |
| 2.12 McAb特异性鉴定 |
| 2.13 McAb杂交瘤细胞的稳定性鉴定 |
| 3 结果 |
| 3.1 设计合成的抗原肽 |
| 3.2 杂交瘤细胞株的筛选结果 |
| 3.3 小鼠腹水中的抗体效价 |
| 3.4 McAb交叉反应性鉴定结果 |
| 3.5 McAb亚型鉴定结果 |
| 3.6 McAb的特异性 |
| 3.7 McAb杂交瘤细胞稳定性鉴定结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第三章 交叉中和DHAV-A和DHAV-C单克隆抗体的鉴定 |
| 1 材料 |
| 1.1 病毒株和细胞株 |
| 1.2 实验动物 |
| 1.3 主要试剂和仪器设备 |
| 2 方法 |
| 2.1 DHAV半数致死量(ELD50)的测定 |
| 2.2 McAb的制备 |
| 2.3 McAb对 DHAV-A和 DHAV-C在鸭胚中增殖的影响 |
| 2.4 McAb中和效价的测定 |
| 2.5 McAb对 DHAV感染雏鸭的预防效果测定 |
| 3 结果 |
| 3.1 DHAV半数致死量的计算 |
| 3.2 McAb对 DHAV在鸭胚中增殖的影响 |
| 3.3 McAb的中和效价 |
| 3.4 McAb预防效果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 全文结论与创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（5）甲肝病毒YN5株在Walvax-2细胞上适应的遗传稳定性研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 1. 甲肝疫苗的使用现状 |
| 2. 人二倍体细胞的发展及优势 |
| 第一部分 甲肝病毒YN5株在Walvax-2细胞上适应株工作种子批毒种的检定 |
| 一 实验材料 |
| 二 实验方法 |
| 三 结果 |
| 四 讨论 |
| 五 结论 |
| 第二部分 适应株五个代次遗传稳定性的分析 |
| 一 实验材料 |
| 二 实验方法 |
| 三 结果 |
| 四 讨论 |
| 五 结论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间获得的学术成果 |
| 致谢 |
（6）柯萨奇A组10型病毒株的传代适应及其代表株的生物学特性分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 第二章 实验材料及方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验标本 |
| 2.1.2 实验用细胞株及小鼠 |
| 2.1.3 实验试剂 |
| 2.1.4 实验主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 CVA10病毒的分离培养 |
| 2.2.2 CVA10病毒株的适应性培养及蚀斑纯化 |
| 2.2.3 CVA10病毒全基因序列测定 |
| 2.2.4 病毒一步生长曲线测定 |
| 2.2.5 乳鼠攻毒实验 |
| 2.2.6 实时荧光定量PCR(Real-time PCR)测定组织病毒载量 |
| 2.2.7 HE染色 |
| 2.2.8 免疫组化 |
| 2.2.9 V6-19/XY/CHN/2017毒株灭活疫苗免疫原性分析 |
| 2.2.10 V6-19/XY/CHN/2017毒株的遗传稳定性分析 |
| 第三章 实验结果 |
| 3.1 CVA10病毒的分离培养及基因型鉴定 |
| 3.1.1 临床标本的分离培养 |
| 3.1.2 CVA10分离株的基因分型 |
| 3.2 CVA10分离株在Vero细胞、KMB17细胞中的适应性传代培养及蚀斑纯化 |
| 3.3 CVA10代表株在Vero细胞、KMB17细胞内的动态增殖 |
| 3.4 CVA10代表株的乳鼠致病性分析 |
| 3.4.1 CVA10攻毒后乳鼠临床症状 |
| 3.4.2 CVA10毒株的乳鼠组织噬性 |
| 3.5 代表毒株V6-19/XY/CHN/2017的免疫原性分析 |
| 3.6 代表毒株V6-19/XY/CHN/2017的遗传稳定性分析 |
| 3.7 CVA10代表株基因序列及氨基酸序列比较分析 |
| 第四章 讨论 |
| 4.1 CVA10病毒的分离培养及基因型鉴定 |
| 4.2 CVA10分离株在Vero细胞、KMB17细胞中的适应性传代培养 |
| 4.3 CVA10代表株在Vero细胞、KMB17细胞内的动态增殖 |
| 4.4 CVA10代表株的乳鼠致病性分析 |
| 4.5 代表毒株V6-19/XY/CHN/2017的免疫原性分析 |
| 4.6 代表毒株V6-19/XY/CHN/2017的遗传稳定性分析 |
| 第五章 结论 |
| 第六章 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
（7）同时识别1和3型鸭甲肝病毒的单抗及胶体金试纸条研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 常用英文缩写词汇 |
| 文献综述 |
| 1. 鸭病毒性肝炎研究进展概况 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 鸭病毒性肝炎的历史与分布 |
| 1.3 鸭肝炎病毒的病原学 |
| 1.4 流行病学 |
| 1.5 临床症状和病理变化 |
| 1.6 DHAV分子生物学 |
| 1.7 鸭肝炎病毒的诊断 |
| 1.7.1 根据临床症状进行初步诊断 |
| 1.7.2 分子生物学诊断 |
| 1.7.3 血清学诊断 |
| 2. 单克隆抗体技术 |
| 3. 胶体金的研究概况及应用 |
| 4. 选题目的和意义 |
| 第一章 鸭甲型肝炎病毒单克隆抗体的制备及鉴定 |
| 1. 材料 |
| 1.1 细胞、菌株与毒株 |
| 1.2 试验动物 |
| 1.3 试剂、材料 |
| 1.4 主要试剂的配制 |
| 1.4.1 细胞培养试剂 |
| 1.4.2 ELISA相关试剂的配制 |
| 1.4.3 SDS-PAGE电泳相关溶液 |
| 1.5 仪器设备 |
| 2. 试验方法 |
| 2.1 DHAV-1单克隆抗体的制备 |
| 2.1.1 DHAV-1抗原的制备及纯化 |
| 2.1.2 免疫方法 |
| 2.1.3 检测DHAV-1抗体间接ELISA方法的建立 |
| 2.1.4 SP2/0小鼠骨髓瘤细胞的培养 |
| 2.1.5 饲养层细胞、免疫小鼠脾细胞的制备 |
| 2.1.6 细胞融合 |
| 2.1.7 杂交瘤细胞的筛选及亚克隆 |
| 2.1.8 杂交瘤细胞的传代、冻存及复苏 |
| 2.1.9 单克隆抗体的大量制备 |
| 2.1.10 单克隆抗体的纯化 |
| 2.2 单克隆抗体特性鉴定 |
| 2.2.1 单克隆抗体亚型的鉴定 |
| 2.2.2 单克隆抗体特异性鉴定 |
| 2.2.3 杂交瘤细胞稳定性测定 |
| 2.2.4 各株单抗ELISA效价测定 |
| 2.2.5 单抗识别抗原位点的相加试验分析 |
| 2.2.6 单抗亲和常数的测定 |
| 3. 结果 |
| 3.1 基于DHAV-1全病毒的间接ELISA方法的构建 |
| 3.1.1 最佳抗原包被浓度和血清稀释度的条件优化 |
| 3.1.2 最佳酶标抗体浓度 |
| 3.1.3 最佳封闭液、封闭时间的优化 |
| 3.1.4 包被条件的确定 |
| 3.1.5 显色时间的确定 |
| 3.1.6 血清孵育时间的确定 |
| 3.1.7 二抗孵育时间的确定 |
| 3.1.8 临界值的确定 |
| 3.2 脾细胞、饲养细胞及SP2/0细胞 |
| 3.3 细胞融合 |
| 3.4 腹水单抗的制备和纯化 |
| 3.5 抗体亚类鉴定 |
| 3.6 细胞培养上清及腹水效价的测定 |
| 3.7 杂交瘤细胞株的稳定性 |
| 3.8 特异性 |
| 3.9 单抗亲和常数的测定 |
| 3.10 单抗抗原表位的初步鉴定 |
| 4. 讨论 |
| 4.1 病毒纯化 |
| 4.2 细胞融合及筛选 |
| 4.3 单抗特性 |
| 第二章 检测1和3型鸭甲肝病毒胶体金试纸条的研制 |
| 1. 材料 |
| 1.1 毒株与菌株 |
| 1.2 试剂、材料 |
| 1.3 主要试剂的配置 |
| 1.4 仪器设备 |
| 2. 试验方法 |
| 2.1 玻璃器皿的清洁 |
| 2.2 胶体金颗粒质量鉴定 |
| 2.2.1 肉眼观测 |
| 2.2.2 紫外扫描鉴定 |
| 2.3 待标记抗体的处理 |
| 2.4 金标单克隆抗体的制备和纯化 |
| 2.4.1 最适标记K_2CO_3的量 |
| 2.4.2 单克隆抗体最适稳定量 |
| 2.4.3 单克隆抗体的胶体金标记 |
| 2.4.4 金标单克隆抗体的纯化 |
| 2.5 试纸条最佳试验条件的优化 |
| 2.5.1 纯化的兔抗DHAV-1 IgG的包被浓度的确定 |
| 2.5.2 羊抗鼠IgG的包被浓度的确定 |
| 2.5.3 胶体金标记的单克隆抗体的稀释度的确定 |
| 2.5.4 试纸条组成材料的选择 |
| 2.6 胶体金试纸的组装 |
| 2.7 检测程序与结果判定 |
| 2.7.1 鸭胚尿囊液或者菌体培养液的处理 |
| 2.7.2 样品的处理 |
| 2.7.3 样品检测的结果判定 |
| 2.8 胶体金试纸条的检测 |
| 2.8.1 胶体金试纸条的灵敏性试验 |
| 2.8.2 胶体金试纸条的特异性试验 |
| 2.8.3 胶体金试纸条的重复性试验 |
| 2.8.4 胶体金试纸条的保存期试验 |
| 2.8.5 临床样品的检测 |
| 3. 结果 |
| 3.1 胶体金溶液质量鉴定 |
| 3.2 胶体金标记抗DHAV-1单抗复合物的鉴定 |
| 3.3 金标抗体的优化 |
| 3.3.1 胶体金最佳标记K_2CO_3的量的确定 |
| 3.3.2 胶体金最佳标记蛋白量 |
| 3.4 试纸条的优化 |
| 3.4.1 C线浓度的优化 |
| 3.4.2 金标抗体浓度的优化 |
| 3.4.3 T线浓度优化 |
| 3.4.4 NC膜的选择 |
| 3.4.5 玻璃纤维素膜的选择 |
| 3.4.6 样品垫的选择 |
| 3.4.7 NC膜封闭时间的确定 |
| 3.5 胶体金试纸条的检测 |
| 3.5.1 重复性 |
| 3.5.2 特异性 |
| 3.5.3 稳定性 |
| 3.5.4 灵敏度 |
| 3.5.5 临床样本的检测 |
| 4. 讨论 |
| 4.1 胶体金试纸条的优化 |
| 4.1.1 抗体的选择 |
| 4.1.2 NC膜的优化 |
| 4.1.3 金标的优化 |
| 4.2 胶体金试纸条性能的检测 |
| 4.3 临床样本的检测 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（8）鸭1型甲肝病毒亚型VP3蛋白间接ELISA方法的建立及其单克隆抗体的制备（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 鸭甲型肝炎病毒的命名 |
| 1.2 鸭甲型病毒性肝炎的流行病学调查 |
| 1.3 鸭甲型病毒性肝炎的病原学 |
| 1.3.1 形态结构 |
| 1.3.2 理化特性 |
| 1.3.3 增殖培养特性 |
| 1.3.4 分子生物学特性 |
| 1.4 鸭甲型病毒性肝炎的临床症状与病变 |
| 1.4.1 经典型鸭甲型病毒性肝炎的临床症状与病变 |
| 1.4.2 胰腺炎型鸭甲型病毒性肝炎的临床症状与病变 |
| 1.5 鸭甲型病毒性肝炎的诊断学 |
| 1.5.1 DHAV-1 的生化指标 |
| 1.5.2 DHAV-1 的分离 |
| 1.5.3 DHAV-1 的诊断方法 |
| 1.6 鸭甲型病毒性肝炎的防控 |
| 1.6.1 弱毒疫苗 |
| 1.6.2 灭活苗 |
| 1.6.3 亚单位疫苗 |
| 1.6.4 高免血清和卵黄抗体 |
| 1.7 研究的目的及意义 |
| 第二章 鸭1型甲肝病毒亚型VP3基因的克隆与序列分析 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 毒株、菌种、载体和血清 |
| 2.1.2 工具酶及试剂 |
| 2.1.3 试验试剂的配置 |
| 2.1.4 试验仪器设备 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 DHAV-1a VP3基因的引物设计 |
| 2.2.2 病毒RNA的提取 |
| 2.2.3 DHAV-1a VP3基因的RT-PCR |
| 2.2.4 PCR产物的胶回收 |
| 2.2.5 VP3克隆质粒的构建 |
| 2.2.6 pEASY-VP3克隆质粒的提取及鉴定 |
| 2.2.7 DHAV-1a VP3蛋白序列分析 |
| 2.2.8 pET-32a-VP3表达质粒的构建与鉴定 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 DHAV-1aVP3基因的扩增与鉴定 |
| 2.3.2 DHAV-1aVP3蛋白的抗原位点分析 |
| 2.3.3 DHAV-1a VP3蛋白的核苷酸同源性、氨基酸同源性分析 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 鸭1型甲肝病毒亚型VP3蛋白的原核表达及纯化 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.1.1 毒株、菌种、载体和血清 |
| 3.1.2 工具酶及生化试剂 |
| 3.1.3 试验试剂的配置 |
| 3.1.4 试验仪器设备 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 DHAV-1a VP3蛋白的诱导表达 |
| 3.2.2 His-VP3融合蛋白的SDS-PAGE电泳分析 |
| 3.2.3 His-VP3融合蛋白诱导表达条件的优化 |
| 3.2.4 VP3蛋白的Western-blot鉴定 |
| 3.3 实验结果与分析 |
| 3.3.1 His-VP3融合蛋白的诱导表达 |
| 3.3.2 诱导时间的优化 |
| 3.3.3 IPTG浓度的优化 |
| 3.3.4 诱导温度的优化 |
| 3.3.5 融合蛋白的可溶性分析 |
| 3.3.6 融合蛋白纯化结果 |
| 3.3.7 VP3蛋白的Western-blot鉴定 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 表达系统的选择 |
| 3.4.2 原核表达载体的选择 |
| 3.4.3 宿主菌 |
| 3.4.4 VP3蛋白原核表达的存在形式 |
| 第四章 鸭1型甲肝病毒亚型VP3蛋白间接ELISA检测方法的建立 |
| 4.1 试验材料 |
| 4.1.1 所用血清 |
| 4.1.2 试验试剂 |
| 4.1.3 试验用液 |
| 4.1.4 试验仪器 |
| 4.2 鸭1型甲肝病毒亚型VP3蛋白间接ELISA检测方法的建立 |
| 4.2.1 最佳抗原稀释倍数与血清稀释倍数的确定 |
| 4.2.2 最佳血清反应时间的确定 |
| 4.2.3 羊抗鸭IgG-HRP二抗工作时间的确定 |
| 4.2.4 最佳显色时间的确定 |
| 4.2.5 临界值的确定 |
| 4.2.6 特异性试验 |
| 4.2.7 重复性试验 |
| 4.3 间接ELISA方法检测临床样品 |
| 4.4 实验结果及分析 |
| 4.4.1 最佳的抗原与血清稀释倍数的确定 |
| 4.4.2 血清最佳作用时间的确定 |
| 4.4.3 HRP标记的羊抗鸭IgG最佳反应浓度的确定 |
| 4.4.4 HRP标记的羊抗鸭IgG最佳反应时间的确定 |
| 4.4.5 最佳显色时间的确定 |
| 4.4.6 临界值的确定 |
| 4.4.7 特异性试验 |
| 4.4.8 重复性试验 |
| 4.5 讨论 |
| 第五章 鸭1型甲肝病毒亚型VP3蛋白单克隆抗体的制备 |
| 5.1 试验材料及试剂 |
| 5.1.1 试验细胞及动物 |
| 5.1.2 主要试剂 |
| 5.1.3 试验用液 |
| 5.1.4 仪器设备 |
| 5.2 VP3-SP2/0 杂交瘤细胞的制备 |
| 5.2.1 VP3蛋白抗原制备 |
| 5.2.2 小鼠的免疫 |
| 5.2.3 间接ELISA方法检测鼠血清抗体效价 |
| 5.2.4 饲养层细胞的制备 |
| 5.2.5 骨髓瘤细胞的准备 |
| 5.2.6 免疫小鼠脾细胞悬液的制备 |
| 5.2.7 细胞融合 |
| 5.3 VP3-SP2/0 阳性杂交瘤细胞的筛选 |
| 5.4 VP3-SP2/0 阳性杂交瘤细胞的亚克隆 |
| 5.5 杂交瘤细胞的冻存、复苏及鉴定 |
| 5.5.1 冻存 |
| 5.5.2 复苏 |
| 5.5.3 亚型鉴定 |
| 5.5.4 特异性试验 |
| 5.5.5 Western-blot鉴定 |
| 5.6 单克隆抗体腹水的制备及效价测定 |
| 5.6.1 腹水的制备 |
| 5.6.2 腹水效价测定 |
| 5.7 结果与分析 |
| 5.7.1 最佳抗原包被浓度及血清稀释倍数的确定 |
| 5.7.2 最佳血清作用时间 |
| 5.7.3 最佳羊抗鼠酶标二抗作用时间 |
| 5.7.4 鼠阴性血清的ELISA检测结果 |
| 5.7.5 免疫小鼠血清抗体效价的测定 |
| 5.7.6 杂交瘤的培养观察 |
| 5.7.7 杂交瘤细胞的筛选 |
| 5.7.8 亚型鉴定 |
| 5.7.9 特异性试验 |
| 5.7.10 杂交瘤细胞的western-blot检测结果 |
| 5.7.11 腹水效价的测定 |
| 5.8 讨论 |
| 5.8.1 影响融合率的因素 |
| 5.8.2 融合细胞的筛选 |
| 5.8.3 饲养细胞的影响 |
| 5.8.4 亚克隆时间的选择宜早 |
| 5.8.5 单抗腹水效价的比较 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 作者简介 |
（9）胰腺炎型鸭1型甲肝病毒VP1蛋白单克隆抗体的制备（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 DHAV-1的流行特点及分布情况 |
| 1.2 鸭1型甲肝病毒的理化特性及生物学特性 |
| 1.3 鸭1型甲型肝炎病毒的特性和基因组结构 |
| 1.3.1 鸭1型甲肝病毒非编码区 |
| 1.3.2 鸭1型甲肝病毒编码区 |
| 1.4 鸭1型甲肝病毒的检测方法 |
| 1.4.1 中和试验 |
| 1.4.2 HA和HI试验 |
| 1.4.3 ELISA试验 |
| 1.4.4 荧光抗体法 |
| 1.4.5 胶体金法 |
| 1.4.6 RT-PCR技术 |
| 1.4.7 PCR-DHPLC |
| 1.4.8 RT-LAMP |
| 1.5 单克隆抗体技术 |
| 1.6 小结 |
| 2. 胰腺炎型DHAV-1的VP1基因的原核表达及鉴定 |
| 2.1 实验材料及试剂 |
| 2.1.1 实验病毒及试剂 |
| 2.1.2 常用溶液的配置 |
| 2.1.3 实验仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 引物设计 |
| 2.2.2 目的基因的PCR扩增 |
| 2.2.3 PCR产物的回收与克隆 |
| 2.2.4 VP1重组蛋白的诱导表达条件的优化 |
| 2.2.5 VP1蛋白的可溶性分析 |
| 2.2.6 VP1蛋白的Western-blot鉴定 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 VP1蛋白抗原表位的预测及序列分析 |
| 2.3.1.1 VP1蛋白的抗原预测 |
| 2.3.1.2 VP1蛋白的亲水性结构 |
| 2.3.1.3 VP1蛋白的表面概率结构 |
| 2.3.2 VP1基因的PCR扩增及双酶切鉴定 |
| 2.3.3 VP1蛋白表达条件的优化 |
| 2.3.4 VP1蛋白的可溶性分析结果 |
| 2.3.5 胰腺炎型鸭1型甲肝病毒VP1蛋白的Western-blot检测 |
| 2.4 讨论 |
| 3. 胰腺炎型鸭1型甲肝病毒VP1蛋白单克隆抗体的制备 |
| 3.1 实验材料及试剂 |
| 3.1.1 实验细胞及动物 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 实验用液 |
| 3.1.4 仪器设备 |
| 3.2 单克隆抗体的制备 |
| 3.2.1 小鼠的免疫 |
| 3.2.2 胰腺炎型DHAV-1抗体的间接ELISA检测方法的建立 |
| 3.2.3 饲养层细胞的制备 |
| 3.2.4 骨髓瘤细胞的准备 |
| 3.2.5 脾细胞的制备 |
| 3.2.6 细胞融合 |
| 3.2.7 阳性杂交瘤细胞的克隆 |
| 3.2.8 杂交瘤细胞的冻存和复苏 |
| 3.2.9 杂交瘤细胞的鉴定 |
| 3.2.10 单克隆抗体腹水制备 |
| 3.2.11 单克隆抗体腹水效价测定 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 检测胰腺炎型DHAV-1抗体的间接ELISA的建立 |
| 3.3.1.1 纯化的胰腺炎型鸭1型甲肝病毒的蛋白定量 |
| 3.3.1.2 最佳抗原稀释度及最佳血清稀释度的确定 |
| 3.3.1.3 抗原最佳包被条件的确定 |
| 3.3.1.4 最佳血清工作时间的确定 |
| 3.3.1.5 酶标二抗最佳工作时间的确定 |
| 3.3.1.6 临界值的确定 |
| 3.3.1.7 免疫小鼠血清中的肝炎抗体效价水平的测定 |
| 3.3.2 杂交瘤细胞株的建立 |
| 3.3.3 稳定性鉴定结果 |
| 3.3.4 杂交瘤细胞的扩大培养 |
| 3.3.5 Western-blot鉴定结果 |
| 3.3.6 单克隆抗体的鉴定结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 抗原的选择与制备 |
| 3.4.2 免疫动物的选择 |
| 3.4.3 免疫办的确定 |
| 3.4.4 饲养细胞 |
| 3.4.5 细胞融合 |
| 3.4.6 单克隆抗体效价比较 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（10）甲型肝炎病毒单克隆抗体细胞株的建立及鉴定（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 方法 |
| 1.3.1 抗原注射 |
| 1.3.2 融合实验 |
| 1.3.3 检测与染色 |
| 1.4 检测指标 |
| 1.4.1 稳定性检测 |
| 1.4.2 特异性检测 |
| 1.4.3 交叉反应 |
| 1.5 统计学处理 |
| 2 结果 |
| 2.1 McAb细胞株的建立 |
| 2.2 McAb杂交瘤细胞的鉴定 |
| 2.2.1 稳定性 |
| 2.2.2 特异性 |
| 2.2.3 效价 |
| 2.2.4 交叉反应 |
| 3 讨论 |
四、甲型肝炎病毒克隆抗体细胞株的建立及应用（论文参考文献）
- [1]交叉中和血清1型和血清3型鸭甲肝病毒单克隆抗体的制备与鉴定[J]. 刘燕,汤承,岳华,王远微. 畜牧兽医学报, 2021(07)
- [2]MHC单倍型鸭胚肝间充质干细胞的建立及应用[D]. 佟相慧. 中国农业科学院, 2020(01)
- [3]猪源唾液酸黏附素介导PRRS病毒感染Marc145细胞的适应性研究[D]. 常艳燕. 甘肃农业大学, 2020(01)
- [4]交叉中和基因A型和基因C型鸭甲肝病毒单克隆抗体的制备与鉴定[D]. 刘燕. 西南民族大学, 2019(03)
- [5]甲肝病毒YN5株在Walvax-2细胞上适应的遗传稳定性研究[D]. 杨燕羽. 昆明医科大学, 2019(06)
- [6]柯萨奇A组10型病毒株的传代适应及其代表株的生物学特性分析[D]. 张捷. 北京协和医学院, 2019(02)
- [7]同时识别1和3型鸭甲肝病毒的单抗及胶体金试纸条研究[D]. 杨旸. 四川农业大学, 2016(04)
- [8]鸭1型甲肝病毒亚型VP3蛋白间接ELISA方法的建立及其单克隆抗体的制备[D]. 黄剑梅. 江西农业大学, 2016(03)
- [9]胰腺炎型鸭1型甲肝病毒VP1蛋白单克隆抗体的制备[D]. 刘伟. 福建农林大学, 2015(08)
- [10]甲型肝炎病毒单克隆抗体细胞株的建立及鉴定[J]. 黄建锋,邓德坚,张晓琼. 海南医学, 2011(21)