一、乙型肝炎病毒S基因经显微注射导入SMMC-7721细胞核内的表达（论文文献综述）
韦武均[1]（2020）在《反基因锁核酸抑制转基因小鼠体内乙肝病毒编码链C基因表达研究》文中研究说明第一章HBV C编码链反基因锁核酸设计、筛选及鉴定目的:针对乙肝病毒（hepatitis B virus,HBV）编码链C基因设计合成反基因锁核酸（locked nucleic acid,LNA）片段,以HBV转基因小鼠为研究对象,筛选出最佳给药剂量、给药途径和给药方式。方法:针对乙肝病毒编码链C基因24042418 nt位点,利用RNAstructure 5.0软件设计合成反基因LNA片段5ˊ-CGA*CGCGGCGA*T*TGA*-3ˊ,设置不同给药剂量组、给药途径组和给药方式组,以阳离子聚合物介导转染HBV转基因小鼠,分别于给药前、给药后1、3、5和7 d,采集眼眶静脉血,采用PCR荧光探针法和磁微粒化学发光法检测血清HBV DNA和HBs Ag、HBe Ag含量。采用单链特异性核酸内切酶酶切实验鉴定LNA片段稳定性。结果:给药后第7d,0.5μg/g剂量组、尾静脉注射组和1次/48h给药组对病毒HBV DNA复制和HBs Ag、HBe Ag表达抑制效果较明显,HBV DNA复制抑制率分别为57.09%、56.61%和57.22%,HBs Ag表达抑制率分别为49.29%、48.65%和48.41%,HBe Ag分别为71.72%、69.95%和69.44%。LNA抗核酸酶降解能力较强。结论:LNA片段5ˊ-CGA*CGCGGCGA*T*TGA*-3ˊ的最佳给药剂量为0.5μg/g,给药途径为尾静脉注射,给药方式为1次/48h。第二章反基因锁核酸抑制转基因小鼠体内乙肝病毒编码链C基因表达目的:探讨针对乙肝病毒编码链C基因24042418 nt位点的反基因LNA在HBV转基因小鼠体内的抗病毒效果。方法:将30只HBV转基因小鼠完全随机分为5组,每组6只,分别为5%GLU空白对照组、无关序列对照组、拉米夫定对照组、反义LNA对照组和反基因LNA实验组,采用尾静脉注射法对5%GLU空白对照组、无关序列对照组、反义LNA对照组和反基因LNA实验组给药,采用连续灌胃法对拉米夫定对照组给药,分别于给药前、给药后1、3、5和7 d,采集眼眶静脉血,采用PCR荧光探针法和磁微粒化学发光法检测血清HBV DNA和HBs Ag、HBe Ag含量,利用RT-PCR法和免疫组化技术检测肝脏HBV Cm RNA和HBs Ag、HBe Ag表达水平。通过HE染色和血常规、生化指标判断反基因LNA对肝肾细胞结构和功能的改变。结果:给药后第1、3、5和7d,反基因LNA组对HBV DNA复制和HBs Ag、HBe Ag表达均有较明显的抑制效果,HBV DNA复制抑制率分别为20.68%、45.66%、52.33%和55.68%,HBs Ag表达抑制率分别为20.44%、36.17%、44.90%和47.87%,HBe Ag分别为35.65%、54.29%、65.08%和72.67%,与对照组比较,差异有统计学意义,P<0.05;肝脏HBV C m RNA相对表达量和HBs Ag、HBcAg阳性细胞率为0.36和38.20%、32.50%,与对照组比较,差异有统计学意义,P<0.05。HE染色和血常规、生化指标未发现肝肾细胞结构和功能有明显改变。结论:乙肝病毒编码链C基因24042418 nt位点是反基因LNA治疗的有效靶点。
陈雪梅[2]（2019）在《顺铂通过激活ROS/JNK和抑制Akt/mTOR通路诱导乙型肝炎病毒再激活的分子机制研究》文中指出目的:乙型肝炎病毒（HBV）感染是一个严重的全球性公共卫生问题。据世界卫生组织报道,全世界约有3.5亿人患有慢性HBV感染,慢性HBV感染是肝细胞癌（HCC）发生的主要原因。一般情况下,慢性HBV感染者和无症状HBV携带者极少发生HBV再激活现象,但患者若接受化疗或免疫抑制治疗肿瘤时,则很可能使肝细胞内静息状态或是低复制状态的HBV大量活化,HBV病毒的大量复制引起肝功能损伤,甚至导致急性肝炎、急性重症肝炎、急性肝衰竭等严重的临床问题。临床上大量数据表明,在化疗药物的使用过程中出现HBV再激活现象,但是化疗药物诱导HBV再激活的具体分子机制至今仍不清楚,因此需要进一步研究。细胞自噬（autophagy）是通过依赖溶酶体去除受损细胞器和长寿命蛋白质一种分解代谢过程,以维持细胞稳态。自噬在许多生理和病理生理过程中起着至关重要的作用。自噬在病毒复制的过程中发挥着“双刃剑”的作用,一方面,自噬可以响应细胞压力,如营养物质剥夺,未折叠的蛋白质反应（UPR）,危险相关分子模式（DAMP）,缺氧,氧化还原应激和线粒体损伤。病毒可以在复制周期的不同阶段触发许多这些刺激诱导自噬,自噬可能作为抗病毒途径发挥作用。另一方面,自噬在病毒复制生命周期中发挥的有益作用,病毒可以逃避抗病毒先天免疫,从而增强其复制。研究表明,病毒感染可能与自噬过程有着复杂的相互联系,主要有以下三个主要结果:（1）自噬被用作促进病毒复制的支架;（2）病毒破坏或抑制自噬过程以促进病毒复制;（3）自噬抑制病毒复制。顺铂是一种有效的化疗药物,常用于治疗各种类型的癌症,包括淋巴瘤,肉瘤,卵巢癌,宫颈癌,小细胞肺癌和膀胱癌等。已有临床报道HBV再激活是使用顺铂等化疗药物严重的并发症之一。病毒复制后宿主免疫功能受损被认为是导致化疗相关HBV再激活的首要因素,但是研究报道HBV再激活发生在化疗早期,表明除了扰乱免疫和病毒复制之间的平衡机制,化疗药物可能直接刺激HBV再激活。因此,化疗药物或免疫抑制剂相关的HBV再激活的潜在的机制需要进一步研究,将为HBV再激活的预防和治疗提供新思路和理论依据。课题组前期实验中,已经在HBV稳定表达的细胞模型和HBV转基因小鼠模型中证实了顺铂可以促进HBV复制和HBV病毒蛋白的合成,因此本实验主要研究顺铂诱导HBV再激活的具体分子机制。实验方法:1、在HepAD38和HepG2-HBV1.3细胞中,采用ELISA、RealTime PCR、Southern blot、Western blot方法检测顺铂作用后HBV病毒复制水平。2、在HepAD38和HepG2-HBV1.3细胞中,采用Western blot、激光共聚焦的方法检测自噬蛋白和HBV病毒蛋白的表达水平,进一步联合使用自噬抑制剂氯喹（Chloroquine diphosphate salt,CQ）、3-甲基腺嘌呤（3-Methyladenine,3-MA）和siATG5阻断自噬后检测HBV复制水平,分析顺铂、自噬和HBV复制的关系。3、采用激光共聚焦显微镜检测顺铂处理细胞后细胞内ROS水平,进一步顺铂联合氧化应激抑制剂N-乙酰半胱氨酸（NAC）,采用ELISA、Real-Time PCR、Southern blot、Western blot等实验,检测自噬水平和HBV病毒复制水平。4、运用Western blot实验及查阅文献,筛选了MAPKs通路相关的信号分子,联合使用shJNK、NAC、SC79和MK2206探索顺铂促进HBV复制的具体分子机制。5、HBV转基因小鼠模型实验验证顺铂促进HBV复制。腹腔注射氯喹或者饮水喂N-乙酰半胱氨酸处理小鼠两天,再联合顺铂连续注射五天,48小时后收集血清和肝组织采用ELISA、Real-Time PCR、激光共聚焦显微镜、Western blot、Southern blot以及IHC等实验方法检测。结果:1、顺铂处理HepAD38和HepG2-HBV1.3细胞后,实验结果显示,与对照组相比,Cisplatin组细胞上清中HBsAg和HBeAg水平、3.5kb mRNA水平、HBV DNA水平、HBV复制中间体以及细胞内HBsAg和HBcAg蛋白含量均明显升高。说明顺铂在体外促进HBV复制。2、采用Western blot和激光共聚焦检测顺铂作用后自噬水平变化,Western blot结果显示:与对照组相比,顺铂作用后LC3I/II蛋白水平呈浓度依赖方式增加,p62呈时间依赖方式降低;激光共聚焦实验显示:与对照组相比,RFP-LC3 puncta和GFP-LC3 puncta均明显增加,但是RFP-LC3 puncta较GFP-LC3 puncta增加更加明显。说明顺铂在体外可以促进完整自噬。采用顺铂进一步联合使用自噬抑制剂CQ、3-MA和siATG5抑制自噬后,Western blot结果显示:自噬水平降低和HBV复制水平均降低。3、顺铂处理HepAD38和HepG2-HBV1.3细胞后,采用激光共聚焦显微镜检测ROS水平,结果显示顺铂明显增强了细胞内ROS水平。进一步采用氧化应激抑制剂NAC,Western blot结果显示:与Cisplatin组相比,Cisplatin+NAC组发现LC3、HBsAg和HBcAg蛋白水平降低;ELISA结果显示,与Cisplatin组相比,Cisplatin+NAC组细胞上清中HBsAg和HBeAg水平降低;Real-Time PCR结果显示:与Cisplatin组相比,Cisplatin+NAC组3.5kb mRNA和HBV DNA水平降低;Southern blot结果显示:与Cisplatin组相比,Cisplatin+NAC组HBV复制中间体水平降低。以上结果说明顺铂通过ROS诱导自噬,抑制ROS会降低顺铂诱导HBV再激活的作用。4、采用Western blot方法筛选了MAPKs通路相关的信号分子,结果显示:Cisplatin作用后,p-JNK表达增加,p-mTOR和p-AKT表达降低,p-p38无明显变化。采用NAC与Cisplatin联合处理,与Cisplatin组相比,p-JNK蛋白水平表达降低,p-AKT、AKT、p-mTOR、mTOR无明显变化。进一步使用shJNK或SC79（AKT诱导剂）与Cisplatin联合处理均可部分逆转Cisplatin诱导的自噬和HBV复制水平,而ROS水平无变化;使用MK2206（AKT抑制剂）与Cisplatin联合处理可促进Cisplatin诱导的自噬蛋白和HBV病毒蛋白,而ROS水平无变化。以上结果说明说明顺铂通过ROS上调JNK和抑制AKT/mTOR信号激活自噬并诱导HBV再激活。5、在HBV转基因小鼠模型中,顺铂促进HBV复制、HBV病毒蛋白合成和诱导炎症,同时顺铂促进ROS水平、MDA水平和自噬水平增加。用ROS抑制剂NAC或自噬抑制剂CQ预处理可以逆转顺铂诱导自噬增强HBV复制,而CQ不影响顺铂诱导的ROS水平增加。结论:在本课题中,我们在HBV复制细胞模型和HBV小鼠模型中证实顺铂促进HBV再激活,从分子水平解析了顺铂通过ROS上调JNK/p-38、抑制AKT/mTOR信号诱导自噬促进HBV复制,为探索HBV再激活的分子机制提供了新的思路。
郑金伟[3]（2019）在《MAPK抑制剂增强体外HBV感染作用和机制的初步探索》文中研究表明乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）的慢性感染仍是危害人类健康的公共卫生问题之一,尽管预防性疫苗的普及显着减少了乙型肝炎病毒新发感染,但目前全球仍有超过2.57亿慢性HBV感染者需要及时有效的治疗。由于目前现有的治疗策略只能控制病毒的复制而难以完全治愈慢乙肝,因此开发更为有效的新型药物是迫切而必要的。新药的研发有赖于对HBV生物学和HBV与宿主相互作用的深入认识,这些研究的实施都需要能模拟HBV完整生命周期的体外细胞模型和体内动物模型的构建和发展。其中细胞模型是最常用且方便的用于体外研究HBV的感染和复制、HBV与宿主之间的相互作用、筛选和评价抗HBV药物的重要平台。本团队之前构建了两株细胞模型:HepG2-N10和HepG2-hNTCP（2B1）。其中HepG2-N10是在HepG2细胞中稳定整合了1.1倍体A基因型的HBV基因组,可以支持HBV复制和用于药物筛选和评价。另外HepG2-hNTCP（2B1）可以支持HBV感染和cccDNA形成,但是感染所需病毒剂量高且感染阳性率低,仅为20%～30%,同时感染时依赖PEG。本研究对MAPK抑制剂库进行筛选,旨在优化HepG2-hNTCP细胞感染模型,提高其感染效率和摆脱PEG的约束。同时寻找限制鼠肝细胞不能支持HBV感染的因子,进而构建支持HBV感染且免疫功能健全的小鼠模型。本研究同时在复制模型HepG2-N10和感染模型HepG2-hNTCP上对140种MAPK抑制剂进行筛选,结果发现两种模型得到的结果差异显着。同时进行抗原水平相关性分析没有发现两种模型得到的结果有明显相关性。感染模型可以支持HBV感染,其病毒以类似自然感染状态进行复制,更符合HBV的生理。因此,可以说明复制模型用于药物筛选和评价的结果需要进一步验证。本研究在2B1细胞模型中对140种MAPK抑制剂进行初步筛选,结果发现了30种MAPK抑制剂在感染后第六天加药处理能够增强HBV复制。进一步分析这30种MAPK抑制剂在感染前加入并持续添加对HBV感染的影响,结果显示有12种促进HBV感染效果显着。同时仅在感染前处理24小时,发现SCH772984,Trametinib,PD184352和Cobimetinib这四种MAPK抑制剂就能非常显着的提升HBV感染水平,其中HBeAg均提高了5倍以上,HBsAg均提高了10倍以上。此外,本研究对这些MAPK抑制剂促进HBV感染的机制进行了初步探索。根据是否上调NTCP表达可将这些MAPK抑制剂分为NTCP途径依赖型和非NTCP依赖型。B-Raf IN1为NTCP途径依赖型的MAPK抑制剂,可以增强HBV的感染,特别是对cccDNA。对B-Raf IN1处理后的2B1细胞进行转录组测序,结果显示B-Raf IN1可增强NTCP的表达,另外与HBV感染和复制相关的宿主基因也有不同程度提高。目前己对上调的JunB基因进行了验证,发现过表达JunB可增强HBV在2B1细胞中的感染以及敲低后抑制HBV的感染,因此可以推出B-Raf IN1促进HBV感染与增强JunB的表达有关。但是JunB本身是一种转录因子,并不能直接作用于HBV。因此仍需寻找与HBV感染更关键的因子。其他与HBV感染相关的宿主基因仍在验证当中。此外,针对非NTCP依赖型的MAPK抑制剂,我们首先猜想是否2B1细胞表面存在其他能与HBV结合的受体。因此,我们进行了 HBsAg结合实验,结果显示B-Raf IN-1d,Pimasertib,Selumetinib,PD0325901,SCH772984,Trametinib,TAK632和Cobimetinib能够明显增强HBsAg阳性率,说明这些MAPK抑制剂诱导了细胞表面某种能与HBsAg结合的蛋白,从而促进HBV的感染。进一步我们筛选了其中几个进行转录组测序,涉及HBV感染相关的宿主基因正在验证中。综述所述,本研究在HepG2-hNTCP细胞模型中筛选出了几种能显着促进HBV感染了MAPK抑制剂并对其作用机制进行了初步探索。为构建更优的体外细胞感染模型提供了可能。
郭斌[4]（2015）在《葛花解酲方对乙醇性HBV转基因小鼠肝癌癌前病变相关因子的影响》文中指出目的：在既往研究的基础上专门针对乙型肝炎病毒（hepatitis B virus, HBV）感染同时饮酒的肝癌高危人群,建立乙醇性HBV转基因小鼠肝癌癌前病变模型,为肝癌癌前病变动物模型的建立探索新的方法,为深入研究肝癌发生发展的分子生物学机制奠定基础；并对肝癌癌前病变模型小鼠灌服葛花解酲方进行早期干预,观察模型小鼠丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、谷胱甘肽S转移酶（GST）、Y谷氨酰转移酶（GGT）在血清中的表达水平及对细胞周期蛋白D1 （CyclinDl）、细胞周期蛋白依赖性激酶4（CDK4）及p27表达的影响。方法：1.肝癌癌前病变小鼠模型的建立：将32只HBV转基因小鼠和32只同月龄同品系BALB/c普通小鼠适应性喂养5天后,HBV转基因小鼠和BALB/c普通小鼠各随机分为16周、22周对照组,16周、22周模型组,每组8只。模型组给予53%（v/v）红星二锅头白酒剂量为l0ml/（kg·d）灌胃,每天一次；对照组给予等体积蒸馏水灌胃,每天一次。饲养期间采用清洁饲料喂养,小鼠自由进食、饮水,每5天称一次体重,根据体重变化调整灌胃剂量。小鼠分别于第16、22周末进行取材,取材前24h对小鼠禁食不禁水,采取摘除眼球取血,颈椎脱臼处死小鼠,处死后立即取小鼠的肝脏,称重后用4%多聚甲醛固定；取胸腺称重,计算胸腺指数；实验过程中观察小鼠的活动情况、精神状态、皮毛光泽度、食欲等。2.葛花解酲方对乙醇性HBV转基因小鼠肝癌癌前病变相关因子的影响：将24只HBV转基因小鼠适应性喂养5天后,随机分为对照组、模型组和治疗组,每组8只。根据动物药理实验用药折算方法,以成人常规用量折算实验小鼠用药量及课题组前期实验研究得出,给药组按0.4g（生药）/10g（体质量）葛花解酲方水煎剂灌胃,体积为5ml/kg,对照组和模型组给予等体积蒸馏水,每天一次；30min后治疗组和模型组给予53%（v/v）二锅头白酒,l0ml/kg,每日一次,对照组给予等体积蒸馏水。小鼠自由进食、饮水,每5天称一次体重,根据体重变化调整灌胃剂量,各组小鼠于第22周末进行取材,取材前24h对小鼠禁食不禁水,摘除眼球取血,采取血液并分离血清,进行生化指标测定,颈椎脱臼处死小鼠,处死后立即取小鼠的肝脏,称重后用4%多聚甲醛固定；取胸腺称重,计算胸腺指数；实验过程中观察：小鼠的活动情况、精神状态、皮毛光泽度、食欲等。采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测小鼠血清中AST、ALT、GST及GGT的含量；采用免疫组化法检测肝组织中CyclinD1、CDK4及P27的表达水平。结果：（1）酒精对小鼠实验前后体重、肝重和肝脏指数、胸腺重和胸腺指数的影响：与同品系相同实验周期的对照组小鼠相比较,模型组小鼠实验前后体重增加程度小于对照组小鼠,肝脏和肝脏指数明显重于对照组小鼠,胸腺和胸腺指数明显小于对照组小鼠,具有统计学意义（P<0.05）；与相同实验周期普通小鼠模型组相比较,转基因小鼠模型组实验前后体重增加程度明显低于普通小鼠模型组,肝重和肝脏指数明显增加,胸腺重和胸腺指数明显降低,有统计学意义（P<0.05）。22周转基因小鼠模型组体重抑制最明显、肝重和肝脏指数明显增加,胸腺重和胸腺指数明显降低。（2）葛花解酲方对ALT、AST、GST、GGT的影响：与模型组相比较,对照组和治疗组中各检测指标具有显着性差异（P<0.05）。与对照组相比较,模型组血清中ALT、AST、GST、GGT分泌水平均有显着性升高（P<0.05）；与模型组相比较,治疗组血清中ALT、AST、GST、GGT分泌水平均有显着性降低（P<0.05）。（3）葛花解酲方对肝癌癌前病变相关因子的影响：与对照组相比较,模型组CyclinD1、CDK4的表达含量显着升高（P<0.05）；与模型组相比较,治疗组CyclinD1、CDK4的表达含量显着降低（P<0.05）。与对照组相比较,模型组p27的表达含量显着升降低（P<0.05）;与模型组相比较,治疗组p27的表达含量显着升高（P<0.05）。结论：（1）长期大量的酒精刺激对小鼠生长发育具有明显的抑制作用；损伤肝脏,增加肝重和肝脏指数；对免疫器官造成损伤,使胸腺重和胸腺指数明显减小。（2）葛花解醒方能够有效降低酒精性肝损伤所致的小鼠血清ALT、AST、GST、GGT活性升高,具有保肝护肝的作用。（3）葛花解醒方能够下调CyclinD1和CDK4的表达,上调p27的表达。通过以上实验结果分析,葛花解酲方对肝癌癌前病变小鼠相关因子的影响可能是：稳定细胞膜,保护肝细胞,改善肝功能；通过下调癌基因CyclinD1和CDK4的表达,上调抑癌基因p27的表达减轻肝癌前病变的进一步恶化,从而达到保护和逆转的作用。
宋扬[5]（2013）在《间充质干细胞与shRNA联合治疗肝损伤的研究》文中进行了进一步梳理乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus, HBV）感染引起的慢性肝炎可以造成肝细胞损伤。肝纤维化的形成是由于受到多种细胞因子的刺激,肝内星状细胞被激活,肝细胞外基质大量合成,以致纤维组织的大量沉积。HBV自身并不会对肝脏造成损伤,引起肝细胞损伤的主要原因是宿主特异性免疫应答,细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocyte,CTL）不仅可以清除HBV,还可以杀伤感染后的肝细胞。在本论文中联合RNA干扰和间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSCs）移植技术共同治疗肝损伤。RNA干扰（RNA interference, RNAi）通过小干扰RNA （siRNA）诱导转录后水平上的基因沉默,为有效的治疗HBV感染提供了新方法。在国内外的文献中,有关利用RNA干扰技术抑制乙型肝炎病毒复制的报道已屡见不鲜。然而,对于中后期慢性乙肝病毒感染的患者来说,虽然体内乙肝病毒的复制被抑制,但肝损伤程度很严重,肝细胞已经不能进行自我修复。这样一来,仅使用RNA干扰技术并不能达到良好的治疗效果。间充质干细胞来源广泛,取材方便,无免疫原性,据报道无论在体内还是体外都有向肝细胞分化的潜能,并可以迁移到受伤的肝组织进行修复,移植后间充质干细胞分泌的一些细胞因子也可以帮助宿主恢复肝损伤,由此,MSCs是肝移植的理想供体。我们一方面通过靶向性的小发夹RNA （small hairpin RNA, shRNA）抑制乙型肝炎病毒在鼠体内的复制：同时,又通过脾内注射移植间充质干细胞以修复模型鼠的肝损伤。这样,既抑制了乙型肝炎病毒的复制又改善了肝损伤的程度。首先我们查阅中外文献选择了不同的HBV DNA靶点,Lx-shRNA157是以HBV DNA基因组S开放式阅读框157i为靶点设计的shRNA表达质粒,Lx-shRNA1694是以HBV DNA基因组X开放式阅读框1694i为靶点设计的shRNA表达质粒,Lx-shRNA157-1694为双靶点shRNA表达质粒。我们合成的三个shRNA表达质粒无论在体内还是体外对HBV的复制都有较好的抑制效果,并且双靶点Lx-shRNAl57-1694对HBV复制的抑制效果都要好于单靶点。其次我们在体外通过特殊培养基的诱导分化,成功将人脐带血间充质干细胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells, HUC-MSCs）和小鼠永生型间充质干细胞（mouse immortal mesenchymal stem cells, mi-MSCs）分化为成骨细胞和成肝细胞。并证明了向成肝细胞分化后的MSCs具有成熟肝细胞的功能,如：糖原的贮存,尿素的合成等。乙型肝炎研究困难是因为HBV的宿主范围狭窄,很难找到合适的动物模型。最后我们结合尾静脉高压注射法和CCl4诱导法成功构建了乙肝病毒肝脏纤维化小鼠模型,使鼠体内既有HBV的复制又有肝纤维化的存在,以模拟慢性HBV感染患者体内的环境。我们联合shRNA和MSCs移植技术治疗肝损伤,shRNA可以靶向性地抑制HBV的复制,MSCs可以修复受损伤的肝组织。通过ELISA、蛋白质免疫印迹法和RT-PCT检测乙型肝炎表面抗原（Hepatitis B surface Antigen, HBsAg）和乙型肝炎e抗原（Hepatitis B e Antigen, HBeAg）的含量,研究结果表明靶向性shRNA确实可以显着降低HBsAg和HBeAg的水平,抑制率可达95%以上。通过天狼星红染色、肝重／体重以及谷草转氨酶和谷丙转氨酶含量的测定检测肝细胞纤维化的程度。通过糖原染色和尿素氮含量的测定以检测肝功能恢复的程度。研究结果表明移植MSCs确实对肝损伤有一定的改善作用,移植后的肝脏基本可以恢复正常的肝功能。本文通过以上实验验证了shRNA和MSCs的作用与功能。将两种技术相结合可以更加有效地治疗由HBV感染所致的肝损伤,这为HBV感染的治疗提供了新的治疗策略。
李茜[6]（2010）在《pcDNA3.1-preS1-GFP重组质粒的构建及其在小鼠精子内的表达》文中认为目的构建含有绿色荧光蛋白（green fluorescent protein, GFP）基因与乙型肝炎病毒（hepatitis B virus, HBV） preS1基因的重组真核表达载体pcDNA3.1-preS1-GFP,观察并检测该重组质粒在小鼠精子内的表达。方法采用聚合酶链反应（polymerase chain reaction, PCR）方法,以pBR322-HBV质粒为模板扩增HBV preSl基因片段,将PCR扩增得到的HBV preSl基因片段与含有GFP的真核表达载体pcDNA3.1-GFP分别进行EcoR I和Xba I双酶切,以T4连接酶过夜连接,经酶切及测序鉴定后,用脂质体LipofectamineTM2000转染小鼠精子,在荧光显微镜下观察GFP有无表达,并应用PCR检测HBV preS1基因的存在。结果①利用DNA重组技术将preS1基因插入到pcDNA3.1-GFP质粒中,经双酶切及测序鉴定,成功构建了pcDNA3.1-preS1-GFP真核表达载体；②将重组质粒按一定比例转染小鼠精子后,在荧光显微镜下观察到转染精子头部有较明亮的绿色荧光；③提取转染精子DNA,经PCR扩增得到位于HBV preSl基因区域内长约589bp的片段,与预期一致。结论①以上研究结果证实,重组质粒pcDNA3.1-preS1-GFP已得到成功构建,这为建立新型HBV垂直传递小鼠模型提供了可能；②重组真核表达载体pcDNA3.1-preS1-GFP在小鼠精子内的表达,表明重组质粒pcDNA3.1-preS1-GFP可用于制备转基因小鼠,同时GFP还可作为HBVpreS1基因存在与否的报告基因。因此本研究为建立新的HBV垂直传递小鼠模型,进而更好地研究HBV的垂直传播机制奠定了实验基础。
邓益斌[7]（2009）在《针对HBV S基因反义锁核酸对乙型肝炎病毒转基因鼠抗病毒疗效研究》文中研究表明中国不仅是一个人口大国,而且也是病毒性肝炎的高发区,仅乙肝病毒携带者就达1.3亿之多。目前尚无特效药。传统中草药因药理机制不十分明确,治疗效果并不理想,而临床常用的干扰素、拉米夫啶等药物的专一性又不高,且容易导致病毒基因变异,因此,寻找一种新的专一性抗HBV药物具有重大的意义。反义寡核苷酸技术的使用,使乙肝基因治疗研究取得了新的突破,但由于反义寡核苷酸容易被组织细胞中的核酸酶降解,以及杂交结合力不强等因素,致使反义核苷酸技术的应用受到限制。锁核酸是最近几年发现的一种抗降解能力强、亲和力高、毒性小、易被机体吸收等特点的新型核酸药物。国外开始利用锁核酸对爱滋病治疗进行研究,而利用该技术对乙肝进行治疗研究国内外尚未见报导。因此,本课题在体外细胞试验研究成功的基础上,进一步以阳离子脂质体作为锁核酸药物的传递体,采用流体动力学法,从尾静脉注入HBV转基因鼠体内,观察反义锁核酸药物在小鼠体内的抗HBV效果。我们从以下几个方面进行研究:1.确定ASODN与阳离子脂质体的最适比例及其包裹形式; 2.确定阳离子脂质体作为基因治疗药物载体在小鼠体内的毒性; 3.确定ASODN在HBV转基因鼠体内的有效剂量及给药方式; 4.观察反义锁核酸在HBV转基因鼠体内的抗病毒效果及其作用规律第一部分反义寡聚脱氧核苷酸与阳离子脂质体的最适比例及其包裹形式目的:探讨反义寡聚脱氧核苷酸（ASODN）与阳离子脂质体的最适比例及其存在方式。方法:设计合成针对HBV S基因翻译起始区（155165nt）的11-聚反义寡脱氧核苷酸片段并进行不同修饰,以无菌ddH2O配成系列标准浓度溶液,于260nm波长处,利用UV-2450紫外分光光度计的定量测定功能制作标准曲线。ASODN与脂质体的相对用量以ug/ul表示,配制成不同比例的载ASODN脂质体混悬液,利用超滤管收集各比例载药脂质体离心后的滤液,UV-2450紫外分光光度计检测出各滤液中ASODN的浓度,并按公式（3-mf）/3×100%计算出载药率。利用琼脂糖凝胶电泳检测ASODN在脂质体混悬液中的存在方式。结果:ASODN的紫外吸光度与其浓度的线性回归方程为:A=0.063C+0.073,R2=0.999。ASODN/脂质体比例为1:0.5、1:1、1:2、1:3和1:4时,载药率分别为71.71%、78.38%、81.45%、83.75%和81.68%。琼脂糖凝胶电泳显示,ASODN/脂质体比例为1:31:4时,电泳条带的亮度明显暗于1:0.51:2时的电泳条带。结论:反义寡聚脱氧核苷酸（ASODN）与阳离子脂质体的最适比例为1:3,ASODN主要以被包裹的形式存在于脂质体混悬液中。载药率不随脂质体的用量无限增加。第二部分阳离子脂质体作为基因治疗药物载体在小鼠体内的毒性目的:探讨阳离子脂质体在小鼠体内的毒性,以确定脂质体作为基因药物载体的安全剂量。方法:采用流体动力学法,经尾静脉给小鼠注射不同剂量的阳离子脂质体,对照组注射等量5%GLU液。于注射前、注射后第1天和第3天,经眶静脉采血,采用自动血球计数仪检测外周血中的白细胞（WBC）、淋巴细胞（LY%）、中性粒细胞（GR%）。用722型分光光度计测定血浆中的清蛋白（Alb）、谷丙转氨酶（ALT）、尿素氮（BUN）、肌酐（CR）。同时做脏器组织切片HE染色,观察肝、肾脏组织结构的变化。结果:与对照组比较,12ul/g剂量以上组的WBC、BUN、CR均明显升高（P<0.05）,ALT、Alb无显着性差异（P>0.05）。12ul/g剂量以下组无明显变化（P均>0.05）。与注射前比较,注射后第1天,WBC、BUN、CR显着升高（P<0.05）,而注射后第3天除CR外均基本恢复正常（P>0.05）。而ALT、Alb无显着性差异（P>0.05）。肝肾脏组织切片HE染色,各剂量组间组织结构变化无差异。结论:阳离子脂质体对小鼠外周血相和肾脏功能的毒性作用呈剂量和时间依赖性,故使用其作为核酸药物载体用于基因治疗研究时,剂量应小于12ul/g体重,每两次给药时间至少间隔1天。第三部分反义寡聚脱氧核苷酸在HBV转基因小鼠体内的有效剂量及给药方式目的:探讨反义寡聚脱氧核苷酸（ASODN）在HBV转基因小鼠体内的有效剂量及给药方式。方法:经尾静脉和腹腔分别给HBV转基因小鼠注射不同剂量的ASODN脂质体混合物,于注射前、注射后第1天、第3天、第7天经眶静脉采血,采用酶联免疫吸附技术检测小鼠血清HBsAg、HBeAg的含量;用PCR基因扩增技术和琼脂糖凝胶电泳技术鉴定小鼠血清中的HBV S片段。结果:PCR扩增产物在7501000bp之间;用药后第1d、3d、7d血清HBsAg和HBeAg的抑制率,3ug/g组为22.1%、36.1%、27.9%和54.4%、77.9%、83.8%;6ug/g组为27.5%、40.6%、33.9%和56.2%、77.5%、86.2%;12ug/g组为31.2%、44.1%、28.9%和60.0%、69.3%、84.0%。腹腔注射组血清HBsAg和HBeAg的抑制率均为0.0%。结论:ASODN对HBV转基因鼠抗病效果存在剂量效应,以6ug/g体重剂量为好。腹腔注射方式无效。第四部分反义锁核酸在HBV转基因小鼠体内的抗病毒效果及其作用规律目的:探讨针对乙型肝炎病毒（HBV）S基因的反义LNA对乙型肝炎转基因小鼠HBV复制和表达的影响。方法:设计合成互补于HBV S基因翻译起始区的反义LNA,与脂质体混合,经尾静脉注入小鼠体内,酶联免疫吸附技术（ELISA）检测血清HBsAg含量;荧光聚合酶链反应（PCR）定量检测血清HBV DNA浓度;免疫组织化学法检测肝脏组织细胞HBsAg、HBcAg的表达;自动血液分析仪检测外周血白细胞数（WBC）、淋巴细胞百分比（LY%）、粒细胞百分比（GR%）、血红蛋白（HGB）、红细胞数（RBC）、红细胞压积（HCT）、平均红细胞体积（MCV）、平均红细胞血红蛋白含量（MCH）、平均红细胞血红蛋白浓度（MCHC）、红细胞分布宽度变异系数（RDW-CV）、血小板数（PLT）、平均血小板体积（MPV）;自动生化分析仪检测血清清蛋白（Alb）、谷丙转氨酶（ALT）、尿素氮（BUN）、肌酐（CR）、肌酸激酶（CK）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）、载脂蛋白A1（ApoA1）、载脂蛋白B（ApoB）等指标;小鼠肝脏、肾脏、心脏做常规病理切片HE染色,观察反义LNA对小鼠脏器的影响。结果:血清HBsAg的表达,注射后第1d、3d、7d、14d、28d,S-ASODN脂质体组抑制率分别为20.3%、31.5%、37.1%、24.1%和15.5% ;LNA-脂质体组抑制率分别为41.7%、52.8%、57.8%、30.5%和27.6%。血清HBV DNA的复制,S-ASODN脂质体组对HBV DNA的抑制率分别为2.41%、14.06%、27.44%、18.69%和17.49% ;LNA-脂质体组抑制率分别为6.64%、38.538%、40.19%、39.12%和23.58%。小鼠肝细胞HBsAg、HBcAg的表达显着低于对照组。小鼠肝肾功能及组织学未见异常。结论:针对HBV S基因反义LNA对乙型肝炎病毒转基因鼠HBV复制和表达有显着抑制作用。
张喆[8]（2008）在《乙型肝炎病毒经生殖细胞垂直传播的实验研究》文中进行了进一步梳理目的:检测乙型肝炎病毒表面抗原（hepatitis B surface antigen,HBsAg）阳性卵巢肿瘤患者卵巢组织中乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）DNA,探讨HBV可以感染人类卵巢组织细胞,为HBV感染经生殖细胞垂直传递提供实验依据;构建携带乙型肝炎病毒表面抗原基因（HBV S）的真核表达载体,转染肝癌细胞HepG2,检测构建载体及HBV S基因在肝癌细胞中的表达。方法:应用聚合酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）、荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization,FISH）和逆转录聚合酶链反应（reversetranscription PCR,RT-PCR）等分子遗传学技术检测卵巢肿瘤患者卵巢组织细胞中HBV DNA、构建重组载体、转染肝癌细胞和检测目的基因表达。结果:①PCR、FISH检测结果发现,HBsAg阳性卵巢肿瘤患者卵巢组织细胞存在HBV DNA,与对照组HBsAg阴性卵巢肿瘤患者卵巢石蜡组织细胞中的检测结果比较,实验结果差异高度显着,P＜0.01;②以质粒pBR322-HBV为模板,PCR扩增出3.2kb全长HBV DNA及700 bp的HBV S基因;③成功构建载体pcDNA3.1/CT-GFP-TOPO-HBS:④R7-PCR检测载体转染HepG2细胞表达HBV SmRNA。结论:①HBV可以感染卵巢组织细胞,HBV感染有可能通过卵细胞进行垂直传播;②pcDNA3.1/CT-GFP-TOPO-HBS真核表达载体构建成功。
许君[9]（2007）在《抗乙型肝炎病毒药物体外筛选评价体系的建立及绿茶提取物抗乙肝病毒研究》文中研究表明乙型肝炎病毒（HBV）严重威胁着人类的健康，采用合适的模型和可靠的检测手段来筛选新型的抗HBV药物一直是人们研究的热点。本文中，我们建立一套荧光定量PCR检测HBV共价闭合DNA（cccDNA）的方法；对两个HBV的稳定表达细胞模型进行了动态分析；并结合ELISA，利用HepG2-N10细胞和所建立的HBV cccDNA荧光定量体系，体外研究了绿茶提取物（GTE）和原核表达的重组苦瓜蛋白的抗乙肝病毒作用。第一章：文献综述。概括介绍了乙型肝炎病毒、乙型肝炎的发病机理和治疗、HBV cccDNA检测的意义、药物筛选模型及绿茶提取物等植物抗病毒因子的生物学活性等。并在本章最后介绍了本论文的研究目的、内容和意义。第二章：实时荧光定量PCR检测HBV cccDNA方法的建立。采用一对跨越HBV基因组正负两链的两个缺口的特异性引物，利用基于Eva greenTM荧光染料的荧光定量PCR技术，用构建的含有HBV基因组的质粒为定量标准品，分别对乙型肝炎患者及健康者的血清、HBV稳定表达细胞系进行检测。结果显示，该系统灵敏度高，重复性好。对血清样本的检测结果显示：六例大三阳患者的血清中有五例检测到了cccDNA，而其他小三阳等样本中没有检测到cccDNA，在HepG2 2．2．15和HepG2-N10细胞核中也检测到cccDNA的存在。第三章：两种稳定表达乙型肝炎病毒的细胞系的动态分析。利用ELISA和Real-time PCR，分别从细胞的增殖、病毒的抗原表达、胞外HBV DNA的合成、细胞内HBV复制型中间体及细胞核内HBV cccDNA水平等方面对两种乙型肝炎病毒的稳定表达细胞系HepG2 2．2．15和HepG2-N10进行了动态分析，结果显示，HepG2-N10具有较快的生长速度，而且能分泌较多的乙肝表面抗原（hepatitis B s Antigen，HBsAg）、乙肝e抗原（Hepatitis B e Antigen，HBeAg）和Dane颗粒；而HepG2 2．2．15的细胞内复制型中间体的量要明显高于HepG2-N10，而且细胞核内的cccDNA的载量比HepG2-N10多一倍。抗病毒试验显示，HepG2-N10能够更快速地验证抗病毒药物的抑制作用，3TC作用六天即可显示出明显的抗乙肝病毒效果。因此，HepG2-N10是一个生长速度较快、易于培养的乙肝病毒表达细胞系，能用于研究HBV生物学特性、乙肝的发病机制、体外抗HBV药物筛选等多项研究。第四章：绿茶提取物（GTE）体外抗乙型肝炎病毒研究。利用HepG2-N10，ELISA测定GTE及其主要成份表没食子儿茶素没食子酸脂（EGCG）作用前后HBeAg和HBsAg的变化。结果显示：GTE在最小有效剂量10μg／ml时即可有效抑制HBV的产生。HBsAg和HBeAg的抑制与GTE作用成剂量依赖关系，并随药物浓度的增加和作用时间的延长，抑制作用也随着增强，差异显着（P＜0.01）；EGCG单独作用于HepG2-N10时，对乙型肝炎病毒也有很强的抑制作用，但与GTE相比作用较弱。用Real-time PCR分析了药物作用前后HepG2-N10细胞培养基上清HBV DNA、细胞内复制性中间体，以及细胞核内的cccDNA的影响；采用One-step reverse transcriptase PCR分析了GTE对于HBV的转录的抑制作用。结果预示以GTE有望成为治疗乙型肝炎的另一种替代或辅助治疗药物。第五章：重组苦瓜抗病毒蛋白MAP30的克隆表达与生物学活性研究。分别采用PCR和RT-PCR扩增出编码MAP30蛋白的基因和cDNA，经测序鉴定后将MAP30 cDNA克隆到原核表达载体pET-28a实现高效表达，结果表明该融合蛋白主要以可溶的形式存在。活性验证表明重组蛋白MAP30具有抗金黄色葡萄球菌生长和抑制真菌菌丝延伸作用，而且对于人正常肝细胞株L-02没有毒性，而作用于癌细胞时，细胞毒性随浓度的增加而增加，二者成剂量依赖性关系，ID50为0.0283mg／ml。将纯化的重组MAP30作用于HBV稳定转染细胞系HepG2-N10，并测定HBV的抗原表达变化，结果表明，重组MAP30具有抗乙型肝炎病毒作用，在所试验的最高浓度0.04mg／ml时，对HBsAg的抑制率最高为12.9％，对HBeAg的最高抑制率为26.7％。
王岚[10]（2007）在《乙型肝炎病毒（adr亚型）全基因组转基因小鼠的建立》文中研究表明本研究首先利用已有的adr亚型HBV全基因组与逆转录病毒载体连接构建正连重组质粒pLNCB及反连的重组质粒pLNCBR,鉴定正确后分别转染PA317细胞,包装出毒,进行正向及反向的鉴定后,扩大培养,浓缩病毒,分别选取正向及反向病毒滴度高的病毒,进行受精卵透明带注射构建HBV（adr）全基因组转基因小鼠。对HBV（adr）全基因组转基因小鼠进行PCR、Southern-blotting检测,结果显示:本实验获得了HBV（adr）全基因组转基因小鼠,阳性率为8.7%。同时对HBV（adr）全基因组转基因小鼠进行乙型肝炎病毒标志物ELISA及肝脏、肾脏组织进行了病理、免疫组化（HBsAg、HBcAg）等检测。实验结果表明,构建的转基因小鼠可以传代,血液检测出现HBsAg阳性,病理检测肝脏出现点状坏死或灶状坏死;免疫组化结果表明,在肝脏及肾脏中均出现HBsAg及HBcAg的表达。
二、乙型肝炎病毒S基因经显微注射导入SMMC-7721细胞核内的表达（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、乙型肝炎病毒S基因经显微注射导入SMMC-7721细胞核内的表达（论文提纲范文）
（1）反基因锁核酸抑制转基因小鼠体内乙肝病毒编码链C基因表达研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英汉缩略词对照表 |
| 前言 |
| 第一章 HBVC编码链反基因锁核酸设计、筛选及鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 HBV转基因小鼠体内病毒活性与亚型检测结果 |
| 2.2 LNA稳定性鉴定结果 |
| 2.3 给药剂量对HBV转基因小鼠血清病毒标志物的影响 |
| 2.4 给药途径对HBV转基因小鼠血清病毒标志物的影响 |
| 2.5 给药方式对HBV转基因小鼠血清病毒标志物的影响 |
| 3 讨论 |
| 第二章 反基因锁核酸抑制转基因小鼠体内乙肝病毒编码链C基因表达 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 反基因LNA对 HBV病毒DNA复制的影响 |
| 2.2 反基因LNA对 HBV病毒C-m RNA表达的影响 |
| 2.3 反基因LNA对 HBV病毒HBs Ag、HBe Ag表达的影响 |
| 2.4 反基因LNA对 HBV病毒HBcAg表达的影响 |
| 2.5 反基因LNA对肝肾脏细胞结构和功能的影响 |
| 3 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 抗乙型肝炎病毒免疫治疗研究新进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表的论文及获得的科研成果 |
（2）顺铂通过激活ROS/JNK和抑制Akt/mTOR通路诱导乙型肝炎病毒再激活的分子机制研究（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 顺铂促进HBV复制的体外实验 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 4 讨论 |
| 第二部分 顺铂通过自噬促进HBV复制的体外实验 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 4 讨论 |
| 第三部分 顺铂通过ROS诱导自噬促进HBV复制的体外实验 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第四部分 体内验证顺铂诱导HBV再激活的分子机制 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表的论文和参加的会议 |
（3）MAPK抑制剂增强体外HBV感染作用和机制的初步探索（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词 |
| 第一章: 前言 |
| 1 乙型肝炎病毒生物学特征 |
| 1.1 病毒分类 |
| 1.2 HBV的血清型和基因型 |
| 1.3 HBV的病毒结构 |
| 1.4 HBV基因组及其功能 |
| 1.5 HBV生命周期 |
| 2 乙型肝炎病毒感染 |
| 2.1 HBV感染的全球地理分布情况 |
| 2.2 HBV的传播途径 |
| 2.3 乙型肝炎病毒感染的自然史 |
| 2.4 HBV感染的预防 |
| 2.5 HBV抗病毒治疗 |
| 3 乙型肝炎病毒研究模型 |
| 3.1 细胞培养模型 |
| 3.2 动物模型 |
| 4 MAPK通路与HBV的相关研究 |
| 5 本研究的目的、意义和思路 |
| 第二章: 材料与方法 |
| 1 材料 |
| 1.1 仪器 |
| 1.2 耗材 |
| 1.3 菌株、质粒、cDNA和细胞株 |
| 1.4 常用试剂 |
| 1.5 实验室常规溶液配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 常规细胞生物学实验 |
| 2.2 HBV感染实验 |
| 2.3 MAPK抑制剂筛选 |
| 2.4 HBV的DNA的提取与检测 |
| 2.5 HBV HBeAg、 HBsAg和HBcAg的检测 |
| 2.6 PreS1结合实验 |
| 2.7 HBsAg结合实验 |
| 2.8 细胞内蛋白水平的检测-Western Blot |
| 2.9 CCK-8细胞毒性检测 |
| 2.10 过表达和敲低宿主基因的慢病毒的构建及感染 |
| 2.11 转录组测序及分析 |
| 2.12 数据处理与统计学分析 |
| 第三章: 结果与分析 |
| 1 MAPK抑制剂的筛选 |
| 1.1 MAPK抑制剂在复制模型HepG2-N10细胞上的初步筛选 |
| 1.2 MAPK抑制剂增强HBV对2B1感染水平的初步探索 |
| 1.3 MAPK抑制剂增强HBV的复制与表达 |
| 1.4 MAPK抑制剂增强HBV的感染与进入 |
| 2 MAPK抑制剂增强HBV对2B1感染的机制探索 |
| 2.1 MAPK抑制剂促进HBsAg与肝细胞表面某宿主蛋白的结合 |
| 2.2 B-Raf IN1可通过上调JunB来增强HBV的复制 |
| 第四章: 讨论 |
| 1 HBV复制模型筛选和评价药物结果的可靠性需进一步验证 |
| 2 MAPK抑制剂不依赖NTCP途径促进HBV感染 |
| 3 B-Raf IN1促进cccDNA形成 |
| 第五章: 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 在校期间发表的论文 |
| 致谢 |
（4）葛花解酲方对乙醇性HBV转基因小鼠肝癌癌前病变相关因子的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 实验一 肝癌癌前病变小鼠的建立 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 实验二 葛花解酲方对乙醇性HBV转基因小鼠肝癌癌前病变相关因子的影响 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 全文总结与展望 |
| 附录一 缩略语表 |
| 附录二 综述 |
| 附录三 参考文献 |
| 附录四 致谢 |
| 附录五 个人简历 |
（5）间充质干细胞与shRNA联合治疗肝损伤的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 前言 |
| 1.1 HBV概述 |
| 1.1.1 HBV形态结构 |
| 1.1.2 HBV基因结构特点 |
| 1.1.3 HBV侵入人体的机制 |
| 1.1.4 病毒性肝炎的发病机理及肝损伤的形成 |
| 1.2 RNA干扰概述 |
| 1.3 MSCs概述 |
| 1.4 动物模型 |
| 1.5 本文的立体依据 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料与常规试剂 |
| 2.1.1 HBV基因靶点的选择及质粒的构建 |
| 2.1.2 抗体 |
| 2.1.3 常规试剂的配制方法 |
| 2.2 仪器和设备 |
| 2.3 方法与相关试剂 |
| 2.3.1 大肠杆菌(DH5α)感受态的制备 |
| 2.3.2 细胞培养及转染 |
| 2.3.3 免疫印迹法 |
| 2.3.4 ELISA法 |
| 2.3.5 MSCs向成骨细胞分化 |
| 2.3.6 MSCs向肝细胞分化 |
| 2.3.7 茜素红染色 |
| 2.3.8 RT-PCR |
| 2.3.9 肝糖原检测 |
| 2.3.10 尿素含量检测 |
| 2.3.11 尾静脉高压注射法建立急性乙型肝炎小鼠模型 |
| 2.3.12 CCl_4肝损伤小鼠模型的建立 |
| 2.3.13 乙肝病毒肝脏纤维化小鼠模型 |
| 2.3.14 小鼠脾内移植MSCs |
| 2.3.15 AST、ALT含量的测定 |
| 2.3.16 天狼星红染色 |
| 第3章 结果与讨论 |
| 3.1 shRNA表达载体体外抑制HBV复制及表达 |
| 3.1.1 质粒的构建 |
| 3.1.2 shRNA抑制HBsAg与HBeAg的表达 |
| 3.1.3 shRNA对HBV mRNA的降解作用 |
| 3.1.4 小结 |
| 3.2 shRNA表达载体体内抑制HBV复制及表达 |
| 3.2.1 尾静脉高压注射法注射结果 |
| 3.2.2 shRNA抑制HBsAg与HBeAg的表达 |
| 3.2.3 shRNA表达载体在体内降解HBsAg mRNA |
| 3.2.4 天狼星红染色 |
| 3.2.5 小结 |
| 3.3 MSCs向成骨细胞分化 |
| 3.3.1 茜素红染色 |
| 3.3.2 小结 |
| 3.4 MSCs向成肝细胞分化 |
| 3.4.1 细胞形态变化 |
| 3.4.2 分化过程中肝特异性蛋白的表达 |
| 3.4.3 肝功能检测 |
| 3.4.4 小结 |
| 3.5 MSCs与shRNA联合治疗乙肝病毒肝脏纤维化小鼠 |
| 3.5.1 shRNA抑制HBsAg与HBeAg的表达 |
| 3.5.2 肝重/体重 |
| 3.5.3 ALT、AST含量检测 |
| 3.5.4 天狼星红染色 |
| 3.5.5 小结 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（6）pcDNA3.1-preS1-GFP重组质粒的构建及其在小鼠精子内的表达（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第1章 材料与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 试剂与材料 |
| 1.3 器材及其来源 |
| 1.4 方法 |
| 第2章 结果 |
| 2.1 pcDNA3.1-preS1-GFP重组载体鉴定 |
| 2.2 转染前后精子活力评估结果 |
| 2.3 重组质粒转染精子后绿色荧光的鉴定 |
| 2.4 转染后精子DNA内preS1的检测与表达 |
| 第3章 讨论 |
| 3.1 HBV的垂直传递 |
| 3.2 pcDNA3.1-preS1-GFP重组载体的构建 |
| 3.3 重组载体的转染与表达 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 致谢 |
（7）针对HBV S基因反义锁核酸对乙型肝炎病毒转基因鼠抗病毒疗效研究（论文提纲范文）
| 中英文对照词汇表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 1 乙型肝炎病毒的分子结构及其特性 |
| 2 乙型肝炎抗病毒治疗现状 |
| 3 阳离子脂质体介导转染法原理及其研究进展 |
| 4 HBV 转基因小鼠模型及其研究进展 |
| 5 反义 DNA 技术及其抗 HBV 研究进展 |
| 6 锁核酸的优势及其研究进展 |
| 7 研究意义及课题设计 |
| 第一部分 反义寡聚脱氧核苷酸与阳离子脂质体的最适比例及其包裹形式 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分 阳离子脂质体作为基因治疗药物载体在小鼠体内的毒性 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第三部分 反义寡聚脱氧核苷酸在HBV 转基因小鼠体内的有效剂量及给药方式 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第四部分 反义锁核酸在 HBV 转基因小鼠体内的抗病毒效果及其作用规律 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 全文小结 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 发表文章 |
| 致谢 |
（8）乙型肝炎病毒经生殖细胞垂直传播的实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 试剂与材料 |
| 1.3 实验器材 |
| 1.4 实验方法 |
| 1.4.1 HBsAg阳性卵巢肿瘤患者卵巢组织HBV DNA检测 |
| 1.4.2 携带HBV S基因真核表达载体的构建 |
| 1.4.3 细胞培养及重组质粒转染 |
| 1.4.4 RNA提取与RT-PCR |
| 结果 |
| 2.1 HBsAg阳性卵巢肿瘤患者卵巢组织HBV DNA检测 |
| 2.2 pcDNA3.1/CT-GFP-TOPO-HBS重组载体鉴定 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 综述参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 致谢 |
（9）抗乙型肝炎病毒药物体外筛选评价体系的建立及绿茶提取物抗乙肝病毒研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1. 乙型肝炎与乙型肝炎病毒简介 |
| 2. 抗乙型肝炎病毒药物筛选常用的筛选方法与筛选模型 |
| 3. 乙型肝炎病毒共价闭合 DNA 检测意义与方法 |
| 4. 植物抗病毒因子的研究进展 |
| 5. 本论文的研究内容和意义 |
| 第二章 实时荧光定量PCR检测HBV cccDNA方法的建立 |
| 摘要 |
| 1. 材料和方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 小结 |
| 第三章两种稳定表达乙型肝炎病毒的细胞系的动态分析 |
| 摘要 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 小结 |
| 第四章绿茶提取物体外抗乙型肝炎病毒研究 |
| 摘要 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 小结 |
| 第五章 重组苦瓜抗病毒蛋白MAP30的生物学活性研究 |
| 摘要 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 小结 |
| 第六章 结论 |
| 1. 实时荧光定量 PCR 检测 HBV cccDNA 方法的建立 |
| 2. 两种稳定表达乙型肝炎病毒的细胞系的动态分析 |
| 3. 绿茶提取物体外抗乙型肝炎病毒研究 |
| 4. 重组苦瓜抗病毒蛋白 MAP30 的生物学活性研究 |
| 参考文献 |
| 个人简历 |
| 已发表和撰写的论文 |
| 致谢 |
（10）乙型肝炎病毒（adr亚型）全基因组转基因小鼠的建立（论文提纲范文）
| 提要 |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 综述一：乙型肝炎病毒细胞及动物模型研究进展 |
| 综述二：动物转基因技术研究进展及应用前景 |
| 实验一：乙型肝炎病毒（adr）全基因组重组逆转录病毒载体的构建及鉴定 |
| 1、材料与方法 |
| 2、结果 |
| 3、讨论 |
| 4、小结 |
| 实验二：乙型肝炎病毒全基因组（adr）重组逆转录病毒包装及滴度测定 |
| 1、材料与方法 |
| 2、结果 |
| 3、讨论 |
| 4、小结 |
| 实验三：HBV（adr）全基因组转基因小鼠的建立、鉴定及ELISA、病理、免疫组化检测 |
| 1、材料与方法 |
| 2、结果 |
| 3、讨论 |
| 4、小结 |
| 结论 |
| 本研究的创新点 |
| 参考文献 |
| 攻读博士期间的科研和论文 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 致 谢 |
四、乙型肝炎病毒S基因经显微注射导入SMMC-7721细胞核内的表达（论文参考文献）
- [1]反基因锁核酸抑制转基因小鼠体内乙肝病毒编码链C基因表达研究[D]. 韦武均. 右江民族医学院, 2020
- [2]顺铂通过激活ROS/JNK和抑制Akt/mTOR通路诱导乙型肝炎病毒再激活的分子机制研究[D]. 陈雪梅. 重庆医科大学, 2019(01)
- [3]MAPK抑制剂增强体外HBV感染作用和机制的初步探索[D]. 郑金伟. 厦门大学, 2019(09)
- [4]葛花解酲方对乙醇性HBV转基因小鼠肝癌癌前病变相关因子的影响[D]. 郭斌. 贵阳中医学院, 2015(04)
- [5]间充质干细胞与shRNA联合治疗肝损伤的研究[D]. 宋扬. 吉林大学, 2013(01)
- [6]pcDNA3.1-preS1-GFP重组质粒的构建及其在小鼠精子内的表达[D]. 李茜. 青岛大学, 2010(03)
- [7]针对HBV S基因反义锁核酸对乙型肝炎病毒转基因鼠抗病毒疗效研究[D]. 邓益斌. 广州医学院, 2009(07)
- [8]乙型肝炎病毒经生殖细胞垂直传播的实验研究[D]. 张喆. 青岛大学, 2008(07)
- [9]抗乙型肝炎病毒药物体外筛选评价体系的建立及绿茶提取物抗乙肝病毒研究[D]. 许君. 中国科学院研究生院（武汉病毒研究所）, 2007(02)
- [10]乙型肝炎病毒（adr亚型）全基因组转基因小鼠的建立[D]. 王岚. 吉林大学, 2007(03)