一、Biological Effects of bFGF on Murine Endometrium in the Process of Blastocyst Implantation（论文文献综述）
张恩瑜[1]（2021）在《LncRNA AU016765在小鼠早期胚胎发育中的作用研究》文中研究表明植入前早期胚胎需要经过重编程,消除亲本印记,使胚胎建立起属于自己的基因表达模式。在胚胎重编程过程中,组蛋白修饰和DNA甲基化研究比较深入,非编码RNA的调控研究有待进一步深入。而随着单细胞转录组测序的应用,为lnc RNA在胚胎发育上的研究奠定了基础。本研究基于前期单细胞转录组测序结果,筛选得到可能对植入前早期胚胎发育具有重要作用的AU016765,为进一步揭示植入前早期胚胎发育的调控机制提供基础研究。本项研究以C57BL/6J和DBA2体外受精获得的BDF1胚胎作为研究对象,通过将小干扰RNA注入BDF1受精卵中,建立AU016765敲低模型,体外培养胚胎。对敲低胚胎进行研究,通过观察植入前早期胚胎的表型,通过定量PCR、RNA FISH、免疫荧光检测胚胎发育过程中的各项指标,初步研究AU016765在早期胚胎发育过程中的作用,为早期胚胎发育的调控机制奠定基础。本研究结果显示:1.通过对单细胞转录组测序结果进行分析,筛选得到AU016765,运用RT-q PCR和FISH发现其在胞质中存在,并在卵裂球中瞬时不对称分布,表达水平在不断降低,可能参与合子基因组激活。2.在2,4细胞期AU016765的表达变化导致合子基因组激活相关基因表达水平异常。AU016765敲低组中Dppa2、Zscan4基因表达水平下调,Dppa2蛋白表达水平并未发生变化。表明AU016765不通过Dppa2/4的调节网络机制,可能通过其他途径调控Zscan4,从而参与合子基因组激活。3.与阴性对照相比,AU016765被敲低后,抑制4细胞期胚胎转录活性,导致4细胞期不同卵裂球产生特异性基因表达模式,暗示其可能对不同卵裂球命运决定和分化潜能产生影响。4.在2,4细胞期,AU016765表达发生变化,对囊胚发育相关基因的表达并没有影响,但Oct4蛋白表达水平在4细胞前期时表达水平高表达;Sox17的蛋白表达水平在2细胞和4细胞后期时表达水平下将。且敲低AU016765以后胚胎仍能发育到囊胚期,Nanog、Sox17、Cdx2、Oct4的表达未受影响,但Oct4蛋白表达水平却显着提高。这表明AU016765在胚胎发育过程中主要调控Oct4的表达。5.敲低AU016765降低胚胎着床率并致使胎儿出现一定机率畸形。综上所述,AU016765在植入前早期胚胎中特定的时空表达,对植入前胚胎发育具有重要的作用。AU016765并未通过Dppa2/4调控网络途径,可能通过其他方式调控Zscan4的表达,参与合子基因组激活。AU01676通过调控Oct4和Dppa2蛋白表达,前期AU016765的表达变化影响植入前胚胎分子水平变化,从而影响植入后胚胎发育。
华仁武[2]（2021）在《猪胚胎附植阶段子宫腔液中细胞外囊泡小RNA测序分析及miR-92b-3p功能研究》文中提出胚胎附植的成功与否是影响母猪产仔数高低的关键因素,在子宫腔液中的细胞外囊泡（Extracellular vesicles,EVs）可以通过介导胚胎与母体子宫内膜之间的交流来影响胚胎附植。我们以妊娠第10、13和18天（D10、D13和D18）的子宫腔冲洗液（Uterine flushing fluids,UFs）中的EVs为研究对象,然后提取子宫腔冲洗液中的细胞外囊泡（UFs-EVs）的小RNA进行测序和生物信息学分析。为进一步了解UFsEVs对猪子宫内膜上皮细胞（EEC）和胚胎滋养层细胞（PTr2）的影响,我们将D13的UFs-EVs处理EEC和PTr2细胞后,提取两组细胞的RNA进行转录组测序和分析。最后,我们筛选出在D10、D13和D18的UFs-EVs中差异表达的mi R-92b-3p,并研究了来源于EEC的EVs包裹的mi R-92b-3p（EVs-mi R-92b-3p）对PTr2细胞的功能影响及其调控机制。主要得到以下结果:（1）通过透射电镜观察到在胚胎附植期间的猪子宫内膜组织中包裹多个杯状囊泡类结构的多泡内泌体。通过扫描电镜发现在胚胎附植期的胚胎表面具有直径为100-400 nm球状小囊泡黏附。免疫组织化学试验表明与EVs分泌和摄取相关的蛋白CD9在猪胚胎附植过程的D10、D13和D18的子宫内膜腔上皮细胞中和D18的胎盘滋养层细胞中都有表达。（2）本研究对D10、D13和D18母猪的UFs-EVs进行了分离,并使用蛋白免疫印迹、透射电镜和纳米粒子粒径分析技术鉴定出UFs-EVs为CD63、CD9和HSP70阳性,Calnexin阴性以及粒径为40-160 nm的杯状EVs。然后对这些UFs-EVs中的小RNA表达谱进行了全面的分析。共鉴定出152个已知的micro RNA（mi RNA）、43个新的mi RNA、6248个已知的piwi-interacting RNA（pi RNA）和110个新的pi RNA。RT-q RCR结果表明,在这些小RNA中,ssc-let-7f-5p、ssc-let-7i-5p和ssclet-7g在三个时期差异表达。生物信息学分析表明,D10 vs D13、D13 vs D18和D10vs D18的3个比较组中差异表达的mi RNA参与了与免疫调控、子宫内膜容受性和胚胎发育相关的生物学过程和通路。（3）将UFs-EVs在PKH67标记之后与EEC和PTr2细胞共培养12h和24h。激光共聚焦观察发现荧光标记的UFs-EVs可以被EEC和PTr2细胞摄取。（4）本研究对D13的UFs-EVs处理过的EEC和PTr2细胞进行转录组测序。在UFs-EVs处理EEC和PTr2细胞后,分别有1793和6279个基因的m RNA表达水平发生了显着的改变。通过RT-q PCR检测发现了ID2、ITGA5、CXCL10、CXCL11在两细胞的对比组中都差异表达。生物信息学分析表明EEC和PTr2细胞在处理后差异表达的基因与免疫调控、细胞迁移、细胞黏附以及EVs的分泌和摄取相关。（5）从EEC细胞培养基中分离出EVs,并通过鉴定了蛋白免疫印迹、透射电镜和纳米粒子粒径分析技术鉴定了EEC细胞释放的EVs。我们使用CM-Dil对来源于EEC细胞的EVs进行染色并与PTr2细胞共培养,通过激光共聚焦观察发现荧光标记的EVs可以被PTr2细胞摄取。（6）通过Transwell共培养体系发现FAM标记的mi R-92b-3p转染的猪原代EEC细胞可以通过EVs的形式传送mi R-92b-3p到PTr2细胞中,并且EVs-mi R-92b-3p可以被PTr2细胞摄取使得mi R-92b-3p在PTr2细胞中的表达水平显着上调。EVsmi R-92b-3p和mi R-92b-3p都可以显着促进PTr2细胞的增殖、迁移和黏附。双荧光素酶分析发现mi R-92b-3p可以靶向TSC1和DKK3,且mi R-92b-3p可以抑制TSC1和DKK3的m RNA和蛋白质的表达。功能回复试验表明TSC1和DKK3的3’UTR载体可以回复mi R-92b-3p对PTr2功能的影响。此外,在小鼠子宫内干涉mi R-92b-3p会导致胚胎附植数量的降低。
李文超[3]（2021）在《梅山猪胚胎附植早期子宫内膜miRNA组分析及2个关键miRNAs功能研究》文中研究说明梅山猪作为太湖猪的一种,是世界公认产仔数最高的猪种之一。梅山猪的母体效应对于繁殖力的影响巨大,其繁殖力的调控机制与胚胎附植过程中的低胚胎丢失率相关。miRNAs可负向调控许多基因的表达,并在许多生理过程中,包括在胚胎附植的过程中均发挥重要的调控作用,然而miRNAs在猪胚胎附植过程中的作用机制尚不清楚。而猪胚胎附植早期是发生胚胎丢失的重要阶段,因此筛选影响胚胎附植的关键miRNAs对提高产仔数有重要的意义。本课题使用Illumina高通量测序技术,分析梅山猪胚胎预附植期（妊娠第9,12天及空怀第12天:MS9、MS12和MS12K）和胚胎附植早期（妊娠第15天:MS15）的子宫内膜组织中的miRNA组谱,筛选影响胚胎附植的关键miRNAs,通过双荧光素酶基因报告系统、扫描电镜、Western Blot、流式细胞术、转录组测序分析和小鼠子宫角注射等技术研究miRNAs对猪子宫内膜上皮细胞和间质细胞的调控作用,以及对胚胎附植的影响。主要研究结果如下:1.测序分析了MS9、MS12、MS15和MS12K四个阶段的子宫内膜组织中的miRNA组谱,得到了312个已知的miRNAs和211个潜在的新miRNAs。2.在梅山猪四个妊娠阶段的对比,MS12 vs MS9、MS15 vs MS12、MS15 vs MS9和MS12 vs MS12K中分别筛选得到15、22、40和1个差异表达miRNAs（DE miRNA）。妊娠第12天和空怀第12天的子宫内膜组织中筛选得到的差异转录本数量最少。KEGG分析结果显示MS15 vs MS9的差异表达miRNAs显着富集至Wnt信号通路。top 25高表达的miRNAs的靶基因显着富集至凋亡通路、PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路、mTOR信号通路及Wnt信号通路。此外,ssc-miR-21是在梅山猪四个阶段的表达水平最高的miRNA。3.进行品种间关联分析,在梅山猪和大白猪两品种间同妊娠时间点分别筛选得到40、41、36和38个DE miRNA。梅山猪和大白猪妊娠第12天的DE miRNAs的靶基因富集至p53信号通路和Wnt信号通路。ssc-miR-451、ssc-miR-204、ssc-miR-199a-5p和ssc-miR-199b-5p是妊娠第12天的种间DE miRNAs,同时也属于top 25高表达的miRNAs,是胚胎附植过程中潜在的功能miRNAs。4.在小鼠妊娠的第3天,子宫角注射miR-199a-5p antagomir后会显着降低胚胎附植数,且观察到胞饮突的形成受到影响,说明小鼠子宫内膜的容受性受到损伤,而注射miR-199a-5p agomir不会降低胚胎附植数,且未观察到胞饮突的形成受到影响。超表达miR-199a-5p后,检测到猪子宫内膜上皮细胞和间质细胞中子宫内膜容受性的标志基因β3-integrin、OPN和LIF的上调表达。以上结果表明miR-199a-5p在子宫内膜容受性的建立过程中发挥重要作用。5.通过对转染miR-199a-5p antagomir和NC后子宫内膜上皮细胞转录组测序分析,筛选获得65个上调表达和9个下调表达的差异表达基因。GO富集分析发现发现差异表达基因富集至免疫相关的生物学过程。KEGG富集分析发现显着富集至细胞因子-细胞因子受体互作通路、趋化因子信号通路、IL-17信号通路及MAPK信号通路。以上结果表明干涉miR-199a-5p的表达,会影响子宫内膜上皮细胞的免疫反应状态,进而可能干扰子宫内膜容受性的建立。6.在小鼠妊娠的第3天,子宫角注射miR-451 antagomir和miR-451 agomir后均会显着降低胚胎附植数。超表达ssc-miR-451后,检测到子宫内膜上皮细胞的细胞周期受到阻滞,而子宫内膜上皮细胞和间质细胞的细胞凋亡数显着增加。生物信息学分析发现CUL4B是细胞周期和细胞凋亡过程中的关键基因,体外实验证明ssc-miR-451与CUL4B的靶向关系,并且ssc-miR-451可在转录后水平抑制CUL4B的蛋白表达水平。以上试验结果提示miR-451可通过调节CUL4B的蛋白表达,影响细胞凋亡的平衡,从而影响胚胎附植。综上所述,我们解析了梅山猪胚胎附植早期的miRNA组谱,筛选得到了调控猪胚胎附植的关键miRNAs和信号通路。发现并印证了miR-199a-5p和miR-451均是胚胎附植过程中的关键功能miRNAs。本课题的研究结果为进一步研究miRNAs介导猪胚胎附植过程中的分子调控机制提供新的理论依据,对提高猪产仔数的研究具有重要的理论指导意义。
王晓寒[4]（2021）在《富血小板血浆（Platelet-rich Plasma,PRP）治疗薄型子宫内膜的研究》文中研究说明研究背景辅助生殖技术已成为解决不孕不育问题的重要技术手段,它的快速发展使得胚胎质量问题得到解决,但薄型子宫内膜所引起的子宫内膜容受性改变仍是辅助生殖技术中周期取消以及胚胎植入失败的主要因素之一[1]。目前加拿大的生殖和男科学会（CFAS）及《辅助生殖技术中异常子宫内膜诊疗的中国专家共识》中将薄型子宫内膜定义为子宫内膜在排卵日或新鲜体外受精（IVF）周期中注射人绒毛膜促性腺激素（Human chorionic gonadotropin,HCG）当天或冻融胚胎移植（Freeze-thaw embryo transfer,FET）周期中开始孕酮的当天未达到7mm[2-3]。但薄型子宫内膜并不仅限于内膜变薄,还包括内膜功能层血流异常、影响内膜容受性因子的改变等多种子宫内膜容受性改变。临床上对于薄型子宫内膜的治疗主要包括基础激素治疗、子宫内膜微创刺激术激发免疫应答、低剂量阿司匹林的应用及促基质、血管形成等,从而起到增加子宫内膜的厚度、改善血流等容受性作用。但由于上述治疗方法的临床效果不确切,且患者的个体差异也较大,因此治疗效果并不理想,急需探寻新的有效治疗方式。随着再生医学的兴起及研究,在其领域中具有独特优势的干细胞成为当今研究的热点,它具体自我更新及多向分化潜能等特性,迄今已广泛应用于多个医学领域。其中便有关于将干细胞应用于子宫内膜修复并成功妊娠的报道[4]。尽管有成功的报道,但其来源受限、创伤大及免疫原性等限制了干细胞应用。近些年随着干细胞领域研究的不断深入,优势明显的经血子宫内膜间充质干细胞（Endometrium mesenchymal stem cells,EnMSCs）的研究也有了重大突破。EnMSCs具有较高的增殖活性,同时还能够向骨、脂肪、肌细胞和软骨细胞等分化,具有极强的多向分化潜能。体外细胞实验研究表明:在雌激素的诱导下,EnMSCs可以向子宫内膜上皮细胞分化[5]。在动物模型中,EnMSCs可重建子宫内膜组织并增加子宫内膜厚度[6]。Tan[7]及Zheng[8]等将经血源性EnMSCs移植治疗重度阿什曼综合征也取得良好疗效。以上研究结果均提示,每个月经周期子宫内膜的生长及功能恢复必定离不开EnMSCs的重要作用。但体外干细胞应用的远行归巢及局部定植非常困难,且临床治疗所需干细胞数量大,复制扩增过程中添加的胎牛血清及异体源性生长因子的加入亦有悖于伦理学范畴。能否寻求一种安全有效的自体资源培养干细胞;更有趣的是,假想这种自体资源能唤醒在体干细胞的功能,便能达到事半功倍的治疗效果。富血小板血浆（Platelet-richplasma,PRP）为一种高浓度的血小板血浆,可由静脉血离心得到。血小板内含有α-颗粒,其激活破裂时可释放出多种生长因子,如转化生长因子（Transforming growth factor,TGF）、血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor,VEGF）、血小板源性生长因子（Platelet derived growth factor,PDGF）、表皮生长因子（Epidermal Growth Factor,EGF）和胰岛素样生长因子（Insulin like growth factor,IGF）等,这些生长因子能够促进细胞增殖、迁移等生物活性的改变,使损伤部位的生物微环境明显得到改善,从而促进组织和新生基质的形成,以达到组织修复和再生的功能,对于损伤后伤口愈合具有积极作用[9]。并且,PRP具有操作简单、安全经济、损伤小等自身特有的优点,故广泛应用于骨科、口腔、皮肤、美容整形等[10-12]。基于以上基础理论研究及相关应用,PRP的应用也逐步引入生殖领域,这为薄型子宫内膜的治疗引入了新的安全有效的自体生物材料。鉴于薄型子宫内膜需要得以治疗的迫切性,干细胞治疗有效但应用受限、难以推广及含有多种生长因子的自体PRP可影响多种细胞功能、应用安全等优良特性,我们设计了此课题,初步探讨PRP在治疗薄型子宫内膜方面的作用。研究目的首先探讨PRP对EnMSCs增殖、迁移和粘附的生物学功能影响;然后用95%乙醇宫腔灌注制作薄型子宫内膜小鼠模型,通过观察薄型子宫内膜小鼠宫腔灌注PRP后子宫内膜的形态学、容受性指标及在体EnMSCs标记物的变化,探讨PRP治疗薄型子宫内膜的效果及潜在机制;最后将自体PRP宫腔灌注应用到拟行FET的薄型子宫内膜患者中,观察宫腔灌注PRP治疗薄型子宫内膜的临床效果;以期寻找到一种治疗薄型子宫内膜的新的有效方法。研究方法1.采集5名健康志愿者静脉血,采用两步离心法分离制作并激活PRP。采用流式细胞仪检测EnMSCs表面标志物CD14、CD19、CD34、CD45、CD73、CD90、CD105、HLA-DR的表达;采用成脂、成骨及成软骨分化培养液培养EnMSCs,观察细胞形态以及脂滴、矿化结节及软骨形成情况完成鉴定。利用添加不同浓度PRP的培养液培养EnMSCs,采用CCK-8（Cell Counting Kit-8）法绘制各组细胞在24h、48h、72h、96h的增殖曲线;采用Transwell法和划痕实验检测不同浓度PRP对EnMSCs迁移及粘附能力的影响。2.95%乙醇宫腔灌注制作薄型子宫内膜小鼠模型,给予宫腔灌注PRP治疗后,通过HE染色观察子宫内膜厚度、面积及微血管的改变;通过免疫组化、ELISA和Western-blot检测子宫内膜功能及容受性指标:细胞角蛋白（Cytokeratin）、波形蛋白（Vimentin）、VEGF、白血病抑制因子（Leukemia inhibitory factor,LIF）和白介素-6（Interleukin-6,IL-6）;通过免疫荧光双染方法检测小鼠EnMSCs的表面标记物:CD90和CD105,观察EnMSCs的在体变化情况,探讨宫腔灌注PRP修复薄型子宫内膜的效果和机制。3.采集20名行FET治疗的薄型子宫内膜不孕患者自身静脉血,2步离心法分离制作PRP,同周期宫腔内无菌灌注,且继续人工周期替代治疗。当子宫内膜达到移植厚度（≥7mm）时,添加孕激素转换内膜行FET。提供适当的黄体期支持并测量血清β-HCG水平。计算并分析子宫内膜厚度、形态及血流情况,并进行阳性β-HCG和临床妊娠情况等随访。结果（1）将不同浓度PRP加入培养液对EnMSCs进行体外培养发现:不同浓度PRP对EnMSCs的增殖具有不同程度的影响,2%PRP组的EnMSCs的增殖活性最大;1%PRP组和4%PRP组EnMSCs的增殖活性略低于2%PRP组;5%PRP组和0.5%PRP组的EnMSCs的增殖活性最弱（p<0.01）。（2）PRP可以促进EnMSCs的迁移。其中,2%PRP培养液培养的EnMSCs的迁移率最大;1%PRP组和4%PRP组EnMSCs次之;5%PRP组和0.5%PRP组EnMSCs的迁移率最小。（3）不同浓度的PRP对EnMSCs的粘附能力影响也不同:2%PRP培养液培养的EnMSCs的粘附能力最强（p<0.01）,其余各组粘附能力无明显差异（p>0.05）。（4）通过制作小鼠薄型子宫内膜模型行宫腔灌注PRP治疗后发现:宫腔灌注PRP可以改善薄型子宫内膜小鼠的子宫内膜容受性,包括子宫内膜形态学改善（内膜厚度、面积及微小血管的增加）和子宫内膜容受性指标的提高（CK9、VIM、VEGF、LIF）;此外,PRP还能抑制炎性因子IL-6的释放。免疫荧光追踪到小鼠EnMSCs在子宫内膜的表达情况,发现PRP宫腔灌注后在体EnMSCs增多。（5）通过观察自体PRP宫腔灌注治疗行FET的薄型子宫内膜患者的临床效果发现:20名患者中,接受PRP治疗前,患者的子宫内膜平均厚度为5.55±0.71 mm,PRP治疗后子宫内膜平均厚度为7.82±1.04 mm（p<0.0001）,且其子宫内膜形态及内膜血流信号也明显得到改善（分别是1.95±0.40 vs 2.75±0.44、2.60±0.50vs 3.40±0.68）。PRP宫腔灌注后所有患者子宫内膜达到移植厚度,其中有12例患者获得临床妊娠,妊娠率达60%,种植率为39.4%,早期流产率为16.7%。结论1.本研究使用不同浓度PRP体外培养EnMSCs,发现在2%PRP浓度范围内,细胞的增殖能力、迁移能力和粘附能力随着PRP浓度的升高而增强,呈剂量依赖性,而采用更高浓度PRP作用后上述作用则表现出回落现象,提示不同浓度PRP对EnMSCs的作用效果不同。首次验证PRP对EnMSCs的增殖、迁移和粘附的影响及与其浓度的关系。2.PRP可替代FBS及单一生长因子培养EnMSCs,为EnMSCs治疗薄型子宫内膜及其它疾病的临床应用提供扩增支持。3.PRP宫腔灌注薄型子宫内膜小鼠,可促进受损子宫内膜增殖修复,改善子宫内膜的容受性,减轻子宫内膜炎症反应。这种作用可能跟PRP影响在体EnMSCs的生物学功能有关。4.PRP宫腔灌注治疗薄型子宫内膜不孕患者,能够增加其子宫内膜厚度、改善血流,避免了周期取消,有利于胚胎植入以获得临床妊娠,且并未增加孕产妇并发症及子代出生畸形的风险。
杨丽春[5]（2021）在《circRNA211/miR-431/CSF1网络对奶山羊子宫内膜容受性建立的影响》文中研究表明哺乳动物的健康胚胎只有在子宫内膜处于容受性状态（容受期）才能成功植入,此时子宫内膜上皮细胞被重塑,以接受胚胎的附植。因此,子宫内膜容受性的建立是胚胎成功植入的重要前提条件。奶山羊情期子宫内膜容受性异常会导致胚胎植入失败,本课题组前期通过高通量测序技术发现circRNA211和miR-431在奶山羊子宫内膜容受期差异表达。而且有文献报道CSF1是子宫内膜容受性的标记基因,但其对奶山羊子宫内膜容受性建立的影响尚未见研究报道。生物信息学分析发现:circRNA211序列中含有miR-431的靶向结合位点;circRNA211的宿主基因FBXO18（F-box protein,helicase,18,F-box蛋白家族18）的CDS区上和CSF1基因（colony stimulating factor 1,巨噬细胞集落刺激因子1）的3’UTR上也有miR-431的靶向结合位点。因此,本试验以奶山羊子宫内膜上皮细胞（GEECs）为研究对象,通过双荧光素酶报告系统、RT-q PCR、Western Blot、CCK-8、Ed U染色和流式细胞术等技术,探究circRNA211/miR-431/CSF1网络对奶山羊子宫内膜上皮细胞的调控机制以及容受性建立的影响。本试验主要结果如下:1.miR-431抑制小鼠子宫内膜容受性的建立与右侧对照组相比,小鼠左侧子宫角注射miR-431 agomir后的子宫内膜组织厚度明显变薄,子宫内膜表面胞饮突的数量减少;子宫内膜容受性标志基因VEGF（vascular endothelial growth factor,血管内皮生长因子）和OPN（osteopontin,骨桥蛋白）显着下调（P<0.01）;MUC1（mucin antigen 1,黏蛋白1）显着上调（P<0.01）。此外,胚胎附植试验发现miR-431明显抑制小鼠胚胎的植入。因此,小鼠体内试验表明miR-431可以通过阻碍子宫内膜容受性建立来抑制胚胎植入。2.在奶山羊子宫内膜上皮细胞中存在circRNA211/miR-431/CSF1调控网络双荧光素酶活性试验发现,circRNA211靶向吸附miR-431;而miR-431能与CSF1和FBXO18靶向结合（P<0.01）。RT-q PCR试验结果表明,过表达FBXO18显着增强circRNA211的表达（P<0.01）,干扰circRNA211的表达后,FBXO18的表达没有影响。此外,miR-431过表达和circRNA211干扰均显着降低了CSF1的m RNA和蛋白水平（P<0.05）;而过表达circRNA211和FBXO18显着上调CSF1的m RNA和蛋白水平（P<0.05）。总之,FBXO18促进了circRNA211的表达,而circRNA211抑制miR-431,且miR-431靶向下调CSF1和FBXO18。3.circRNA211/miR-431/CSF1网络促进GEECs的增殖CCK-8和Ed U染色结果发现,过表达FBXO18、circRNA211和CSF1显着促进GEECs的增殖,而共转染miR-431则在一定程度上减弱了这种增殖作用（P<0.01）。相反,过表达miR-431或干扰CSF1/circRNA211后显着抑制了细胞的增殖（P<0.01）。同时,流式细胞术和Western Blot结果均表明,过表达CSF1、circRNA211和FBXO18明显抑制GEECs的凋亡,而miR-431或干扰circRNA211后却明显促进GEECs的凋亡作用。综上所述,FBXO18正向调控circRNA211,而circRNA211作为ce RNA吸附miR-431,从而减弱miR-431对靶基因CSF1和FBXO18的负调控作用。本研究结果揭示了circRNA211/miR-431/CSF1调控网络及其对奶山羊子宫内膜上皮细胞的影响,并且小鼠活体试验发现,miR-431抑制小鼠子宫内膜容受性的形成。本研究为深入探究奶山羊子宫容受性的调控机理提供了试验依据,为提高奶山羊繁殖率提供理论基础。
张悦[6]（2021）在《Rictor/mTORC2通过调控上皮细胞重塑参与子宫内膜容受性》文中认为目的:胚胎植入是发育至具备着床功能的囊胚种植到容受性良好的子宫内膜的过程,成功的胚胎植入是正常妊娠的先决条件。植入失败将导致妊娠异常,其中约三分之一的植入失败由囊胚“质量不佳”引起,三分之二源于子宫内膜容受性的建立异常。然而,目前关于子宫内膜容受性这一复杂精细的动态过程,其分子机制仍不明晰。在前期研究发现小鼠围植入期子宫内膜中mTORC2成员Rictor存在时空表达特异性的基础上,本研究旨在深入探究Rictor对围植入期子宫内膜功能的调控作用及分子机制,以期补充完善子宫内膜容受性的分子调控网络,并为不孕症提供新的临床诊疗思路。方法:1.子宫内膜条件性敲除Rictor基因小鼠的建立及模型验证（1）借助Cre-Loxp重组酶系统特异性敲除小鼠子宫内膜目的基因Rictor:购买PR-Cre工具小鼠（C57BL/6J）,再将其与同品系携带Rictorf/f的小鼠合笼繁殖,经过几代繁殖后,通过鼠尾DNA琼脂糖凝胶电泳鉴定实验,筛选出基因型为PR cre+/-Rictorf/f的雌性小鼠,即为实验所需要的子宫内膜条件性敲除Rictor小鼠,记为Rictord/d,同时基因型为PRcre-/-Rictorf/f的小鼠作为对照组,记为Rictorf/f。（2）小鼠模型的验证:通过免疫组织化学和蛋白免疫印迹检测Rictord/d小鼠与Rictorf/f小鼠子宫内膜Rictor的蛋白表达。2.小鼠正常妊娠模型的建立及取材取8周龄性成熟Rictorf/f与Rictord/d小鼠（体重20-30g）,与同品系野生型的性成熟雄鼠以2:1比例于17:30-18:00合笼交配,次日早晨08:00-08:30查见阴栓者记为妊娠第一天（D1）,妊娠天数以此类推。分别取两组D4、D4.5、D5小鼠血液、卵巢以及子宫内膜组织。3.条件性敲除子宫内膜Rictor对小鼠卵巢形态及功能的影响（1）对各组小鼠卵巢进行湿重秤量和统计。（2）用q-PCR检测各组卵巢中Rictor的转录水平;通过IHC检测各组卵巢组织中Rictor的蛋白表达水平;用ELISA检测各组小鼠血清雌二醇和孕酮水平并进行统计学分析。4.条件性敲除子宫内膜Rictor对小鼠子宫形态及胚胎植入的影响（1）各组小鼠分别于囊胚进入宫腔时期即妊娠D4、子宫内膜形态转化时期即D4.5和胚胎植入期即D5收集子宫组织,统计小鼠子宫湿重。（2）于各组妊娠D5小鼠尾静脉注射0.1mL台盼蓝溶液（0.4%）对胚胎植入点进行观察,统计小鼠子宫内膜胚胎植入位点数量。若无台盼蓝显示的着床点,则使用生理盐水冲胚后显微镜下统计囊胚数量。5.条件性敲除子宫内膜Rictor对小鼠子宫内膜容受性的影响（1）通过IHC检测细胞增殖标志物Ki67和容受性标志物Lif在两组小鼠D4、D4.5子宫内膜的表达情况。（2）通过IHC检测D4、D4.5小鼠子宫内膜组织中雌激素受体ERa/pERa和孕激素受体PR的蛋白表达;利用q-PCR检测D4小鼠子宫内膜组织中雌孕激素下游信号分子Muc1,Ltf,Lgf,Hsd11b2,Areg,Ihh和Hand2的mRNA水平。6.小鼠子宫内膜腔上皮细胞重塑及相关信号通路检测（1）透射电镜观察D4.5小鼠子宫内膜上皮细胞微绒毛形态和细胞间紧密连接。（2）IHC检测CK8在D4、D4.5小鼠子宫内膜的表达以观察腔上皮细胞形态;IHC检测细胞间粘附分子E-Cadherin在D4、D4.5小鼠子宫内膜的蛋白表达;IF检测侧面紧密连接蛋白Occludin,Claudin-7和上皮顶端连接分子Par3在D4、D4.5小鼠子宫内膜的蛋白表达,观察细胞间紧密连接状态。（3）TUNEL检测D4、D4.5小鼠子宫内膜细胞凋亡情况;IHC检测Foxo1在D4、D4.5小鼠子宫内膜的蛋白表达。（4）IHC检测微管解聚相关调节蛋白TTBK1在D4、D4.5小鼠子宫内膜的蛋白表达。（5）WB检测D4、D4.5和D5小鼠子宫内膜组织中Rictor及上皮重塑相关信号通路蛋白pAKT/AKT、Rac-1、ERM/pERM、PAK1/pPAK1的蛋白表达水平,b-actin作为内参。7.小鼠子宫内膜腔上皮细胞Na+通道功能及相关信号通路检测（1）分离Rictorf/f以及Rictord/d小鼠原代子宫内膜上皮细胞进行培养,利用IF检测上皮细胞标志性分子角蛋白来鉴定细胞纯度,利用胰酶处理细胞模拟囊胚刺激信号。（2）借助荧光染料DiBAC（4）3指示细胞膜电位的变化,激光共聚焦显微镜采集图像。（3）WB检测两组小鼠原代子宫内膜上皮细胞中Na+通道（ENaCa）及相关信号通路蛋白Sgk1/pSgk1的蛋白表达。8.Rictor对人子宫内膜容受性的调控及相关机制检测通过宫腔镜手术取正常对照组以及不孕患者的分泌期子宫内膜标本;IHC检测两组人子宫内膜组织中Rictor的蛋白表达。（1）Rictor在人子宫内膜腔上皮细胞重塑中的作用及相关信号通路检测IF检测人子宫内膜侧面紧密连接蛋白Occludin、Claudin-7的表达,显微镜下观察细胞形态以及紧密连接状态;培养人子宫内膜癌细胞系Ishikawa（容受态子宫内膜上皮细胞）,经转染shRNA-Rictor下调Rictor表达后,WB检测Rictor、pAKT/AKT、Rac-1、ERM/pERM、PAK1/pPAK1以及b-actin的蛋白表达水平。（2）Rictor对人子宫内膜腔上皮Na+通道功能的调控及相关信号通路检测Ishikawa细胞经转染shRNA-Rictor下调Rictor表达后,利用胰酶处理模拟囊胚刺激信号,借助荧光染料DiBAC（4）3指示细胞膜电位的变化,激光共聚焦显微镜采集图像;WB检测Ishikawa细胞转染shRNA-Rictor前后,ENaCa、Sgk1/pSgk1的蛋白表达水平。9.利用转录组测序及生物信息学分析深入探讨Rictor调控小鼠容受期子宫内膜功能的机制（1）收集Rictorf/f以及Rictord/d小鼠妊娠D4新鲜子宫内膜组织进行转录组测序;（2）对测序数据进行差异基因的统计分析,绘制韦恩图;对差异基因进行功能聚类（GO）分析以及KEGG信号通路分析;深入挖掘与子宫内膜容受性建立密切相关的上皮细胞分子事件（细胞增殖、细胞凋亡和细胞骨架）相关差异基因。结果:1.子宫内膜条件性缺失Rictor基因的小鼠模型建立成功通过对小鼠鼠尾DNA的琼脂糖凝胶电泳鉴定实验,筛选出Rictorf/f和Rictord/d小鼠。IHC和WB结果均显示:与对照组小鼠相比,Rictor在Rictord/d小鼠D4、D4.5、D5子宫内膜组织中的表达水平明显降低。2.子宫内膜条件性缺失Rictor基因对小鼠卵巢功能的影响（1）q-PCR结果显示:各组卵巢组织中Rictor的转录水平无显着差异;IHC结果显示:Rictor蛋白广泛表达于各组小鼠卵巢组织的颗粒细胞及黄体细胞质,Rictord/d小鼠卵巢颗粒细胞中Rictor的表达与对照小鼠相比水平有所下降。（2）卵巢湿重结果显示:Rictord/d小鼠D4卵巢湿重减小,但D4.5、D5无显着差异。（3）ELISA结果显示:Rictord/d小鼠D4血清雌二醇和孕酮激素水平较Rictorf/f均有所上调。3.Rictor在子宫内膜表达缺失导致小鼠胚胎植入失败（1）Rictord/d小鼠D5子宫在尾静脉注射台盼蓝后,肉眼观察无着床点,与Rictorf/f小鼠相比有统计学意义。（2）D5未见着床点的小鼠子宫用生理盐水冲洗宫腔后,显微镜下观察冲洗液可看到一定数量的正常囊胚。4.子宫内膜Rictor基因表达缺失导致子宫内膜容受性受损（1）IHC结果显示:Ki67表达于Rictorf/f小鼠D4,D4.5子宫内膜基质细胞核,而在Rictord/d小鼠子宫内膜腔上皮细胞核呈强阳性,而基质细胞Ki67阳性细胞减少;Lif高表达于对照组小鼠子宫内膜上皮细胞质,而在Rictord/d小鼠子宫内膜中表达显着降低。（2）对雌孕激素信号通路的检测结果显示:ER广泛表达于两组小鼠D4和D4.5子宫内膜组织的上皮细胞和基质细胞的细胞质与细胞核,p-ER高表达于Rictorf/f小鼠子宫内膜基质细胞核,ER和p-ER在Rictord/d小鼠子宫内膜腔上皮细胞中呈强阳性,基质细胞表达减弱;PR广泛表达于两组小鼠D4和D4.5子宫内膜组织基质细胞的细胞质与细胞核,且Rictord/d小鼠子宫内膜基质细胞中蛋白表达水平显着降低;q-PCR结果显示:与Rictorf/f小鼠相比,Rictord/d小鼠妊娠D4子宫内膜组织中雌激素在上皮细胞中的下游靶基因Muc1、Ltf表达显着增加,在基质细胞中的下游靶基因Lgf、Hsd11b2表达减少;孕激素在上皮细胞的下游靶基因Areg、Ihh和基质细胞的下游靶基因Hand2均显着下调。5.Rictor通过pAKT/Rac-1调控小鼠子宫内膜上皮细胞重塑（1）TEM结果显示:Rictorf/f小鼠子宫内膜腔上皮细胞可见变短的微绒毛,部分细胞间紧密连接打开;而Rictord/d小鼠子宫内膜腔上皮细胞的微绒毛消失,核周间隙增宽,出现空泡样细胞。（2）IHC结果显示:CK8表达于两组小鼠子宫内膜腔上皮细胞的细胞质,Rictorf/f小鼠于D4时子宫内膜腔上皮呈单层立方状,而Rictord/d小鼠子宫内膜腔上皮细胞呈现多层且仍为柱状,部分出现空泡样细胞;E-Cadherin聚集在Rictorf/f小鼠腔上皮细胞顶端,侧面粘附分子表达减少,而Rictord/d小鼠腔上皮细胞侧面粘附分子仍呈强阳性。（3）IF结果显示:紧密连接蛋白Occludin,Claudin-7主要表达于两组小鼠腔上皮和腺上皮的细胞质以及细胞膜,两种蛋白在Rictord/d小鼠D4、D4.5子宫内膜腔上皮表达增加,多聚集在细胞膜近腔侧,Par3主要表达于两组小鼠腔上皮细胞的细胞质及细胞膜,Rictord/d小鼠D4,D4.5子宫内膜腔上皮表达增加,且细胞与细胞之间的膜表达增加更为明显。（4）IHC检测TTBK1发现其主要定位在Rictorf/f小鼠腔上皮和腺上皮细胞质中,在Rictord/d小鼠D4、D4.5子宫内膜上皮细胞中的表达明显下调。（5）TUNEL检测结果发现Rictord/d小鼠腔上皮细胞凋亡增加;IHC结果显示:Foxo1广泛表达于Rictorf/f小鼠子宫内膜腔上皮的细胞质,而在Rictord/d小鼠腔上皮细胞核的定位显着增加。（6）WB检测结果显示:与Rictorf/f小鼠相比,Rictord/d小鼠D4、D4.5、D5子宫内膜组织中pAKT,Rac-1表达下调。6.Rictor通过Sgk1/pSgk1调控小鼠子宫内膜上皮Na+通道功能（1）上皮细胞膜电位检测发现,Rictorf/f小鼠原代上皮细胞在胰酶处理模拟囊胚刺激信号后,膜电位信号增强,而Rictord/d小鼠的上皮细胞在胰酶处理后,膜电位信号无显着变化。（2）WB检测显示,Rictord/d小鼠子宫内膜中pSgk1表达下调,ENaCa表达无显着差异。7.Rictor参与调控人子宫内膜容受性（1）IHC检测显示:Rictor主要定位于人子宫内膜上皮和基质细胞质中,在不孕患者子宫内膜中Rictor的表达明显低于正常对照组。（2）IF检测显示:紧密连接蛋白Occludin,Claudin-7主要定位在人子宫内膜腔上皮和腺上皮胞膜和胞质。在不孕患者子宫内膜中表达升高,特别是腔上皮细胞近宫腔侧;WB检测Ishikawa细胞转染shRNA-Rictor后,pAKT、Rac-1、pERM、pPAK1表达较对照组显着下调。（3）上皮细胞膜电位检测发现,shRNA-Rictor转染Ishikawa细胞后用胰酶处理模拟囊胚刺激信号,膜电位信号较对照组变化不明显;WB检测Ishikawa细胞转染shRNA-Rictor后,ENaCa、pSgk1的蛋白表达较对照组下调。8.RNA-Secquence测序数据及分析（1）对D4 Rictorf/f以及Rictord/d小鼠子宫内膜进行转录组测序,结果发现在容受性建立时期,与Rictorf/f小鼠相比,Rictord/d小鼠子宫内膜组织中表达发生显着变化(log2Rictord/d/Rictorf/f≥2)的差异基因1677个,其中上调883个,下调794个。（2）GO分类和KEGG信号通路分析结果显示:与细胞增殖紧密相关的差异基因有36个,其中上调25个,下调11个;与细胞凋亡紧密相关的差异基因有12个,其中上调11个,下调1个;与细胞骨架紧密相关的差异基因有12个,其中上调7个,下调5个。结论:（1）借助Cre-Loxp重组酶系统可特异性敲除小鼠子宫内膜目的基因Rictor的表达,而子宫内膜条件性缺失Rictor将导致小鼠子宫内膜雌孕激素信号通路失衡、容受性受损,进而导致不孕。（2）Rictor通过调控子宫内膜腔上皮细胞转化参与容受性建立,其中pAKT/Rac-1介导的上皮细胞极性重塑和Sgk1/pSgk1介导的腔上皮细胞Na+通道功能变化可能是Rictor调控子宫内膜容受性的重要机制。（3）Rictor在不孕症患者子宫内膜上皮细胞中表达显着下调,且Rictor在人子宫内膜上皮细胞极性重塑以及Na+通道功能的调控中发挥重要作用,提示其可作为不孕症的潜在诊治靶标。（4）测序及生物信息学分析提示Rictor可能通过调控子宫内膜腔上皮细胞的增殖、凋亡或细胞骨架稳定性参与调控子宫内膜容受性的建立。
张宏硕[7]（2021）在《O-GlcNAc修饰介导能量代谢变化对子宫内膜细胞功能及妊娠结局的影响》文中研究指明一.背景及目的O-GlcNAc修饰是在蛋白质的丝氨酸或苏氨酸残基上添加单个O-linked-DNacetylglucosamine的翻译后修饰方式,在真核细胞细胞核、细胞质、线粒体蛋白中广泛存在。O-GlcNAc对蛋白质的修饰作用只受到两种酶的动态调控,糖基转移酶O-GlcNAc transferase（OGT）负责O-GlcNAc的添加,糖苷酶O-GlcNAcase（OGA）负责O-GlcNAc的去除。O-GlcNAc修饰需要己糖胺生物途径（HBP）的终产物UDP-GlcNAc作为供体,O-GlcNAcylation被认为是一个营养传感器和信号整合子,通过响应外界营养和应激压力参与信号转导与细胞代谢状态的调节。O-GlcNAcylation直接或间接的调节糖酵解。尽管细胞摄入的葡萄糖有大约2-5%进入糖酵解的HBP分支途径,但细胞内超过4000种蛋白需经O-GlcNAc修饰来调控关键的细胞过程,如调节信号、转录、线粒体活动、细胞骨架功能、蛋白质降解等,进而调控多种生理过程,O-GlcNAc修饰异常与多种疾病的发生密切相关,但O-GlcNAc修饰在妊娠过程中的作用罕有报道。哺乳动物“胚胎着床”是指胚泡经过与子宫内膜的识别、定位、黏附以及穿过基底膜等一系列行为而植入子宫内膜的过程。成功的胚胎着床是建立持续妊娠的关键事件,需要子宫内膜进行适当分化并进入接受状态。本实验室前期结果表明,人分泌期子宫内膜O-GlcNAcylation增高,有研究表明人类多种妊娠并发症与子宫内膜糖代谢异常有关,而胚胎植入前O-GlcNAcylation是如何协调葡萄糖代谢影响子宫内膜细胞生理变化并为着床准备的在很大程度上仍然未知。Aquaporin-3（AQP3）作为水通道蛋白（AQPs）家族中的一员,在细胞膜上转运水和溶质方面起着重要作用。水通道蛋白根据序列相似性和底物选择性,可分为三类（传统水通道蛋白、水/甘油通道蛋白和超级水通道蛋白）,AQP3属于水/甘油通道蛋白。AQP3在肿瘤转移、信号转导中起着关键作用,但目前对AQPs在生殖系统的作用研究尚处起步阶段。本实验室前期结果表明,人分泌期子宫内膜AQP3高表达,并通过与Ezrin蛋白的相互作用改变细胞骨架影响细胞形态,导致EMT的发生,进而参与子宫内膜的侵袭和迁移。而鉴于AQP3转运甘油的能力,其在子宫内膜细胞增殖过程高表达是否调控子宫内膜甘油代谢进一步调控妊娠母体能量需求我们并不清楚。特异性蛋白1（Sp1）被鉴定为是与SV40启动子结合的转录因子。Sp1不同程度地调控了许多关键因素,并在疾病进程中发挥重要作用,同时,Sp1的功能可以通过多种翻译后修饰调控。本实验室发现Sp1可以特异性的结合到AQP3启动子区域,激活AQP3的转录。已有报道并经预测,Sp1可被O-GlcNAc修饰,并且具有多个潜在O-GlcNAcylation位点。Sp1的O-GlcNAcylation是否参与AQP3的表达调控、具体哪个修饰位点发挥关键作用有待确定。胚胎成功着床子宫内膜接受状态的建立与17β-雌二醇（E2）和孕酮（P4）的动态相互作用密不可分。适当的葡萄糖代谢对于子宫内膜进入接受状态的生理变化至关重要。葡萄糖转运体（GLUTs）负责细胞内对葡萄糖的摄取,是葡萄糖代谢的第一步。有文献报道子宫内膜存在GLUTs。然而,我们仍然不了解这一过程的具体机制。本研究旨在探讨O-GlcNAc修饰对子宫内膜能量代谢及对胚胎着床的影响。我们分析了子宫内膜O-GlcNAc修饰水平;调控O-GlcNAc修饰对糖酵解、HBP途径中GLUT1、关键调节酶表达变化,以及O-GlcNAc修饰对乳酸、甘油、ATP等相关产物的影响;分析了子宫内膜细胞糖酵解途径及能量代谢变化与子宫内膜容受状态和妊娠结局相关性;子宫内膜AQP3及介导的甘油转运是否参与子宫内膜细胞糖酵解来补偿能量需求;Sp1激活AQP3表达与功能发挥是否与其潜在的O-GlcNAc修饰位点相关;容受性子宫内膜中葡萄糖代谢及能量需求中是否受激素调控;逐步揭示O-GlcNAc修饰介导的能量代谢变化对子宫内膜细胞功能及妊娠结局影响的分子机制。二.方法（一）.着床期GLUT1通过HBP诱导的O-GlcNAc修饰升高影响子宫内膜变化和妊娠结局1)免疫组化分析人增生期、分泌期子宫内膜组织O-GlcNAc、GLUT1、GFAT、Glycogen表达情况。2)CCK-8、Transwell检测调控子宫内膜细胞O-GlcNAc修饰对细胞增殖、迁移、侵袭情况。3)体外着床模型检测调控O-GlcNAc修饰对细胞黏附效率的影响。4)孕鼠子宫角注射siOGT下调O-GlcNAc修饰,检测对胚胎植入效率的影响。5)临床自然流产、人工流产子宫内膜组织qPCR检测OGT mRNA表达差异。6)免疫组化检测孕鼠D1-D5子宫内膜GLUT1、GFAT、Glycogen表达情况。（二）.O-GlcNAc修饰通过AQP3介导的糖酵解补偿调控代谢重编程1)用生物能量分析仪（Seahorse）检测细胞外酸化率（ECAR,近似糖酵解）,氧消耗速率（OCR,近似线粒体呼吸）2)用C13标记的葡萄糖LC-MS分析糖酵解、磷酸戊糖途径、己糖胺生物途径、三羧酸循环相关代谢产物变化。3)使用试剂盒检测子宫内膜组织和细胞中甘油、丙酮酸、乳酸、ATP含量。4)转录组测序检测OGT调控的代谢相关基因和途径。5)2-NBDG检测细胞葡萄糖摄入情况。6)免疫组化分析人和小鼠子宫内膜组织着床期甘油激酶GYK表达情况。7)D3孕鼠子宫角注射siAQP3,检测胚胎植入效率。（三）.转录因子Sp1的S491位点O-GlcNAc修饰激活AQP3的表达1)免疫沉淀检测Sp1的O-GlcNAc修饰水平。2)免疫荧光法检测Sp1表达定位。3)将Sp1的潜在O-GlcNAc修饰位点S491、S612、T640、S641、S698、S702)均或分别突变为丙氨酸,构建突变质粒。4)子宫内膜细胞转染突变质粒,通过Western blotting和qPCR检测Sp1、AQP3,验证O-GlcNAc修饰对自身稳定性以及对AQP3转录活性的影响。（四）.孕激素通过GLUT1调控糖代谢促进子宫内膜容受性1)建立去卵巢小鼠模型,通过免疫组化确定孕激素对GLUT1的影响。2)WB检测不同浓度孕激素处理下细胞的GLUT1、G6PD表达情况,3)2-BNDG检测不同浓度孕激素处理下细胞葡萄糖摄入情况。4)试剂盒检测孕激素处理细胞中丙酮酸、乳酸、ATP含量。5)CCK-8、Transwell检测细胞增殖、侵袭情况。6)生物能量分析仪（Seahorse）检测细胞外酸化率（ECAR,近似糖酵解）。7)JAR细胞模拟胚胎体外检测黏附效率。8)子宫角注射siGLUT1,检测胚胎植入效率。三.结果（一）.着床期GLUT1通过HBP诱导的O-GlcNAc修饰升高影响子宫内膜变化和妊娠结局1.O-GlcNAc修饰对细胞功能以及妊娠结局具有重要意义1)人子宫内膜中O-GlcNAc修饰水平在分泌期高于增生期。2)在模拟低、高接受态的HEC-1A、RL95-2细胞中,调控O-GlcNAc修饰水平能够影响细胞的增殖、迁移、侵袭功能。3)在体外调控O-GlcNAc修饰水平,影响JAR细胞对HEC-1A、RL95-2的黏附效率。4)孕鼠体内子宫角注射OGT siRNA显着降低胚胎植入率。5)人类自然流产（胎亡流产）的子宫内膜组织中OGT mRNA表达显着低于人工流产子宫内膜。2.着床期子宫内膜高表达的GLUT1通过HBP增加O-GlcNAc修饰水平1)人子宫内膜样本以及孕鼠模型显示GLUT1在着床窗口期升高。2)人子宫内膜样本以及孕鼠模型显示Glycogen糖原在着床窗口期升高。3)高糖（15mM、25mM）能够增加HEC-1A、RL95-2细胞的O-GlcNAc修饰水平。4)对HBP通路的激活和抑制能够影响O-GlcNAc修饰水平。5)人子宫内膜样本以及孕鼠模型显示HBP关键酶GFAT在着床窗口期升高。（二）.O-GlcNAc修饰通过AQP3介导的糖酵解补偿调控代谢重编程1.O-GlcNAcylation调控糖代谢1)调控子宫内膜细胞O-GlcNAcylation影响糖酵解水平。2)O-GlcNAcylation的下调增加了细胞的OCR（近似有氧呼吸）。3)13C-标记葡萄糖代谢物检测发现,O-GlcNAcylation的升高,普遍增加了糖酵解、PPP和HBP的代谢物,而TCA循环代谢物减少。4)人子宫内膜分泌期ATP,乳酸含量明显高于增生期。2.OGT下调细胞的转录组学分析1)下调OGT的RL95-2细胞中,共鉴定26429个转录本,其中1587个转录本上调,2266个转录本下调。2)GO分析显示,大部分被调控的基因属于核糖体代谢、核苷酸生物合成、能量代谢产物生物合成和蛋白稳定。3)KEGG通路的富集分析发现,被调节的基因多数参与了中心碳代谢通路。4)下调OGT的RL95-2细胞中,测序检测到的SLC2（GLUTs）家族的转录本中,SLC2A1（编码GLUT1）的下调最为显着。5)O-GlcNAcylation通过c-Myc调控GLUT1的表达。6)抑制OGT、OGA可以影响细胞的葡萄糖摄入。7)下调OGT的RL95-2细胞中,测序检测到的AQPs家族的转录本中,只有AQP3的表达降低。3.AQP3为子宫内膜糖代谢提供能量补偿1)对HBP通路的激活和抑制影响O-GlcNAcylation调控AQP3的表达。2)人子宫内膜分泌期甘油含量明显高于增生期。3)调控O-GlcNAcylation能够影响细胞对甘油的摄入。4)含有甘油的培养环境提高了细胞的糖酵解水平。5)人子宫内膜样本以及孕鼠模型显示甘油激酶（GYK）在着床窗口期升高。6)孕鼠体内子宫角注射AQP3 siRNA能够降低胚胎植入率。7)在敲低AQP3的RL95-2细胞中,含有甘油的培养环境也提高了细胞的糖酵解水平8)调节AQP3可以影响细胞中葡萄糖的摄取,也会影响c-Myc和GLUT1的表达。（三）.转录因子Sp1的S491位点O-GlcNAc修饰激活AQP3的表达1.Sp1的O-GlcNAc修饰促进AQP3表达1)转录因子Sp1特异性调控AQP3的表达。2)OGT、OGA抑制剂Alloxan、PUGNAc影响Sp1的O-GlcNAc修饰水平。3)O-GlcNAc修饰影响Sp1的核内移位。4)通过突变质粒调控Sp1的O-GlcNAc修饰,影响AQP3表达。2.Sp1的S491位点O-GlcNAc修饰影响自身稳定性1)对HBP通路的激活和抑制能够影响AQP3的表达。2)Sp1的O-GlcNAc修饰增加了自身稳定性。3)Sp1在S491位点的O-GlcNAc修饰影响其稳定以及对AQP3的转录活性。（四）.孕激素通过GLUT1调控糖代谢促进子宫内膜容受性1.孕激素（P4）诱导GLUT1表达并影响糖代谢和细胞功能1)着床期子宫内膜GLUT1表达升高。2)去卵巢小鼠模型显示,孕激素诱导GLUT1表达。3)孕激素促进了细胞糖酵解和磷酸戊糖途径。4)孕激素促进细胞的增殖和侵袭能力。2.GLUT1下调抑制糖酵解和胚胎植入1)GLUT1下调抑制细胞葡萄糖的摄入和糖酵解水平。2)GLUT1下调抑制JAR细胞对内膜细胞的黏附。3)小鼠体内子宫角注射GLUT1 siRNA显着降低胚胎植入率。四.结论1.着床期子宫内膜O-GlcNAc糖基化修饰升高增加了糖酵解、PPP和HBP的代谢物,降低TCA循环的代谢物,影响细胞代谢重编程。2.O-GlcNAcylation通过调控GLUT1、AQP3影响子宫内膜糖酵解代谢。3.AQP3通过甘油的转运和增加GLUT1的表达为糖酵解代谢提供补偿。4.Sp1的O-GlcNAcylation影响自身稳定以及对AQP3的转录。5.孕激素通过GLUT1调控糖代谢并影响细胞功能。
段乳侠[8]（2021）在《小鼠囊胚微囊泡诱导子宫内膜上皮细胞上皮间质转化的研究》文中进行了进一步梳理研究背景微囊泡（Microvesicles,MV）是细胞释放的直径100-1000 nm的脂质双分子膜性囊泡,它们选择性地包装源细胞的多种生物活性物质,如脂质、细胞因子、趋化因子、生长因子、特异性及非特异性蛋白、DNA、m RNA、microRNA、lnc RNA、circ RNA等[1],介导细胞间信号的传递。近来研究表明,囊胚能够分泌微囊泡且作用于受体细胞,改变受体细胞功能和行为[2]。在哺乳动物中,妊娠的建立需要通过胚胎发出怀孕识别信号,然后胚胎植入和胎盘形成[3]。胚胎植入是囊胚与母体子宫内膜相互“对话”的结果,囊胚在原癌基因、粘附分子等的调控下有序侵袭母体子宫内膜,在此过程中,子宫内膜在各种细胞因子、雌激素、孕激素和粘附因子组成的网络系统的精确调控下,产生对胚胎的容受性[4]。在此期间,子宫内膜上皮细胞发生了明显的形态和结构变化,以适应胚胎的着床。其主要特征是上皮间充质转化（epithelial mesenchymal transformation,EMT）,即上皮细胞首先失去极性和细胞间黏附,然后获得侵袭和迁移能力,最终转化为间充质表型[4]。细胞间的交流传统上认为是通过直接细胞间接触或通过细胞分泌的信号分子传递信息进行。近来研究显示,MV在细胞间转移也是一种重要细胞通讯方式[5],且微囊泡的信使功能主要依赖来源细胞的表型[6]。因此,我们推测,囊胚微囊泡参与囊胚与子宫内膜细胞对话,且与子宫内膜上皮-间质转化可能存在一定联系。因此,本课题采用孕3.5天BABL/C小鼠囊胚和子宫内膜原代细胞为材料,建立囊胚微囊泡与子宫内膜上皮细胞的共培养体系,分析植入前囊胚MV对子宫内膜上皮细胞上皮-间质转化的影响。验证囊胚微囊泡诱导子宫内膜上皮细胞向间质细胞转化的可能性,为胚胎植入过程中MV通讯提供依据。研究目的1.建立一种小鼠子宫内膜上皮细胞原代分离和纯化的优化方法。2.验证小鼠囊胚微囊泡诱导子宫内膜上皮细胞上皮-间质转化的现象和可能机制。研究方法1.用不同的酶和不同纯化方法处理子宫内膜组织得到子宫内膜上皮细胞,用形态学观察、细胞免疫荧光法和流式细胞术鉴定子宫内膜上皮细胞特征性蛋白Cytokeratin-8的表达,以检测细胞纯度,建立一种小鼠子宫内膜上皮细胞原代分离和纯化的优化方法。2.取孕3.5天BABL/C孕鼠子宫,收集囊胚,经超高速离心结合密度梯度离心分离纯化MV,透射电子显微镜观察其形态,纳米颗粒跟踪仪测定其尺寸分布,WB分析其特征性蛋白Tsg101与CD63的表达。建立囊胚MV与子宫内膜上皮细胞（mEEC）共培养模型,ECIS实时监测120 h内子宫内膜上皮细胞侵袭力的动态变化。取12 h、36 h、48 h、60 h、84 h、120 h作为时间节点,将植入前囊胚MV与mEE细胞共培养组与mEE细胞对照组的电阻值进行比较分析。q PCR分析MV miRNA组成,通过对这些miRNA及其靶基因的生物信息学分析,预测了可能对受体细胞侵袭有促进作用的miRNA和和诱导EMT的可能机制。3.以PKH26对囊胚MV染色示踪,建立植入前囊胚MV与mEE细胞的共培养体系,分别设置0 h、48 h、96 h组别。采用激光共聚焦显微镜检测植入前囊胚MV进入mEE细胞的过程。通过Western-blot实验和细胞免疫组化实验检测mEE细胞对E-cadherin、Vimentin蛋白的表达。并采用Image J软件进行细胞表达E-cadherin、Vimentin蛋白相对量化分析。研究结果1.两种方法中,上皮细胞分离后成团,贴壁较慢,将5×105个细胞接种于24孔板中,24 h后,细胞可长至80%爬片,使用胰蛋白酶消化均不可传代培养。形态学及上皮细胞特异性抗体Cytokeratin-8鉴定为上皮细胞。流式细胞仪鉴定Dispase Ⅱ与胰酶消化后差速贴壁纯化（方法A）所提上皮细胞纯度为80%,胶原酶I与DNase消化后过筛纯化（方法B）所提上皮细胞纯度为60%,方法A可简单、高效地培养出原代上皮细胞,且具备上皮细胞生物学特性,是一种良好的小鼠子宫内膜上皮细胞原代分离和纯化的方法。2.孕3.5天囊胚处理后通过超高速离心结合密度梯度离心分离出一种直径主要约在200 nm的球形微囊泡,并表达微囊泡特征蛋白Tsg101和CD63。ECIS结果显示mEE细胞与小鼠囊胚MV共培养至12 h、24 h、36 h其侵袭力与mEE细胞对照组相比较无明显差异（P>0.05）,当培养至48 h、60 h时,实验组mEE细胞的侵袭力明显高于对照组细胞（P<0.05）,当培养至84 h、120 h时,实验组mEE细胞的侵袭力极显着高于对照组细胞（P<0.01）。PCR结果显示植入前囊胚MV中有224个与侵袭相关的miRNA,占总侵袭相关miRNA的近一半,80个miRNA可以促进侵袭。尽管抑制侵袭的miRNA在数量上占优势,但一些促进侵袭的miRNA在MV中已经有了高水平的表达,如miR-346、miR-21。提示小鼠囊胚MV诱导上皮细胞EMT可能是MV携带miRNA-21靶向PTEN激活PI3K/AKT通路调控的。3.植入前囊胚MV与mEE细胞共培养0 h,mEE细胞内没有PKH26标记的MV,共培养96 h,有大量的MV聚集在mEE细胞的胞质内及细胞核周边。且相比于共培养0 h,共培养96 h的mEE细胞对PKH26标记的MV的摄取率显着升高（P<0.01）。与此同时,E-caderhin蛋白在mEE细胞中表达显着下调（P<0.05,P<0.01）,Vimentin蛋白在mEE细胞中表达显着上调（P<0.05,P<0.01）。结论1.采用Dispase Ⅱ酶和胰蛋白酶共同消化子宫组织再经差速贴壁纯化获得子宫内膜上皮细胞原代的培养方法可简单、高效地培养出原代上皮细胞,是一种良好的小鼠子宫内膜上皮细胞原代分离和纯化的优化方法。2.植入前囊胚MV与mEE细胞共培养体系确定了植入前囊胚MV是能够促进mEE细胞侵袭能力的,且能够影响mEE细胞E-caderhin蛋白、Vimentin蛋白的表达。基于小鼠囊胚MV含有的miRNA种类以及特性,此结果提示mEE细胞侵袭性增强进而向间质细胞转化的可能性是与小鼠囊胚携带着miRNA-21靶向PTEN激活PI3K/AKT通路调控的。
相立峰[9]（2020）在《人胚胎原肠前动态发育研究》文中研究指明伴随工业水平的进步和生活水平的提高,不良的生活环境、不健康的饮食习惯和日益增加的生存压力等导致育龄夫妇的精子与卵子质量急速下降,不孕不育已成为威胁生殖健康的一个重要问题。当胚胎发育至第7天,人胚胎需植入母体的子宫中才能继续存活和发育。这个阶段胚胎在子宫体内发生的变化以及导致这些变化的关键细胞和分子事件,由于材料的无法获得以及缺乏相应技术导致这些问题仍处在黑匣子状态。胚胎植入失败以及在此阶段的发育异常是导致早期流产的主要原因。因此,对人胚胎原肠前发育过程的研究将为我们理解生命起源、探索早期胚胎发育动态变化过程和分子调控机制提供重要的理论依据。2016年的两篇报道在小鼠胚胎体外培养的基础上,建立了着床后人胚胎体外2D培养体系,该体系能够将胚胎在体外培养至13天,并观察到一些谱系分离的现象。然而2D条件下胚胎存在一些重要缺陷,如2D培养的胚胎是扁平的,缺乏体内3D的拓扑结构;虽然2D培养胚胎的滋养外胚层12天后仍在继续存活,但整个胚胎结构发生了坍塌和出现了发育的紊乱,导致很多细胞类型（羊膜上皮）、腔（羊膜腔、卵黄囊）和结构（基底膜、前后轴、原条）无法在2D培养的胚胎中清楚地观测到。因此,这些缺陷限制了2D体系很难真正模拟体内胚胎的发育,无法揭示胚胎在该阶段的发育事件和机制。为了克服以上这些缺陷,我们开展了本论文的研究。我们在获得严格的伦理允许和病人知情同意的条件下,利用临床上捐献的胚胎,通过改善培养基和培养方法,开发了一个三维（3D）人囊胚培养体系,并采用该体系首次将人囊胚在3D条件下培养到原条原基阶段。这些3D胚胎能高度地模拟体内胚胎的发育,经历不同形态的发育并自发组装成2D条件下无法产生的3D结构,包括胚胎双层胚盘、羊膜（amnion）、基底膜（basal membrane）、初级和灵长类独特的次级卵黄囊、前后轴和原条前体。利用这个体系,我们揭示了人原肠前胚胎的关键发育事件:（1）通过单细胞转录表达谱的分析,揭示了上胚层细胞、下胚层细胞和滋养层细胞谱系分化和发育的动态和分子调控网络。（2）羊膜上皮细胞（AME）是上胚层细胞分离出来的第一类细胞系,不同于啮齿类动物,人AME发生于原条形成之前,但其特性和分子机制不清楚。我们发现:与上胚层细胞相比,AME显着地下调多能性基因,其形成与基底膜的缺失显着相关,并有独特的分子表达谱。（3）首次阐明细胞滋养层（cytotrophoblast）、绒毛外细胞滋养层（extravillous cytotrophoblast）和合胞体滋养细胞（syncytiotrophoblast）在胚胎着床后的分化以及引起分化的信号和转录因子,揭示了绒毛外细胞滋养层在早期胚胎中不同于中、后期胎盘的功能。（4）揭示了上胚层细胞（PSCs,多能干细胞）着床后将很快从naive到primed状态的转变。PSCs从着床至第14天期间保持相对的稳定状态,而其发育和转化是由不同的多能因子协调作用所决定的。（5）通过人和非人灵长类胚胎的转录组分析,发现非人灵长类和人上胚层细胞在代谢上具有明显差异,而在维持干细胞多能性以及发育的关键分子和信号通路上具有保守性。本论文利用独创的人胚胎体外3D培养体系详细阐述了胚胎在发育过程中谱系的分离、羊膜腔的形成、羊膜上皮的分离、卵黄囊的形成、胚胎极性的产生和原条的形成等发育学事件。本论文回答了EPI多能性的维持和转化、羊膜上皮的形成机制、滋养层分化发育的机制等科学问题。本研究成果为胚胎的早期发育和干细胞的相关研究提供了新的模型,为组织再生和器官再生提供了研究的理论基础,为研究胚胎因素的着床失败和早期流产提供了理论支持,为不孕症治疗和辅助生殖技术中现存问题的解决提供了研究思路和研究方向。
李如梅[10]（2020）在《胎盘特异性抗原8（PLAC8）对早期胚胎发育与胚胎植入过程的影响研究》文中研究说明研究目的（1）PLAC8在不同物种的胚胎发育中具有重要的作用,并且前期研究发现在人类早期胚胎发育的各个时期中均有PLAC8蛋白的表达,然而在人类胚胎发育过程中具体作用仍然未知,因此我们通过构建慢病毒PLAC8敲降载体转染临床上废弃的人类早期胚胎,探讨PLAC8对人胚胎发育的影响。进一步,在细胞水平上探讨PLAC8对人胚胎干细胞的作用机制。（2）前期研究发现PLAC8在人类囊胚体外植入过程中也有表达,并与胚胎的植入状态相关,在植入状态良好的情况下PLAC8表达量高,反之,PLAC8表达量低。本研究则探讨PLAC8对胚胎植入过程的具体影响。研究方法研究一我们通过创建可以转录出敲降PLAC8 m RNA表达的sh RNA慢病毒载体来下调PLAC8表达水平。通过转染小鼠胚胎来确定最适转染滴度。再利用确定好的最适慢病毒滴度转染临床上废弃的早期3PN胚胎,观察对其胚胎卵裂率的影响。进一步,在细胞水平上探讨PLAC8对人胚胎干细胞（h ESCs）的作用机制;通过慢病毒载体感染h ESCs细胞,实时荧光定量PCR（q PCR）和Western Blot（WB）检测PLAC8空载体组、敲降组转染人胚胎干细胞的效率;采用q PCR检测转染慢病毒后人胚胎干细胞增殖相关基因的相对表达情况;利用Western Blot分析细胞增殖marker蛋白的表达情况;进一步利用流式细胞仪检测敲降PLAC8对人胚胎干细胞（h ESCs）凋亡的影响。研究二本实验首先构建PLAC8 RNAi的慢病毒载体;通过体外受精实验获得鼠胎,收集发育至囊胚期的的鼠胚;设置慢病毒滴度分别为1×104TU/ml,1×105TU/ml,1×106TU/ml,1×107TU/ml,1×108TU/ml转染囊胚,明确最佳感染囊胚的慢病毒滴度;最后运用小鼠胚胎子宫移植技术,把经过慢病毒转染过的囊胚移植到假孕母鼠体内,2.5天后处死观察胚胎在子宫中的植入情况。研究结果研究一成功构建了PLAC8的慢病毒敲降体系;慢病毒可以成功转染鼠胚和人类早期胚胎,使用1×107TU/ml诱导PLAC8 RNAi的慢病毒载体感染3PN的第2-3天胚胎,敲降组胚胎卵裂率（6.5）较阴性对照组（空载体组）显着降低（10.57±1.87）;敲降组胚胎停止发育率（86%）显着高于阴性对照组（53%）。慢病毒干扰载体成功转染人胚胎干细胞h ESCs,以GAPDH为内参,阴性对照组与敲降组的PLAC8 m RNA的相对表达量分别是1.00±0.06,0.41±0.06,敲降组PLAC8m RNA表达量低于阴性对照组（P<0.05）,具有统计学意义;Western blot实验结果显示:内参基因是β-actin,敲降组表达下调,进一步证明慢病毒介导干扰质粒能敲降PLAC8蛋白表达。敲降组与阴性对照组相比细胞增殖相关的基因CCND1和Ki67均下调,内参基因是GAPDH,敲降组的CCND1m RNA和ki67m RNA的相对表达量分别是0.46±0.088和0.41±0.174,具有统计学意义;同时敲降组较阴性对照组cyclin D1、PCNA蛋白下调,β-actin为内参蛋白,阴性对照组和敲降组的cyclin D1蛋白表达量分别1.32±0.18和0.78±0.11,PCNA蛋白表达量分别是1.69±0.11和1.41±0.08,经分析差异具有统计学意义。流式细胞术检测敲降组凋亡率比阴性对照组增高。研究二成功收集经过体外受精后的囊胚;经过实验发现运用慢病毒的滴度在1×107TU/ml转染囊胚最合适;成功的把转染后的囊胚移植到小鼠的子宫内,2.5天后发现PLAC8敲降组囊胚附植率低于阴性对照组。研究结论1.首次通过构建PLAC8 RNAi的慢病毒载体感染人类早期发育的胚胎。2.证实了PLAC8影响早期胚胎的发育,敲降早期胚胎的PLAC8基因的表达降低了胚胎的卵裂率。3.细胞实验进一步验证敲降人胚胎干细胞PLAC8基因的表达,会降低细胞增殖表达并促进细胞凋亡。4.敲降囊胚的PLAC8基因表达会导致胚胎的附植率降低。
二、Biological Effects of bFGF on Murine Endometrium in the Process of Blastocyst Implantation（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、Biological Effects of bFGF on Murine Endometrium in the Process of Blastocyst Implantation（论文提纲范文）
（1）LncRNA AU016765在小鼠早期胚胎发育中的作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 引言 |
| 1 小鼠植入前早期胚胎发育过程的重要阶段 |
| 1.1 合子基因组激活 |
| 1.2 致密化 |
| 1.3 囊胚形成 |
| 2 表观遗传修饰在植入前胚胎发育过程中的研究 |
| 2.1 组蛋白修饰 |
| 2.2 DNA甲基化修饰 |
| 2.3 非编码RNA调控 |
| 3 lncRNA在胚胎发育过程中的研究进展 |
| 4 研究意义 |
| 第二章 材料与方法 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 实验试剂及配制 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 小鼠体外受精胚胎的收集 |
| 2.2 小鼠体内受精胚胎的收集 |
| 2.3 荧光原位杂交 |
| 2.4 荧光定量PCR |
| 2.5 显微注射 |
| 2.6 免疫荧光 |
| 2.7 结扎 |
| 2.8 移植 |
| 第三章 结果与分析 |
| 1 单细胞转录组测序数据分析 |
| 1.1 筛选小鼠胚胎潜在功能性lnc RNA |
| 1.2 测序结果验证 |
| 2 AU016765在胚胎中的定位 |
| 3 AU016765对合子基因组激活的影响 |
| 3.1 AU016765 siRNA序列确定 |
| 3.2 AU016765敲低验证 |
| 3.3 AU016765对合子基因组激活标志基因的影响 |
| 4 AU016765对多能性相关基因的影响 |
| 5 AU016765对胚胎转录活性的影响 |
| 6 AU016765对囊胚发育的影响 |
| 6.1 AU016765对2,4细胞期囊胚发育相关基因的影响 |
| 6.2 AU016765对2,4细胞前、中、后期囊胚发育相关蛋白的影响 |
| 6.3 AU016765对囊胚发育相关蛋白的影响 |
| 7 AU016765对植入后胚胎发育的影响 |
| 第四章 讨论与结论 |
| 1 讨论 |
| 2 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 在校期间公开发表论文及着作情况 |
（2）猪胚胎附植阶段子宫腔液中细胞外囊泡小RNA测序分析及miR-92b-3p功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表(Abbreviation) |
| 1 前言 |
| 1.1 研究问题的由来 |
| 1.2 文献综述 |
| 1.2.1 胚胎附植期间的母胎交流 |
| 1.2.2 细胞外囊泡 |
| 1.2.3 细胞外囊泡中小RNA调控胚胎附植的研究进展 |
| 1.3 研究目的和意义 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 技术路线 |
| 2.2 试验材料 |
| 2.2.1 猪子宫腔液及子宫内膜组织和胚胎样品 |
| 2.2.2 细胞系、载体和菌株 |
| 2.2.3 主要试剂 |
| 2.2.4 主要溶液的配制 |
| 2.2.5 主要仪器设备 |
| 2.2.6 主要分子生物学软件和数据库 |
| 2.3 试验方法 |
| 2.3.1 细胞外囊泡的提取 |
| 2.3.2 透射电镜 |
| 2.3.3 扫描电镜 |
| 2.3.4 免疫组织化学 |
| 2.3.5 纳米粒子粒径分析技术 |
| 2.3.6 小RNA提取 |
| 2.3.7 小RNA测序 |
| 2.3.8 蛋白的抽提及WesternBlot |
| 2.3.9 来自猪胚胎和子宫内膜的小RNA数据集的分析 |
| 2.3.10 时序性分析 |
| 2.3.11 细胞外囊泡染色后摄取分析 |
| 2.3.12 Clue GO分析 |
| 2.3.13 String分析 |
| 2.3.14 RNA提取 |
| 2.3.15 转录组测序 |
| 2.3.16 细胞转染 |
| 2.3.17 引物设计 |
| 2.3.18 miRNA mimic和miRNA inhibitor合成 |
| 2.3.19 cDNA的合成 |
| 2.3.20 荧光定量PCR |
| 2.3.21 无细胞外囊泡的血清获取 |
| 2.3.22 Transwell共培养体系 |
| 2.3.23 野生双荧光载体的构建 |
| 2.3.24 突变型3’UTR的 PmirGLO双荧光素酶报告载体构建 |
| 2.3.25 双荧光素酶活性的测定 |
| 2.3.26 细胞迁移测定 |
| 2.3.27 细胞增殖测定 |
| 2.3.28 细胞黏附测定 |
| 2.3.29 小鼠子宫角注射 |
| 2.3.30 数据统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 细胞外囊泡在猪胚胎附植期的子宫中的发现 |
| 3.2 细胞外囊泡的鉴定 |
| 3.3 CD9的在子宫内的免疫组织化学检测 |
| 3.4 小RNA测序 |
| 3.4.1 小RNA测序数据质控 |
| 3.4.2 小RNA长度分布和类别 |
| 3.4.3 高表达miRNA的功能预测 |
| 3.4.4 miRNA的聚类分析 |
| 3.4.5 差异表达miRNA的功能预测 |
| 3.4.6 时序性分析 |
| 3.5 细胞外囊泡对EEC和PTr2细胞的转录组调控 |
| 3.5.1 细胞外囊泡的摄取 |
| 3.5.2 转录组测序数据质控 |
| 3.5.3 差异表达基因 |
| 3.5.4 差异表达基因的聚类分析 |
| 3.5.5 差异表达基因功能预测 |
| 3.5.6 差异表达基因的蛋白互作 |
| 3.6 细胞外囊泡包裹的miR-92b-3p对胚胎附植的影响 |
| 3.6.1 子宫内膜上皮细胞源的细胞外囊泡(EECs-EVs)的鉴定 |
| 3.6.2 EECs-EVs的摄取 |
| 3.6.3 miR-92b-3p的表达谱 |
| 3.6.4 EVs-miR-92b-3p的转移 |
| 3.6.5 EEC细胞外囊泡源的miR-92b-3p对PTr2细胞的影响 |
| 3.6.6 miR-92b-3p对PTr2细胞的影响 |
| 3.6.7 mi R-92b-3p的靶基因验证 |
| 3.6.8 PmirGLO-TSC1-3’UTR和pmirGLO-DKK3-3’UTR可以挽救mi R-92b-3p在PTr2 细胞上的效果 |
| 3.6.9 miR-92b-3p对胚胎附植相关基因的调控 |
| 4 讨论 |
| 4.1 猪胚胎附植期子宫腔液中存在细胞外囊泡 |
| 4.2 猪胚胎附植期子宫腔液冲洗液中细胞外囊泡的小RNA分子调控机制的预测 |
| 4.2.1 猪子宫腔液中细胞外囊泡的小RNA表达水平的变化可能与胚胎发育和附着有关 |
| 4.2.2 猪UFs-EVs中高表达的已知miRNAs可能在胚胎附植时期调节囊胚激活、胚胎发育和子宫内膜容受性 |
| 4.2.3 猪UFs-EVs中差异表达的miRNAs在胚胎附植过程中可能对子宫内膜容受性、免疫功能和胚胎发育有影响 |
| 4.2.4 猪子宫腔液中细胞外囊泡中具有piRNA的存在 |
| 4.2.5 猪胚胎附植期UFs-EVs对EEC和PTr2细胞的转录水平调控机制 |
| 4.3 EEC细胞释放的EVs-miR-92b-3p靶向TSC1和DKK3调控PTr2 细胞的功能 |
| 5 小结 |
| 5.1 本研究的主要结论和意义 |
| 5.2 本研究的特色和创新点 |
| 5.3 本研究的不足之处和后续研究建议 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表的文章 |
| 致谢 |
（3）梅山猪胚胎附植早期子宫内膜miRNA组分析及2个关键miRNAs功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略表(Abbreviation) |
| 第一章 前言 |
| 1.研究问题的由来 |
| 2.胚胎附植过程 |
| 3.胚胎附植的主要调控因子 |
| 3.1.细胞生长因子 |
| 3.2.粘附相关因子 |
| 3.3.免疫相关因子 |
| 4.胞饮突:容受性子宫内膜的标志物 |
| 5.胚胎附植相关miRNA |
| 5.1.miRNA的调控机制 |
| 5.2.miRNAs参与介导胚胎附植 |
| 5.3.miR-199与miR-451的研究进展 |
| 6.目的与意义 |
| 第二章 梅山猪胚胎附植早期子宫内膜miRNA文库构建及测序分析 |
| 1.引言 |
| 2.试验材料 |
| 2.1.试验动物 |
| 2.2.主要仪器和设备 |
| 2.3.主要试剂 |
| 2.4.常用试剂配制 |
| 2.5.生物信息学分析 |
| 2.6.生物技术服务 |
| 3.试验方法 |
| 3.1.RNA提取与质检 |
| 3.1.1.RNA提取 |
| 3.1.2.RNA质量检测 |
| 3.2.建立文库及测序 |
| 3.3.测序结果注释 |
| 3.3.1.测序数据过滤 |
| 3.3.2.比对与注释 |
| 3.3.3.miRNA表达量的计算 |
| 3.4.DEmiRNA分析 |
| 3.5.聚类分析 |
| 3.6.功能富集分析 |
| 3.6.1.靶基因预测 |
| 3.6.2.GO功能富集和KEGG通路富集分析 |
| 3.7.实时荧光定量PCR |
| 3.7.1.RNA反转录 |
| 3.7.2.引物设计及退火温度的确定 |
| 3.7.3.实时荧光定量 |
| 4.结果与分析 |
| 4.1.原始数据 |
| 4.2.miRNA特征分析 |
| 4.2.1.长度分布 |
| 4.2.2.sRNA注释分类 |
| 4.3.miRNA靶基因预测 |
| 4.4.miRNAs表达量及高表达miRNAs的功能富集分析 |
| 4.5.聚类分析 |
| 4.5.1.PCA聚类 |
| 4.5.2.热图聚类 |
| 4.6.DEmiRNA分析及功能注释 |
| 4.6.1.梅山猪四个妊娠时期DEmiRNA分析 |
| 4.6.2.品种间DEmiRNA分析 |
| 4.7.测序数据的实时荧光定量PCR验证 |
| 5.讨论 |
| 第三章 miR-199a-5p调控子宫内膜细胞转录组分析及功能研究 |
| 1.引言 |
| 2.试验材料 |
| 2.1.试验动物 |
| 2.1.1.母猪子宫 |
| 2.1.2.SPF小鼠 |
| 2.2.主要仪器和设备 |
| 2.3.主要试剂耗材 |
| 2.4.常用试剂配制 |
| 2.5.数据库与分析软件 |
| 2.6.生物技术服务 |
| 3.试验方法 |
| 3.1.细胞培养 |
| 3.2.细胞转染 |
| 3.3.细胞RNA抽提 |
| 3.4.实时荧光定量检测 |
| 3.5.转录组测序分析 |
| 3.5.1.文库构建 |
| 3.5.2.基因差异表达分析,聚类及功能注释 |
| 3.6.细胞周期测定 |
| 3.7.细胞凋亡测定 |
| 3.8.扫描电镜观察 |
| 3.9.小鼠子宫角注射 |
| 4.结果与分析 |
| 4.1.miR-199a-5p调控EECs转录组分析 |
| 4.2.miR-199a-5p调控EECs和ESCs细胞周期 |
| 4.3.miR-199a-5p调控EECs和ESCs细胞凋亡 |
| 4.4.miR-199a-5p对子宫内膜容受性相关基因的影响 |
| 4.5.miR-199a-5p影响小鼠胚胎附植 |
| 5.讨论 |
| 第四章 miR-451调控子宫内膜细胞功能研究 |
| 1.引言 |
| 2.试验材料 |
| 2.1.试验动物 |
| 2.2.载体、菌株、细胞 |
| 2.3.主要仪器和设备 |
| 2.4.主要试剂耗材 |
| 2.5.常用试剂配制 |
| 2.6.数据库与分析软件 |
| 2.7.生物技术服务 |
| 3.试验方法 |
| 3.1.细胞培养 |
| 3.1.1.猪原代子宫内膜上皮细胞和间质细胞分离与培养 |
| 3.1.2.PTr2细胞培养 |
| 3.2.细胞转染 |
| 3.3.细胞RNA提取 |
| 3.4.实时荧光定量PCR |
| 3.5.Western blotting |
| 3.5.1.蛋白浓度测定 |
| 3.5.2.SDS-PAGE电泳 |
| 3.5.3.转膜 |
| 3.5.4.免疫反应 |
| 3.5.5.化学发光及成像 |
| 3.6.靶基因3’UTR双荧光素酶报告载体的构建 |
| 3.6.1.引物设计 |
| 3.6.2.双荧光素酶报告载体的构建 |
| 3.6.3.突变型双荧光素酶报告载体的构建 |
| 3.7.细胞周期检测 |
| 3.8.细胞凋亡检测 |
| 3.9.小鼠子宫角注射 |
| 4.结果与分析 |
| 4.1.miR-451调控EECs细胞周期 |
| 4.2.miR-451调控EECs和ESCs细胞凋亡 |
| 4.3.miR-451对子宫内膜容受性相关基因的影响 |
| 4.4.miR-451影响小鼠胚胎附植 |
| 4.5.miR-451靶向CUL4B和PSAT1 |
| 5.讨论 |
| 第五章 总结 |
| 1.本研究的主要结论和意义 |
| 2.本研究的特色和创新点 |
| 3.本研究的不足之处与后续研究建议 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表论文情况 |
| 致谢 |
（4）富血小板血浆（Platelet-rich Plasma,PRP）治疗薄型子宫内膜的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 中英文缩略词表 |
| 第一章 前言 |
| 1.薄型子宫内膜的研究现状 |
| 1.1 薄型子宫内膜的临床诊断及危害 |
| 1.2 薄型子宫内膜的病因 |
| 1.3 薄型子宫内膜的治疗 |
| 2.子宫内膜间充质干细胞(EnMSCs)的研究概况及应用 |
| 2.1 干细胞概况及应用 |
| 2.2 EnMSCs的研究历程及应用 |
| 3.富血小板血浆(PRP)的研究进展 |
| 3.1 PRP的来源及成分 |
| 3.2 PRP的作用及临床应用 |
| 4.本课题的研究思路及意义 |
| 第二章 PRP对人子宫内膜间充质干细胞(EnMSCs)增殖、迁移及粘附功能的影响 |
| 1.材料 |
| 1.1 一般资料 |
| 1.2 主要实验试剂及耗材 |
| 1.3 主要实验仪器 |
| 1.4 主要实验试剂配制 |
| 2.方法 |
| 2.1 PRP的制备 |
| 2.2 EnMSCs的培养 |
| 2.3 流式细胞仪的鉴定 |
| 2.4 体外EnMSCs的诱导分化 |
| 2.5 实验分组 |
| 2.6 CCK-8法测量不同浓度PRP对EnMSCs增殖活性的影响 |
| 2.7 Transwell实验和划痕实验检测不同浓度PRP对EnMSCs迁移活性的影响 |
| 2.8 粘附实验测定不同浓度PRP对EnMSCs粘附能力的影响 |
| 2.9 统计分析 |
| 3.结果 |
| 3.1 EnMSCs的形态 |
| 3.2 EnMSCs的细胞表面标记物表达 |
| 3.3 EnMSCs多系分化检测 |
| 3.4 PRP对EnMSCs增殖的影响 |
| 3.5 PRP对EnMSCs迁移的影响 |
| 3.6 PRP对EnMSCs粘附的影响 |
| 4.讨论 |
| 第三章 PRP修复薄型子宫内膜模型小鼠子宫内膜的研究 |
| 1.实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 PRP来源 |
| 1.3 主要实验试剂及耗材 |
| 1.4 主要实验仪器 |
| 2.方法 |
| 2.1 薄型子宫内膜小鼠模型制作 |
| 2.2 子宫内膜石蜡包埋切片及HE染色 |
| 2.3 免疫组织化学染色 |
| 2.4 蛋白免疫印迹(Western-blot)实验 |
| 2.5 酶联免疫吸附测定(ELISA) |
| 2.6 免疫荧光 |
| 2.7 统计分析 |
| 3.实验结果 |
| 3.1 HE染色结果 |
| 3.2 免疫组织化学结果 |
| 3.3 Western-blot结果 |
| 3.4 ELISA结果 |
| 3.5 免疫荧光结果 |
| 4.讨论 |
| 第四章 PRP宫腔灌注治疗薄型子宫内膜的临床观察 |
| 1.材料 |
| 1.1 患者收集 |
| 1.2 PRP来源 |
| 1.3 伦理审核及知情同意 |
| 1.4 主要实验试剂及仪器 |
| 2.方法 |
| 2.1 治疗前准备 |
| 2.2 子宫内膜的测量 |
| 2.3 内膜准备 |
| 2.4 PRP的制备 |
| 2.5 PRP宫腔灌注 |
| 2.6 胚胎移植 |
| 2.7 随访 |
| 2.8 统计学分析 |
| 3.结果 |
| 3.1 一般资料统计 |
| 3.2 超声检查结果 |
| 3.3 妊娠结局 |
| 3.4 随访结果 |
| 4.讨论 |
| 全文总结 |
| 综述 PRP在女性生殖领域中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 附件 |
（5）circRNA211/miR-431/CSF1网络对奶山羊子宫内膜容受性建立的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 山羊子宫内膜容受性建立的研究进展 |
| 1.1 子宫内膜的研究概况 |
| 1.1.1 子宫内膜上皮细胞的研究现状 |
| 1.1.2 胚胎植入前子宫内膜上皮细胞的生理变化 |
| 1.1.3 子宫容受性形成的研究进展 |
| 1.2 调控子宫内膜容受性的细胞因子 |
| 1.3 circRNAs的研究进展 |
| 1.4 micro RNAs的研究进展 |
| 1.4.1 micro RNAs的研究进展 |
| 1.4.2 micro RNAs在子宫内膜中的研究现状 |
| 1.4.3 miR-431 的研究进展 |
| 1.5 CSF1/CSF1R的研究进展 |
| 1.5.1 CSF1 的研究进展 |
| 1.5.2 CSF1R的研究进展 |
| 1.5.3 CSF1/CSF1R介导的信号通路的研究现状 |
| 1.6 CSF1/CSF1R与子宫内膜发展的研究进展 |
| 1.7 本研究的目的与意义 |
| 第二章 miR-431 通过靶向CSF1 对奶山羊子宫内膜上皮细胞调控作用的研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料和方法 |
| 2.2.1 试验仪器设备 |
| 2.2.2 试验试剂 |
| 2.2.3 试验动物 |
| 2.2.4 试验方法 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 miR-431 的转染效率 |
| 2.3.2 miR-431 对奶山羊子宫内膜上皮细胞凋亡的影响 |
| 2.3.3 miR-431 抑制小鼠体内子宫内膜容受性的建立 |
| 2.3.4 miR-431 靶向下调CSF1 的表达 |
| 2.3.5 CSF1 在奶山羊子宫内膜上皮细胞中的转染效率 |
| 2.3.6 CSF1 对奶山羊子宫内膜上皮细胞增殖的影响 |
| 2.3.7 CSF1 对奶山羊子宫内膜上皮细胞凋亡的影响 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 circRNA211 通过吸附miR-431 对奶山羊子宫内膜上皮细胞调控作用的研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料和方法 |
| 3.2.1 试验仪器设备 |
| 3.2.2 试验试剂 |
| 3.2.3 试验动物 |
| 3.2.4 试验方法 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 circRNA211和FBXO18在GEECs中的转染效率 |
| 3.3.2 circRNA211与FBXO18 表达的相关性分析 |
| 3.3.3 circRNA211 靶向抑制miR-431 |
| 3.3.4 miR-431 靶向抑制FBXO18 |
| 3.3.5 circRNA211和FBXO18对CSF1 表达的影响 |
| 3.3.6 circRNA211 对奶山羊子宫内膜上皮细胞增殖的影响 |
| 3.3.7 FBXO18 对奶山羊子宫内膜上皮细胞增殖的影响 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 进一步研究的问题 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（6）Rictor/mTORC2通过调控上皮细胞重塑参与子宫内膜容受性（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 胚胎植入的机制:为改善自然妊娠和辅助生殖提供思路 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 博士期间发表的论文 |
（7）O-GlcNAc修饰介导能量代谢变化对子宫内膜细胞功能及妊娠结局的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一部分 着床期GLUT1 通过HBP诱导的O-GlcNAc修饰影响子宫内膜变化和妊娠结局 |
| (一)前言 |
| (二)材料和方法 |
| 1.实验材料 |
| 2.实验方法 |
| (三)结果 |
| 1.O-GlcNAc 修饰在着床窗口期子宫内膜表达升高,调控O-GlcNAc 修饰影响细胞功能 |
| 2.调控O-GlcNAc修饰影响细胞黏附及着床率 |
| 3.着床窗口期子宫内膜GLUT1 表达升高,激活HBP |
| 4.GLUT1 通过HBP增加O-GlcNAc修饰水平 |
| (四)讨论 |
| (五)结论 |
| 第二部分 O-GlcNAc修饰通过AQP3 介导的糖酵解补偿调控代谢重编程 |
| (一)前言 |
| (二)材料和方法 |
| 1.实验材料 |
| 2.实验方法 |
| (三)结果 |
| 1.O-GlcNAcylation调控代谢重编程 |
| 2.转录组分析显示O-GlcNAcylation调控GLUT1和AQP3 |
| 3.AQP3 转运甘油调控子宫内膜细胞糖酵解水平 |
| 4.AQP3 影响GLUT1 表达以及植入效率 |
| (四)讨论 |
| (五)结论 |
| 第三部分 转录因子Sp1的S491 位点O-GlcNAc修饰激活AQP3 表达 |
| (一)前言 |
| (二)材料和方法 |
| 1.实验材料 |
| 2.实验方法 |
| (三)结果 |
| 1.O-GlcNAc修饰促进Sp1 核内移位 |
| 2.Sp1的O-GlcNAc修饰促进AQP3 表达 |
| 3.Sp1的O-GlcNAc修饰影响自身稳定性 |
| 4.Sp1的S491 位点O-GlcNAc修饰影响对AQP3 转录 |
| (四)讨论 |
| (五)结论 |
| 第四部分 孕激素通过GLUT1 调控葡萄糖代谢促进子宫内膜容受性建立 |
| (一)前言 |
| (二)材料和方法 |
| 1.实验材料 |
| 2.实验方法 |
| (三)结果 |
| 1.孕激素(P4)诱导GLUT1 表达 |
| 2.孕激素(P4)影响葡萄糖代谢和细胞功能 |
| 3.GLUT1 下调抑制糖酵解 |
| 4.GLUT1 缺失抑制胚胎植入 |
| (四)讨论 |
| (五)结论 |
| 参考文献 |
| 综述 O-GlcNAcylation作为营养传感器和信号整合子协调多种细胞代谢途径 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表论文及参会情况 |
| 致谢 |
（8）小鼠囊胚微囊泡诱导子宫内膜上皮细胞上皮间质转化的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩写一览表 |
| 第一章 文献综述 细胞外微囊泡(MV)对上皮间质转化调控作用的研究进展 |
| 1.1 微囊泡(MV) |
| 1.2 上皮间质转化(EMT) |
| 1.3 微囊泡在病理过程EMT中的作用 |
| 1.3.1 MV与肿瘤中EMT的关系 |
| 1.3.2 MV与肾病中EMT的关系 |
| 1.3.3 MV与肝病中EMT的关系 |
| 1.4 微囊泡在EMT中的作用机制 |
| 1.4.1 MV诱导EMT的发生 |
| 1.4.2 MV抑制EMT的发生 |
| 1.5 小结 |
| 第二章 引言 |
| 第三章 小鼠子宫内膜上皮细胞分离、纯化方法优化及鉴定 |
| 3.1 材料、试剂和仪器 |
| 3.1.1 主要材料 |
| 3.1.2 实验试剂 |
| 3.1.3 实验仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 mEE细胞原代培养及纯化 |
| 3.2.2 细胞免疫荧光法 |
| 3.2.3 流式细胞术法 |
| 3.2.4 统计学分析 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 小鼠子宫大体图 |
| 3.3.2 Dispase II与胰酶消化后差速贴壁纯化的细胞 |
| 3.3.3 胶原酶I与 DNase消化后过细胞筛纯化的细胞 |
| 3.3.4 细胞免疫荧光法检测Cytokeratin-8 表达 |
| 3.3.5 流式细胞术检测Cytokeratin-8 表达 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 小鼠囊胚微囊泡诱导子宫内膜上皮细胞的侵袭性 |
| 4.1 材料、试剂及仪器 |
| 4.1.1 主要材料 |
| 4.1.2 实验试剂 |
| 4.1.3 实验仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 超排卵与提取囊胚 |
| 4.2.2 囊胚MV制备 |
| 4.2.3 囊胚MV鉴定 |
| 4.2.4 mEE细胞的培养 |
| 4.2.5 小鼠囊胚MV与子宫内膜上皮细胞(mEEC)的共培养 |
| 4.2.6 细胞动态分析仪分析mEE侵袭力的变化 |
| 4.2.7 qPCR法分析囊胚MV促进侵袭性的miRNA |
| 4.2.8 统计学分析 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 植入前囊胚形态 |
| 4.3.2 鉴定植入前囊胚MV的形态、大小及其特征蛋白 |
| 4.3.3 细胞动态分析仪实时监测mEE侵袭力的变化 |
| 4.3.4 植入前囊胚微囊泡中miRNAs情况 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 小鼠囊胚微囊泡对子宫内膜上皮细胞E-cadherin、Vimentin表达的影响 |
| 5.1 材料、试剂和仪器 |
| 5.1.1 主要材料 |
| 5.1.2 实验试剂 |
| 5.1.3 实验仪器 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 超排卵与提取囊胚 |
| 5.2.1.1 BABL/C小鼠超数排卵、合笼、检栓 |
| 5.2.1.2 提取囊胚 |
| 5.2.2 囊胚的MV制备 |
| 5.2.3 小鼠囊胚MV与子宫内膜上皮细胞(mEEC)的共培养 |
| 5.2.4 mEE细胞的培养 |
| 5.2.5 激光共聚焦观察囊胚MV进入mEE细胞的过程 |
| 5.2.6 Western-blot分析mEE细胞表达E-caderhin 蛋白、Vimentin 蛋白水平 |
| 5.2.7 ICC法分析mEE细胞表达E-caderhin 蛋白、Vimentin 蛋白水平 |
| 5.2.8 Image J分析免疫组化光密度值 |
| 5.2.9 Image J分析westen-blot条带灰度值 |
| 5.2.10 统计学分析 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 植入前囊胚MV进入mEE细胞过程 |
| 5.3.2 植入前囊胚MV下调mEE细胞表达E-caderhin蛋白水平 |
| 5.3.3 植入前囊胚MV上调mEE细胞表达Vimentin蛋白水平 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 第六章 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 硕士期间发表的论文 |
（9）人胚胎原肠前动态发育研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 环境因素与生殖健康 |
| 1.1.1 环境污染与生殖健康 |
| 1.1.2 生活方式与配子发生 |
| 1.1.3 胚胎体外培养环境压力与表观遗传改变 |
| 1.2 早期胚胎发育概述 |
| 1.2.1 早期胚胎发育 |
| 1.2.2 多能干细胞与胚胎发育 |
| 1.3 着床前胚胎发育 |
| 1.3.1 辅助生殖技术现状 |
| 1.3.2 着床前胚胎发育过程 |
| 1.3.3 着床前胚胎基因调控 |
| 1.4 着床后胚胎发育 |
| 1.4.1 胚胎2D体外培养体系的建立 |
| 1.4.2 着床后胚胎发育过程 |
| 1.4.3 着床后胚胎发育转录因子调控 |
| 1.4.4 人类胚胎干细胞模型 |
| 1.5 信号通路在胚胎发育及干细胞中的研究 |
| 1.5.1 Wnt信号通路与胚胎发育 |
| 1.5.2 TGF-β/Activin/Nodal信号通路对胚胎发育的作用 |
| 1.6 论文的立题依据及主要研究内容 |
| 第二章 实验材料及方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 材料来源 |
| 2.1.2 主要试剂及配制方法 |
| 2.1.3 使用抗体 |
| 2.1.4 仪器设备 |
| 2.1.5 耗材 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 胚胎样品的准备 |
| 2.2.2 胚胎体外培养 |
| 2.2.3 Matrigel浓度的选择 |
| 2.2.4 全胚染色 |
| 2.2.5 胚胎冰冻切片及切片染色 |
| 2.2.6 共聚焦显微镜拍照 |
| 2.2.7 单细胞消化分离 |
| 2.2.8 细胞测序过程 |
| 2.2.9 测序结果分析 |
| 第三章 人胚胎原肠前动态发育研究实验结果 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 人胚胎体外3D培养体系的建立 |
| 3.2.1 人胚胎体外培养体系探索 |
| 3.2.2 着床后胚胎发育过程是谱系动态变化的过程 |
| 3.3 EPI动态发育研究 |
| 3.3.1 EPI发育过程是naive向 primed转变的过程 |
| 3.3.2 EPI发育阶段互相联系又各自表达不同基因 |
| 3.3.3 人类与非人灵长类EPI发育既有差异又有保守性 |
| 3.4 着床后胚胎关键结构的形成 |
| 3.4.1 羊膜上皮是从EPI中迁移出来的一群独特的细胞 |
| 3.4.2 胚胎前后轴及原条前体的形成 |
| 3.5 滋养层细胞发育是分化发育的过程 |
| 第四章 讨论 |
| 4.1 人胚胎体外培养体系的突破 |
| 4.2 本研究填补了着床后人胚胎发育分子机制的空白 |
| 4.3 胚胎发育过程是多能性细胞从naive到 primed态转变过程 |
| 4.4 人类胚胎与其他物种胚胎发育的差异 |
| 4.5 人胚胎发育过程中特殊结构的形成 |
| 4.6 滋养层细胞发育分化 |
| 4.7 小结 |
| 第五章 总结与展望 |
| 5.1 总结 |
| 5.2 论文的创新性 |
| 5.3 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 A 攻读博士期间取得的科研成果及奖励 |
| 附录 B 医学伦理证明 |
（10）胎盘特异性抗原8（PLAC8）对早期胚胎发育与胚胎植入过程的影响研究（论文提纲范文）
| 英文缩略词对照表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一部分 PLAC8对人植入前早期胚胎发育的影响 |
| 1.前言 |
| 2.实验材料 |
| 3.实验方法 |
| 4.统计学方法 |
| 5.实验结果 |
| 6.讨论 |
| 7.结论 |
| 第二部分 PLAC8在胚胎植入过程的作用 |
| 1.前言 |
| 2.实验材料 |
| 3.实验方法 |
| 4.统计学方法 |
| 5.实验结果 |
| 6.讨论 |
| 7.结论 |
| 参考文献 |
| 附录 :个人简历 |
| 致谢 |
| 综述 胚胎植入子宫过程的机制调节研究进展 |
| 参考文献 |
四、Biological Effects of bFGF on Murine Endometrium in the Process of Blastocyst Implantation（论文参考文献）
- [1]LncRNA AU016765在小鼠早期胚胎发育中的作用研究[D]. 张恩瑜. 阜阳师范大学, 2021(12)
- [2]猪胚胎附植阶段子宫腔液中细胞外囊泡小RNA测序分析及miR-92b-3p功能研究[D]. 华仁武. 华中农业大学, 2021
- [3]梅山猪胚胎附植早期子宫内膜miRNA组分析及2个关键miRNAs功能研究[D]. 李文超. 华中农业大学, 2021
- [4]富血小板血浆（Platelet-rich Plasma,PRP）治疗薄型子宫内膜的研究[D]. 王晓寒. 山东大学, 2021(11)
- [5]circRNA211/miR-431/CSF1网络对奶山羊子宫内膜容受性建立的影响[D]. 杨丽春. 西北农林科技大学, 2021
- [6]Rictor/mTORC2通过调控上皮细胞重塑参与子宫内膜容受性[D]. 张悦. 重庆医科大学, 2021(01)
- [7]O-GlcNAc修饰介导能量代谢变化对子宫内膜细胞功能及妊娠结局的影响[D]. 张宏硕. 大连医科大学, 2021(01)
- [8]小鼠囊胚微囊泡诱导子宫内膜上皮细胞上皮间质转化的研究[D]. 段乳侠. 西南大学, 2021(01)
- [9]人胚胎原肠前动态发育研究[D]. 相立峰. 昆明理工大学, 2020(04)
- [10]胎盘特异性抗原8（PLAC8）对早期胚胎发育与胚胎植入过程的影响研究[D]. 李如梅. 安徽医科大学, 2020(02)